KR20130139286A - 엘로티닙 치료를 위한 마커로서 ipp 복합체 - Google Patents

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한노 랑겐
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Abstract

본 발명은 암 환자의 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료의 임상적 이득을 위한 예측적인 바이오마커에 관한 것이다.

Description

엘로티닙 치료를 위한 마커로서 IPP 복합체{IPP COMPLEX AS MARKER FOR ERLOTINIB TREATMENT}
본 발명은 암 환자의 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료의 임상적 이득을 위한 예측적인 바이오마커에 관한 것이다.
수많은 인간 악성 종양은 상피 성장 인자 수용체(EGFR)의 일탈적 또는 과발현과 관련되어 있다. EGF, 형질전환 성장 인자-α(TGF-α) 및 다른 수많은 리간드는 EGFR에 결합하여 수용체의 세포내 타이로신 키나제 도메인의 자가인산화를 자극한다. 이어서, 다양한 세포내 경로가 활성화되고, 이들 하류의 사건은 시험관내에서 종양 세포 증식을 야기한다. EGFR을 통한 종양 세포의 자극이 생체내에서 종양의 성장 및 종양의 생존에 중요할 수 있다는 것이 상정되어 왔다.
EGRF 타이로신 키나제의 억제제인 타세바(Tarceva)(등록상표)의 이전의 임상적 자료는 목적한 효과적인 농도(예비 임상 자료에 의해 측정됨)를 제공하는 복용량에서 이 화합물이 안전하고 일반적으로 잘 견딜만하다는 것을 나타내고 있다. 진행된 질병을 갖는 환자에서의 I 및 II상 임상 시험은 타세바(등록상표)가 일련의 상피 종양에서 유망한 임상적 활성을 갖는다는 것을 증명하였다. 실제로, 타세바(등록상표)는 이전에 치료된 두정부 암 및 NSCLC(비소세포성폐암)를 갖는 환자에게서 확립된 2차 화학요법과 유사한 정도로 지속적인 부분적 완화를 유도할 수 있지만, 항암화학요법보다 양호한 안정성 프로파일의 추가적 이점을 갖고 개선된 편의성(정맥 내[i.v] 투여 대신 정제)을 갖는 것으로 나타났다. 무작위의 이중 맹검, 위약-통제 시험(BR.21)은 단일 약품 타세바(등록상표)가 진행된 질병을 위한 표준 치료에 실패한 NSCLC 환자의 생존을 유의하게 연장하고 개선할 수 있다는 것을 보여주고 있다.
타세바(등록상표)(엘로티닙 하이드로클로라이드)는 경구 활성의 강력한 EGFR 타이로신 키나제의 억제제(EGFR-TKI)인 작은 화학 분자이다.
이레사(Iressa)(상표)(제피티닙)는 경구 활성의 EGFR 타이로신 키나제의 억제제(EGFR-TKI)인 작은 화학 분자이다.
폐암은 북미 및 유럽에서 암-관련 사망의 주요 원인이다. 미국에서, 폐암의 2차적인 사망의 수는 조합된 암 사망의 2번째(결장), 3번째(흉부) 및 4번째(전립선) 주요 원인을 합친 사망의 수를 초과한다. 모든 폐암의 약 75% 내지 80%는 NSCLC이며, 약 40%의 환자는 국소적으로 발달되고/되었거나 절제불가능한 질환을 나타낸다. 이 군은 전형적으로 종괴가 큰 IIIA 및 IIIB 질환을 갖는 환자를 포함하며, 악상 흉막 삼출액은 제외한다.
유럽 연합에서의 폐암의 순수한 발생률은 52.5이고, 사망률은 48.7사례/100,000/년이다. 남성들 사이에서, 비율은 각각 79.3 및 78.3이고, 여성들 사이에서는 각각 21.6 및 20.5이다. NSCLC는 모든 폐암 사례의 80%를 차지한다. 남성들 사이의 폐암 사망률의 약 90% 및 여성들 사이의 폐암 사망률의 80%는 흡연에 의한 것이다.
미국 암 협회(American Cancer Society)에 따르면, 미국에서는 2004년 동안 약 173,800건의 새 폐암 사례(남성에서 93,100건 및 여성에서 80,700건)가 있었고, 이는 모든 새로운 암의 약 13%를 차지하였다. 대부분의 환자는 상기 질환의 결과로서 진단의 2년 이내에 사망한다. 많은 NSCLC 환자에게서 성공적인 치료는 찾기 힘들다. 진행된 종양은 종종 수술로 해결할 수 없으며 방사선요법 및 항암화학요법의 허용가능한 복용량에 저항할 수 있다. 무작위 시험에서, 현재의 대부분의 활성화된 조합의 항암화학요법은 약 30% 내지 40%의 반응률 및 35% 내지 40%의 1년 생존율을 달성하였다. 이는 실제로 단독 지지 요법에서 나타나는 10%의 1년 생존율보다 발전한 것이다(문헌[쉐퍼드(Shepherd) 1999]).
현재까지, 재발 후 재발된 환자를 위한 치료적 선택은 최선의 지지 요법 또는 일시적 완화로 제한되었다. 최선의 지지 요법과 도세탁셀(탁소티어(Taxotere))을 비교하는 최근의 시험은 NSCLC 환자가 시스플라틴계 1차 섭생법을 실패한 후 2차 항암화학요법으로부터 이득을 얻을 수 있음을 나타냈다. 0, 1 또는 2의 ECOG 전신상태정도(performance status)를 갖는 모든 연령의 환자는 이전의 플래티늄계 치료에 난치성을 보인 환자들과 같이 도세탁셀을 사용하여 개선된 생존을 보였다. 치료로부터 이득을 얻지 못한 환자는 10%의 체중 손실, 높은 락테이트 탈수소효소 수준, 다-장기 침범, 또는 간 침범을 갖는 환자를 포함한다. 추가로, 도세탁셀 단독 요법의 이득은 2차 셋팅의 정도를 넘지 못했다. 도세탁셀을 3차 또는 그 이상의 치료로서 받는 환자는 생명 연장을 보이지 않았다. 단독-약품 도세탁셀은 NSCLC를 위한 표준 2차 치료법이 되었다. 최근에, NSCLC의 2차 치료법에서의 또다른 무작위 III상 시험에서 페메트렉시드(알림타(Alimta)(등록상표))와 도세탁셀을 비교하였다. 페메트렉시드를 사용하는 치료는 임상적으로 동등한 효능을 야기했지만, 도세탁셀에 비해 상당히 적은 부작용이 있었다.
암 치료를 개별화하는 방법을 개발할 필요성이 존재함이 오랫동안 인지되어 왔다. 표적화된 암 치료의 개발과 함께, 종양 표적의 분자 프로파일(즉, 임상적 이득에 대해 예측할 수 있는 것)을 제공할 수 있는 방법론에 특히 관심이 있다. 암에서의 유전자 발현 프로파일링을 위한 원리의 증명은 현재의 형태학 및 면역조직화학 시험에 근거하여 명확하지 않은 종양 유형의 분자 분류에 의해 확립되었다. 2개의 분리된 질환 단위는 유전자 발현 프로파일링을 사용함으로써 널리 퍼진 큰 B-세포 림프종의 현재의 단일 분류와는 다른 예후로 구별된다.
종양에 활성화된 EGFR 돌연변이를 지니는 NSCLC 환자는 특히 타이로신 키나제 억제제, 예컨대 엘로티닙 및 제피티닙이 잘 반응하는 것으로 나타났다(파즈-아레스(Paz-Ares) 등 2010). 제피티닙이 선택되지 않은 환자 집단에 임상학적 이득을 주지 않는 것으로 보이는 반면(문헌[태처(Thatcher) 등], 문헌[란센트(Lancet) 2005]), 엘로티닙은 이득을 주는 것으로 보였다(문헌[쉐퍼드(Shepherd) 등, NEJM 2005]; 문헌[카푸죠(Cappuzzo) 등 2010]).
그러므로, 본 발명의 목적은 암 환자에서의 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료의 임상적 이득에 대해 예측적이고 암 환자에서의 제피티닙을 사용하는 치료의 임상적 이득에 대해 비-예측적인 발현 바이오마커를 제공하는 것이다.
도 1: 엘로티닙 하이드로클로라이드, 제피티닙 또는 둘 다에 의해 유의하게 변하는 증가하는 화합물 농도에 따른 단백질 풍부도의 변화를 보여준다. 상기 변화는 p-값으로부터 증가한 기대치와 일반적으로 잘 일치한다(도 2 참조). 그러나, 제피티닙에서만 EPHA1, K0564, KC1E, NUD12, SN1L1이 발견된 반면, 엘로티닙 하이드로클로라이드 대체된 샘플에서만 LIMS1(PINCH) 및 M3K1이 식별되었으며, 따라서 정량화되었다.
도 2: log10 변환 후 엘로티닙 하이드로클로라이드의 조정된 p-값 대 제피티닙의 조정된 p-값이 나타나 있다(선은 5%의 오차 가능성을 나타낸다). 영역 A는 엘로티닙 하이드로클로라이드 및 제피티닙에 유의하게 결합하는 단백질을 나타내고, 영역 B 및 C는 각각 엘로티닙 하이드로클로라이드 및 제피티닙에 유의하게 결합하는 단백질을 나타낸다. 영역 D의 단백질은 둘 다에 대해 유의한 결합을 나타내지 않는다. 본 도면은 두 화합물에서 식별된 단백질만 보여줄 수 있으며, 이러한 이유로 엘로티닙 하이드로클로라이드 또는 제피티닙 대체된 샘플에만 존재하는 상기 명명된 단백질은 여기에 나타나 있지 않다.
도 3: 다양한 NSCLC 세포주에서의 엘로티닙 하이드로클로라이드와 제피티닙의 상호작용 프로파일. EGFR의 상대량은 모든 세포주에서 유사한 반면, 본 도면은 엘로티닙 하이드로클로라이드 결합된 분획에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH의 특정한 풍부함을 보여준다.
도 4: 엘로티닙 및 제피티닙과 ILK DFG-루프 부분과의 잠재적 상호작용을 보여주는 정렬되고 겹쳐진 ILK 및 EGFR 결정 단백질 구조의 ATP 결합 부위. 산소 원자는 붉은색이고, 질소는 파란색이고, 염소는 녹색이고, 불소는 밝은 청록색이다. 엘로티닙/EGFR 복합체(1M17)의 탄소 원자는 연어 색이고, 제피티닙/EGFR 복합체(2ITY)의 탄소 원자는 노란색이고, ILK의 탄소 원자는 흰색이다. 그림은 파이몰(pyMOL)을 사용하여 만들었다. 엘로티닙 및 제피티닙의 아닐린 고리에서 상이한 치환이 존재한다(제피티닙에서는 3 위치가 염소로 치환되었지만 엘로티닙에서는 아세틸렌으로 치환되었고, 엘로티닙에서는 4 위치가 비치환되었지만 제피티닙에서는 불소로 치환되었다). 원자 근접성에서 생성된 차이는 제피티닙에 비해 엘로티닙이 ILK의 ATP 결합 부위에 더 호의적으로 결합하는 것을 암시한다.
도 5: 엘로티닙은 E-카데린을 안정화시킴으로써 H358의 전이를 늦춘다. (A) E-카데린에 대한 웨스턴 블랏. 총 단백질 함량에 대해 정규화되고 2개의 분리된 실험 사이에서 평균화된 (B) E-카데린, (C) ILK 및 (D) PINCH의 정량화된 신호.
도 6: NSCLC 세포주에서의 IPP 발현. (A) EGFR 야생형 NSCLC 상피 세포주 H292, H441, H358, H322, 및 중간엽 세포주 H460, H1299, H226 및 Calu6에 대한 ILK, 알파-파빈, PINCH, E-카데린, 비멘틴 및 GAPDH의 웨스턴 블랏. (B) GAPDH 수준에 대해 정규화되고 IPP 복합체의 발현 수준을 측정하기 위해 평균화된, 정량화된 웨스턴 블랏 신호.
도 7: 임상적 이득을 얻은 환자 대 얻지 못한 환자에서의 E-카데린(CDH1) 및 ILK 발현. 각각의 점은 하나의 샘플에서 측정된 (log2 변환된) 유전자의 신호를 나타낸다. 파란색 및 빨간색 점은 각각 임상적 이득을 얻은 환자 및 얻지 못한 환자의 샘플과 상응한다(돗플롯을 파테크(Partek) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다).
세포외 기질(ECM)은 조직 및 장기를 형성하기 위한 구조적 뼈대를 제공한다. ECM은 세포 표면의 기질 접착 분자와 결합하여 생존, 증식, 극성 및 분화를 조절하는 다양한 세포내의 신호전달 경로에 영향을 미친다. ECM에 결합하는 접착 분자의 중요한 계열은 인테그린이다. 인테그린은 알파 및 베타-아단위로 이루어지고 큰 세포외 도메인 및 상대적으로 작은 세포질 도메인으로 구성된다. 리간드 결합은 ECM에 대한 세포 접착 부위에서 다중 단백질 복합체의 조립을 이끄는 신호전달의 일련의 과정을 활성화시킨다. 이 사건은 세포에 2가지 중요한 영향을 미친다: 이는 ECM과 액틴 세포골격 사이의 연결을 구축하고, 많은 세포내 신호전달 경로의 흐름을 변경한다. 인테그린 매개 신호전달의 중요한 조절자로 작용하는 3개의 단백질은 ILK(인테그린-연결 키나제), 어댑터 단백질 PINCH(특히 관심있는 Cys-His-풍부 단백질) 및 파브(Parv)(파빈(Parvin))이며, 이중 ILK는 인테그린 매개 신호전달의 주요 조절자이다. 상기 분자는 IPP 복합체라고 일컬어지는 이종삼량체(heterotrimeric) 복합체를 형성한다. ILK의 주된 기능은 인테그린과 세포골격을 연결하는 것이다. ILK는 이의 N-말단 도메인을 통해 PINCH에 결합하고, 이의 C-말단 도메인을 통해 알파-파빈에 결합하여 PINCH-ILK-알파-파빈 3원 복합체(IPP 복합체)를 형성한다. IPP 복합체는 인테그린과 액틴 세포골격 사이의 어댑터 및 몇몇 신호전달 경로를 조절하는 중추로서 작용한다.
야생형 EGFR 함유 인간 비소세포성폐암(NSCLC) 세포주는 EMT 이전에 엘로티닙 하이드로클로라이드에 대해 큰 민감성을 보인다(문헌[톰슨(Thomson) 등, (2005)]). 상피 세포의 중간엽 세포로의 전환(EMT)은 세포 접착의 손실, E-카데린 발현의 억제 및 증가한 세포 이동성으로 특징지어지는 생물학적 세포의 표현형 전환이다. 몇몇 발암 경로(예컨대, 펩티드 성장 인자, 인테그린 등)는 EMT를 유도하는 것으로 여겨진다. EMT는 증식을 겪는 세포의 특징적인 세부 특징이고, 이는 종양의 진행 및 전이에서 중요한 역할을 하는 것으로 시사되어 왔다. 인테그린-연결된 키나제의 증가된 발현은 비소세포성폐암에서 보다 짧은 생존과 관련된다(문헌[타카나미(Takanami) 등, (2005)]).
MERIT 연구는 2차 비소세포성폐암 환자에서 타세바를 위한 비-무작위의 공개-표지 효능 마커 식별 시험이다.
용어 "바이오마커"는 생물학적 상태(즉, 생물학적 과정 또는 치료 상호작용에 대한 약리학적 반응)의 지표로서 사용되는 물질을 의미한다. 바이오마커는 질병의 위험 또는 진행, 또는 주어진 치료에 대한 질병의 민감성과 관련된 단백질의 발현 또는 상태의 변화를 나타낸다.
용어 "마커 유전자"는 DNA 조각이 성공적으로 숙주 유기체에 삽입되었는지의 여부를 측정하기 위해 사용되는 유전자를 의미한다.
유전자의 발현은 유전자의 정보가 기능성 유전자 산물, 예컨대 단백질의 합성에 사용되는 과정이다. 용어 "발현 수준"은 특정 유전자가 세포, 조직 또는 유기체 내에서 발현되는 수준을 의미한다. 단백질과 관련된 문맥에서 용어 "발현 수준"은 특정 시간에 세포에 존재하는 특정 단백질의 양을 나타낸다.
"화학적 프로테오믹스(chemical proteomics)"는 전체 프로테옴으로부터 상호작용하는 단백질 복합체를 포획하고 식별하기 위한 미끼로서 고정된 작은 분자를 사용하는 질량-분석법을 기준으로 하는 친화성 크로마토그래피 접근법이다. 이는 예컨대 이들의 작용 방식을 연구하기 위해 키나제 억제제에 적용되거나, 표적 식별을 위해 자연 산물에 적용될 수 있다.
용어 "활성화 수준"은 특정 시간에 세포내에서 활성화되는 특정 단백질의 가능성을 나타낸다. 한 가지 예는 그들의 기질을 변형할 수 있도록 특정 부위에서 인산화되는 키나제이다.
용어 "치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 IPP 복합체의 발현 수준의 대표값"은 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서 마커 유전자의 평균 발현 수준의 측정치를 나타낸다. 임상적 이득은 12주 이상 동안 객관적 반응 또는 질병 안정화를 갖는 것으로 정의된다.
특정 실시양태에서, 마커 유전자의 발현 수준은 미세 배열 기술, 또는 정량적 RT-PCR과 같이 RNA 발현 수준을 평가하는 다른 기술, 또는 각각의 단백질의 발현 수준을 보는 임의의 방법(예컨대, 면역조직화학법(IHC))에 의해 측정된다. 유전자 칩의 구성 및 사용이 당해 분야에 널리 공지되어 있다(미국특허 제 5,202,231 호, 제 5,445,934 호, 제 5,525,464 호, 제 5,695,940 호, 제 5,744,305 호, 제 5,795,716 호 및 제 15,800,992 호 참조, 또한 문헌[Johnston, M. Curr. Biol. 8:R171-174 (1998)] 및 문헌[Iyer VR et al., Science 283:83-87 (1999)] 참조). 물론, 유전자의 발현 수준은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 다른 방법, 예컨대, 노던 블랏, RT-PCR, 리얼 타임 정량 PCR, 프라이머 신장, RNase 보호, RNA 발현 프로파일링에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 마커 유전자는 바이오마커 셋트에 대한 다른 바이오마커, 특히 EGFR 바이오마커와 결합될 수 있다. 바이오마커 셋트는 암 환자에서의 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료의 효과에 대해 예측하기 위한 예측적 바이오마커의 임의의 조합으로부터 만들어질 수 있다. 본원에 기술된 바이오마커 및 바이오마커 셋트는 예컨대, 암 환자가 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료 개입에 대해 어떻게 반응할 것인가를 예측하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유전자"는 유전자 변이체를 포함한다. 용어 "변이체"는 진뱅크(GenBank) 등록번호에 주어진 핵산 서열과 실질적으로 유사한 핵산 서열과 관련있다. 용어 "실질적으로 유사한"은 당해 분야의 숙련자에 의해 잘 이해된다. 특히, 유전자 변이체는 인간 집단에서 가장 일반적인 대립 유전자의 핵산 서열에 비해 뉴클레오타이드 교환을 보이는 대립 유전자일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 실질적으로 유사한 핵산 서열은 가장 일반적인 대립 유전자와 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 유사성을 갖는다. 용어 "변이체"는 또한 스플라이스 변이체와 관련된 것을 의미한다.
본 발명에 기술된 유전자의 유전자 발현의 검출 및 정량을 위한 기술은 노던 블랏, RT-PCR, 리얼 타임 정량 PCR, 프라이머 신장, RNase 보호, RNA 발현 프로파일링 및 관련 기술을 비제한적으로 포함한다. 이들 기술은 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다(예컨대, 문헌[Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 2000)] 참조).
본 발명에 기술된 각각의 유전자의 단백질 발현의 검출을 위한 기술은 면역조직화학법(IHC)을 비제한적으로 포함한다.
본 발명의 바이오마커는 암 환자, 특히 난치성 NSCLC 환자를 위한 개별화된 치료법이다. 상기 개별화된 치료법은 치료하는 의료진이 암, 특히 NCSLC 치료법을 위해 존재하는 약물 중에서 가장 적당한 약품을 선택하는 것을 가능하게 해 줄 것이다. 미래의 환자 각각을 위한 개별화된 치료법의 이점은 다음과 같다: 반응 속도/이득을 보는 환자의 수가 증가할 것이고, 비효과적인 치료에 의한 부작용이 감소할 것이다.
본원에 사용된 전문용어는 특정 실시양태를 기술하기 위한 목적이며, 제한하기 위한 의도가 아니라는 것이 이해되어야 한다. 또한, 임의의 방법, 장치 및 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가물인 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있음에도 불구하고, 바람직한 방법, 장치 및 물질이 이하 기술된다.
놀랍게도, 본 발명은 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응이 환자의 종양 샘플에서 함께, 각각, 또는 각각 개별적으로 조합된 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질의 활성화 수준을 측정함으로써 예측될 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 임상 결과에서의 상이함은 화학적 프로테오믹스에 의해 측정된 엘로니팁 및 제피티닙의 단백질 상호작용 프로파일에서의 상이함에 의한 것일 수 있다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두 또는 각각의 발현 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두 또는 각각의 발현 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두 또는 각각의 보다 낮은 발현 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두의 발현 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두의 발현 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두의 보다 낮은 발현 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 ILK 및 PINCH 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 ILK 및 PINCH 유전자 모두의 발현 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK 및 PINCH 유전자 모두의 발현 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK 및 PINCH 유전자 모두의 보다 낮은 발현 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 ILK 및 알파-파빈 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 ILK 및 알파-파빈 유전자 모두의 발현 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK 및 알파-파빈 유전자 모두의 발현 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK 및 알파-파빈 유전자 모두의 보다 낮은 발현 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 알파-파빈 및 PINCH 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두의 발현 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두의 발현 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두의 보다 낮은 발현 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 ILK 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 ILK 유전자의 발현 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK 유전자의 발현 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK 유전자의 보다 낮은 발현 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 PINCH 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 PINCH 유전자의 발현 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 PINCH 유전자의 발현 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 PINCH 유전자의 보다 낮은 발현 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 알파-파빈 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 알파-파빈 유전자의 발현 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 알파-파빈 유전자의 발현 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 알파-파빈 유전자의 보다 낮은 발현 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 발현 수준이 미세 배열 기술에 의해 측정되는, 본원에 기술된 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 단백질의 활성화 수준을 측정하는 단계; 및 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질 모두 또는 각각의 활성화 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질 모두 또는 각각의 활성화 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질 모두 또는 각각의 보다 낮은 활성화 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질의 활성화 수준을 측정하는 단계; 및 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질 모두의 활성화 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질 모두의 활성화 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질 모두의 보다 낮은 활성화 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 ILK 단백질의 활성화 수준을 측정하는 단계; 및 ILK 단백질의 활성화 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK 단백질의 활성화 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK 단백질의 보다 낮은 활성화 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 PINCH 단백질의 활성화 수준을 측정하는 단계; 및 PINCH 단백질의 활성화 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 PINCH 단백질의 활성화 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 PINCH 단백질의 보다 낮은 활성화 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 ILK 및 PINCH 단백질의 활성화 수준을 측정하는 단계; 및 ILK 및 PINCH 단백질 모두의 활성화 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK 및 PINCH 단백질 모두의 활성화 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK 및 PINCH 단백질 모두의 보다 낮은 활성화 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 알파-파빈 및 PINCH 단백질의 활성화 수준을 측정하는 단계; 및 알파-파빈 및 PINCH 단백질 모두의 활성화 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 알파-파빈 및 PINCH 단백질 모두의 활성화 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 알파-파빈 및 PINCH 단백질 모두의 보다 낮은 활성화 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 ILK 및 알파-파빈 단백질의 활성화 수준을 측정하는 단계; 및 ILK 및 알파-파빈 단백질 모두의 활성화 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK 및 알파-파빈 단백질 모두의 활성화 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK 및 알파-파빈 단백질 모두의 보다 낮은 활성화 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 알파-파빈 단백질의 활성화 수준을 측정하는 단계; 및 알파-파빈 단백질의 활성화 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 알파-파빈 단백질의 활성화 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 알파-파빈 단백질의 보다 낮은 활성화 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 환자의 종양 샘플에서의 ILK 단백질의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및 ILK의 인산화 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK의 인산화 수준의 대표값과 비교하는 단계를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK 단백질의 상이한 인산화 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 (i) 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; (ii) ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개 유전자의 발현 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 유전자의 발현 수준의 대표값과 비교하는 단계로서, (iii) 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 유전자의 보다 낮은 발현 수준이 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 단계; 및 (iv) 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료를 상기 환자를 위한 암 치료로서 선택하는 단계를 포함하는, 인간 환자를 위한 암 치료를 선택하는 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 효과량의 엘로티닙 하이드로클로라이드를 환자에게 투여함을 포함하는, 환자의 암을 치료하는 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 유전자의 발현 수준이 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개 유전자의 발현 수준보다 낮은 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 (i) 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 단백질의 활성화 수준을 측정하는 단계; (ii) ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개 단백질의 활성화 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 단백질의 활성화 수준의 대표값과 비교하는 단계로서, (iii) 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 단백질의 보다 낮은 활성화 수준이 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 단계; 및 (iv) 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료를 상기 환자를 위한 암 치료로서 선택하는 단계를 포함하는, 인간 환자를 위한 암 치료를 선택하는 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 효과량의 엘로티닙 하이드로클로라이드를 환자에게 투여함을 포함하는, 환자의 암을 치료하는 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 단백질의 활성화 수준이 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개 단백질의 활성화 수준보다 낮은 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 모두에 관한, 본원에 기술된 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 ILK 및 PINCH 모두에 관한, 본원에 기술된 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 알파-파빈 및 PINCH 모두에 관한, 본원에 기술된 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 ILK 및 알파-파빈 모두에 관한, 본원에 기술된 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 ILK에 관한, 본원에 기술된 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 알파-파빈에 관한, 본원에 기술된 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 PINCH에 관한, 본원에 기술된 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 암이 비소세포성폐암(NSCLC)인, 본원에 기술된 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 암 환자가 제피티닙을 사용하는 치료에 대해 반응하지 않는, 본원에 기술된 방법에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하기 위한, ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개 유전자의 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하기 위한, ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자의 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하기 위한, 알파-파빈 및 PINCH 유전자의 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하기 위한, ILK 및 PINCH 유전자의 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하기 위한, ILK 및 알파-파빈 유전자의 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 (i) 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 단백질의 활성화 수준을 측정하는 단계; (ii) ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두 또는 각각의 발현 수준을 치료로부터 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두 또는 각각의 발현 수준의 대표값과 비교하는 단계; 및 (iii) 엘로티닙 하이드로클로라이드를 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두 또는 각각의 보다 낮은 발현 수준을 갖는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자를 치료하기 위한 엘로티닙 하이드로클로라이드의 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질 모두의 활성화 수준에 관한, 암을 치료하기 위한 엘로티닙 하이드로클로라이드의 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 ILK 단백질의 활성화 수준에 관한, 암을 치료하기 위한 엘로티닙 하이드로클로라이드의 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 알파-파빈 단백질의 활성화 수준에 관한, 암을 치료하기 위한 엘로티닙 하이드로클로라이드의 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 PINCH 단백질의 활성화 수준에 관한, 암을 치료하기 위한 엘로티닙 하이드로클로라이드의 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 ILK 및 알파-파빈 단백질의 활성화 수준에 관한, 암을 치료하기 위한 엘로티닙 하이드로클로라이드의 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 ILK 및 PINCH 단백질의 활성화 수준에 관한, 암을 치료하기 위한 엘로티닙 하이드로클로라이드의 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 알파-파빈 및 PINCH 단백질의 활성화 수준에 관한, 암을 치료하기 위한 엘로티닙 하이드로클로라이드의 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 ILK에 관한, 본원에 기술된 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 알파-파빈에 관한, 본원에 기술된 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 PINCH에 관한, 본원에 기술된 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 암이 NSCLC인, 본원에 기술된 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 암 환자가 제피티닙을 사용하는 치료에 대해 반응을 보이지 않는, 본원에 기술된 용도에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 (i) ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개 유전자의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 화합물; 및 (ii) 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 암의 치료로부터 고통받는 환자의 반응을 예측하기 위해 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함하는, ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개 유전자의 수준을 검출하기 위한 키트로서, 기준 샘플과 비교되는, ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개 유전자의 감소된 발현 수준이 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료로부터 이득을 얻을 수 있는 환자를 나타내는 키트에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 ILK에 관한, 본원에 기술된 키트에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 알파-파빈에 관한, 본원에 기술된 키트에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 PINCH에 관한, 본원에 기술된 키트에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 암이 NSCLC인, 본원에 기술된 키트에 관한 것이다.
특정 목적에서, 본 발명은 암 환자가 제피티닙을 사용하는 치료에 대해 반응하지 않는, 본원에 기술된 키트에 관한 것이다.
또 다른 목적에서, 본 발명은 본 발명의 시험관내 방법에 의해 식별되는 암 환자를 치료하는 치료 방법을 제공한다. 상기 치료 방법은 엘로티닙 하이드로클로라이드를, 동봉된 서열번호 1, 2 및 3의 유전자의 예측적인 발현 및/또는 활성화 패턴을 기준으로 치료를 위해 선택된 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 치료되는 특정 암은 NSCLC이다.
서열번호
서열번호 1은 인간 ILK의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
서열번호 2는 인간 알파-파빈의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
서열번호 3은 인간 PINCH의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
실시예
본 발명은 이제 하기 실시예에서 추가로 기술될 것이고, 이는 단지 설명으로서 의도된 것이며 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
세포 배양
H292 세포를 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신/글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지(깁코(Gibco)-31870)에서 유지시켰다. 1×108의 H292 세포의 펠렛을 2.5ml 완충액(150mM NaCl(나트륨 클로라이드), 1mM CaCl2(칼슘 클로라이드), MgCl2(마그네슘 다이클로라이드), 1% NP40(노닐 페녹시폴리에톡실에탄올), 단백질 가수분해효소 억제제 부재 완전한 EDTA(에틸렌다이아민-테트라아세테이트), 1mM 오르토바나데이트 및 50mM 헤페스(Hepes))에서 용해시켰다. 얼음에서 10분 동안 항온처리한 후, 용해물을 4℃에서 12,000xg로 15분 동안 원심분리하여 투명하게 하였다.
화합물 합성 및 고정
엘로티닙 하이드로클로라이드 및 제피티닙을 에폭시-활성화된 세퍼로즈(sepharose) 6B 비드(쥐이 헬스케어(GE Healthcare))에 공유결합으로 연결되도록 화학적으로 변형시켰다. 유도체를 10mM 나트륨 하이드록사이드(NaOH)의 존재하에 50% 다이메틸포름아마이드(DMF)/0.1M 나트륨 카보네이트(Na2CO3) pH 11에서 암조건의 실온에서 밤새도록 에폭시-활성화된 세퍼로즈 6B에 커플링시켰다. 50% 다이메틸포름아마이드(DMF)/0.1M 나트륨 카보네이트(Na2CO3)로 3회 세척한 후, 남아있는 반응성 기를 1M 에탄올아민으로 차단시켰다. 이어서, 제조사의 지시에 따라 세척 단계를 수행하였다. 결합 효율을 최대 흡수 파장 247 및 330nm에서 커플링되기 전과 후의 화합물 용액의 광학 밀도를 비교함으로써 추산하였다.
경쟁 실험 및 친화성 크로마토그래피
각각의 단백질 500㎍을 엘로티닙 하이드로클로라이드 또는 제피티닙의 증가되는 농도(최종 농도 0, 0.0856, 0.2862, 0.957, 3.2, 10.7, 35.78, 119.6 및 400μM)로 4℃에서 1시간 동안 회전하에 예비 항온처리하였다. 이후, 샘플을 고정된 엘로티닙 하이드로클로라이드 또는 제피티닙으로 4℃에서 3시간 동안 회전으로 평형된 에폭시-활성화된 세퍼로즈 비드와 혼합하였다. 이후, 비드를 용해 완충액으로 3회 세척한 후, 100μL SDS 로딩 완충액으로 재현탁시킨 후 85℃에서 5분 동안 끓이고 12,000xg에서 5분 동안 원심분리하였다.
SDS-PAGE
용리 샘플을 4 내지 20%의 트리스 글라이신 SDS-PAGE(인비트로젠(Invitrogen), EC6025BOX)에서 분리시켰다. 젤을 1시간 동안 40% 에탄올, 10% 아세트산에서 고정시키고 쿠마시 블루(Coomassie blue)(인비트로젠 LC6025)를 사용하여 밤새 염색하였다.
질량 분석
젤 내부 절단(in-gel digestion)을 위하여, 쉐브첸코(Shevchenko, 1996) 등의 개작된 프로토콜을 사용하였다. 간단하게, 각각의 레인의 젤을 9조각으로 잘라 96웰 프록세온(Proxeon) 플레이트에 로딩하였다. 이후, 젤 조각을 밀리큐(milliQ) 물 및 아세토나이트릴로 세척하고, 다이티오트레이티올에서 환원시키고 요오도아세트아마이드로 알킬화시켰다. 세척한 후, 조각을 50ng 트립신(프로메가(Promega), V5111)으로 항온처리하여 밤새 절단하였다. 절단물의 상청액을 모으고, 젤 조각의 펩티드를 25mM 암모늄 바이카보네이트의 1 변화 및 5% 포름산의 2 변화를 사용하여 추출하였다. 모든 상청액을 모아 건조시키고 2% 아세토나이트릴, 5% 포름산으로 재현탁시킨 다음, 전자분사 이온 트랩 질량 분석기(벨로스 LTQ-올비트랩(Velos LTQ-Orbitrap), 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))에 커플링된 나노플로우 액체 크로마토크래피(프록세온(Proxeon) EASY-nLC)를 사용하는 LC-MS/MS로 분석하였다. 펩티드를 아쿠아(AQUA) 100μm 트랩 컬럼에 커플링된 레프로실-PUR C18-아쿠아(ReproSil-PUR C18-AQUA) 3μm 컬럼에서 60분 아세토나이트릴 구배에 걸쳐 분리시켰다.
서열 식별
원 데이터 파일을 시퀘스트(SEQUEST) 검색 알고리즘 27(SEQUEST 버전 27.0, 개정 12, 써모 일렉트론(Thermo Electron))을 사용하여 가공하였다. 검색을 모 이온에 대한 +/-10ppm 및 단편 이온에 대한 +/-1.0Da의 질량 오차로 스위스프롯 인간 데이터베이스(SwissProt Human database)(버전 48, 219024 엔트리)와 비교하여 수행하였다. 메티오닌(환원된/산화된; +15.9949Da)을 차별 수식으로 간주하는 반면, 시스테인을 완전히 카밤아이도메틸화된 것(+58.0133Da)으로 간주하였다. 1개 이하의 절단 미스(miscleavege)를 갖는 완전히 트립신 처리된 펩티드만을 데이터 분석에서 고려하였다. 이들의 엑스코어(XCorr) 스코어가 단독으로, 2중으로, 또는 3중으로 하전된 이온 각각에 대해 2.0, 2.5 또는 3.0을 넘는 경우 및 상응하는 dCn 스코어가 0.1을 초과하는 경우에만 펩티드를 분명하게 식별된 것으로 간주하였다. 본 보고서에서, 2개 이상의 상이한 펩티드가 식별되는 단백질만을 정량 목적을 위해 추가로 처리하였다.
진데이터 리파이너MS 5.2.6( Genedata RefinerMS 5.2.6)을 사용한 질량 분석 데이터
각각의 화합물과 각각의 밴드의 경우를, 독립적으로, 각각의 써모 원 파일을 진데이터 리파이너MS 5.2.6에 의해 로딩하였다. 중심(centroid) 데이터는 메모리 사용을 감소시키기 위해 폐기하였다. 오직 1개의 스펙트럼에서 나타나는 신호만 제거하였다: 샘플의 모든 데이터 표현(크로마토그램)을 공통의 2D m/z-RT 그리드에 나타냈다. 적절한 피크 발견 파라미터에 의존하는 크로마토그램 얼라인먼트를 하기 전에, 피크 발견 파라미터를 시각적으로 조사하였다. 크로마토크램 얼라인먼트는 발견된 공통의 피크 및 트리비얼 트리(Trivial Tree) 알고리즘을 기준으로 하여 크로마토그램 사이에서 체류 시간 이동을 교정한다. 이 작동의 성공을 시각적으로 조사하였다. RT 레인지 리스트릭션(RT Range Restriction)은 크로마토그래피의 23 내지 52분의 정보가 많은 지역 밖의 신호와 데이터를 폐기한다. 크로마토그램 어베레이지 활성은 모든 입력 크로마토그램의 가상의 평균 크로마토그램을 계산한다. 노이즈의 수준은 "강도 역치(Intensity Threshold)" 작업흐름 단계에 의해 1000au 역치 아래의 각각의 신호를 제거하며 감소한다. RT 및 m/z 방향에서의 피크 및 이들의 경계를 발견하고 피크-서라운딩 정사각형으로 시각화하였다. 정사각형을 각각의 크로마토그램에 비추고 엑스트랙티드 이온 카운츠(eXtracted Ion Counts, XIC)를 이 경계 내에서 측정하였다. 피크 당 1개의 행 및 크로마토크램 당 1개의 열을 갖는 생성된 스프레드시트를 다음 작업흐름 단계에서 파일로 저장하였다. 이 신호 경계내에서 발견된 MS/MS 스캔의 스캔아이디(ScanID)를 같은 방식으로 저장하였다. 작업흐름 단계, 이들의 명령 파라미터 및 단계로부터의 진단 정보(예컨대, 샘플 당 국지적 크로마토그래피 이동의 정도, 발견된 신호의 개수)를 요약한 보고서를 작성하였다.
추가 처리
각각의 화합물과 각각의 밴드의 경우, 독립적으로, 각각의 샘플을 퀀틸(Quantile) 방법(문헌[스미스(Smyth) 2003])을 사용하여 정규화하였다. 리파이너MS에서 발견된 피크를 각각의 측정에서의 이들의 스캔아이디를 통한 서열 정보를 사용하여 할당하였다. 식별되지 않은 피크 또는 보다 불분명하게 식별된 피크를 제거하였다. 양적인 정보를 log2-변환시켰다. 처리 조절을 위하여, 양적인 데이터를 프린시팔 콤포넌트 애널리시스(Principal Component Analysis)로 처리하였다: 처음 4개의 주성분의 스코어는 화합물 농도 및 처리 파라미터, 예컨대 젤 레인 수, LC-MS 회분 ID 또는 LC-MS 실행 수와 관련된다. 마할라노비스 거리(Mahalanobis Distance) 가외치(outlier)를 처음 2개의 주성분의 스코어를 기준으로 추산하였다; 95% 신뢰 구간 바깥의 샘플을 가외치로 간주하고 추가의 분석에서 제거하였다.
단백질 대리체에 대한 펩티드 강도의 조합
펩티드를 이들의 잠재적 단백질 전구체에 할당하였다. 각각의 발견된 단백질 전구체의 조합을 전형적으로 단 1개의 단백질 구성원, 또는 단백질 및 스플라이싱된 변형체를 갖는 별개의 단백질 정량 군에 주었다. 이리재리(Irizarry) 등(2003)에 따라, 각 단백질 정량 군의 상대적 풍부도를 선형 가법 모형에 맞추어 정규화 및 log-변형된 엑스트랙티드 이온 카운츠(XIC)로부터 얻었다:
XICijn = μin + αjn + εijn
이때, αj는 펩티드 효과이고, μi는 단백질 정량 군의 로그 크기 상대적 풍부도이고, εij는 평균 0인 독립적인 동일하게 분포된 오류 구간을 나타낸다. 문헌[이리재리 등 (2003)] 및 문헌[홀더(Holder) 등 (2001)]에 기술된 바와 같이, 확실하게 모델 파라미터를 추산하기 위해 중위수 다듬기(median polish)를 사용하였다.
유의한 복용량 반응 검출
화합물의 농도 수로부터 히로츠 대조 행렬(Hirotsu contrast matrix)을 얻고(문헌[브렛츠(Bretz) 등 (2001)] 참조), 처음과 마지막 대조를 제거하였다. 각각의 대조 및 단백질 정량 군을 위해 적당한 t-통계(t-statistics) TSC를 얻었다(문헌[심스(Smyth) 등(2004)] 참고). 각각의 단백질 정량 군을 위해, TMC = max(TSC)를 얻었다(문헌[브렛츠 등 (2001)] 참고). P-값을 문헌[웨스트폴 및 영(Westfall and Young), (1993)]으로부터 유래한 문헌[게(Ge) 등 (2003)]을 기준으로 하여 1000개의 순열과 함께 스텝-다운 maxT 조정된 p-값을 위한 알고리즘을 기준으로 하여 얻었다. |T|가 아닌 T를 선택함으로써 통계의 일면성에 대해 변경하였다.
시각화 및 임의의 계산은 R 2.10.1("R" 인용)을 사용하여 수행하였다.
Figure pct00001
다른 NSCLC 세포주에서의 결합 프로파일 확인
H292, H441, H460 및 H1299 세포를 10% 소 태아 혈청 및 2mmol/L L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지에서 유지시켰다. 화합물 합성, 고정 및 친화성 크로마토그래피를 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 써모 피니그안(Thermo Finnigan) LCQ 데카(Deca) XP에 연결된 LC 시스템(LC-패킹)에서 질량 분석법 분석을 수행하였다. 요약하자면, 펩티드 추출물(1% 포름산과 함께 5% 아세토나이트릴, 0.5% 아세트산, 0.012% HFBA(헵타플루오로부틸산)에서의)을 20μL/분의 속도로 트랩 컬럼(펩맵(PepMap: 상표) C18, 5㎛(LC-패킹스), 5mm×300㎛ I.D.)에 주입하였다. 이어서, 펩티드를 분석 컬럼(매직(Magic) C18(상표) 5㎛(스펙트로넥스(Spectronex), 10cm × 75㎛ I.D.) 상의 용매 A(5% 아세토나이트릴, 0.5% 아세트산, 0.012% HFBA)에 옮겼다. 8분 후에 5 내지 15% 용매 B(80%(부피/부피) 아세토나이트릴중 0.5% 아세트산, 0.012% HFBA), 65분 후에 15 내지 38%의 용매 B, 25분 후에 38 내지 80%의 용매 B의 3 단계 선형 구배를 이용하여 용리를 수행하였다. 컬럼 용출액을 질량 분석기의 ESI 소스에 직접 도입하였다. 질량 분석기를 양이온 모드에서 작동시키고, 데이터-의존 모드에서 단편화를 위해 모 이온을 선택하였다. 원 MS/MS 데이터를 시퀘스트(버전 27)를 사용하여 인간 스위스프롯 데이터베이스와 비교하여 검색하였다. 허용된 1개의 절단 미스 및 1.5Da의 펩티드 질량 오차가 파라미터에 포함되엇다.
TGF베타3 처리시 상피 세포에서 중간엽 세포 상태로 변화(문헌[톰슨 2008])하는 것으로서 이전에 기술되었던 모델 NSCLC 세포주인 H358을 사용하였다. TFG베타3 처리의 13일 후에 E-카데린이 감소하는 결과를 보였고, 이는 세포가 실제로 전이되는 것을 나타낸다(도 5A). TGF베타3 및 제피티닙으로 처리한 세포와 달리, TGF베타3 및 엘로티닙으로 처리한 H358 세포에서의 E-카데린의 수준은 변하지 않았다. 웨스턴 블랏 신호의 정량은 비처리 세포와 13일 동안 TGF베타3으로 처리한 세포 사이에서 E-카데린의 수준이 1/3 초과로 감소하는 것을 나타냈다(도 6B). 엘로티닙으로 처리하는 것은 이 감소를 막아주는 반면, 제피티닙은 E-카데린 수준의 TGF베타3-매개된 감소의 억제에 실패했다(도 5B). ILK 및 PINCH 발현에 대한 효과는 TGF베타3 처리 후 두 단백질의 수준이 증가함을 나타낸다(도 5C 및 D). ILK 및 PINCH의 발현 수준은 엘로티닙으로 처리했을 때 변하지 않았고, 이는 제피티닙으로 처리했을 때 확연하지 않은 효과이다. 따라서, 이 EMT 모델은 E-카데린의 손실을 억제함으로써 엘로티닙이 EMT의 정도를 감소시켜준다는 것을 증명하고, ILK 및 PINCH의 TGF베타3-매개된 증가를 막아준다는 것을 암시한다.
복합체 ILK, 알파-파빈 및 PINCH의 3개 성분이, EMT 상태와 연관된 전체 복합체의 발현 가능성이 아니라 개별적으로 연구되었다. 8개의 EGFR 야생형 NSCLC 세포주를 상피 세포 마커로서 E-카데린의 발현 및 중간엽 세포 마커로서 비멘틴에 의해 평가하여 상기 상태에 의존하여 선택하였다(문헌[톰슨 2005]; 문헌[톰슨 2008]). H358에서의 알파-파빈을 제외하고, 8개의 세포주에서 다양한 강도로 모든 IPP 단백질을 검출하였다(도 6A). 정량화 및 정규화 후에, IPP 복합체 강도의 전체의 합은 상피 세포에 비해 중간엽 세포에서 1.8배 더 높았다. PINCH1이 가장 높게 발현된 단백질이었으며(상피 세포 및 중간엽 세포 각각에서 총 IPP 발현의 55% 및 58%), ILK(25% 및 22%), 알파-파빈(19% 및 20%)이 뒤를 따랐다(도 6B).
E-카데린 및 ILK 발현
IPP 및 EMT와 관련된 보다 전반적인 유전자 사이의 잠재적 관계를 평가하였다. 특히, 이들의 발현 사이의 차이를 엘로티닙으로부터 임상적 이득을 얻은 환자 및 얻지 못한 환자에서 프로파일링하였다. 통틀어서, 21개의 예비-선택된 유전자 중 16개만을 검출된 탐침 셋트를 사용하여 식별하였으며, 통계학적으로 분석하였다. 31개의 탐침 셋트(16개의 특이 유전자에 상응함)중에서, 2개가 임상적 이득을 얻은 환자 및 얻지 않은 환자로부터의 종양 샘플에서 통계학적으로 유의하게 차별 발현을 하였다. 2개의 상응하는 유전자는 임상적 이득을 얻은 환자에서 각각 하향 조절(0.93배, p=0.011)되고 상향 조절(1.38배, p=0.033)된 ILK 및 CDH1(E-카데린)이었다.
EGFR 과 ILK 결정 단백질 구조의 정렬
EGFR-결합된 엘로티닙 또는 제피티닙의 공개적으로 이용가능한 결정 구조 pdb 파일 및 아데노신 트라이포스페이트(ATP)와 복합된 ILK의 결정 구조를 결정학적 데이터베이스 PDB(문헌[베르만(Berman) 2000])(pdb 코드 1M17, 2ITY, 3KMW; 문헌[스타모스(Stamos) 2002]; 문헌[윤(Yun) 2007]; 문헌[푸쿠다(Fukuda) 2009])로부터 다운로드하였다. 3개의 키나제 구조를 ATP 결합 부위를 형성하는 잔기의 부분 집합의 Cα 원자로부터 좌표를 이용하여 구조적으로 정렬하였다(EGFR 넘버링을 기준으로 하는 잔기 번호 691 내지 693, 701 내지 703, 719 내지 72(19)1, 751, 766 내지 772, 820 내지 823, 831 내지 832). 파이몰 시각화 패키지를 사용하여 정렬 및 거리 측정을 하였다.
H358 NSCLC 세포주에서의 EMT 전이 시험
H358 세포주를 재조합 10ng/ml TGF베타3(미국 뉴욕주 뉴욕 소재 페프로테크(Peprotech)) 및 엘로티닙 또는 제피티닙 5μM로 3, 6, 10 및 13일 동안 처리하였다. 3일 마다 세포 배양 배지를 교체하였다. 세포 용해를 1% NP-40 및 단백질 가수분해효소 억제제를 함유한 PBS에서 수행하였다. 4℃에서 15분 동안 12,000g로 원심분리하여 투명하게 한 후, SDS-PAGE로 단백질을 분리시키고 웨스턴 블랏 분석을 위해 가공하였다. 콤팩트 디지털 카메라(발광 이미지 분석기(Luminescent Image Analyzer): 일본 도쿄 소재 후지필름(Fujifilm))를 사용하여 이미지를 찍고 이미지퀀트(ImageQuant) TL(미국 위스콘신주 워키쇼 소재 쥐이 헬스케어(GE Healthcare))을 사용하여 정량화하였다.
MERIT 데이터의 분석
유전자 발현 프로파일을 엘로티닙(150mg/일)을 사용하여 치료한 IIIb/IV기의 NSCLC를 갖는 102명의 환자의 종양 생검 샘플에서 측정하였다. 종양 생검을 어피메트릭스 진칩 휴먼 게놈 U133A 2.0 어레이(Affymetrix GeneChip Human Genome U133A 2.0 Array)(미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재 어피메트릭스(Affymetrix))에 의한 유전자 발현 프로파일링을 사용하여 분석하였다. 본원에 기술된 모든 유전자 발현 결과(폴드 변화 및 p-값)는 이미 보고된 통계학적 분석으로부터 유래한다(문헌[탄(Tan) 2010]). 본 발명자들은 특히 엘로티닙으로부터 임상적 이득을 얻은 환자 및 얻지 않은 환자의 유전자 발현 프로파일 사이의 차이를 자세히 관찰하였다. EMT의 전사 조절 또는 IPP 복합체에 잠재적으로 관련된 하기 21개 단백질을 상응하는 유전자 및 미세 배열 탐침 셋트에 대해 맵핑하였다: 트위스트, 스네일[Sma1], 젭[TCF8], Lef-1, E12/E47 기초 루프 헬릭스[bHLH], 슬러그[Sma2], E-카데린[CDH1], N-카데린[CDH2], Myc, 비멘틴, 카테닌 베타, 카테닌 델타, 피브로넥틴, 에피모르핀, 인테그린-연결된 키나제[ILK], 파빈 알파, 파빈 베타, PINCH 1, PINCH 2, 전이-관련된 단백질 3[MTA3], Y 상자 결합 단백질 1[YB-1].
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cctgaacaaa cactctggca ttgacttcaa acagcttaac ttcctgacga 660 agctcaacga gaatcactct ggagagctat ggaagggccg ctggcagggc aatgacattg 720 tcgtgaaggt gctgaaggtt cgagactgga gtacaaggaa gagcagggac ttcaatgaag 780 agtgtccccg gctcaggatt ttctcgcatc caaatgtgct cccagtgcta ggtgcctgcc 840 agtctccacc tgctcctcat cctactctca tcacacactg gatgccatat ggatccctct 900 acaatgtact acatgaaggc accaatttcg tcgtggacca gagccaggct gtgaagtttg 960 ctttggacat ggcaaggggc atggccttcc tacacacact agagcccctc atcccacgac 1020 atgcactcaa tagccgtagt gtaatgattg atgaggacat gactgcccga attagcatgg 1080 ctgatgtcaa gttctctttc caatgtcctg gtcgcatgta tgcacctgcc tgggtagccc 1140 ccgaagctct gcagaagaag cctgaagaca caaacagacg ctcagcagac atgtggagtt 1200 ttgcagtgct tctgtgggaa ctggtgacac gggaggtacc ctttgctgac ctctccaata 1260 tggagattgg aatgaaggtg gcattggaag gccttcggcc taccatccca ccaggtattt 1320 cccctcatgt gtgtaagctc atgaagatct gcatgaatga agaccctgca aagcgaccca 1380 aatttgacat gattgtgcct atccttgaga agatgcagga caagtaggac tggaaggtcc 1440 ttgcctgaac tccagaggtg tcgggacatg gttgggggaa tgcacctccc caaagcagca 1500 ggcctctggt tgcctccccc gcctccagtc atggtactac cccagccatg gggtccatcc 1560 ccttccccca tccctaccac tgtggcccca agaggggcgg gctcagagct ttgtcacttg 1620 ccacatggtg tctcccaaca tgggagggat cagccccgcc tgtcacaata aagtttatta 1680 tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1731 <210> 2 <211> 4091 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaaagccgca gcctcagtcc cgccgccgcc cgctgcgtcc gcccagcgcc agctccgcgt 60 cccgaccggc ccgcggcagc ctgcgccgcg ccatggccac ctccccgcag aagtcgcctt 120 ctgtccccaa gtctcccact cccaagtcgc ccccgtcccg caagaaagat gattccttct 180 tggggaaact cggagggacc ctggcccgga ggaagaaagc caaggaggtg tccgagctgc 240 aggaggaggg aatgaacgcc atcaacctgc ccctcagccc aattcccttt gagctggacc 300 ccgaggacac gatgctggag gagaatgagg tgcgaacaat ggtggatcca aactcacgca 360 gtgaccccaa gcttcaagaa ctgatgaagg tattaattga ctggattaat gatgtgttgg 420 ttggagaaag aatcattgtg aaagacctag ctgaagattt gtatgatgga caagtcctgc 480 agaagctttt cgagaaactg gagagtgaga agctaaatgt ggctgaggtc acccagtcag 540 agattgctca gaagcaaaaa ctgcagactg tcctggagaa gatcaatgaa accctgaaac 600 ttcctcccag gagcatcaag tggaatgtgg attctgttca tgccaagagc ctggtggcca 660 tcttacacct gctcgttgct ctgtctcagt atttccgcgc accaattcga ctcccagacc 720 atgtttccat ccaagtggtt gtggtccaga aacgagaagg aatcctccag tctcggcaaa 780 tccaagagga aataactggt aacacagagg ctctttccgg gaggcatgaa cgtgatgcct 840 ttgacacctt gttcgaccat gccccagaca agctgaatgt ggtgaaaaag acactcatca 900 ctttcgtgaa caagcacctg aataaactga acctggaggt cacagaactg gaaacccagt 960 ttgcagatgg ggtgtacctg gtgctgctca tggggctcct ggagggctac tttgtgcccc 1020 tgcacagctt cttcctgacc ccggacagct ttgaacagaa ggtcttgaat gtctcctttg 1080 cctttgagct catgcaagat ggagggttgg aaaagccaaa accgcggcca gaagacatag 1140 tcaactgtga cctgaaatct acactacgag tgttgtacaa cctcttcacc aagtaccgta 1200 acgtggagtg aggggctgcc ctgggcccac cactgcccaa gagttcttgc tgttggcgta 1260 ctggaccctc ctccgaactg ccttaccctg cttattcctg tctcttgcac tgtgctctcc 1320 cacaagtcca gctgcaaccc agagatagtg gaaactgaaa ttaggaagga aatcatcaat 1380 aactcagtgg gctgacccat ccctcccagg cgctggggac caacctagca atgaaggttg 1440 ggaaggttgt tcccttcccg gtgccaggtc cagatttccc tccatgattt gggaaccagc 1500 ttaggcaaaa gagtccccac aagatgaaaa taaagatcct agttaccatt caaaggatgc 1560 taactgtgtg tcaggcccca cactaagtgc tctgctctga tatactcaag gccattaatc 1620 ttcaggactc ccattgacgt aggtgtttca ttcccctttt acagatgagg aaactaaggc 1680 ttggaggtta aatgacttgc cagaagttgg aatttttttc ctctttgaac ataacctctc 1740 ccttctccct aaaggtaacc actattctga gtccaatcat caaggttttg cttttctttt 1800 tagctaagta tgcattcctc aatagtagac agtacaacat gtttataaca agccaattac 1860 attatgttct ttgcatgttc taaagttgtg tatgtgtgtg cacatctgag cacgtgcaca 1920 tgtacacctg agccaaaaac acgagaaccc actgatctca ccactggggc aagctaggtc 1980 agagcttagt gattcacact gaaattggca aattggattt aacccaatta atagtgtgtg 2040 tgtggcagga gtcatgtccc tcacatcctt tgtacaaatg aaaattactc ttaattcctt 2100 cagatttata ataactctgt actttggttt cagggtgaca tttgggaagg attttgttta 2160 gaattaatgg agtggcacat tttgcagcct ttttgcttga ttgcatgtaa tggaaatgcc 2220 ctatattttc ctgcaaaata agtactaaat tcattatcgt taagcaaatg tacaatatgc 2280 tcaggcaccg cagagagctg ggcacgggcc catgtgagca tcactttgga agtagggctc 2340 ttcaacaggg acccttgaac tttaaagaaa ggaacttctt tttgccttct aattgatcat 2400 ttagactatt ctggctaagt ctgcccacat gtaattaccg gctaattcaa gcgaggaaaa 2460 atgtaagtca tttagaccaa agccaagcag tttctttgcg tgggttactc aagggcttgt 2520 ggttacttgt atctcctcta tgtgaacttg actttgaaag acagagctct agtgtgccag 2580 cctgctaagt cctgtaagaa tagggaaggg cggagggggg tgggcagtga ctaggggacg 2640 agaagcatgg ggaaaatatt tgcactctaa acatacagag atagaggtgg ggcttgtggt 2700 acttaacact tgtagccatc aactgactga gaccttgggc taaataatca attgtgctga 2760 tattacatct cgttatggaa tgttcctaaa tatgccaggt agacaccagc ccaagtaccc 2820 tcctccagaa gtctgtgact accttgtcac tactttaggc ccattccaca aagcccatct 2880 ctggtttgag aattcatttt gatctgtatc tacaccaccc aaagttaggc ctcctataat 2940 gtccaaaaca ttcctttcag cctttttatt tcttactgta ctgtctctta ctgtactgtc 3000 tatctgcagt aattgaggac ccataaaatt tagataacta catgtctttg ctcttagaat 3060 tgtcactcag cataatgagc atttaacata caaaggcaat gtactgtttt gtgttgatct 3120 atgtaaaaga atacaattct tttttacata attagtgaaa ttttattttt tattaggaaa 3180 cactaaatag tgtaatattt cttttgcttt taaaaaaatt cctggtagca aatcaagata 3240 aataattgct tcattttctt gagcaatact gaagcaggat gaagtaagag gaatgcattc 3300 atttaaacat gctttgcttt atgaattttg tctctttttt ggtctctttt tcttatattc 3360 aagttacaaa tgtacaagta tccttactaa gagtgctcct tttgtatttt acatatatac 3420 agtatgaaaa tacattggaa cactaggaaa gtttttaaat aacagttcta atttatcaga 3480 aaattgtgtt ttgggattga gttctttgtc tcagcccaga atcccaggtc ctgggcctgg 3540 ttttctaatg ctgtcatctc agttcgatat tttactttag aatctggaat ctcctactta 3600 atatatgacc atgactttga aaggcaaaag aggaatcaag aataaataaa acaaacttaa 3660 tcttcatctt taaaaaaaag aaaaaagaaa ccaaaatgag aatcaacact tcataggctc 3720 actgggtttt cttttctttt ctgttaattt aaactcagtt atttttaatg cttaatacat 3780 acatggtgca aaatttaaaa agcgcaaata ggtatctagt ggaaaaccta agcctccctc 3840 tctctccggc acccattacc tctccctgga ggcaactgtt ttgatccatt tcttacacac 3900 actgccagag atactctagg catgtaaagc acaaacatac atataaaatc tgcgggcttc 3960 aaaaaatata agtaggatgt catctatact gtcatacact ttgtttttta tcacttactt 4020 aatgttatat cttggatatt gtattaccct gggtattaaa aagaactcct ttcacatttt 4080 aaaataaaaa a 4091 <210> 3 <211> 1877 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 acaaagactg tgtcactact ttgtggaatg ttattttaga acttccagaa tgcctcagta 60 aatcctgact gccatgtaac tgtgtactgt gctgctgagc tcttaacatg aagcagcagc 120 agtgaccctg gcgggccagg ctgacgtgcg tgggaacagt gggagtgacc ctggctggga 180 agcagggagg cctggatatt gtttctcctg gctctgtgtc ctgccattct catccctgtg 240 ctcagagctc tcaagcaccc acgatggcct tctcaggccg agcgcgcccc tgcattatcc 300 cagagaacga agaaatcccc cgagcagccc ttaacactgt ccacgaggcc aatgggaccg 360 aggacgagag ggctgtttcc aaactgcagc gcaggcacag tgacgtgaaa gtctacaagg 420 agttctgtga cttttatgcg aaattcaaca tggccaacgc cctggccagc gccacttgcg 480 agcgctgcaa gggcggcttt gcgcccgctg agaagatcgt gaacagtaat ggggagctgt 540 accatgagca gtgtttcgtg tgcgctcagt gcttccagca gttcccagaa ggactcttct 600 atgagtttga aggaagaaag tactgtgaac atgactttca gatgctcttt gccccttgct 660 gtcatcagtg tggtgaattc atcattggcc gagttatcaa agccatgaat aacagctggc 720 atccggagtg cttccgctgt gacctctgcc aggaagttct ggcagatatc gggtttgtca 780 agaatgctgg gagacacctg tgtcgcccct gtcataatcg tgagaaagcc agaggccttg 840 ggaaatacat ctgccagaaa tgccatgcta tcatcgatga gcagcctctg atattcaaga 900 acgaccccta ccatccagac catttcaact gcgccaactg cgggaaggag ctgactgccg 960 atgcacggga gctgaaaggg gagctatact gcctcccatg ccatgataaa atgggggtcc 1020 ccatctgtgg tgcttgccga cggcccatcg aagggcgcgt ggtgaacgct atgggcaagc 1080 agtggcatgt ggagcatttt gtttgtgcca agtgtgagaa accctttctt ggacatcgcc 1140 attatgagag gaaaggcctg gcatattgtg aaactcacta taaccagcta tttggtgatg 1200 tttgcttcca ctgcaatcgt gttatagaag gtgatgtggt ctctgctctt aataaggcct 1260 ggtgcgtgaa ctgctttgcc tgttctacct gcaacactaa attaacactc aagaataagt 1320 ttgtggagtt tgacatgaag ccagtctgta agaagtgcta tgagaaattt ccattggagc 1380 tgaagaaaag acttaagaaa ctagctgaga ccttaggaag gaaataagtt cctttatttt 1440 ttcttttcta tgcaagataa gagattacca acattacttg tcttgatcta cccatattta 1500 aagctatatc tcaaagcagt tgagagaaga ggacctatat gaatggtttt atgtcatttt 1560 tttaattaaa aaagaaaaat tcatataatc gtgtttaaaa cacaaatgaa gtcagtattt 1620 gcctttgtta acccttatcc atttgttgac atgtagactg tttacaaaaa aaaaacacat 1680 ggttaaatgt taaattttaa ttaaggcccc caaaaattaa atataacttt ttaaaatgaa 1740 aggagtcacc ttttacatga ctcaggtgaa aaaacagtat aaacattaat ttactttgtg 1800 ttcaaaagaa aattccaact gctgttgggg aaggacacag aaaagaaaaa taaccaccca 1860 agaaaaacaa aaaaaaa 1877

Claims (18)

  1. 환자의 종양 샘플에서의 ILK(인테그린-연결된 키나제), 알파-파빈 및 PINCH(특히 관심있는 Cyc-His-풍부 단백질) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두 또는 각각의 발현 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두 또는 각각의 발현 수준의 대표값과 비교하는 단계
    를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두 또는 각각의 보다 낮은 발현 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    발현 수준이 미세 배열 기술에 의해 측정되는 시험관내 방법.
  3. 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 단백질의 활성화 수준을 측정하는 단계; 및
    ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질 모두 또는 각각의 활성화 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질 모두 또는 각각의 활성화 수준의 대표값과 비교하는 단계
    를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질 모두 또는 각각의 보다 낮은 활성화 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법.
  4. 환자의 종양 샘플에서의 ILK 단백질의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및
    ILK 단백질의 인산화 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK 단백질의 인산화 수준의 대표값과 비교하는 단계
    를 포함하는, 엘로티닙 하이드로클로라이드를 사용하는 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하는 시험관내 방법으로서, 환자의 종양 샘플에서의 ILK 단백질의 상이한 인산화 수준이 치료로부터 임상적 이득을 얻는 환자를 나타내는 시험관내 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,
    ILK, 알파-파빈 및 PINCH 모두에 관한 시험관내 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,
    ILK에 관한 시험관내 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,
    알파-파빈에 관한 시험관내 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,
    PINCH에 관한 시험관내 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
    암이 비소세포성폐암(NSCLC)인 시험관내 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 있어서,
    암 환자가 제피티닙을 사용하는 치료에 대해 반응하지 않는 시험관내 방법.
  11. 엘로티닙 하이드로클로라이드 치료에 대한 암 환자의 반응을 예측하기 위한, ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 유전자의 용도.
  12. (i) 환자의 종양 샘플에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 단백질의 활성화 수준을 측정하고;
    (ii) ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두 또는 각각의 발현 수준을 치료로부터 임상적 이득을 얻지 못한 환자 집단의 종양에서의 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두 또는 각각의 발현 수준의 대표값과 비교하고;
    (iii) 엘로티닙 하이드로클로라이드를 ILK, 알파-파빈 및 PINCH 유전자 모두 또는 각각의 보다 낮은 발현 수준을 갖는 환자에게 투여함으로써
    암을 치료하기 위한 엘로티닙 하이드로클로라이드의 용도.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    ILK에 관한 용도.
  14. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    알파-파빈에 관한 용도.
  15. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    PINCH에 관한 용도.
  16. 제 11 항 내지 제 15 항중 어느 한 항에 있어서,
    암이 NSCLC인 용도.
  17. 제 11 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 있어서,
    암 환자가 제피티닙을 사용하는 치료에 대해 반응하지 않는 용도.
  18. 본원에 기술되어 있는 발명.
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