KR102392587B1 - 퇴행성 관절염 진단용 바이오마커 - Google Patents

퇴행성 관절염 진단용 바이오마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 퇴행성 관절염 진단용 바이오마커로서 TRIM24와 RIP3의 신규한 용도에 관한 것으로, 본 발명에서는 퇴행성 관절염 발병 초기에 TRIM24 발현이 감소하고, 이에 따라 RIP3 발현이 증가하는 경향을 확인함으로써, TRIM24 및 RIP3가 퇴행성 관절염 진단용 바이오마커로 활용될 수 있음을 최초로 규명하였다. 이들 두 단백질은 퇴행성 관절염 발병 초기부터 발현양 변화를 확인할 수 있어, 퇴행성 관절염의 조기 진단을 가능하게 하여, 퇴행성 관절염의 진행을 조기에 차단할 수 있는 효과가 있다.

Description

퇴행성 관절염 진단용 바이오마커 {Biomarkers for diagnosing osteoarthritis}
본 발명은 퇴행성 관절염 진단용 바이오마커에 관한 것으로, 더 상세하게는 TRIM24 및/또는 RIP3의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성 관절염 진단용 조성물과 치료 적용에 대한 가이드를 제공하는 것에 관한 것이다.
퇴행성 관절염 (osteoarthritis, OA)은 주로 연골 형성 (cartilage ECM synthesis) 억제 및 연골조직 파괴(cartilage destruction) 촉진으로 오는 퇴행성관절 질환이다. 노화와 관련된 많은 병인학적 위험 인자들과 병리생리학적 과정들이 퇴행성 관절염의 진행에 기여한다. 관절 불안정성과 손상을 포함한 기계적 스트레스 및 퇴행성 관절염에 걸리기 쉽게 하는 노화 관련 인자들이 잠재적인 퇴행성 관절염 야기 기작들이다. 이러한 인자들은 다양한 이화 및 동화 인자들을 생산하는 독특한 세포 타입인 연골세포 내 생화학적 경로들의 활성화로 인해 Mmp(Matrix metalloproteinase)에 의한 ECM (extracellular matrix)의 분해, 그리고 연골세포의 탈분화(dedifferentiation) 및 아팝토시스 (apoptosis)를 통한 ECM 합성의 중단을 초래한다 (Pelletier JP et al, Arthritis Rheum, 44:1237-47, 2001). 특히, 관절을 이루고 있는 연골 조직은 한번 손상되게 되면 정상적으로 생체 내에서 재생이 되지 않는다. 이러한 관절의 연골조직이 손상될 경우 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 되며, 만성화될 경우 치명적인 퇴행성 관절염을 유발하게 되어 정상적인 생활이나 직업적인 활동을 방해하게 된다.
이처럼, 관절 연골의 파괴를 특징으로 하는 퇴행성 관절염은 기계적 스트레스로 인한 동화 및 이화 인자 불균형에 의해 발생하고, 이러한 인자들이 연골 세포의 생화학적 경로를 변경하고 세포 외 기질 (ECM)을 생성하는 능력을 감소시키며 이화 작용 기질 분해 효소를 통해 ECM 분자를 분해하여 염증 반응을 유발하게 된다. 많은 자료에서 연골 세포의 사멸(chondrocyte death)이 퇴행성 관절염 병인과 관련되어 있음을 시사하고 있다 (Ryu JH, et al. Cell Death Differ 2012;19(3):440-50; Thomas CM, F et al. Osteoarthritis Cartilage 2007;15(1):27-34.) 아폽토시스(apoptosis)는 type II 콜라겐 또는 기타 ECM 구성 요소를 방출하지 않고 탈분화된 연골세포(dedifferentiated chondrocyte)를 제거하는 것으로 고려되는 반면, 네크롭토시스(necroptosis)는 세포막을 파열시킴으로써 주변 조직에 해로운 영향을 미치는 비교적 최근 알려진 병태 생리학적 세포 사멸 형태이다. 네크롭토시스 세포는 강력한 염증 반응을 유발하는 손상 관련 분자 패턴을 방출하고, 아폽토시스에 비해 더 면역원성이 있으며, 염증 반응과 ECM 분해를 촉진한다.
네크롭토시스는 주로 수용체 상호 작용 단백질 키나제 1 (RIP1), RIP3 및 혼합 계통 키나제 도메인 유사 단백질 (mixed lineage kinase domain-like protein , MLKL)에 의해 매개된다. RIP1-RIP3 복합체의 조립 및 활성화는 두 단백질의 키나제 활성에 따라 달라진다. RIP3 활성화는 MLKL의 인산화를 유도하고 이를 세포막으로 이동시켜 파괴한다. 세포 사멸(cell death), 염증, 종양 형성 및 신진 대사에서 RIP3의 복잡한 역할은 조직 손상 매개체와 질병 진행 및 중증도의 순환 마커와 함께 광범위하게 연구되어 왔다. RIP1 및 RIP3 억제는 신장, 뇌 및 심장 허혈성 재관류 손상; 췌장염; 및 아세트 아미노펜 유도 간염 모델을 포함한 수많은 병리학적 마우스 모델의 결과를 개선하는 것으로 보고되었다. 또한 RIP3는 기질인 MLKL과 독립적으로 그리고 의존적으로 작용할 수 있으며, 이는 RIP3 및 MLKL이 조직 특이적 효과를 발휘할 수 있음을 시사한다.
최근에는 RIP3가 MLKL과 무관하게 TLRTRIF-RIP3-IL-1β축을 통해 관절염 발병을 촉진한다고 제안한 바 있고, (Lawlor KE, et al. Nat Commun 2015;6:6282), 또 다른 연구에서는 p55TNFR-IKK2-RIP3 축이 활막 섬유아세포 관절 유발성 및 세포 사멸 반응을 조율한다는 것을 발견한 바 있으나 (Armaka M, et al. Nat Commun 2018;9(1):618), 이는 모두 류마티스 관절염 모델에 기초한 연구로, 연골에서 RIP3의 생리적 및 병리학적 역할은 아직 다루어지지 않았으며 RIP3 매개의 신호조절이 조절이 퇴행성 관절염 발병에 관여하는지 여부에 대한 연구는 전혀 이루어진 바 없다.
본 발명에서는 RIP3가 퇴행성 관절염 병인에 어떻게 관여하는지에 대한 기본 분자 메커니즘을 인간 퇴행성 관절염 연골 샘플과 내측 반월상 연골 (destabilization of the medial meniscus, DMM) 수술 유도 퇴행성 관절염 마우스 모델을 이용하여 연구하였고, 그 결과 퇴행성 관절염이 발병하고 진행됨에 따라 RIP3 발현의 조절 인자인 TRIM24의 발현이 감소되고, 이로 인해 RIP3 발현이 증가한다는 것을 관찰하였으며, 특히 RIP3의 발현이 증가하고 TRIM24의 발현이 감소되는 시점이 관절이 파괴되는 시점으로 서로 역 상관이 있음을 본 발명을 통해 규명하여, TRIM24 및 RIP3가 퇴행성 관절염의 조기 진단용 바이오마커로 사용 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Pelletier JP et al, Arthritis Rheum, 44:1237-47, 2001 Ryu JH, et al. Cell Death Differ 2012;19(3):440-50. Thomas CM, F et al. Osteoarthritis Cartilage 2007;15(1):27-34. Lawlor KE, et al. Nat Commun 2015;6:6282 Armaka M, et al. Nat Commun 2018;9(1):618
본 발명은 퇴행성 관절염 진단용 바이오마커로서 TRIM24와 RIP3의 신규한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TRIM24 및/또는 RIP3의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성 관절염 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 관절염 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 후보 물질을 세포에 처리하는 단계; 및
(b) 세포에서 TRIM24의 발현을 증가 및/또는 RIP3의 발현을 감소시키는 물질을 퇴행성 관절염 예방 또는 치료 물질로 선별하는 단계.
본 발명에서는 퇴행성 관절염 발병 초기에 TRIM24 발현이 감소하고, 이에 따라 RIP3 발현이 증가하는 경향을 확인함으로써, TRIM24 및 RIP3가 퇴행성 관절염 진단용 바이오마커로 활용될 수 있음을 최초로 규명하였다. TRIM24는 발병초기에 서서히 발현이 감소함으로써 병의 진행을 예측할 수 있고, 이와 반대로 RIP3는 증가하여 병의 진행 정도를 예측할 뿐 아니라 RIP3 활성 조절을 통한 치료 가능성을 제시하고 있다. 이들 두 단백질은 퇴행성 관절염 발병 초기부터 발현양 변화를 확인할 수 있어, 퇴행성 관절염의 조기 진단을 가능하게 하여, 퇴행성 관절염의 진행을 조기에 차단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 연골세포에서 MLKL 발현이 검출되지 않음을 나타낸다. (A) 조직 RIP1, RIP3 및 MLKL 발현 패턴을 보여주는 단백질 아틀라스 데이터 (Protein Atlas에서 수정됨). (B) 다양한 조직 샘플에서 네크롭토시스 조절 인자의 발현 수준. 단백질 추출물은 웨스턴 블롯팅으로 분석함 (상단 패널). 웨스턴 블로팅의 정량화 (하단 패널). (C) 도 2A의 웨스턴 블로팅 결과의 정량화 (n = 3). (D) 연골 세포를 M2 버퍼, Laemmli SDS 버퍼 (L), RIPA 버퍼 (R) 또는 초음파 처리와 함께 RIPA 버퍼 (R+So)에 용해하였다. 용 물은 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. Vimentin은 불용성 단백질 검출에 대한 양성 대조군으로 사용되었다 (n = 3). (E) 연골 세포를 MG132, CQ 또는 10mg/mL의 E64d + 10mg/mL 펩스타틴 A로 6 시간 동안 처리하고 세포 용해물을 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. NIK 및 LC3II는 각각 프로테아좀 및 리소좀 의존적 분해를 차단한 대조군이다 (n = 3). (F) 도 2B의 웨스턴 블로팅 결과의 정량화 (n = 3). (G) MEF 및 연골 세포를 TSZ (TNF + zVAD + SMAC 모방체)로 지정된 시간 동안 처리하고 세포 용해물을 웨스턴 블롯팅 (n = 3)으로 분석함. (H) MEF 및 연골 세포를 TSZ (TNF + zVAD + SMAC 모방체)로 처리하고 세포 용해물을 웨스턴 블 롯팅으로 분석함 (왼쪽 패널) (n = 3). MEF와 연골 세포를 지정된 시간 동안 TSZ로 처리하고 MTT 분석 또는 위상차 현미경으로 세포 독성을 분석함 (중간). TNF로 유도된 세포 사멸을 LDH 분석법으로 분석함 (오른쪽). 값은 평균 ± SEM으로 표시함. two-tailed t-test을 사용하여 통계 분석을 수행함.
도 2는 연골 세포에서 RIP3의 비-정규적(non-canonical) 역할이 퇴행성 관절염 병인과 관련이 있음을 보여준다. (A) 연골 세포에서 네크롭토시스 발현 수준을 나타냄. (A) 연골 세포에서 괴사 조절제의 발현 수준. 야생형 및 MLKL 녹아웃 MEF, 골수 유래 단핵구 (BMDM), 대식세포, 연골 조직 및 일차 마우스 관절 연골 세포에서 추출한 단백질을 웨스턴 블로팅으로 분석함 (n = 3). (B) MEF 및 연골 세포를 TSZ (TNF + zVAD + SMAC 모방체)로 처리하고 세포 용해물을 웨스턴 블로팅으로 분석함 (n = 3). (C) Alcian blue, Safranin O 및 RIP3, p-MLKL 및 MLKL 면역 염색 (n = 5)으로 염색된 비손상 및 손상된 인간 연골. 스케일 바 : 100 μm. (D) qPCR에 의해 측정된 비손상 및 손상된 인간 퇴행성 관절염 연골에서의 RIP3 발현 (n = 5). 값은 평균 ± SEM으로 표시됨. two-tailed t-tests을 사용하여 통계 분석을 수행함. (E) 표시된 MOI에서 Ad-C (대조군) 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포에서 RIP3, p-RIP3, MLKL 및 p-MLKL의 웨스턴 블로팅 분석 (n = 3). (F) 대조군과 비교하여 처리된 세포에서의 RIP3 관련 유전자(표 3에 나열됨)의 GSEA 분석.
도 3은 상승된 RIP3 발현이 연골 세포에서 퇴행성 관절염 병인 관련 유전자 발현 패턴과 상관 관계가 있음을 보여준다. (A) 표시된 각 단백질의 상대적 발현 수준은 도 2C에 나타난 인간 비손상 및 손상된 연골의 면역 조직 화학으로부터 결정되었다(n = 5). (B) 도 2E의 웨스턴 블로팅 결과의 정량화 (n = 3). (C) Ad-Rip3- 및 Ad-C- 감염된 RIP1-/-MEF 및 Flag-RIP3 형질 감염된 MEF에서 네크롭토시스 조절 인자의 웨스턴 블로팅 분석 (n = 3). (D) Ad-C 또는 Ad-Rip3에 감염된 연골 세포에서 RIP3 및 p-RIP3의 웨스턴 블로팅 (왼쪽) 및 유전자 발현 (오른쪽) 분석. Ad-Rip3 및 Ad-C-감염된 연골 세포 사이에서 차등 발현된 (differentially expressed) 유전자 (DEG)는 폴드 변화(Fold change, FC)> 3을 사용하여 선택되었음. 상위 10 개의 상향 조정된 DEG (Up-DEG) 및 상위 10 개의 퇴행성 관절염 관련 Up-DEG는 RIP3 과발현으로 나열함 (중간). Functional annotation은 Up-DEG에서 상당히 강화되었다. MSigDB (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)에서 hallmark gene annotation을 사용하여 hypergeometric tests를 수행하고 -log10 (q-value)으로 정의된 농축 점수를 산출하였다. Ad-C 또는 Ad-Rip3 (오른쪽)에 감염된 연골 세포에서 Mmp3의 RT-PCR 분석. (E) Up-DEG에서 상당히 풍부한 functional terms. Functional annotation은 MSigDB의 큐레이트된 유전자 세트 (C2)에서 얻음. 값은 평균 ± SEM으로 표시됨. two-tailed t-test을 사용하여 통계 분석을 수행함.
도 4는 RIP3 발현의 변화(modulation)가 퇴행성 관절염과 상관관계가 있음을 보여주는 것이다. 표시된 MOI 에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포(n = 5)에서 RIP3, MMP3, MMP13 및 COX2의 (A) RT-PCR (왼쪽) 및 qPCR (오른쪽), (B) 웨스턴 블로팅 분석 결과. (C) Ad-Rip3에 감염된 연골 세포(n = 5)에서 Adamts4, Adamts5, aggrecan 및 Col2a1의 qPCR 분석. (D) 연골 세포 (n = 5)에서 Ad-Rip3 감염에 의한 아그레카나제 (왼쪽) 및 콜라게나제 (오른쪽) 활성. (E) Safranin-O 염색, OARSI 등급, 골극 형성 및 연골하 골판 두께로 평가된 Ad-C 및 Ad-Rip3가 관절 내로 주입된 마우스 무릎 관절의 연골 파괴 및 퇴행성 관절염 발달 (n = 9). (F) Ad-C- 또는 Ad-Rip3 주입된 연골에서 RIP3, MMP3, MMP13, COX2, MLKL 및 p-MLKL 면역 염색. 통계 분석은one-way ANOVA with Bonferroni's test (A, C 및 D), nonparametric Mann-Whitney U tests (E, OARSI 등급, 골조직 형성)와 two-tailed t-tests(E, 연골 하골판)로 수행함. 스케일 바 : 100 μm
도 5는 상승된 RIP3 발현이 연골 세포 세포 사멸을 유도하지 않음을 보여준다. 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3으로 감염된 연골 세포(n = 5)에서 표시된 단백질 또는 전사체 수준에 대한 (A) 도 2B의 웨스턴 블라팅 결과의 상대적 발현양 (B) 및 RT-PCR 분석. 표시된 단백질의 상대적 발현 수준은 (C) 도 4F에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3 주사 연골에서 면역 조직 화학 또는 (D) 도 6B 에서 DMM 작동 WT 또는 Rip3 KO 마우스의 연골 (n = 9)로부터 결정됨. (E) 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포에서 LDH 분석 또는 위상차 현미경으로 세포 세포 독성을 분석함. 대조군 MEF는 표시된 시간 동안 TSZ로 처리하고 LDH 분석 또는 위상차 현미경으로 세포 세포 독성을 분석함. (F) 아폽토시스 유도 조건, TC (TNF 30 ng/mL + 시클로헥시미드, CHX 1 mg/mL) 하에서 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포의 아폽토시스 관련 단백질 패턴 분석. 연골 세포는 또한 RIP3 과발현없이 TC로 처리되었고, 세포 용해물은 웨스턴 블로팅으로 분석되었음. (G) 연골 세포 및 RIP3 과발현 연골 세포에서 TNF- 유도된 다운스트림 신호. 세포를 지정된 시간 동안 TNF로 처리하고 웨스턴 블로팅으로 세포 용해물을 분석함. 값은 평균±SEM으로 표시되고 one-way ANOVA with Bonferroni's test (A 및 D) 또는 a two-tailed t-test(C)로 평가됨
도 6은 Rip3 녹아웃 마우스에서 감소된 퇴행성 관절염 병인을 나타낸다. (A 및 B) WT 및 Rip3 녹아웃 마우스에 수술 DMM (n = 9)을 적용하였다. 연골 파괴는 Safranin-O 염색, OARSI 등급, 골극 형성, 연골하 골판 두께 (A) 및 RIP3, MMP3, MMP13, COX2, MLKL 및 p-MLKL 면역 조직 화학 염색 (B)에 의해 평가되었다. 값은 표시된 수의 독립된 실험의 표준 ± 표준편차로 표현된다. 통계 분석은 one-way ANOVA with Bonferroni's test (A), a non-parametric Mann-Whitney U test (A, OARSI 등급 지정, 골극 형성), 또는 two-tailed t-test (A, 연골하 골판 두께)로 수행됨. 스케일 바 : 100 μm.
도 7은 RIP3 과발현은 음성 조절 인자(regulator)인 TRIM24를 통해 유전자 발현 패턴을 변경함을 보여준다. 마이크로어레이 데이터에 기반한 업스트림 조절 인자를 예측하기 위하여 Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software (QIAGEN, https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuitypathway-analysis)로 전사체 조절 인자를 분석하였다. 분석된 데이터는 활성화 Z-스코어 > 1 또는 < -1로 필터링되었으며, 분석된 샘플에서 조절 인자가 발현될 필요는 없었다. (B) MEF 및 (C) 연골 세포는 표시된 MOI의 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염시켰다. 세포 용 해물은 웨스턴 블로팅 (왼쪽) (n = 3) 및 qPCR (오른쪽) (n = 4)에 의해 분석되었다. (D) Ad-C 또는 Ad-Rip3으로 감염된 연골 세포 (n = 3)에서 RIP3, p-RIP3 및 TRIM24의 웨스턴 블롯 분석(왼쪽). Ad-C 또는 Ad-Rip3으로 감염된 연골 세포 (n = 4)에서 Rip3 및 Trim24의 qPCR 분석(오른쪽). 값은 평균±표준편차로 표현함. two-tailed t-test를 사용하여 통계 분석을 수행함.
도 8은 TRIM24 하향 조절이 퇴행성 관절염 관련 유전자 발현을 유도하는 것을 보여준다. (A) 도 7B, (B) 도 7C, (C) 도 7D에 따른 웨스턴 블로팅 결과의 정량화 (n=3). (D) 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA에 감염된 MEF에서 TRIM24, RIP3 및 COX2의 웨스턴 블로팅 분석 (n = 3) (왼쪽). 3 회의 독립적인 실험을 기반으로 평균±표준편차로 나타낸 웨스턴 블로팅 결과의 정량화 (중간). Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 MEF에서 Mmp3, Mmp13 및 Cox2의 qPCR 분석 (n = 4) (오른쪽). (E) 표시된 MOI의 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 연골 세포 (n = 5)의 도 9B의 웨스턴 블로팅으로부터 표시된 단백질의 상대적 발현 수준은 결정되었음. (F) 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 연골 세포에서 위상차 현미경 (왼쪽)으로 세포 세포 독성을 분석함.. Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 연골 세포에서 Rip3, Mmp3, Cox2 및 Trim24의 qPCR 분석 (오른쪽) (n = 9). 값은 평균±표준편차로 표현되었고, 통계 분석은 two- tailed t-test (A-D) 또는 one-way ANOVA with Bonferroni's test (E)로 수행하였다.
도 9는 TRIM24가 RIP3 발현의 업스트림 조절 인자임을 보여준다. 표시된 MOI의 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 연골 세포(n = 5)에서 TRIM24, RIP3, MMP3 및 COX2의 (A) RT-PCR (왼쪽), qPCR (오른쪽) 및 (B) 웨스턴 블롯 분석. Safranin-O 로 염색된 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA를 관절 내 주사한 WT 마우스의 무릎 관절 연골 (n = 9)에서, (C) 연골 파괴, 골조직 형성 및 연골하 골 두께를 스코어링으로 평가하고, (D) Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA가 주입 된 연골에서의 TRIM24, RIP3, MMP3, MMP13 및 COX2을 면역 염색함. (E) 표시된 단백질의 상대적 발현 수준은 DMM 수술 후 2 주마다 연골의 면역 조직 화학으로부터 결정되었음 (n = 9). 값은 평균으로 표현되었으며, 데이터는 one-way ANOVA with Bonferroni's test (A), non-parametric Mann-Whitney U test (C; OARSI 등급, 골극 형성) 또는 two-tailed t-test (C; 연골 하 골판 두께)을 사용하여 분석하였음. 스케일 바 : 100 μm.
도 10은 TRIM24와 RIP3의 발현이 DMM에 의해 유도된 퇴행성 관절염 모델에서 역 상관 관계가 있음을 보여준다. (A) 도 9D에 따른 표시된 MOI에서 Ad-C 또는 Ad-Trim24 shRNA로 감염된 연골 세포 (n = 9)의 면역 조직 화학으로부터 표시된 단백질의 상대적 발현 수준이 결정되었다. (B 및 C) WT 마우스는 연골 파괴를 유도하기 위해 DMM 수술을 받았다 (n = 5). (B) 퇴행성 관절염 증상은 OARSI 점수를 사용하고 골조직 및 연골하 골 형성을 평가하여 점수를 매겼다. (C) 도 9E에 따른 DMM 수술 연골의 면역 조직 화학으로부터 표시된 단백질의 상대적 발현 수준이 결정되었다. 값은 표준±표준편차로 표현되었으며, 데이터는 two-tailed t-test (A) 또는 one-way ANOVA with Bonferroni's test (B 및 C)를 사용하여 분석되었다.
도 11은 AZ-628이 RIP3 키나제 활성을 약화시키고 RIP3 매개 퇴행성 관절염 병인을 감소시킴을 보여준다. (A) CMap 접근법을 사용한 인 실리코 약물 스크리닝의 개략도 및 상위 10 개 예측 화합물. (B) AutoDock Vina를 사용한 AZ-628, 네라티닙 및 셀루메티닙의 RIP3에 대한 결합 친화도 분석. (C) 표시된 용량의 AZ-628, 셀루메티닙 또는 네라티닙의 존재/부재에서 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포에서 RT-PCR (상단) 및 웨스턴 블로팅 (하단)에 의해 결정된 MMP3, MMP13 및 COX2 발현 (n=5). (D) AZ-628에 의한 RIP3 키나제 활성의 억제. 연골 세포는 아데노 바이러스 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염되었고 GSK'872, AZ-628 및 HS-1371로 처리되었음. 세포 용해물은 웨스턴 블로팅 (n = 3)에 의해 분석됨. (E) (C)와 동일한 조건에서 Mmp3의 qPCR 분석 (n = 9). (F) LDH 방출 분석을 사용하여 평가된 세포 독성 (n = 6). (G) RIP3 매개 퇴행성 관절염 및 AZ-628의 억제 효과의 다이어그램. 값은 평균 ± SEM으로 표시되며, two-tailed t-tests를 사용하여 통계 분석을 수행함.
도 12는 RIP3 키나제 활성을 조절하기 위한 새로운 억제제 선별을 나타낸다. (A) PubChem로부터 억제제 분자의 3D 구조. (B) LDH 분석에 의해 검출된 연골 세포 생존력에 대한 AZ-628, 셀루메티닙 및 네라티닙의 효과 (n = 5). (C 및 D) 표시된 용량의 AZ-628, 셀루메티닙 및 네라티닙의 존재 또는 부재하에 Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포(n = 5)에서 표시된 단백질의 상대적 발현 수준을 (C) qPCR 및 (D) 도 11C의 웨스턴 블로팅 결과 확인함. 데이터는 one-way ANOVA with Bonferroni's test를 사용하여 분석하였다.
도 13은 AZ-628이 RIP3 매개 퇴행성 관절염 병인의 강력한 억제제로 작용함을 보여준다. (A) RIP3을 사용한 14 개 화합물의 결합 친화성 분석. (B) RIP3 및 소분자에 대한 컴퓨팅 도킹 모델. (C) 도 11D의 웨스턴 블로팅의 정량화 결과 (n = 3). (D) Ad-C 또는 Ad-Rip3 에 감염된 연골 세포에서 Rip3, Cox2 및 Mmp3 발현의 qPCR 분석 (n = 9). (E) Ad-C 또는 Ad-Rip3로 감염된 연골 세포에서 웨스턴 블 롯팅 (왼쪽) 및 위상차 현미경 (오른쪽)에 의해 평가된 세포 독성. (F) RIP3 키나제 도메인에 결합하는 AZ-628 또는 포스페이트의 다이어그램. 값은 평균±표준편차로 표현되고, 통계 분석은 two-tailed t-test로 수행하였음.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
관절염은 크게 비 염증성 관절염과 염증성 관절염으로 나눌 수 있는데, 비염증성 관절염으로는 골 관절염 (퇴행성 관절염, osteoarthritis, OA)을 들 수 있고, 염증성 관절염으로는 류마티스 관절염을 대표적으로 들 수 있다.
퇴행성 관절염은 일명 골관절염이라고도 불리며, 발병원인은 아직 분명하지 않지만, 유전, 외상, 비만, 노화, 대사이상 등과 같은 다양한 유발인자들이 이에 관여한다고 알려져 있다. 이러한 인자들에 의해 연골세포에서 공격인자와 방어인자 간의 균형이 깨지게 되고, 연골조직 파괴 촉진 및 연골 마모가 심화되면서 골관절염에 특징적인 병리학적 변화로 인해 환자는 통증을 느끼게 되고, 관절운동에 제한이 생긴다고 보고되어 있다.
반면, 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis, RA)의 경우, 연골세포 및 연골조직 파괴로 인해 유발되는 퇴행성 관절염과는 달리, 자가면역반응에 의한 질환의 진행이 중요한 원인 인자로 알려져 있다. 류마티스 관절염은 활막 세포의 염증과 증식을 특징으로 하는, 만성 자가면역 질환 (autoimmune diseases)으로서, 퇴행성 관절염과 달리 관절 주위 뼈의 골다공증 및 골미란 등이 발생한다. 류마티스 관절염은 활막 (synovial membrane)의 염증이 관절막 (joint capsule)과 인대 (ligament), 건 (tendon)으로 퍼지고, 뼈로 침범하여 진행되게 된다. 따라서, 퇴행성 관절염과 류미티스 관절염은 그 발병 원인 및 진행단계가 전혀 상이하며, 이에 대한 치료 방법도 상이하다.
본 발명에서는 RIP3가 퇴행성 관절염 병인에 어떻게 관여하는지에 대한 기본 분자 메커니즘을 인간 퇴행성 관절염 연골 샘플과 내측 반월상 연골 (destabilization of the medial meniscus, DMM) 수술 유도 퇴행성 관절염 마우스 모델을 이용하여 연구하였고, 그 결과 퇴행성 관절염이 발병하고 진행됨에 따라 RIP3 발현의 조절 인자인 TRIM24의 발현이 감소되고, 이로 인해 RIP3 발현이 증가되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, TRIM24 및/또는 RIP3의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성 관절염 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 TRIM24는 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 RIP3는 서열번호 28의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 TRIM24에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 압타머; 및/또는 RIP3에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 압타머인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 TRIM24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 및/또는 RIP3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 관절염 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 PCR 분석용, 면역분석용(immunoassay) 또는 마이크로어레이 키트인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다:
(a) 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 후보 물질을 세포에 처리하는 단계; 및
(b) 세포에서 TRIM24의 발현을 증가 및/또는 RIP3의 발현을 감소시키는 물질을 퇴행성 관절염 예방 또는 치료 물질로 선별하는 단계.
본 발명의 용어 "퇴행성 관절염 (osteoarthritis, OA) 및 "골 관절염"은 혼용하여 사용되며, 동일한 의미로 이해되어야 할 것이다.
본 발명의 일 양태에서 TRIM24 및/또는 RIP3의 발현 또는 활성 수준은 생물학적 시료에서 측정할 수 있는데, 본 발명에 사용되는 용어 "생물학적 시료"는 인체로부터 얻어지는 모든 시료, 예컨대, 연골(특히, 관절연골)의 세포 또는 조직, 오줌, 타액, 혈액, 혈장 또는 혈청 시료를 의미하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서는 퇴행성 관절염이 의심되는 객체로부터 분리된 연골 조직 샘플 또는 연골 조직에서 분리된 체액 샘플을 생물학적 시료로 사용하는 것이 바람직하며, 퇴행성 관절염에 의해 손상된 것으로 의심되는 연골 조직 샘플 또는 연골 조직에서 분리된 체액을 생물학적 시료로 사용하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 퇴행성 관절염 상태의 동정, 관절염의 단계 결정 또는 치료에 대한 퇴행성 관절염의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예후"는 질병의 진행 가능성 과정, 특히, 질병의 차도, 질병의 재생, 관절염 재발 측면에서의 예측을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 예후는 퇴행성 관절염 환자의 질병이 완치될 가능성을 의미한다.
본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법, 재조합 DNA 방법 또는 파아지 항체 라이브러리 방법에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 공지되어 있으므로 자세한 설명은 생략하지만, 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어질 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다
본 발명을 항체 또는 압타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 퇴행성 관절염을 진단하는 데 이용될 수 있다.
이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 이러한 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.
본 발명이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시 양태는 분석하고자 하는 미지의 생물학적 시료의 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 1단계; 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 분해물을 반응시키는 2단계; 상기 2단계 의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 3단계; 및 상기 효소의 활성을 측정하는 4단계를 포함할 수 있다.
여기서, 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF (enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민 (OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT (nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
본 발명이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시양태는 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 1단계; 포획항체와 시료를 반응시키는 2단계; 상기 2단계의 결과물의 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, TRIM24 및/또는 RIP3에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 각각 반응시키는 3단계; 및 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 4단계를 포함할 수 있을 것이다.
여기서, 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질 (예컨대, 바이오틴), 효소 (알칼린 포스파타아제, β갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질 (예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET (fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다
이러한 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 압타머를 이용할 수 있다. 압타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 압타머의 일반적인 내용은 공지되어 있으므로 상세한 설명은 생략한다.
상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 퇴행성 관절염을 진단할 수 있다. 즉, 생물학적 시료에서 RIP3 단백질이 고발현되는 경우, 시그널이 정상 생물학적 시료(예컨대, 관절연골 세포 또는 조직, 혈액, 혈장 또는 혈청) 보다 강하게 나오는 경우, 특히 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 80% 이상 또는 100% 이상 강하게 나오는 경우에는 퇴행성 관절염으로 진단될 수 있다.
반대로, 생물학적 시료에서 TRIM24 단백질이 저발현되는 경우, 시그널이 정상 생물학적 시료(예컨대, 관절연골 세포 또는 조직, 혈액, 혈장 또는 혈청) 보다 약하게 나오는 경우, 특히 검출되는 강도가 정상 대조군에 비해 70% 이하, 바람직하게는 50% 이하, 보다 바람직하게는 30% 이하, 20% 이상 또는 10% 이하로 약학게 나오는 경우에는 퇴행성 관절염으로 진단될 수 있다.
이와 같은 TRIM24 및 RIP3 발현량 변화는 퇴행성 관절염 유발 후 4주에 관찰이 가능하기 때문에, 6주부터 발현양이 증가하는 MMP3, MMP13 및 COX2로 인해 퇴행성 관절염 발병을 진단하는 것에 비해 진단 시기를 현저히 앞당길 수 있으며, 조기 진단에 유리하게 활용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 마이크로어레이용 조성물인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 조성물이 유전자 증폭용 조성물인 경우에는 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 프라이머 또는 프로브는 TRIM24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 및/또는 RIP3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브로서, 각각 RIM24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 또는 RIP3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적인 서열을 갖는다. 본 발명에서 사용되는 용어 "상보적(complementary)"은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 "상보적"은 용어 완전 상보적 (perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 조성물이 포함된 마이크로어레이에 있어서, 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체 (substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다. 한편, 본 발명의 조성물이 포함된 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로 어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
본 발명의 퇴행성 관절염 진단 또는 예후부석용 조성물이 포함된 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.
상술한 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 퇴행성 관절염 여부를 판단할 수 있다. 프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단 (예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생물학적 시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있으며, 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 예를 들어, 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃조건으로 세척하는 것을 의미한다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제 (예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스레드 시약 (10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di[3-ethyl benzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다.
따라서 본 발명의 퇴행성 관절염 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 1단계; 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 퇴행성 관절염 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 RIP3 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 관절연골의 조직 또는 세포)보다 강하게 나오는 경우, 특히 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상, 보다 바람직하게는 3배 이상으로 강하게 나오는 경우에는 퇴행성 관절염으로 진단된다. 또한, 시료에서 TRIM24 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 관절연골의 조직 또는 세포)보다 약하게 나오는 경우, 특히 특히 1/2 이하, 바람직하게는 1/3 이하, 보다 바람직하게는 1/5 이하로 약하게 나오는 경우에는 퇴행성 관절염으로 진단된다.
본 발명의 퇴행성 관절염 진단 또는 예후분석용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있는데, 용어"증폭"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다.
따라서 본 발명은 원칙적으로 생물학적 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.
mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다. 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다. 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한 것 일 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소일 수 있다. 중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수도 있다. 본 발명에서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
이렇게 증폭된 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 생물학적 시료에서 RIP3 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(예컨대, 정상 관절 연골 세포 또는 조직, 혈액, 혈장 또는 혈청)보다 높게 나오는 경우, 특히 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상, 보다 바람직하게는 3배 이상 높게 나오는 경우에는 퇴행성 관절염으로 진단된다. 또한, 생물학적 시료에서 TRIM24 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현이 정상 시료(예컨대, 정상 관절 연골 세포 또는 조직, 혈액, 혈장 또는 혈청)보다 낮게 나오는 경우, 특히 1/2 이하, 바람직하게는 1/3 이히, 보다 바람직하게는 1/5 이하로 낮게 나오는 경우에는 퇴행성 관절염으로 진단된다.
따라서 본 발명의 관절염 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 1단계; 및 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 마커는 퇴행성 관절염에서 발현양이 현저히 변화되는 생체 분자이다. 이러한 마커의 발현양의 변화는 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "고발현"은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 높은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, RIP3 마커가 정상세포 또는 조직과 비교하여 1.5-10 배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서 퇴행성 관절염으로 판정할 수 있다. 반대로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "저발현"은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 낮은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 낮은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, TRIM24 마커가 정상세포 또는 조직과 비교하여 1/2-1/50 배 정도 저발현 되는 경우, 본 발명에서 퇴행성 관절염으로 판정할 수 있다.
본 발명에 있어서, TRIM24는 정상 조직에서 발현되나, 퇴행성 관절염이 발병되었거나 진행되는 조직에서 연골이 파괴됨에 따라 더 이상 발현되지 않거나 그 발현양이 감소되는 것을 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, RIP3는 정상 조직에서 발현되지 않거나 그 발현양이 미미하나 퇴행성 관절염이 발병되었거나 진행되는 조직에서 연골이 파괴됨에 따라 발현되거나 그 발현양이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 RIP3는 정상 조직에서 그 활성이 없거나 매우 약하나 퇴행성 관절염이 발병되었거나 진행되는 조직에서 연골이 파괴됨에 따라 그 활성이 확인되거나 그 활성이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에 있어서 RIP3 발현양 또는 활성이 증가함에 따라 퇴행성 관절염의 진행 단계를 파악할 수 있을 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 퇴행성 관절염에 의해 손상된 연골 조직의 TRIM24 발현양은 정상 객체 또는 비손상 조직에 비해 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상 감소된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 퇴행성 관절염에 의해 손상된 연골 조직의 RIP3 발현양 또는 활성은 정상 객체 또는 비손상 조직에 비해 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상 증가된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 정상 객체에서는 TRIM24 발현이 명확히 확인되나, 퇴행성 관절염에서는 TRIM24 거의 발현되지 않거나 발현양이 현저히 감소하는 것으로, 해당 발현양 감소는 당업자가 용이하게 식별 가능한 정도일 것이다.
또한, 본 발명에 있어서, 정상 객체에서는 RIP3 발현이 확인되지 않거나 미미한 정도에 불과하나, 퇴행성 관절염에서는 RIP3 발현양이 확인되거나 미미한 정도가 현저히 증가하는 것으로, 해당 발현양 증가는 당업자가 용이하게 식별 가능한 정도일 것이다.
본 발명에서는 퇴행성 관절염 마우스 모델에서 TRIM24 및 RIP3의 발현양을 검출하였으나, 인간 TRIM24 및 RIP3의 검출에 적합한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 압터머, 프라이머 또는 프로브를 사용하는 경우, 인간에서 퇴행성 관절염을 진단할 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 인간 TRIM24 및 RIP3의 검출에 적합한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 압터머, 프라이머 또는 프로브는 해당 유전자 또는 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 것이라면 제한없이 사용할 수 있을 것이다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명 할 것이다.
실시예 1. 실험방법
1-1. 인간 퇴행성 관절염 샘플 및 실험 퇴행성 관절염 마우스 모델의 제작
인간 연골 샘플은 무릎 관절 전체 치환술(total knee arthroplasty)을 받은 63 ~ 80 세의 개인에게서 얻었다 (표 1). 모든 환자는 서면 동의서를 제출하였고, 샘플 수집은 가톨릭대학교의 IRB에 의해 승인되었다(UC14CNSI0150).
수컷 C57BL/6 및 Rip3-/-마우스 (C57BL/6; Dr. VM Dixit, Genentech, San Francisco, USA)는 아주 대학교 실험실 동물 연구 센터에서 모든 동물 절차를 승인한 Institutional Animal Care and Use Committee의 가이드라인에 따라 유지하였다.
Figure 112020098373602-pat00001
실험 퇴행성 관절염 모델을 생산하기 위해, 12 주령 수컷 마우스를 수술 DMM에 적용하고 수술 후 10 주에 희생시켰다. 암컷 마우스는 퇴행성 관절염 병인에 대한 여성 호르몬의 영향 때문에 사용에서 배제하였다. 관절 내 주사를 위한 아데노바이러스는 Vector Biolabs (Malvern, USA)에서 구입하였다: Ad-C (1060), Ad-Rip3 (ADV-270614) 및 Ad-shRNA Trim24 (shADV-274975). 야생형 마우스에 아데노바이러스 (1 x 109 PFUs/10 μL)를 매주 2 회 무릎 관절에 주사하고 첫 번째 아데노 바이러스 주사 후 3 주 후에 희생시켰다.
1-2. 일차 마우스 관절 연골 세포의 분리 및 세포 배양
마우스 관절 연골세포는 출생 후 5일 째 ICR 마우스의 연골에서 분리하고, 단백질 분해 효소와 콜라게나제로 효소적으로 분해한 후, 10 % FBS, 100 units/mL의 페니실린 및 100ug/mL의 스트렙토마이신이 보충된 DMEM (Capricorn science GmbH; Hessen, Germany)에서 유지시켰다. 3일째, 세포 (4.25 x 105 세포/웰)를 아데노 바이러스로 감염시키거나 재조합 단백질로 처리하였다. Mlkl+/+ 및 Mlkl-/- MEF는 10 % FBS 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 유지시켰다.
1-3. 시약
항체는 Enzo Biochem (New York, USA; RIP3), BD-Transduction Laboratories (Breda, Netherlands; RIP1), Santa Cruz Biotechnology (Dallas, USA; GAPDH, Actin, IκBα, Vimentin), Cell Signaling Technology (Danvers, USA; p-ERK, p-JNK, PARP, Caspase3, p-RIPK1, NIK), Abcam (Cambridge, UK; p-MLKL, p-RIP3, MLKL, TRIM24, COX2, MMP3, MMP13), 및 Sigma-Aldrich (St Louis, USA; LC3B, Vinculin)로부터 구입하였다. TNF-α 및 zVAD는 R&D Systems (Minneapolis, USA)에서 구입하였다. Cycloheximide, Pepstatin A 및 MG132는 Calbiochem (San Diego, USA)에서 구입하였다. Chloroquine diphosphate (CQ) 및 AZ-628은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. GSK'872는 Selleckchem (Houston, USA)에서 구입하였다. Selumetinib은 Abcam에서 구입하였다. Neratinib은 MedChemExpress (Princeton, USA)에서 구입했습니다. HS-1371은 자체 제작하였다 (Park HH, Park SY, Mah S, et al. HS-1371, a novel kinase inhibitor of RIP3-mediated necroptosis. Exp Mol Med 2018;50(9):125).
1-4. 세포 생존력 분석
세포 생존력은 젖산 탈수소 효소 (LDH) 비색 분석 키트 (BioVision (Milpitas, CA, USA))를 사용하여 평가되었다. 연골 세포를 96 웰 디쉬 (1.5 x 104 세포/웰)에 분주하고 24 시간 (5 % CO2, 37℃동안 배양하고 다양한 농도의 AZ-628, 셀루메티닙 및 네라티닙으로 24 시간 동안 처리하였다. 495 nm에서 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 상청액을 분석하였다. 미처리 (100 % 생존) 및 Triton X-100 처리 (0 % 생존) 샘플을 정규화에 사용하였다. 생존율은 다음과 같이 계산하였다:
Figure 112020098373602-pat00002
1-5. 웨스턴 블로팅
세포를 M2 완충액에 용해하고, 마우스 조직은 50mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 50mM NaF, 1 % Tween 20, 0.2 % NP-40 및 프로테아제 저해제로 구성된 용해 완충액에 용해하였다. 동일한 양의 세포 추출물을 SDS-PAGE (6 % 스태킹 겔 및 10 % 러닝 겔)로 분리하고 면역 블롯팅으로 분석했하였다.
1-6. 역전사(RT)-PCR 및 qPCR
총 RNA는 TRIzol 시약 (Molecular Research Center (Molecular Research Center (Cincinnati, OH, USA))을 사용하여 관절 연골 세포에서 추출하고 ImProm-II ™Transcriptase (Promega (Madison, WI, USA))를 사용하여 상보적 DNA (cDNA)로 역전사하였으며 표 2에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR 또는 qPCR로 증폭하였다. qPCR은 SYBR premix Ex Taq (TaKaRa Bio, Kusatsu, Shiga, Japan)를 사용하여 수행하였으며, 결과는 Gapdh로 정규화되고 대조군과 비교한 폴드-변화로 표현하였다.
Figure 112020098373602-pat00003
1-7. 콜라게나제 및 아그레카나제 활성 분석
연골 세포를 6-웰 디쉬 (2 x 105 세포/웰)에 분주하고 Ad-C 또는 Ad-Rip3 아데노바이러스(Ad-C (1060), Ad-Rip3 (ADV-270614), Vector Biolabs (Malvern, USA)) 로 감염시켰다. 세포를 FBS 없는 DMEM에서 36 시간 동안 배양 하였다. 배양 배지를 수집하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 Viva®Columns (Sartorius Stedim Biotech, Gottingen, Germany)을 사용하여 동일한 부피를 농축하였다. 농축된 샘플은 EnzCheck ™Assay kits (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하여 총 콜라게나제 활성에 대해 분석하였다. 콜라게나제 활성은 Ex/Em = 485/530 nm에서 SYNERGY H1 마이크로 플레이트 리더 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 형광 신호로 측정하였다. 아그레카나제 활성은 Aggrecanase Activity Assay Kit (Abnova, Taipei, Taiwan)를 사용하여 분석하였다. 아그레카나제 수준은 제조업체의 프로토콜에 따라 430 nm에서 흡광도를 측정하여 농축된 상청액에서 정량화되었다.
1-8. 조직학 및 면역 조직 화학
인간 퇴행성 관절염 연골과 마우스 무릎 관절을 4 % 파라포름알데히드에 고정하고 파라핀에 포매하였다. 마우스 무릎 관절은 0.5 M EDTA (pH 7.4)에서 2 주 동안 석회화하였다. 파라핀 포매 샘플은 Safranin-O 또는 Alcian blue 또는 면역 염색으로 염색하였다. 연골 파괴는 실험 그룹핑에 대해 알지 못하는 세 명의 관찰자에 의해 실험 퇴행성 관절염 마우스 모델에서 평가되었으며 OARSI (국제 퇴행성 관절염 연구 학회) 등급 시스템 (등급 0-6)에 따라 점수가 매겨졌다. OARSI 점수는 각 마우스에 대한 평균 최대 점수로 제시되었다. 대표적인 Safranin-O 염색 이미지는 각 섹션의 최고 고도 병변(advanced lesions)에서 선택되었으며 이전에 설명한대로 골극 성숙도(osteophyte maturity)를 정량화하였다. 연골하 골 경화증(Subchondral bone sclerosis)은 연골하 골판 두께를 측정하여 결정하였다. MMP3, MMP13 및 MLKL (Abcam), COX2 및 TRIM24 (Proteintech) 및 RIP3 (Enzo Biochem) 항체를 사용하여 인간 및 마우스 연골 절편에서 면역 조직 화학 염색을 수행하였다.
1-9. 마이크로어레이 분석
마우스 관절 연골 세포를 Ad-Rip3 또는 Ad-C (MOI, 800)로 36 시간 동안 감염시켰다. 총 RNA는 TRIzol 시약 (Molecular Research Center)을 사용하여 분리하고 제조업체의 프로토콜에 따라 Affymetrix Mouse GeneChip 2.0 ST Array (Macrogen, Seoul, Korea)로 분석했습니다. 마이크로어레이 데이터는 접근 코드 GSE154669로 유전자 발현 옴니버스에 저장되었다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE154669) (Rip3 용).
1-10. 인 실리코 결합 분석
사용된 리간드의 화학 구조 (도 10A)는 PubChem 데이터베이스 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)에서 검색하였다. 분자 도킹 분석은 단백질-리간드 결합 친화도 및 위치를 결정하는데 널리 사용되는 AutoDock Vina (ver. 1.1.2)를 사용하여 수행되었다. 모든 도킹 분석은 단단한 수용체(rigid receptors)와 완전히 유연한 리간드(fully flexible ligands)로 수행되었다. 수용체 좌표 및 도킹 매개 변수는 AutoDock MGLTools (ver. 1.5.6)를 사용하여 준비하였다. 리간드 결합 친화도는 음의 Gibbs 자유 에너지 (Δ를 사용하여 평가하였다. 도킹 구조는 PyMOL (ver. 1.3; DeLanoScientific, San Carlos, CA, USA)을 사용하여 시각화되었다.
1-11. Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)
GSEA는 Java GSEA 소프트웨어 (ver. 4.0.3; Broad Institute, MIT)를 사용하여 수행되었다. 유전자는 발현에 따라 순위가 매겨졌다. RIP3 과발현 후 상향 조절되거나 하향 조절된 것들을 RIP3 관련 유전자 세트로 선택하였다.
1-12. 통계분석
모든 실험은 4 회 이상 독립적으로 수행되었다. Shapiro-Wilk normality test, Levene's homogeneity of variance test, 및 two-tailed independent t-test를 사용하여 두 개의 독립 그룹을 비교하였다. Shapiro-Wilk test, Levene's test, 및 one-way analysis of variance with Bonferroni's post-hoc test를 이용하여 다수의 비교를 수행하였다. non-parametric Mann-Whitney U tests를 이용하여 서수 등급 시스템(ordinal grading system)을 기반으로 한 데이터를 분석하였다. 0.05 미만의 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 2. RIP3 과발현에 의한 유전자 발현 양상 변화와 퇴행성 관절염과의 연관성
연골 퇴행(cartilage degeneration)에서 네크롭토시스(necroptosis)의 역할을 조사하기 위해 다양한 마우스 조직 샘플에서 RIP3 및 MLKL의 발현 패턴을 조사하였다. RIP3 발현은 조직마다 크게 다르지 않았으나, MLKL 발현은 연골과 (도 1A, 도 1B) 연골에서 우세한 세포 유형인 일차 마우스 관절 연골 세포(primary mouse articular chondrocytes)에서 극히 낮게 나타났다 (도 1C, 도 2A). 낮은 MLKL 발현은 프로테아좀 (MG132)이나 리소좀 (CQ, E64d/Pep A) 억제제가 MLKL 단백질 수준을 변화시키지 않은바, 단백질 불용성, 구성적 단백질 회전율 또는 단백질 안정성 때문은 아니라고 판단되었다 (도 1D, 도 1E). 네크롭토시스 자극(TNFα + zVAD + SMAC mimetic; TSZ)은 MLKL을 인산화하여 네크롭토시스를 유도하는 RIP3를 활성화 할 수 있다. TSZ 처리 후, MLKL 인산화는 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 에서 강하게 검출되었지만 연골 세포에서는 검출되지 않았다 (도 2B; 도 1F, 1G). 한편, TNF는 MLKL의 인산화의 결함으로 인해, 연골세포에서 네크롭토시스를 유도하지 못하였다 (도 1H).
연골에서 RIP3의 가능한 역할을 탐구하기 위하여 본 발명자들은 인간 퇴행성 관절염 비손상 및 손상된 연골 샘플에서 RIP3 발현을 조사하였다. 손상된 퇴행성 관절염 연골에서는 비손상된 샘플에 비해 RIP3 발현이 현저히 높게 나타났으나 (도 2C, 2D; 도 3A), MLKL 및 p-MLKL 발현은 다르지 않았고 검출할 수 없었다. 다음으로, 본 발명자들은 Ad-Rip3에 감염된 일차 마우스 관절 연골 세포에서 RIP3를 이소성으로 (ectopically) 발현시켰다. RIP3 과발현은 네크롭토시스를 유도할 수 있는 MLKL 인산화를 유발하지 않았다 (도 2E; 도 3B). 따라서 퇴행성 관절염 발병에서 RIP3 과발현은 전형적인 네크롭토시스 의존 기능(necroptosis-dependent functions)과 구별될 것이다. 상향 조절된 RIP3 발현은 MLKL 인산화를 통해 RIP1 독립적인 네크롭토시스를 유발하는 것으로 알려져 있는데, 이를 테스트하기 위해 RIP1이 결핍된 MEF(RIP1-deficient MEF)에서 RIP3을 과발현하여 RIP3 활성화가 다운스트림 이벤트를 트리거하기에 충분함을 보고자 하였다. 상향 조절된 RIP3 발현은 RIP1 인산화가 없는 상태에서 MLKL 인산화를 강화시켰으며, 이는 퇴행성 관절염 발달에서 RIP3의 역할이 네크롭토시스 독립적일 가능성이 낮음을 시사한다(도 3C).
다음으로, 본 발명자들은 Ad-Rip3에 감염된 연골 세포의 전사체 변화를 조사하기 위해 마이크로어레이를 사용하여 게놈 차원의 발현 프로파일링을 수행하였다. RIP3 과발현은 퇴행성 관절염 발병, 염증, MMP 활성화 및 ECM 분해에 핵심적인 역할을 하는 catabolic factors-matrix metalloproteinase 3 (Mmp3)의 발현을 증가 시켰다(도 3D). 기능 강화 분석 결과, RIP3 과발현으로 유도된 유전자(RIP3 overexpression-induced genes)는 TNFα 신호 전달 및 염증에 관여한다는 것으로 나타났다(도 3E).
RIP3 유도된 유전자 발현을 추가로 평가하기 위해 GSEA에 의해 퇴행성 관절염 연골에서 150 개의 상향 조절 및 71 개의 하향 조절된 유전자의 발현을 조사한 결과 (표 3), 퇴행성 관절염 시그니처 유전자가 RIP3 과발현 연골 세포에서 상향 조절되었음을 발견하였다 (도 2F).
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실시예 3. RIP3에 의한 퇴행성 관절염 발병의 조절
MMP3, MMP13, ADAMTS4 및 ADAMTS5는 퇴행성 관절염 발병에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고, Cox2는 주로 염증에 관여하며 콜라게나제(collagenas) 및 아그레카나제(aggrecanase) 활성화에 의해 연골 기질 분해를 유발한다. 본 발명자들은 상승된 RIP3 발현과 퇴행성 관절염 병인 사이의 연관성을 조사하고자, 관절 연골 세포에서 상향 조절된 이화 인자 (MMP3, MMP13, COX2 및 ADAMTS4) 및 하향 조절 된 동화 인자 (Col2a1 및 Aggrecan) 발현을 확인하였는데(도 4A-4C; 도 5A, 5B), 이들 유전자는 모두 퇴행성 관절염에서 연골을 파괴(disrupt)하는 것으로 잘 알려져 있다. MMP3와 MMP13은 콜라게나제 활성을 가지고 있고, Adamts4 및 Adamts5는 주로 각각 아그레카나제 1 및 2로 기능한다. 본 발명자들은 Ad-Rip3 감염에 의해 아그레카나제와 콜라게나제 활성이 상향 조절된다는 것을 확인하였다 (도 4D). 연골 세포에서 확인한 사항과 일관되게, Ad-Rip3은 Ad-C에 비해 WT 마우스에서 심각한 연골 파괴 및 퇴행성 관절염 증상을 유발했으며, 면역 조직 화학 염색은 Ad-Rip3이 연골에서 RIP3 과발현을 유발하고 MMP3, MMP13 및 COX2 발현을 증가시킴을 나타내었다 (도 4F, 도 5C). 이러한 효과를 확인하기 위하여, Rip3 결핍 마우스에서 인간 퇴행성 관절염 개발에 가장 적합한 DMM-유도된 퇴행성 관절염 모델을 확립하였다. 연골 파괴, 퇴행성 관절염 발현(manifestation), 이화 인자 발현은 WT 마우스에 비해 이들 마우스에서 현저하게 감소되었다 (도 6A, 6B; 도 5D). 인간 퇴행성 관절염 연골에서 RIP3 상향 조절과 일치하게, RIP3 결핍은 DMM 유발 마우스 모델에서 퇴행성 관절염을 약화(attenuate)시키는 것으로 밝혀졌으며, 이는 RIP3가 퇴행성 관절염 발병에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
퇴행성 관절염과 상승된 RIP3 발현은 모두 세포 사멸과 밀접한 관련이 있기 때문에, 본 발명자들은 Ad-Rip3에 감염된 연골 세포에서 세포 독성을 관찰하여 RIP3 과발현이 퇴행성 관절염 발병을 가속화하는 세포 사멸 경로를 유발하는지 여부를 조사하였다. Ad-Rip3 유도된 RIP3 과발현은 TNF 매개 세포 사멸 유도된 PARP 및 카스파제 3 절단에도 불구하고 연골 세포 형태 또는 LDH 방출의 변화 (도 5E) 또는 PARP 절단을 유도하지 않았으며 (도 5F), 이로써 세포 사멸은 RIP3 매개 퇴행성 관절염 병인과 관련이 없음을 알 수 있었다. 그러나, RIP3 과발현은 TNF 매개 신호 전달을 유도하여 (도 5G), RIP3 상향 조절이 비표준(non-canonical) MLKL 독립적 기능을 통해 퇴행성 관절염 병인을 강화할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. RIP3 매개 퇴행성 관절염 병인 신호의 음성 조절 인자로서의 TRIM24
연골 세포 분자 패턴에서 RIP3 매개된 변화의 기본 메커니즘을 이해하기 위하여 Ingenuity Pathway Analysis를 수행함으로써, 이러한 변화를 담당하는 업스트림 조절 인자를 예측하고자 하였다. 결과적으로, 본 발명자들은 367개의 상이하게 발현되는 (differentially expressed) 유전자 전사체를 확인하였다 (도 7A). 69개의 음성 업스트림 조절 인자 중, NF-κ를 통해 TNFα 신호를 조절하고 리간드 의존적 방식으로 레티노산 수용체 알파 (RARα)와 상호 작용하여 마우스에서 RARα 매개 전사를 약화시키는 중요한 전사 코어 조절 인자인 TRIM24가 선택되었다. 다른 조직 및 질병에서 TRIM24의 기능이 보고된 연구는 있지만, 연골 및 기타 관절 조직에서의 TRIM24 조절(modulation)은 아직 알려져 있지 않다. TRIM24가 RIP3 전사의 음성 업스트림 조절 인자인지 확인하기 위하여 Ad-Trim24 shRNA를 사용하여 일차 마우스 관절 연골 세포에서의 발현을 감소시켰다 (knock-down). TRIM24 하향 조절은 Rip3 mRNA 발현을 향상시켰지만 (도 7B, 7C; 도 8A, 8B), RIP3 과발현은 TRIM24 mRNA 또는 단백질 발현에 영향을 미치지 않았다 (도 7D; 도 8C), 이는 TRIM24가 RIP3 전사의 음성 업스트림 조절 인자(negative upstream regulator)임을 나타낸다.
이후 본 발명자들은 MEF에서 TRIM24 넉-다운(knock-down)을 통한 RIP3 전사 조절이 퇴행성 관절염 관련 유전자 발현 패턴의 변화를 유도(elicit)하는지 여부를 조사하였다. Trim24 shRNA에 감염된 MEF는 Mmp3, Mmp13 및 Cox2 mRNA 발현뿐만 아니라 RIP3 및 COX2 단백질 발현을 증가시켰다(도 8D). 이와 유사하게 Ad-Trim24 shRNA에 감염된 연골 세포는 RIP3, MMP3, MMP13 및 COX2 발현을 증가시켜 (도 9A, 9B, 도 8E, 8F), RIP3가 TRIM24 매개 음성 조절의 분자 표적이 될 수 있음을 나타내었다. 마우스의 무릎 관절 조직에서 Ad-Trim24 shRNA 매개 TRIM24 녹다운은 연골 파괴, 골조직 형성(osteophyte formation), 연골하 골판 두께(subchondral bone plate thickness)(도 9C) 및 이화 인자 발현 (MMP3, MMP13 및 COX2)을 현저하게 증가시켰다 (도 9D, 도 10A). 퇴행성 관절염 질환의 발병 또는 진행에 대한 TRIM24-RIP3 축 (TRIM24-RIP3 axis)의 기여도를 명확히 하기 위해, 본 발명자들은 DMM 수술 후 마우스 퇴행성 관절염 연골 샘플에서 Trim24 및 RIP3의 시간에 따른 발현 프로파일을 조사하였다. 연골 파괴, 골조직 형성, 연골하 골경화증(subchondral bone sclerosis)과 같은 퇴행성 관절염 발현(manifestations)은 DMM 수술 후 4 ~ 6 주에 점진적으로 증가한 반면 (도 10B) Trim24는 퇴행성 관절염 유발 후 4주에 50% 감소함을 확인할 수 있었고, 이와 반대로 RIP3 발현은 4주에 정상보다 30% 증가하며 6주에 80%, 8주, 10주에 100%가 증가 하였다. (도 10E, 도 9C). 따라서 TRIM24는 상승된 RIP3 발현을 음성 조절하여 6주부터 증가하는 MMP3, MMP13 및 COX2로 인해 퇴행성 관절염 발병을 가속화 하는 것임을 알 수 있었고, TRIM24와 RIP3의 역 상관으로부터 퇴행성 관절염 발병 속도 및 진행 속도를 진단할 수 있음을 예측할 수 있었다.
실시예 5. CMap를 사용한 RIP3 발현과 관련된 약물의 식별
TRIM24는 전사적 공동조절 인자(transcriptional coregulator)로 신체 내에서 다양한 기능을 담당하기 때문에 TRIM24를 직접적인 약물 개발의 표적으로 삼는데에는 한계가 있다. 따라서 본 발명자들은 CMap 접근 방식으로 in silico 화합물 스크리닝을 통하여 RIP3를 억제함으로써 퇴행성 관절염 병인을 차단할 수 있는 약물을 확인하고자 하였다. 간략히 기술하자면, 본 발명자들은 CMap 데이터베이스에서 약 20,000 개의 소분자(small molecules)에 대한 약물 유도 전사체 데이터로부터 연골 세포에서 RIP3 과발현에 의해 상향 조절된 후 하향 조절되는 유전자의 우선순위를 정하여, RIP3 과발현에 대해 반대 발현 시그니처를 갖는 화합물을 검색하였다 (도 11A). 본 발명자들은 종래 퇴행성 관절염과 연관성이 알려져 있지 않은 후보 화합물 중 셀루메티닙, 네라티닙, 및 AZ-628을 동정하였다 (도 11A, 도 12A). 분자 도킹 분석에서 9 개의 화합물이 우수한 RIP3 결합 친화도 (결합 에너지 < -7.0kcal/mol)를 나타내고 5 개 화합물이 중간 정도의 RIP3 상호 작용 (결합 에너지> -7.0kcal/mol; 도 11B)을 나타내었다.
연골 세포에서 이들 화합물의 세포 독성 효과를 테스트 한 결과, AZ-628과 셀루메티닙은 2μM에서 독성을 나타내지 않았고, 네라티닙은 1μM에서 독성을 나타내지 않는 것으로 확인하였다 (도 12B). 한편, 이들 화합물이 RIP3 매개 퇴행성 관절염 병인을 억제하는지 조사해 본 결과, RIP3 과발현에 의한 MMP3, MMP13 및 COX2 발현을 용량 의존적 방식으로 감소시킴을 확인할 수 있었으며 (도 11C, 도 12C, 12D), 이들 화합물이 RIP3 활성을 억제하는 것도 확인하였다. AZ-628은 셀루메티닙 또는 네라티닙보다 더 높은 결합 친화성을 나타내며 RIP3 과발현 연골 세포에서 퇴행성 관절염 발병을 보다 효과적으로 억제하는바 (도 11C), 이에 대해 추가로 조사해 보았다. RIP3의 과발현은 자발적 자가-인산화를 초래하고 퇴행성 관절염 병인을 강화시킬 수 있다. 따라서, 퇴행성 관절염은 RIP3 키나제를 표적으로 하는 항암제, dabrafenib (DAB) 및 sorafenib을 사용하여 RIP3 키나제 활성을 억제함으로써 약화될 수 있을 것이다.
실시예 6. 퇴행성 관절염 병인에서 RIP3 키나제 저해에 따른 RIP3 활성 억제
종래 알려진 RIP3 키나제 억제제에는 유형 I (DAB 및 GSK'843), II (sorafenib, GSK'067 및 HS-1371), III 또는 분류되지 않은 (GSK'872, GSK'840) 키나제 결합 모드가 있으며, DAB 및 HS-1371은 RIP3 매개 염증성 질환의 치료 가능성을 보여준 바 있다. 이들의 RIP3 조절 능력을 조사하기 위해, DAB, GSK'872, HS-1371 및 AZ-628 의 시험관 내 결합 친화성을 조사하고((도 13A, 13B) RIP3 과발현 연골 세포에 미치는 영향을 조사하였다. 4 종류의 화합물 모두 RIP3 인산화를 거의 완전히 억제하였지만 (도 11D, 도 13C), Mmp3 및 Cox2 발현은 AZ-628 처리 된 연골 세포에서만 감소하였다 (도 11E, 도 13D). GSK'872 및 HS-1371은 AZ-628 보다 연골 세포에 더 큰 세포 독성 효과를 보였으며 (도 11F, 도 13E), 이는 이들의 결합이 RIP3의 구조적 변화를 유발하고 연골 세포 아폽토시스를 유도할 수 있음을 시사한다 (도 13E).
종합하면, 상기 데이터는 AZ-628이 RIP3 매개 퇴행성 관절염 병인을 차단할 수 있는 강력한 RIP3 키나제 억제제임을 시사한다. TRIM24-RIP3 축을 교란하는 경우 연골 세포에서 RIP3 매개 네크롭토시스에 따른 세포 사멸이 아닌 유전자 발현을 변화시킴으로써 퇴행성 관절염 발병을 가속화 한 반면, AZ-628에 의한 RIP3 키나제 활성 억제는 연골 세포 독성없이 퇴행성 관절염 관련 유전자 발현을 약화시켰다. 따라서, 연골 병리 생리학에 RIP3 키나제 활성이 연관되어 있음을 밝힌 상기 결과로부터, RIP3 발현 및 활성을 조절하는 물질을 효과 좋은 퇴행성 관절염 치료제로 활용할 수 있음을 알 수 있다 (도 11G, 도 13F).
실시예 7. 유전자 정보
본 발명에서 사용된 유전자 정보는 다음과 같다.
mouse RIPK3: UniGene ID Mm.46612
mouse Trim24 shRNA: UniGene ID Mm.41063
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Biomarkers for diagnosing osteoarthritis <130> P20-B224 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gaagacgaca tcaccatcca g 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ctgtctttgt cacccacaca tg 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 catccgaaac cctgtcaact tg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gcccatcatc ttccacaata gc 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 atgtcgtgcg tcaagttatg g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tcagtcccat ccgtaacctt tg 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 cacactggta agtggggcaa ga 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ggattgtgtt 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Asn Leu Pro Ser Leu 610 615 620 Pro Asp Ile Asp Cys Ser Ser Thr Ile Met Leu Asp Asn Ile Val Arg 625 630 635 640 Lys Asp Thr Asn Ile Asp His Gly Gln Pro Arg Pro Pro Ser Asn Arg 645 650 655 Thr Val Gln Ser Pro Asn Ser Ser Val Pro Ser Pro Gly Leu Ala Gly 660 665 670 Pro Val Thr Met Thr Ser Val His Pro Pro Ile Arg Ser Pro Ser Ala 675 680 685 Ser Ser Val Gly Ser Arg Gly Ser Ser Gly Ser Ser Ser Lys Pro Ala 690 695 700 Gly Ala Asp Ser Thr His Lys Val Pro Val Val Met Leu Glu Pro Ile 705 710 715 720 Arg Ile Lys Gln Glu Asn Ser Gly Pro Pro Glu Asn Tyr Asp Phe Pro 725 730 735 Val Val Ile Val Lys Gln Glu Ser Asp Glu Glu Ser Arg Pro Gln Asn 740 745 750 Ala Asn Tyr Pro Arg Ser Ile Leu Thr Ser Leu Leu Leu Asn Ser Ser 755 760 765 Gln Ser Ser Thr Ser Glu Glu Thr Val Leu Arg Ser Asp Ala Pro Asp 770 775 780 Ser Thr Gly Asp Gln Pro Gly Leu His Gln Asp Asn Ser Ser Asn Gly 785 790 795 800 Lys Ser Glu Trp Leu Asp Pro Ser Gln Lys Ser Pro Leu His Val Gly 805 810 815 Glu Thr Arg Lys Glu Asp Asp Pro Asn Glu Asp Trp Cys Ala Val Cys 820 825 830 Gln Asn Gly Gly Glu Leu Leu Cys Cys Glu Lys Cys Pro Lys Val Phe 835 840 845 His Leu Ser Cys His Val Pro Thr Leu Thr Asn Phe Pro Ser Gly Glu 850 855 860 Trp Ile Cys Thr Phe Cys Arg Asp Leu Ser Lys Pro Glu Val Glu Tyr 865 870 875 880 Asp Cys Asp Ala Pro Ser His Asn Ser Glu Lys Lys Lys Thr Glu Gly 885 890 895 Leu Val Lys Leu Thr Pro Ile Asp Lys Arg Lys Cys Glu Arg Leu Leu 900 905 910 Leu Phe Leu Tyr Cys His Glu Met Ser Leu Ala Phe Gln Asp Pro Val 915 920 925 Pro Leu Thr Val Pro Asp Tyr Tyr Lys Ile Ile Lys Asn Pro Met Asp 930 935 940 Leu Ser Thr Ile Lys Lys Arg Leu Gln Glu Asp Tyr Ser Met Tyr Ser 945 950 955 960 Lys Pro Glu Asp Phe Val Ala Asp Phe Arg Leu Ile Phe Gln Asn Cys 965 970 975 Ala Glu Phe Asn Glu Pro Asp Ser Glu Val Ala Asn Ala Gly Ile Lys 980 985 990 Leu Glu Asn Tyr Phe Glu Glu Leu Leu Lys Asn Leu Tyr Pro Glu Lys 995 1000 1005 Arg Phe Pro Lys Pro Glu Phe Arg Asn Glu Ser Glu Asp Asn Lys Phe 1010 1015 1020 Ser Asp Asp Ser Asp Asp Asp Phe Val Gln Pro Arg Lys Lys Arg Leu 1025 1030 1035 1040 Lys Ser Ile Glu Glu Arg Gln Leu Leu Lys 1045 1050 <210> 28 <211> 518 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Met Ser Cys Val Lys Leu Trp Pro Ser Gly Ala Pro Ala Pro Leu Val 1 5 10 15 Ser Ile Glu Glu Leu Glu Asn Gln Glu Leu Val Gly Lys Gly Gly Phe 20 25 30 Gly Thr Val Phe Arg Ala Gln His Arg Lys Trp Gly Tyr Asp Val Ala 35 40 45 Val Lys Ile Val Asn Ser Lys Ala Ile Ser Arg Glu Val Lys Ala Met 50 55 60 Ala Ser Leu Asp Asn Glu Phe Val Leu Arg Leu Glu Gly Val Ile Glu 65 70 75 80 Lys Val Asn Trp Asp Gln Asp Pro Lys Pro Ala Leu Val Thr Lys Phe 85 90 95 Met Glu Asn Gly Ser Leu Ser Gly Leu Leu Gln Ser Gln Cys Pro Arg 100 105 110 Pro Trp Pro Leu Leu Cys Arg Leu Leu Lys Glu Val Val Leu Gly Met 115 120 125 Phe Tyr Leu His Asp Gln Asn Pro Val Leu Leu His Arg Asp Leu Lys 130 135 140 Pro Ser Asn Val Leu Leu Asp Pro Glu Leu His Val Lys Leu Ala Asp 145 150 155 160 Phe Gly Leu Ser Thr Phe Gln Gly Gly Ser Gln Ser Gly Thr Gly Ser 165 170 175 Gly Glu Pro Gly Gly Thr Leu Gly Tyr Leu Ala Pro Glu Leu Phe Val 180 185 190 Asn Val Asn Arg Lys Ala Ser Thr Ala Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly 195 200 205 Ile Leu Met Trp Ala Val Leu Ala Gly Arg Glu Val Glu Leu Pro Thr 210 215 220 Glu Pro Ser Leu Val Tyr Glu Ala Val Cys Asn Arg Gln Asn Arg Pro 225 230 235 240 Ser Leu Ala Glu Leu Pro Gln Ala Gly Pro Glu Thr Pro Gly Leu Glu 245 250 255 Gly Leu Lys Glu Leu Met Gln Leu Cys Trp Ser Ser Glu Pro Lys Asp 260 265 270 Arg Pro Ser Phe Gln Glu Cys Leu Pro Lys Thr Asp Glu Val Phe Gln 275 280 285 Met Val Glu Asn Asn Met Asn Ala Ala Val Ser Thr Val Lys Asp Phe 290 295 300 Leu Ser Gln Leu Arg Ser Ser Asn Arg Arg Phe Ser Ile Pro Glu Ser 305 310 315 320 Gly Gln Gly Gly Thr Glu Met Asp Gly Phe Arg Arg Thr Ile Glu Asn 325 330 335 Gln His Ser Arg Asn Asp Val Met Val Ser Glu Trp Leu Asn Lys Leu 340 345 350 Asn Leu Glu Glu Pro Pro Ser Ser Val Pro Lys Lys Cys Pro Ser Leu 355 360 365 Thr Lys Arg Ser Arg Ala Gln Glu Glu Gln Val Pro Gln Ala Trp Thr 370 375 380 Ala Gly Thr Ser Ser Asp Ser Met Ala Gln Pro Pro Gln Thr Pro Glu 385 390 395 400 Thr Ser Thr Phe Arg Asn Gln Met Pro Ser Pro Thr Ser Thr Gly Thr 405 410 415 Pro Ser Pro Gly Pro Arg Gly Asn Gln Gly Ala Glu Arg Gln Gly Met 420 425 430 Asn Trp Ser Cys Arg Thr Pro Glu Pro Asn Pro Val Thr Gly Arg Pro 435 440 445 Leu Val Asn Ile Tyr Asn Cys Ser Gly Val Gln Val Gly Asp Asn Asn 450 455 460 Tyr Leu Thr Met Gln Gln Thr Thr Ala Leu Pro Thr Trp Gly Leu Ala 465 470 475 480 Pro Ser Gly Lys Gly Arg Gly Leu Gln His Pro Pro Pro Val Gly Ser 485 490 495 Gln Glu Gly Pro Lys Asp Pro Glu Ala Trp Ser Arg Pro Gln Gly Trp 500 505 510 Tyr Asn His Ser Gly Lys 515

Claims (8)

  1. TRIM24 및 RIP3의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성 관절염 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, TRIM24는 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 퇴행성 관절염 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, RIP3는 서열번호 28의 아미노산 서열로 표시되는 퇴행성 관절염 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제제는 TRIM24에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 압타머; 및 RIP3에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 압타머인 것을 특징으로 하는 퇴행성 관절염 진단용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제제는 TRIM24를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 및 RIP3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 퇴행성 관절염 진단용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 퇴행성 관절염 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 PCR 분석용, 면역분석용(immunoassay) 또는 마이크로어레이 키트인 것을 특징으로 하는 퇴행성 관절염 진단용 키트.
  8. 다음 단계를 포함하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
    (a) 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 후보 물질을 세포에 처리하는 단계; 및
    (b) 세포에서 TRIM24의 발현을 증가 및 RIP3의 발현을 감소시키는 물질을 퇴행성 관절염 예방 또는 치료 물질로 선별하는 단계.
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