KR101797354B1

KR101797354B1 - Ｅｉ２４의 신규 용도

Info

Publication number: KR101797354B1
Application number: KR1020160050735A
Authority: KR
Inventors: 이한웅; 최정민; 조병철; 최유라; 장지영; 김혜련
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2016-03-15
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2017-11-13
Also published as: KR20170107342A

Abstract

본 발명은 EI24의 신규 용도에 관한 것으로, IGF-1R(Insulin growth factor-1 receptor) 신호 전달을 저해하여 EGFR 티로신 키나아제 저해제의 약제 내성을 개선에 관여하는 EI24의 새로운 용도를 제공한다. 본 발명에 따르면, EI24의 발현 수준을 측정하여 항암제에 대한 약제 내성 여부를 판별할 수 있다. 또한, EI24 또는 이의 활성화제를 이용하여 항암제의 약제 내성을 억제, 지연 또는 개선할 수 있다. 뿐만 아니라, EI24가 항암제의 약제 내성에 관여하는 경로를 조절함으로써, 기존의 항암제의 효능을 향상시키고, 항암제에 약제 내성을 억제, 지연 또는 개선할 수 있다.

Description

ＥＩ２４의 신규 용도{Novel use of EI24 gene}

본 발명은 IGF-1R(Insulin growth factor-1 receptor) 신호 전달을 저해하여 EGFR 티로신 키나아제 저해제의 약제 내성을 개선하는 것에 관여하는 EI24의 신규 용도에 관한 것이다.

지난 수십 년 동안 암 관련 연구의 비약적인 발전으로 대부분의 암이 조기 발견 시 완치가 가능해졌다. 최근에는 기존의 화학요법 대신 분자 생물학적 기전을 이해하고 이를 이용한 RTK(Receptor tyrosine kinase) 억제제가 표적 치료의 핵심 기법으로 활용이 되었고 실제로 많은 제약기업에서 다양한 암종에 대한 RTK 제제를 출시하였다. 하지만, 이러한 표적치료제들은 일정기간 동안 상당한 효과를 보이지만, 결국 항암제에 대해 내성을 보이고 오히려 공격적이 된다는 문제가 있다. 따라서 항암제에 대한 내성 극복은 여전히 암 치료분야에서 극복하지 못하고 있는 난제로 남아있다.

한편, EI24 유전자는 EI24(Etoposide-induced protein 2.4 homolog)를 코딩하는 유전자로 p53의 타겟 유전자이며 세포사멸을 유도하는(pro-apoptotic) 유전자로 알려져 있다. EI24 유전자는 발암 과정 및 암의 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어, 활발히 연구가 되고 있다. 본 발명자는 이전의 연구를 통하여 EI24 유전자 및 단백질 발현 수준이 암의 전이와 관련됨을 밝힌바 있다(대한민국 등록특허 제10-1213033호).

그러나, 현재까지 항암제 내성과 관련한 EI24의 용도에 대하여는 알려진 바 없다.

대한민국 등록특허 제10-1213033호

본 발명의 목적은 항암제에 대한 내성의 출현 여부를 예측할 수 있는 EI24의 용도, EI24 또는 이의 활성화제의 항암제 내성 억제 또는 개선 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 EI24 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 또는 EI24 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 EGFR(epidermal growth factor receptor) 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는, EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성 판별용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 개체로부터 분리한 생물학적 시료로부터 EI24 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준을 측정하고, 상기 측정된 mRNA 발현 수준 또는 단백질 발현 수준을 대조시료의 발현 수준과 비교하고, EI24 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준이 대조시료의 발현 수준보다 5 내지 20배 낮은 경우 EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대해 약제 내성이 있는 것으로 판별하는 것을 포함하는, EGFR(epidermal growth factor receptor) 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성의 판별을 위하여 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, EI24 유전자, EI24 유전자 발현 활성화제, EI24 단백질 또는 EI24 단백질 활성화제를 포함하는 EGFR(epidermal growth factor receptor) 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성 억제 또는 개선용 의약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, EI24 유전자, EI24 유전자 발현 활성화제, EI24 단백질 또는 EI24 단백질 활성화제를 포함하는 IGF-1R(Insulin growth factor-1 receptor) 신호 전달 저해용 의약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 후보물질과 EI24 유전자 또는 EI24 단백질을 접촉시키고, 상기 후보물질이 EI24 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준을 촉진하는지를 판단하는 것을 포함하는 IGF-1R 신호 전달 저해용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, EI24의 발현 수준을 측정하여 항암제에 대한 약제 내성 여부를 판별할 수 있다. 또한, EI24 또는 이의 활성화제를 이용하여 항암제의 약제 내성을 억제, 지연 또는 개선할 수 있다. 뿐만 아니라, EI24가 항암제의 약제 내성에 관여하는 경로를 조절함으로써, 기존의 항암제의 효능을 향상시키고, 항암제에 약제 내성을 억제, 지연 또는 개선할 수 있다.

도 1은 EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대한 내성 유무에 따른 EI24의 발현 수준을 비교한 결과를 보여준다.
도 2는 폐암 세포주에서 EI24 발현 저하에 따른 제피티닙에 대한 반응성을 비교한 결과를 보여준다.
도 3은 폐암 세포주에서 EI24 과발현에 따른 제피티닙에 대한 반응성을 비교한 결과를 보여준다.
도 4는 폐암 세포주에서 EI24 발현 저하에 따른 신호전달 분자들의 발현 수준을 비교한 결과를 보여준다.
도 5는 제피티닙 내성 폐암 세포주에서 EI24 과발현에 따른 신호전달 분자들의 발현 수준을 비교한 결과를 보여준다.
도 6은 EI24의 발현 저하에 따른 약물 내성 획득 메커니즘을 분석하기 위하여 RTK(receptor tyrosine kinase) 어레이를 수행한 결과를 보여준다.
도 7은 EI24의 발현 저하에 따른 IGF-1R의 하위 분자들의 활성화를 분석한 결과를 보여준다.
도 8은 EI24가 IGF-1R 신호전달에 미치는 영향을 분석한 결과를 보여준다.
도 9는 EI24의 발현 수준이 IGF-1의 발현 수준에 미치는 영향을 분석한 결과를 보여준다.
도 10은 EI24의 발현 수준이 IGF-1 mRNA의 발현 수준에 미치는 영향을 분석한 결과를 보여준다.
도 10은 EI24의 발현 수준이 IGF-1 단백질의 발현 수준에 미치는 영향을 분석한 결과를 보여준다.
도 11은 EI24의 발현 수준에 따른 암 줄기세포 표지자의 발현 수준을 분석한 결과를 보여준다.
도 12는 EI24 및 IGF-1R의 발현 수준이 암환자의 예후에 미치는 영향을 분석한 결과를 보여준다.
도 13은 EGFR 티로신 키나아제 저해제 및 IGF-1R 저해제가 폐암 세포의 생존에 미치는 영향을 분석한 결과를 보여준다.
도 14는 EGFR 티로신 키나아제 저해제 및 IGF-1R 저해제가 폐암 세포의 암 생성 능력에 미치는 영향을 분석한 결과를 보여준다.
도 15는 EI24의 발현 저하에 따른 세포주의 세포 형태를 비교한 결과를 보여준다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 EI24 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 또는 EI24 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 EGFR(epidermal growth factor receptor) 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성 판별용 조성물에 관한 것이다.

상기 EI24 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 또는 EI24 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 EI24의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 의미한다.

본 발명에서 EI24 유전자 혹은 EI24 단백질이라고 구별해서 기재하지 않고, "EI24"로 지칭하는 경우는 EI24 유전자 또는 EI24 단백질을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, EI24, EI24 유전자 또는 EI24 단백질은 이들과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 이들의 단편이 포함되는 것으로 해석된다. 따라서, 본 발명에서 EI24의 발현 수준은 EI24 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 EI24 단백질 발현 수준을 포함하는 의미이다.

한 구체예에서, EI24 유전자의 mRNA 발현 수준을 특정할 수 있는 제제는, 이에 제한되는 것은 아니나, EI24 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함한다.

본 발명에서 "프로브"는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태를 포함한다.

본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3'hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로서, 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복제를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynuleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 EI24 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머로, 바람직하게 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스(전향) 및 안티센스(후향) 핵산으로 구성될 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은, 필요한 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 프라이머는 EI24 유전자의 mRNA에 상보적인 센스 및/또는 안티센스 프라이머일 수 있다. 센스 또는 안티센스 프라이머를 단독으로 포함할 수도 있고, 센스 및 안티센스 프라이머를 함께 포함할 수도 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

한 구체예에서, EGFR 티로신 키나아제 저해제는 엘로티닙, 라파티닙, 아파티닙, 네라티닙, 포지오티닙, 라파티닙, 또는 제피티닙 등에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기에서 기술한 조성물을 포함하는, EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성 판별용 키트 또는 약제 내성 판별 시스템을 제공한다.

한 구체예에서, 약제 내성 판별용 키트는 통상적인 mRNA 및 단백질 정량 분석에 기반한 진단 키트를 제한 없이 포함한다. 예를 들어, 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 단백질 키트 또는 어레이 키트일 수 있다. RT-PCR 키트의 경우, EI24 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTP), Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 대조시료란 EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성이 없는 상태의 대조군으로부터 분리한 생물학적 시료를 의미한다.

한 구체예에서, 생물학적 시료는 혈액 또는 생검조직일 수 있다.

예를 들어, 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 방법으로 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩, 나노스트링, 또는 RNA 서열을 이용한 RNA 분석법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통해서 약제 내성 판별 여부가 필요한 개체의 생물학적 시료의 mRNA 발현량과 대조시료에서의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량의 정도를 비교함으로써 EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성 출현 여부를 판별할 수 있다.

한 구체예에서, 생물학적 시료의 EI24 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준이 대조시료의 발현 수준보다 낮은 경우가 EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성 판별의 지표일 수 있다.

대조시료와 비교하여 약제 내성이 있는 경우 EI24 유전자 또는 EI24 단백질의 발현 수준이 저하되므로, 이의 발현 수준을 정상 수준으로 향상시켜 약제 내성을 지연, 억제 또는 개선할 수 있다.

본 발명자들은 EI24의 발현 수준과 EGFR 티로신 키나아제 저해제 약제 내성과의 관련성이 어떠한 기전에 의한 것인지 연구하였다. 그 결과, EI24가 IGF-1R 신호 전달 경로를 통하여 EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성에 관여함을 확인할 수 있었다. 구체적으로, EI24의 발현 수준이 저하되면, IGF-1R 신호 전달이 활성화됨에 따라, EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성이 발생함을 알 수 있었다. 따라서, EI24 유전자, EI24 유전자 발현 활성화제, EI24 단백질 또는 EI24 단백질 활성화제 등을 이용하여 EI24의 발현을 향상시키면, EI24 발현 저하에 따른 IGF-1R 신호 전달의 활성화를 저해할 수 있다.

한 구체예에서, IGF-1R 신호 전달의 저해가 EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성 억제 또는 개선을 위한 것일 수 있다. EI24 발현 저하에 따른 IGF-1R 신호 전달의 활성화를 저해하면, 결과적으로 EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성을 지연, 억제 또는 개선할 수 있다.

본 발명은 또한, EI24 유전자 또는 EI24 단백질을 포함하는 IGF-1R 신호 전달을 저해하는 의약의 스크리닝용 조성물을 제공한다.

위에서 기술한 바와 같이, EI24 유전자 또는 EI24 단백질의 발현 수준을 향상시키면 IGF-1R 신호 전달의 활성화를 저해할 수 있으므로, EI24 유전자 또는 EI24 단백질의 발현 수준을 촉진하는 물질은 IGF-1R 신호 전달 저해용 의약으로서 사용될 수 있다.

EI24와 후보물질 간의 반응 확인은 단백질-단백질, 단백질-화합물, DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질, DNA-화합물, RNA-단백질, RNA-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 생체 외부에서(in vitro) EI24 유전자와 후보 물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류세포와 시험대상물질을 반응시킨 후 노던 분석, 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법, 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포 내로 도입한 후 시험대상물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법, EI24 단백질과 후보 물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), EI24 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다.

상기 스크리닝용 조성물은 EI24 외에도, 핵산 또는 단백질의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝용 조성물은 생체 내(in vivo) 실험을 위해, 상기 EI24를 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 EI24를 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝용 조성물은 EI24 외에도, EI24와 후보물질 간의 반응 확인 방법에 따라 Dvl을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 시험대상물질은 통상적인 선정방식에 따라 IGF-1R 신호 전달을 저해하는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<실시예>

(세포 배양 및 세포주 확립)

PC9 EGFR-돌연변이 NSCLC 세포주 및 이의 제피티닙-내성 유도체(PC9-GR)은 S.M. Kim 등의 문헌(Mol . Cancer Ther. vol.11, pp.2254-2264(2012))에 기재되어 있다. 모든 세포는 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 인간 EI24-과발현 세포주 및 대조군 세포주는 FLAG-태그가 달린 EI24를 포함하는 플라스미드 및 해당 빈 벡터(pcDNA3.1)를 각각 트랜스펙션시켜 확립하였다. 인간 EI24가 넉다운된 세포주는 J.M. Choi 등의 문헌(Oncotarget, vol.4, pp.2383-2396(2013))에 기재된 방법에 따라 확립하였다. shRNA 서열은 다음과 같다:

#TRCN0000159876: 5'-CCGGGCCATTTGGTTTCAGGATATACTCGAGTATATCCTGAAACCAAATGGCTTTTTTG-3'; 및

#TRCN0000160559: 5'-CCGGCAAAGCATATCTCTTCCAGTTCTCGAGAACTGGAAGAGATATGCTTTGTTTTTTG-3'.

(플라스미드 및 시약)

인간 EI24 구축물은 J.M. Choi 등의 문헌(Oncotarget, vol.4, pp.2383-2396(2013))에 기재되어 있다. 인간 EI24에 대한 shRNA는 Sigma-Aldrich 사에서, 제피니닙은 Cayman Chemical 사에서, PQ-401 및 AG-1024는 Selleck Chemicals 사에서, 인간 IGF-1 및 재조합 IGF-1은 R&D Systems 사에서 구입하였다.

(면역블랏팅 및 항체)

단백질 추출은 S. Devkota 등의 문헌(Int . J. Biochem . Cell Biol. vol.44, pp.1887-1896(2012))에 기재된 대로 수행하였다. 면역블랏팅 결과는 LAS-3000 Imager(Fujifilm 사)를 사용하여 얻었다. 이를 위해, 하기 항체를 사용하였다: anti-phospho-EGFR, anti-EGFR, anti-phospho-IRS-1, anti-IRS-1, anti-AKT, anti-phospho-AKT, anti-ERK1/2 및 anti-phospho-ERK1/2. 상기 항체들은 Cell Signaling Technology 사에서 구입하였다.

(RNA 분리 및 실시간 qPCR)

전체 RNA는 Trizol (Invitrogen 사)을 사용하여 준비하였다. Superscript III First-Strand Synthesis System을 사용하여 Oligo-dT 프라이머(Invitrogen 사)로 1 ㎍의 전체 RNA를 역-전사시켜 cDNA를 제조하였다. 실시간 qPCR은 J.M. Choi 등의 문헌(Oncotarget, vol.4, pp.2383-2396(2013))에 기재된 대로 수행하였다. 상기 문헌에 기재되어 있는 프라이머 서열을 사용하거나 OriGene 사(www.origene.com)에서 얻었다.

(세포 생존도 분석)

세포를 3×10⁴ cells/well의 밀도로 96-웰 배양 접시에 씨딩하고, 24시간 동안 인큐베이션 하였다. 48시간 동안 약물에 세포를 노출하고, 0.4 mg/mL의 MTT를 웰의 중간 높이까지 첨가하였다. 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션 한 후, 100 ㎕의 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 생존세포 내 포마잔 결정을 녹였다. 마이크로 리더(Bio-Rad 사)에서 포마잔 산물의 590 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 3반복으로 수행하였다.

(IGF-1 정량)

배양 세포에서 상등액을 모으고, 5분 동안 원심분리하여 죽은 세포와 세포 부스러기를 버렸다. IGF-1에 대해 제조업체의 설명서에 따라 키트(#DG100, R&D Systems 사)를 사용하여 ELISA 분석을 수행하였다.

(인간 RTK 및 키나아제 분석)

제조업체의 설명서에 따라 프로테옴 프로파일러 인간 Phospho-RTK 항체 분석 및 인간 Phospho-Kinase 항체 분석 키트(R&D Systems 사)를 수행하였다. 간단히 말해, 레퍼런스 대조군을 각각 포함하는 49 RTKs (RTK 분석) 또는 43 키나아제 및 2개의 관련 전체 단백질(키나아제 분석)에 대한 이중 항체 스팟이 점으로 찍혀 있는 니트로셀룰로오스 멤브레인과 방금 분리한 단백질을 4℃에서 오버나이트 동안 인큐베이션 하였다. 결합 단백질은 50 ㎕의 호스래디쉬 페록시다아제(HRP)에 결합된 마우스 항-phospho-tyrosine 항체로 화학발광분석을 통해 검출하였다.

(GEO2R 분석)

Gene Expression Omnibus (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)에서 EGFR-TKI-sensitive 및 EGFR-TKI-resistant 클론의 유전자 발현값을 포함하는 마이크로어레이 데이터세트를 얻었다. 이중 GSE38121 (Z. Zhang et al. Nat. Genet. vol.44, pp.852-860(2012)), GSE38404 (A.B. Cortot et al. Cancer Res. vol.73, pp.834-843(2013)) 및 GSE37700 (D. Ercan et al. Cancer Discov. vol.2, pp.934-947(2012)) 데이터세트를 선택하여 EI24 발현을 평가하였다. T. Barrett 등의 문헌(Nucleic Acids Res. vol.41, pp.D991-D995 (2013))에 기재된 대로 GEO2R 인터페이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)를 통해 데이터를 분석하였다.

(통계 분석)

통계 분석은 GraphPad Prism을 사용하여 수행하였다. 달리 언급하지 않는 한 unpaired t-test를 사용하였다. P<0.05 값을 통계적으로 유의한 값으로 간주하였다.

<실시예 1> EI24 발현 수준과 EGFR 티로신 키나아제 저해제(EGFR TKI; Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor)에 대한 내성과의 연관성 분석

EGFR TKI에 대한 EI24의 기능을 예측하기 위해서 각 세대별(제1 내지 제3세대) EGFR TKI에 민감성을 보이는 세포와 저항성을 보이는 세포를 가지고 마이크로어레이를 수행한 여러 참고문헌과 Oncomine 데이터분석의 결과를 통해 EI24의 발현량을 비교하였다.

도 1의 Zhang 데이터세트(GSE3812)는 엘로티닙-민감성 HCC827 세포와, 엘로티닙-저항성 클론 HCC827-ER1 및 HCC827-ER2에서 EI24 유전자 발현값을 보여주고, Cortot 데이터세트(GSE38404) 및 Ercan 데이터세트(GSE37700)는 약물-민감성 클론(PC9 및 NCI-H1975)과 약물-저항성 클론(PFR31, PFR32 및 NCI-H1975-WZR6)에서 EI24 유전자 발현값을 보여준다.

도 1에 나타난 바와 같이, EI24는 각 세대별 EGFR TKI에 대해 반응성을 보이는 세포보다 저항성을 보이는 세포에서 발현량이 감소한 것을 확인할 수 있었다.

이를 바탕으로 EGFR의 변이에 기인하고 EGFR TKI(제피티닙)에 반응성을 보이는 비소세포성 폐암 세포주인 PC9에서 shRNA를 이용하여 EI24를 발현저하시켰을 때, 해당 약물에 대한 반응성이 변하는지 실시간 qPCR 분석을 통해 관찰해보았다.

상기 shRNA는 GFP-타겟 서열(9-shGFP)과 EI24-타겟 서열(9-shEI24#1 및 9-shEI24#2)을 포함한다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 비소세포성 폐암 세포주인 PC9의 대략적인 IC₅₀ 값은 0.1μM 정도로 나타났지만, EI24를 발현저하 했을 때에는 적어도 100배 이상의 농도에서 IC₅₀ 값이 형성됨을 관찰할 수 있었다. 따라서 EGFR 변이에 기인한 비소세포성 폐암에서 EI24가 발현 저하되었을 때 EGFR TKI에 대한 저항성이 증가함을 확인할 수 있었고, 이는 다른 연구그룹에서 수행한 마이크로어레이 데이터와 일치함을 알 수 있었다.

또한, PC9 세포주 중 제피티닙에 저항성을 보이는 세포주(PC9-GR)에 EI24 유전자를 과발현시키고 제피티닙을 넣어 면역블랏팅 분석을 통해 EI24 발현과 MTT 분석을 통해 세포사멸을 측정하였다. PC9-GR 세포에서의 EI24 발현에 대한 면역블랏팅 분석에서, 상기 PC9-GR 세포는 대조군 벡터(9GR-Ctrl) 또는 외부에서 도입한 EI24(9GR-O/E#1 및 #2)를 발현한다.

도 3에서와 같이, 제피티닙에 대한 반응성이 높아지는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 20 μM의 제피티닙에 노출될 때 EI24의 이소성 발현은 18%까지 세포 생존도를 감소시켰다.

EI24-매개된 EGFR-TKI 민감도의 분자적 메커니즘을 알기 위해, EI24 넉다운 세포(9-shEI24) 및 대조군 세포(9-shGFP)에서 제피티닙 처리 후 EGFR, AKT 및 ERK1/2의 단백질 인산화를 시험하였다.

9-shEI24 세포는 대조군 세포에 비해 증가된 p-EGFR, p-AKT 및 p-ERK1/2의 발현을 나타내어, EI24의 발현저하는 EGFR을 인산화하여 활성화하지만, 제피티닙의 작용 기작인 EGFR의 인산화를 막지 못하는 것으로 보였다(도 4).

또한, PC9-GR 세포에서 제피티닙 처리 시 EI24의 이소성 발현이 AKT 인산화를 감소시키는지를 관찰한 결과, 여전히 비소세포성 폐암 세포주의 생존 신호 중 하나인 AKT의 활성화가 유지되는 것으로 관찰되었으며, 이는 제피티닙에 저항성을 보이는 세포주에서 EI24를 과발현시켰을 때 감소하는 결과를 보였다(도 5).

<실시예 2> EI24 발현 저하에 따른 약물 내성 획득 메커니즘 분석

EI24의 발현저하에 따른 획득내성 메커니즘을 관찰하기 위해 RTK 어레이를 수행하였고, EI24의 발현저하는 IGF-1R의 활성화를 유도하고 과발현은 억제하는 것으로 관찰되었다.

RTK 제제의 획득내성 메커니즘의 하나인 키나아제 스위치(kinase switch) 여부를 확인하기 위해 프로테옴 프로파일러 인간 Phospho-RTK 항체 어레이 및 인간 Phospho-Kinase 항체 어레이 키트(R&D Systems)을 이용하여 RTK 어레이를 통해 EI24의 유전자 변화에 의해 활성화된 RTK들을 스크리닝한 결과 EI24에 의해 특이적으로 IGF-1R의 활성화가 변화됨을 관찰하였다(도 6).

또한, 같은 어레이 실험을 통하여 EI24에 유전자에 의해 활성화된 IGF-1R의 하위 분자들의 활성화 변화량을 살펴본 결과, AKT, ERK1/2, p38 등의 활성화가 조절됨을 관찰하였다(도 7)

위의 결과를 토대로 9GR 세포주와 이 세포주에 EI24를 과발현시킨 세포주를 이용하여 IGF1 처리의 영향을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. 그 결과 인산화된 IRS와 ERK1/2의 발현이 증가하지 않음을 발견함으로써, 실제로 비소세포성 폐암 세포주에서 EI24 유전자의 과발현이 IGF-1에 의한 IGF-1R 신호전달 경로를 억제하는 것을 알 수 있었다(도 8).

단백질 발현에서의 결과를 발견하였으므로, 전사조절에도 영향을 미치는지 보기 위하여 RT-PCR을 이용하여 IGF-1의 mRNA 양을 측정하였다. 그 결과 EI24의 발현 변화가 IGF-1R을 활성화하는데 중요한 리간드로 작용하는 IGF-1의 mRNA의 발현을 조절하는 것을 발견하였으며(도 9), 실제로 세포주에서 EI24의 발현량에 따라 IGF-1의 농도가 변화하였다(도 10). 이는 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA, R&D Systems #DG100)를 이용하여 세포주에서 얻은 배지에 존재하는 IGF-1의 양을 측정한 결과이다.

<실시예 3> EI24 발현 저하에 따른 약물 내성 메커니즘 분석

EI24의 발현 저하로 인한 약물 내성 획득 과정이 암 줄기세포와 관련성이 있는지 알아보기 위하여, 암 줄기세포 특이적 표지자(NANOG와 SOX-2)에 대한 실험을 RT-PCR을 이용하여 수행하였다.

그 결과, EI24를 발현저하시킨 세포주들에서 증가된 암 줄기세포 특이적 표지자들이 EI24의 발현량에 따라 변화함이 관찰되었다(도 11).

<실시예 4> EI24 및 IGF-1R의 발현 수준이 폐암 환자의 생존률에 미치는 영향 분석

폐암 환자에서 EI24와 IGF-1R의 발현량에 따른 생존률을 Gene Expression Omnibus (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)로부터 GSE38121, GSE38404 및 GSE37700 데이터세트를 얻어 GEO2R 인터페이스를 이용하여 비교한 결과, 상대적으로 낮은 EI24, 높은 IGF1-R의 발현을 보이는 환자군의 좋지 않은 예후가 관찰되었다(도 12).

<실시예 5> IGF-1R 저해제의 유용성 평가

이로써 비소세포성 폐암 세포주에서 EI24의 발현저하에 따른 EGFR TKI에 대한 획득내성이 IGF-1R에 의함임을 증명하였다. 실제로 IGF-1R을 표적으로 하는 치료요법이 효과가 있는지 알아보기 위해 EGFR TKI, IGF-1R 저해제, 혹은 두 가지 저해제를 동시에 병행하여 처리한 후에 PC9 세포주에서 EI24를 발현저하시킨 세포들의 생존율을 비교하였다. EGFR TKI에 민감한 세포주인 PC9에서 EI24를 발현저하 시켜서 저항성을 가진 세포주는 제피티닙과 두 가지 IGF-1R 저해제를 각각 처리한 것보다 동시에 처리하는 것이 더 효과적으로 세포사멸을 일으킴을 알 수 있었고 (도 13), 이들 세포주의 콜로니 형성 분석(colony formation assay)를 수행한 결과 세포주의 암 발생 능력도 현저히 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 14).

비소세포성 폐암 세포주인 PC9 세포주는 전형적인 상피(epithelial) 형태를 보이나 EI24를 발현저하시키면 EMT가 발생하여 간엽(mesenchymal) 형태의 세포주로 변하는 것을 일반 광학 현미경으로도 쉽게 관찰할 수 있었다(도 15).

많은 연구에서 EMT와 IGF-1R의 활성화를 연계하여 항암 내성 기작을 증명하고 있는바, 본 발명자들의 기존 연구(EI24의 발현저하에 따른 EMT 유도)와 연계하여 볼 때 IGF-1R을 타겟으로 하는 치료요법이 효과적임을 증명하고 있다.

Claims

EI24 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 또는 EI24 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 항암제인 EGFR(epidermal growth factor receptor) 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성 판별용 조성물.
제1항에 있어서,
EGFR 티로신 키나아제 저해제는 엘로티닙, 라파티닙, 아파티닙, 네라티닙, 포지오티닙, 다코미티닙, WZ4002 및 제피티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 항암제인 EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성 판별용 조성물.
제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는, 항암제인 EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성 판별용 키트.
제3항에 있어서,
키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 단백질 키트 또는 어레이 키트인, 항암제인 EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성 판별용 키트.
개체로부터 분리한 생물학적 시료로부터 EI24 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준을 측정하고,
상기 측정된 mRNA 발현 수준 또는 단백질 발현 수준을 대조시료의 발현 수준과 비교하고, EI24 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준이 대조시료의 발현 수준보다 5 내지 20배 낮은 경우 EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대해 약제 내성이 있는 것으로 판별하는 것을 포함하는, 항암제인 EGFR(epidermal growth factor receptor) 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성의 판별을 위하여 정보를 제공하는 방법.
제5항에 있어서,
EGFR 티로신 키나아제 저해제는 엘로티닙, 라파티닙, 아파티닙, 네라티닙, 포지오티닙, 다코미티닙, WZ4002 및 제피티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 항암제인 EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성의 판별을 위하여 정보를 제공하는 방법.
EI24 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 항암제인 EGFR(epidermal growth factor receptor) 티로신 키나아제 저해제의 내성 억제용 의약 조성물.
제7항에 있어서,
EGFR 티로신 키나아제 저해제는 엘로티닙, 라파티닙, 아파티닙, 네라티닙, 포지오티닙, 다코미티닙, WZ4002 및 제피티닙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 항암제인 EGFR(epidermal growth factor receptor) 티로신 키나아제 저해제의 내성 억제용 의약 조성물.
EI24 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 IGF-1R(Insulin growth factor-1 receptor) 신호 전달 저해용 항암 의약 조성물.
제9항에 있어서,
IGF-1R 신호 전달의 저해가 항암제인 EGFR 티로신 키나아제 저해제에 대한 약제 내성 억제 또는 개선을 위한 것인, IGF-1R(Insulin growth factor-1 receptor) 신호 전달 저해용 항암 의약 조성물.
후보물질과 EI24 유전자 또는 EI24 단백질을 접촉시키고,
상기 후보물질이 EI24 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준을 촉진하는지를 판단하는 것을 포함하는 IGF-1R(Insulin growth factor-1 receptor) 신호 전달 저해용 항암 의약의 스크리닝 방법.