CN111053907A

CN111053907A - Setdb1基因作为靶点在治疗炎症性肠病中的应用

Info

Publication number: CN111053907A
Application number: CN201911424718.2A
Authority: CN
Inventors: 莫玮; 韩家淮; 王瑞聪; 李洪达; 吴剑锋; 蔡治煜
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-04-24

Abstract

本发明中通过小鼠动物实验证明，SETDB1蛋白低表达会导致基因组不稳定并启动ZBP1驱动的细胞程序性死亡，最终造成炎症性肠病的发病。因此本发明提供调高Setdb1基因表达的试剂、抑制Zbp1基因表达的试剂、抑制Mlkl基因表达的试剂及抑制Rip3基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用，从而为治疗炎症性肠病提供了一种新的思路和手段。

Description

Setdb1基因作为靶点在治疗炎症性肠病中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及Setdb1基因作为靶点在治疗炎症性肠病中的应用。

背景技术

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)有多种致病因素，包括遗传的和环境的。炎症性肠病主要分为克罗恩病和溃疡性结肠炎两类。克罗恩病和溃疡性结肠炎的主要区别在于炎症发生的位置和炎症本身的不同。克罗恩病可影响到消化系统的任何部分，从口腔至肛门都有可能发生跳跃性病变，多发于回肠末端。而溃疡性结肠炎发病仅限于结肠和直肠部分。微观上，溃疡性结肠炎发病仅限于黏膜(肠的上皮组织)，而克罗恩病影响到整个肠内壁。

虽然炎症性肠病有不同的形式，但是它们都有一些共同的症状：腹痛、呕吐、腹泻、血便或体重减轻等一些相关的疾病，如关节炎，坏疽性脓皮病，原发性硬化性胆管炎，口腔复发性溃疡等。通常根据临床表现，结合血液检查、粪便检查、结肠镜和活体组织切片等来诊断。

治疗炎症性肠病常用氨基水杨酸制剂，如柳氮磺胺吡啶、美沙拉嗪等。根据不同的严重程度，通常用免疫抑制剂来缓解症状，如强的松、硫唑嘌呤、甲胺蝶呤、6-巯嘌呤等。类固醇的药物也被常用来控制病情的突发，曾被作为维持药剂。近年来，生物疗法也被用来治疗炎症性肠病。对于药物治疗无效或者出现了严重的并发症的患者需要进行手术治疗，如肠切除、狭隘成形术或暂时性或永久性结肠造口术或回肠造口术。另外还有不同形式的替代性医学治疗炎症性肠病。尽管如此，寻求控制根本的病理以避免长期服用类固醇药物产生的副作用以及手术切除，仍是目前医学界积极探索追求的方向。

发明内容

在本发明中，发明人通过小鼠动物实验证明，没有SETDB1蛋白的表观遗传保护的话，会导致基因组不稳定并引起病变，具体地说，肠道干细胞中的类病毒调动先天免疫反应并启动ZBP1驱动的细胞程序性死亡，最终造成了细胞死亡与炎症反应的恶性循环，而这又造成了炎症性肠病的发病。

因此，筛选靶向作用于SETDB1、ZBP1以及细胞程序性死亡相关基因/蛋白并因此可以干扰胞质核酸(病毒类似物)造成不稳定基因组的化合物有助于治疗IBD。

本发明的第一目的在于提供调高Setdb1基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。

本发明的第二目的在于提供抑制Zbp1基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。

本发明的第三目的在于提供抑制Mlkl基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。

本发明的第四目的在于提供抑制Rip3基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。

本发明的第五目的在于提供抑制Rip3基因表达的试剂和抑制Mlkl基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。

本发明是这样实现的：

调高Setdb1基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。

抑制Zbp1基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。

抑制Mlkl基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。

抑制Rip3基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。

进一步地，所述抑制Rip3基因表达的试剂为无机物类抑制剂、小分子有机物类抑制剂以及核酸和蛋白质类抑制剂中的一种或多种。

进一步地，所述无机物类抑制剂包括金属离子的氯化物、氟化物和磷酸盐。

进一步地，所述小分子有机物类抑制剂包括氨基苯并噻唑类抑制剂、二芳基马来酰亚胺类抑制剂、二芳基脲类抑制剂、喹唑啉类抑制剂、异喹啉磺酰胺类抑制剂、吡啶并咪唑类抑制剂和十字孢碱类抑制剂。

优选地，所述氨基苯并噻唑类抑制剂为GSK'872。

GSK'872的分子结构式如下：

抑制Rip3基因表达的试剂和抑制Mlkl基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。

本发明通过翔实、严谨的实验证明了Setdb1基因是炎症性肠病的生物靶点，其低表达或不表达与炎症性肠病具明确的因果关系，且证明抑制Zbp1、Mlkl、Rip3以及同时抑制Mlkl和Rip3可改善或治愈因Setdb1基因低表达或不表达导致的炎症性肠病，从而为治疗炎症性肠病提供了一种新的思路和手段。

附图说明

图1为实施例1中关于SETDB1在正常(n＝32)和IBD病人(n＝36)中的相对表达水平对比图，数据来源于数据库GSE 112366。

图2为实施例1中关于SETDB1蛋白在正常肠道组织和活检的IBD病人样品中的相对表达水平对比图。左边为电泳图，n＝4，GAPDH为western内参；右边为相应的蛋白相对表达水平统计图，**P≤0.01。

图3为实施例1中关于SETDB1在人正常回肠和结肠组织中的染色示意图。左右两个图中，上面的两个箭头标示肠绒毛细胞，下面的两个箭头标示肠道干细胞，中间的两个箭头标示间质细胞。

图4为实施例1中关于SETDB1在正常人(n＝17)和IBD(n＝30)病人手术样品中的染色强度统计，数据来源于图5。

图5为实施例1中关于SETDB1在非IBD病人和IBD病人肠组织手术样品中的染色示意图。左上角的黑框标示放大的隐窝，右上标示病人的序列号。

图6A为实施例1中关于SETDB1在非IBD病人肠道手术样品中的染色示意图。

图6B为实施例1中关于SETDB1在IBD病人肠道组织切片样品中的染色示意图。

图7为实施例2中关于SETDB1在他莫昔芬诱导后的小鼠肠道组织切片中的染色示意图。黑框内为放大的隐窝示意图，n＝3。

图8为实施例2中8dpi的小鼠肠镜示意图，n＝2。

图9为实施例2中Setdb1敲除小鼠肠道苏木精-伊红染色示意图，左上角黑框标示放大的隐窝，黑框中的箭头标示死亡的细胞。右边部分为肠绒毛和隐窝相对长度统计图。

图10为实施例3中关于在4种基因型的小鼠回肠组织中每个隐窝中的TUNEL信号个数统计图，n＝3。

图11为实施例3中关于在4种基因型的小鼠回肠中每个隐窝中的TUNEL染色示意图。n＝3。

图12为实施例3中关于在4种基因型的小鼠肠道中的各类免疫细胞个数统计图，Gr-1：中性粒细胞；F4/80：巨噬细胞；CD45和CD3：T细胞；B220，B细胞。n＝3。数据来源于图13。*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001。

图13A、图13B、图13C、图13D为实施例3中关于免疫细胞在4种基因型的肠道缺失SETDB1的小鼠肠道组织切片中的染色示意图。

图14为实施例3中用不同药物处理对Setdb1^iIEC-KO小鼠肠道隐窝起源的类器官的细胞死亡的影响效果图。EtOH：酒精刺激对照组；4-OHT：诱导敲除Setdb1实验组；TnfαAb+4-OHT：肿瘤坏死因子中和抗体治疗实验组；Nec-1+4-OHT：RIPK1激酶抑制剂治疗实验组；GSK‘872+4-OHT：RIPK3激酶抑制剂治疗实验组。右边为统计图，Rel.PI.area.per.org,每个类器官的相对PI染色面积，n＝3。比列尺：50μm。***P≤0.001。

图14A为实施例3中GSK’872药物治愈和对照小鼠在他莫昔芬诱导8dpi的苏木精-伊红染色示意图，PC：近端结肠，DC：远端结肠。n＝3。

图14B为实施例3中在抗生素处理条件下8dpi对照组和实验组小鼠肠道组织苏木精-伊红染色示意图，n＝3。

图15为实施例4中两种基因型小鼠每个隐窝中pRIP3染色信号个数统计图，n＝3。

图16为实施例4中两种基因型小鼠每个隐窝中pRIP3染色示意图，n＝3。

图17为实施例4中3种基因型小鼠每个回肠隐窝当中的TUNEL信号统计图，统计数据来源于每个基因型各3对小鼠的总计50个隐窝。

图18为实施例4中3种基因型的小鼠回肠中的TUNEL染色示意图，n＝3。

图19为实施例4中3种基因型小鼠在他莫昔芬诱导后8dpi肠道的苏木精-伊红染色示意图，右图是小鼠回肠的绒毛和隐窝的相对长度统计图，n＝3。

图20为实施例4中3种基因型的小鼠回肠和结肠中的免疫细胞个数统计图，n＝3。

图21的左边为实施例5中在Setdb1^fl/fl和Setdb1^iIEC-Het小鼠的肠道隐窝中SETDB1蛋白的表达水平图，右边是蛋白相对表达水平统计图，n＝4。

图22为实施例5中有肠道形态破损的Setdb1敲降小鼠和对照小鼠的苏木精-伊红染色示意图。

图23为实施例5中4-OHT诱导后在来源于肠道隐窝的类器官培养中的相对PI染色面积示意图。n＝2。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行即可实现。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例中涉及的基因、蛋白的序列及相关的例如基因敲除等基因工程操作技术均是本领域技术人员公知的，为了本发明申请文件清楚简要的目的，因此没有一一具体罗列。

本发明(包括附图)的术语汇总列举如下：

IBD(inflammatory bowel disease)：炎症性肠病

SETDB1(SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1)：SET结构域分叉组蛋白赖氨酸甲基转移酶1

Setdb1：小鼠SETDB1基因

dpi(days post induction)：诱导后天数

ZBP1(Z-DNA-binding protein 1)：Z-DNA结合蛋白1

Zbp1：小鼠ZBP1基因

MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein)：混合系列蛋白激酶结构域样蛋白

Mlkl：小鼠混合系列蛋白激酶结构域样蛋白基因

RIP3(receptor interacting protein kinase 3)：受体相互作用蛋白激酶3

Rip3：小鼠RIP3基因

IHC(Immunohistochemistry)：免疫组织化学

Setdb1^f1/f1小鼠：基因未敲除小鼠

Setdb1^iIEC-KO小鼠：Setdb1基因敲除小鼠

Setdb1^iIEC-KO；Mlkl^-/-小鼠：Setdb1基因与MLKL基因双敲除小鼠

Setdb1^iIEC-KO；Rip3^-/-小鼠：Setdb1基因与RIP3基因双敲除小鼠

Setdb1^iIEC-KO；Zbp1^-/-小鼠：Setdb1基因与Zbp1基因双敲除小鼠

Setdb1^iIEC-Het(Villin-CreERT2；Setdb1^fl/+)：SETDB1杂合型小鼠，该杂合型小鼠的SETDB1的表达量大约为野生型的一半

Normal：正常

Relative expression：相对表达水平

Patients-Biopsy：病人样品

Ileum：回肠

Colon：结肠

Relative IHC：相对免疫组织化学

Intensity of SETDB1：SETDB1强度

crypt：肠隐窝

non-epi：非肠道上皮

Ctrl：对照

Control samples：对照样品

proximal colon：近端结肠

distal colon：远端结肠

ileal crypts：回肠隐窝

ileal villi：回肠绒毛

TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)：一种通用细胞凋亡检测技术

PI((propidiumiodide)：碘化丙啶。

实施例1：验证SETDB1表达与IBD关系

如图1所示，对36份IBD病人病灶活检样本的SETDB1含量进行检测分析，和正常组织相比，该36份IBD病人病灶活检样本中的SETDB1含量降低了近50％，说明SETDB1的含量高低和IBD具临床相关性。

如图2所示，对IBD病人病灶活检样本进行免疫印迹分析，结果显示SETDB1含量有明显下降。

如图3所示，SETDB1的表达非常明显地集中在肠上皮细胞/肠道干细胞(下面的两个箭头标示)和某些非上皮细胞(中间的两个箭头标示)。

如图4、图5、图6A、图6B所示，对30份IBD病人手术样本进行SETDB1 IHC分析，结果表明SETDB1表达大量下调发生在肠腺隐窝区细胞(肠上皮细胞)中而不是非上皮细胞中。

实施例2：Setdb1敲除IBD小鼠构建与分析

考虑到环境因素对刚出生小鼠影响较大以及年轻小鼠易发IBD的事实，选取8周大的成年小鼠并用一剂量的他莫昔芬进行诱导敲除Setdb1，构建肠上皮细胞中Setdb1基因敲除的小鼠Setdb1^iIEC-KO，诱导3天后观察小鼠。Setdb1^iIEC-KO小鼠3天后表现出严重的肠炎症状并体重下降，5天后出现了腹泻症状，如图7所示。

如图8所示，对Setdb1^iIEC-KO小鼠的结肠进行内窥镜检查发现有粘膜增厚、溃疡、缺血等症状。

Setdb1敲除后的小鼠8天后产生了严重的肠浮肿，而10天左右几乎全部死亡。病理解剖结果确诊了Setdb1^iIEC-KO小鼠在8天后患上末端回肠炎和结肠炎。苏木精-伊红染色结果显示结构被破坏的肠上皮，表现为肠绒毛萎缩和肠隐窝变形，如图9所示。

实施例3：

为了评估细胞程序性死亡对于Setdb1^iIEC-KO小鼠IBD症状的影响，构建Mlkl基因敲除小鼠及Rip3基因敲除小鼠以体内阻碍细胞程序性坏死。

如图10、图11分别所示，相较于Setdb1^iIEC-KO小鼠，Setdb1^iIEC-KO；MLKL^-/-小鼠及Setdb1^iIEC-KO；RIP3^-/-小鼠的肠隐窝细胞死亡数量大大减少了。

如图11所示，Setdb1^iIEC-KO；MLKL^-/-小鼠及Setdb1^iIEC-KO；RIP3^-/-小鼠的肠上皮的完整性得到了恢复。如图12、图13A、图13B、图13C、图13D所示，免疫细胞入侵得到了极大地抑制，说明基因组不稳定导致的细胞程序性死亡与导致肠炎的干细胞死亡有关，进而说明抑制Mlkl基因表达的试剂、抑制Rip3基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中具有应用价值。

如图14所示，RIP3抑制剂GSK'872可以使Setdb1基因失活的组织免于死亡。

如图14A、图14B所示，用大剂量的GSK’872处理Setdb1^iIEC-KO小鼠可以大大改善小鼠的IBD症状。

图14B还示出，敲除Mlkl或Rip3可以极大延长Setdb1^iIEC-KO小鼠的生命周期。

实施例4：

ZBP1蛋白是一个包含RHIM(受体结合蛋白的同源结合基序)的蛋白，它可以通过它的RHIM与RIP3结合从而启动细胞程序性坏死。在4dpi的Setdb1^iIEC-KO小鼠肠隐窝细胞中检测到由ZBP1募集的RIP3，说明ZBP1与基因组不稳定导致的细胞程序性死亡有关。

在本实施例中，如图15、图16所示，通过Zbp1基因敲除后观察到RIP3失活，以及如图17、图18所示的，几乎没有肠上皮细胞死亡，说明ZBP1确实与基因组不稳定导致的细胞程序性死亡有关，并因此可以确定抑制Zbp1基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中具有应用价值。

为了验证，在本实施例中，还构建了Setdb1^iIEC-KO；Zbp1^-/-小鼠，并观察到如图19所示的肠上皮细胞的绒毛萎缩及如图20所示的淋巴浸润大大减少的结果，说明ZBP1在RIP3介导的细胞程序性死亡中是一个关键的调控蛋白，并进一步确定抑制Zbp1基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中具有应用价值。

实施例5：

基于IBD人类患者更可能是SETDB1低表达而不是完全不表达，为了在我们的小鼠模型和人IBD间建立可靠联系，我们对SETDB1杂合型小鼠Setdb1^iIEC-Het进行了相关试验，如图21所示，该杂合型小鼠的SETDB1的表达量大约为野生型的一半。

Setdb1^iIEC-Het小鼠表达大约40-45％的SETDB1蛋白，如图22所示，也发展出结构损害的上皮细胞。

如图23所示，在肠道器官培养的体外实验中，Setdb1半表达也导致了更多的肠道细胞死亡。

Setdb1^iIEC-Het小鼠可以模拟人IBD的情况，其发展出肠道炎症说明SETDB1低表达是人IBD的原因。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.调高Setdb1基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。

2.抑制Zbp1基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。

3.抑制Mlkl基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。

4.抑制Rip3基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抑制Rip3基因表达的试剂为无机物类抑制剂、小分子有机物类抑制剂以及核酸和蛋白质类抑制剂中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述无机物类抑制剂包括金属离子的氯化物、氟化物和磷酸盐。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述小分子有机物类抑制剂包括氨基苯并噻唑类抑制剂、二芳基马来酰亚胺类抑制剂、二芳基脲类抑制剂、喹唑啉类抑制剂、异喹啉磺酰胺类抑制剂、吡啶并咪唑类抑制剂和十字孢碱类抑制剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述氨基苯并噻唑类抑制剂为GSK'872。

9.抑制Rip3基因表达的试剂和抑制Mlkl基因表达的试剂在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用。