TWI567391B - 辨識早期肺腺癌病患之次群組之生物標記 - Google Patents

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Description

辨識早期肺腺癌病患之次群組之生物標記
本發明係關於在早期NSCLC中辨識出早期肺腺癌病患之次群組之生物標記及方法，其可用以協助輔助療法之臨床試驗設計。
根據35 U.S.C 119(e)，本申請案享有於2011年5月23日申請之美國臨時申請案第61/489,063號之優先權，其所有內容皆被引用併入本文中。
肺癌為全球與癌症相關之死亡之主要成因。對於早期非小細胞癌(NSCLC)，手術切除為治療早期非小細胞肺癌(NSCLC)之選擇之一1,2。雖然手術切除仍為主要治療方式，且可提供最佳之存活機會3-6，然而，於第I期NSCLC中，已報告之失敗率介於27%至38%5-9，且約90%之癌症死亡皆與腫瘤復發或轉移有關連8-12。許多隨機的臨床試驗已評估輔助性化學療法於切除第I期之NSCLC病患13-15中之角色，以及試著於手術切除後，找出具高復發風險或預後不良之病患。然而，該結果仍具爭議性。
於先前技術之參考文獻中發現，具有第I期NSCLC之病患經以手術切除後具有相對好的術後結果3-6。然而，經手術切除後復發之病患的存活率是不佳的8-12。於大多數國家，腺癌為NSCLC之最常見的組織亞型28,29。再者，於過去數十年中，鱗狀細胞癌罹患率已降低，而腺癌於兩種性別之罹患率卻都增加了28。雖然於局部擴散性NSCLC進行術後的輔助性化學療法仍被廣泛地接受；然而，於早期NSCLC中，輔助性化學療法之角色仍待決定。於文獻中許多報告試著於具有第I期NSCLC的病患中辨識出不佳的預後因子，以進行輔助性療法13-15。再者，許多目前臨床試驗發現，組織性次群組對於標的療法及較新的化學療法具有不同的術後結果30-33。
因此，在早期即辨識出具高風險之早期肺腺癌病患之次群組，對於以組織學為基礎之療法是重要且有需要的。
於本發明中，不可預期地發現了T淋巴激素活化之殺手細胞源蛋白激酶(TOPK)為肺癌中具潛力的治療標的，其可藉由調控PI3K/PTEN/AKT依賴之訊號傳遞路徑以促進細胞移動。再者，於本發明中亦發現將TOPK剔弱可降低肺癌幹細胞特性及增加對於順鉑(cisplatin)所誘發之肺癌細胞死亡的敏感性。亦即，本發明提供一種可於早期NSCLC中辨識早期肺腺癌病患之次群組的生物標記，即T淋巴激素活化之殺手細胞源蛋白激酶(TOPK)，以及肺癌之治療標的。
因此，在一方面，本發明提供一種於早期NSCLC病患中辨識出早期肺腺癌病患之次群組的方法，包含測定源自該等病患的組織樣本中TOPK表現程度，並依據TOPK表現程度以辨識早期肺腺癌病患之次群組；其中若發現該病患的組織樣本中TOPK過量表現，則該病患之總存活率為不佳。
於另一方面，本發明提供一種用於設計臨床試驗之方法供早期NSCLC病患治療肺腺癌，該方法包含測定源自該病患的組織樣本中TOPK表現程度，並依據該病患之組織樣本中TOPK表現程度將病患之存活程度進一步分群。
於又一方面，本發明提供一種用於評估切除第I期腺癌之病患的預後值之方法，包含測定源自該病患之組織樣本中TOPK表現程度，及根據TOPK表現程度以辨識該病患之預後值；其中若發現病患的組織樣本中TOPK過量表現，則該病患之預後值不佳。
於再一方面中，本發明提供TOPK抑制劑之用途，係藉由降低癌幹細胞特性及增加對於順鉑(cisplatin)所誘發之癌細胞死亡的敏感性，以用於製備治療癌症之醫藥組合物。
本文所使用的「T淋巴激素活化之殺手細胞源蛋白激酶(TOPK)」或「PDZ結合激酶(PDZ-binding kinase，PBK)」乙詞是指一個具有322個胺基酸的類MAPKK之絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶。
於本發明中，不可預期地發現T淋巴激素活化之殺手細胞源蛋白激酶(TOPK)可作為一生物標記，以於早期非小細胞肺癌(NSCLC)中辨識早期肺腺癌病患之次群組；此對於臨床試驗於輔助療法之設計有很大的助益。本發明發現TOPK為肺癌之具潛力的治療標的，係可藉由調控PI3K/PTEN/AKT依賴之訊號傳遞路徑以促進細胞移動。因為腫瘤復發為經手術切除早期肺腺癌治療後最常見之治療失敗的原因，TOPK過量表現可預先決定腫瘤之轉移能力及作為一顯著的預後因子，以預測縮短的總存活率及復發時間。
因此，本發明提供一種於早期NSCLC病患中辨識早期肺腺癌病患之次群組的方法，包含測定源自該等病患的組織樣本中TOPK表現程度，並依據TOPK表現程度以辨識早期肺腺癌病患之次群組；其中若發現該病患的組織樣本中TOPK過量表現，則該病患之總存活率為不佳。
再者，本發明提供一種用於設計臨床試驗之方法供早期NSCLC病患治療肺腺癌，該方法包含測定源自該病患的組織樣本中TOPK表現程度，並依據TOPK表現程度以辨識早期肺腺癌病患之次群組，並按照該等病患之組織樣本中TOPK表現程度將病患之存活程度進一步分群。
另一方面，本發明提供一種用於評估切除第I期腺癌之病患的預後值之方法，包含測定源自該病患之組織樣本中TOPK表現程度，及根據TOPK表現程度以辨識該病患之預後值；其中若發現病患的組織樣本中TOPK過量表現，則該病患之預後值不佳。
此外，經以實例確認，於A549細胞中將TOPK剔弱可降低癌幹細胞特性及增加對於順鉑(cisplatin)所誘發之細胞死亡的敏感性。因此，本發明提供TOPK抑制劑之用途，係藉由降低癌幹細胞特性及增加對於順鉑(cisplatin)所誘發之癌細胞死亡的敏感性，以用於製備治療癌症之醫藥組合物。
於本發明之一具體實施例中，該癌症為肺癌，具體而言為非小細胞肺癌(NSCLC)。
此處所使用的「TOPK抑制劑」乙詞是指一分子、化合物、或物質，其實質上可抑制或降低TOPK的表現或活性。
於本發明之一具體實施例中，該TOPK抑制劑可為核酸分子，如短(或小)的干擾RNA(siRNA)，或短(或小)的髮夾RNA(shRNA)。此處所使用的「短(或小)干擾RNA」或「siRNA」乙詞是指一雙股RNA分子，其具有20-25個核苷酸長度，其於RNA干擾(RNAi)路徑中扮演一重要角色，其中該siRNA可干擾特定基因的表現程度。此處所使用的「短(或小)髮夾RNA」或「shRNA」乙詞是指一RNA序列，其可形成一緊密的髮夾型彎曲，並可藉由RNA干擾以靜默基因的表現。
於本發明之另一具體實施例中，TOPK抑制劑可為一化合物，其係選自由硫達嗪(Thioridazine)、普氯哌嗪(Prochlorperazine)、茵芋鹼(Skimmianine)、吐根鹼(Emetine)、DL-塞奧芬(DL-thiorphan)、比沙可啶(Bisacodyl)、阿司咪唑(Astemizole)、吡維(Pyrvinium)、坦螺旋黴素(Tanespimycin)、氯丙嗪(Perphenazine)、三氟拉嗪(Trifluoperazine)、氯丙嗪(Chlorpormazine)、異煙肼(isoniazid)、他克羅林(tacrolimus)、及漆黃素(Fisetin)所組成之群組，其係藉由使用源自TOPK siRNA之基因標記(gene signature)查詢連接圖譜(Connectivity Map,CMap)88，以辨識出該等化合物可作為TOPK之可能的抑制劑。
根據本發明，該TOPK抑制劑為siRNA或shRNA，其可抑制或降低TOPK的表現。於本發明之實例中，該siRNA為siTOPK-1，其具有如SEQ ID NO：1所述之第一股，或為siTOPK-2，其具有如SEQ ID NO：2所述之第一股。於本發明之其他實例中，該shRNA為shTOPK-3，其具有如SEQ ID NO：3所述之序列；或為shTOPK-4，其具有如SEQ ID NO：4所述之序列。siRNA及shRNA兩者皆可用該領域任何已知或常用之方式送入細胞中。
本發明將以下述具體實施例來更特定的闡述，該等所提供之具體實施例僅用於示例性而非用於侷限本發明之目的。
實施例
I.臨床試驗數據及Q-RT-PCR分析
材料/個體及方法
用以進行微陣列及Q-RT-PCR分析之臨床樣本
本研究中係使用兩組肺腺癌微陣列數據組。第一組為吾人先前研究中之總共66個樣本，藉由HG-U133A晶片進行微陣列分析。該等樣本包含源自27個接受過肺癌手術之病患的成對樣本及數種肺癌細胞株，像是CL1-0及CL1-5。第二組，另外50個樣本，係對應於源自肺癌病患的25個成對手術樣本，將之以HG-U133 plus 2.0晶片進行微陣列分析。該兩組數據組已存放於NCBI的基因表現資料庫(Gene Expression Omnibus，GEO)中，且可藉由GEO系列登錄號GSE7670及GSE27262取得。本研究之試驗方法係經台北榮民總醫院之倫理委員會許可。所有病患已給予知情同意書，並個別地簽署該同意書(VGHIRB No.：95-06-21A)。該等病患皆無接受過新輔助性療法(neoadiuvant treatment)，如：於手術前的化學療法。研究樣本包含經病理專家確認之腫瘤及鄰近的正常組織，係於診斷性組織切片時取得，以及鄰近的正常組織係從腫瘤外之鄰近 部位所取得。腫瘤及鄰近之正常組織皆以液態氮快速冷凍之，且分離RNA樣本以供微陣列分析及接續的Q-RT-PCR研究。腫瘤的組織切片型態及時期，係根據世界衛生組織(World Health Organization)之分類及肺癌之國際分期法決定47,3。源自肺癌病患之18組腫瘤及鄰近正常之成對樣本的TOPK mRNA表現程度係以Q-RT-PCR評估，該Q-RT-PCR係以Taq-Man探針(ABI)實行之。試驗皆以Applied Biosystems Model 7700儀器進行三重複試驗。數據係以平均值±s.d.表示。為了分析腫瘤及鄰近的正常樣本之分佈情形，吾人係以Wilcoxon符號等級檢定(Wilcoxon signed rank test)進行兩組間的統計分析。
免疫組織化學染色
所用之組織係來自於高雄醫學大學醫院。所有臨床樣本係自高雄醫學大學進行腫瘤切除或手術步驟之病患中取得，且皆附有知情同意書及人體試驗委員會之同意。收集病患資訊，包含姓別、年齡及病理組織診斷。手術樣本於建檔保存前皆經福馬林固定並包埋於石蠟中。吾人使用該等建檔保存的樣本進行免疫組織化學染色。病患之追蹤觀察係進行長達200個月。四點染色強度計分系統被設計用於測定於癌症樣本中之TOPK相對表現程度；該染色強度分數從0(無表現)至3(最高表現)。所有的免疫組織化學染色結果經兩位病理專家分別進行審閱及計分。所用之抗體包含抗人類的TOPK(1：100，Cell Signaling)及PTEN(1：50，Dako)。免疫檢測係以HRP-DAB檢測套組(Vector Laboratories)進行。Cox比例風險回歸遂被用以測試於單變量模式及多變量模式中之因子的預後顯著性。斯皮爾曼等級相關性分析(Spearman's rank correlations)係用於測定TOPK及PTEN免疫組織化學染色間的比較關係。所有統計分析為雙尾測定，且當p<0.05被認為具顯著差異。
細胞、試劑移動及侵犯試驗
所有細胞培養相關的試劑皆購自Invitrogen。人類肺癌細胞株A549、H23及H1299、以及IMR90細胞係購自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)。人類肺腺癌細胞株CL1-0及CL1-5，係為楊泮池教授所慷慨贈與。所有細胞係於適當的培養基中進行培養，如A549、CL1-0及CL1-5是用RPMI 1640培養基；IMR90、H1299及H23是用DMEM培養基。每一個培養基係添加10%胎牛血清、2 mM的L-麩醯胺酸(L-glutamine)及1%的青黴素/鏈黴素。細胞轉染係根據製造商之指示以親脂胺(lipofetamine)(Invitrogen)進行。為了剔弱TOPK之固有的表現程度，遂由Applied Biosystems購買三個siRNA，其序列分別可抗TOPK(si-TOPK1：5’-GCAGCCAUAAUUUUAAAAGdTdT-3’、si-TOPK2：5’-CCCUGAGGCUUGUUACAUUdTdT-3’、si-TOPK3：5’-GCUCUGGAAACAGAUGUCUdTdT-3’)。另外，亦以不規則的siRNA二連體做為負對照組。於轉染後24或48小時，收集細胞，並將之進行移動或增生試驗，並以先前所述之西方墨點法測定TOPK的蛋白量(Chen et al 2009a)。所用之藥物型抑制劑(LY294002、U0126、及SB203580)來自Cell Signaling。所用之初級抗體(稀釋倍率)，包含：抗-TOPK(1：1000，BD Biosciences)、抗-Flag M2(1：3000，Sigma)、抗-磷酸-AKT(1：1000，Cell Signaling)、抗-AKT(1：1000，Cell Signaling)、抗-PTEN(1：1000，Cell Signaling)、抗-β-微管蛋白(1：3000，Santa Cruz Biotechnology)及抗-HA(1：3000，Upstate)。
選殖及突變誘發
為了構築TOPK表現質體，TOPK cDNA的序列係利用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)自MCG株中以PCR增幅。用以選殖野生型TOPK之引子對為5’-ATACACGGTCCGATGGAAGGGATCAGTAATTTC-3’及 5’-GATGACGGACCGCTAGACATCTGTTTCCAGAGC-3’(下底線係指限制酶之切位)。將PCR產物分別插入pCMV-2-FLAG或pcDNA3.1-HA表現載體之CPO1位置中。吾人亦製備了一個激酶-死亡(kinase-dead，KD)突變體，其中將Lys64及Lys65以Ala(K64-65A)取代。17
結果
1.透過基因表現數據組之整合辨識出TOPK為一肺腺癌之正調控及轉移相關的蛋白激酶
為了快速找出可用於肺癌療法之首要標的，尤其是涉及轉移之較不清楚特性的蛋白激酶，吾人建立一個生物資訊平台整合四個轉錄體數據組，以辨識出該等基因。經吾人生物資訊的調查結果，吾人係以較不清楚特性的TOPK基因為首要標的。首先，吾人使用一訓練用微陣列數據組，所述樣本係源自具有肺腺癌之27個病患，且經組織病理學確認過，該等樣本係以HG-U133A進行Affymetrix微陣列圖譜分析55。以Wilcoxon符號等級檢定(p<0.01)及使用Benjamini及Hochberg錯誤發現率關連性(p<0.01)進行檢測，在鄰近正常區域及腫瘤間之不同表現程度之轉錄產物中，TOPK係為正調控表現的，如箱型圖所示(圖1A，左)。兩個已知的致癌基因蛋白激酶EGFR及AURKA，亦於相同數據組中顯示為過量表現(圖1A，左)；此結果顯示微陣列圖譜可作為一前所未有的平台，可用於發現與致癌機轉有關的新穎調控子，例如肺癌。第二，為了證實此一發現，吾人進行一獨立的微陣列分析，將25個成對的、第I期之肺腺癌病患樣本以一新的Affymetrix微陣列(HG-U133 plus 2.0)晶片及相同的統計分析圖譜化。再次地，相較於鄰近正常區域，於腫瘤中之TOPK表現係為正調控的(圖1A，右)。
第三，為了提供吾人於電腦篩選的額外資訊，吾人創造兩組轉移的標記。公開可取得的微陣列資料(從GEO下載)係 用於取得不同的微陣列數據組，將之以Quantile Normalization進行標準化，以利用R建立具潛力之轉移生物標記辨識平台。如前述47，吾人比較了225個二次轉移的腫瘤(包含20個腫瘤轉移至淋巴結，及200個轉移性腫瘤)，以及30個良性腫瘤，以取得轉移的具潛力之啟動子組。TOPK存在著不同的表現模式，如箱型圖所示(圖1B，左)。最後，由於經gefitinib治療後52，肺癌通常會轉移至腦部，因此，吾人將6個市售可得之正常腦部及5個肺腺癌轉移至腦部的樣本進行比較。基因表現有所區別的即被認為具有潛力參與肺腺癌轉移機轉，而TOPK為其中之一(圖1B，右)。經由四個不同的微陣列數據組之結合，辨識出TOPK為肺腺癌中一過量表現且與轉移有關的蛋白激酶。該等資料顯示TOPK之正調控可能導致於人類肺腺癌中所出現之部分異常。
2.肺腺癌及侵入性的肺癌細胞株中提高之TOPK表現
為了釐清TOPK於肺癌發展的分子機制，吾人先確認TOPK之基因表現圖譜數據。將24個成對的肺腺癌腫瘤及鄰近的非腫瘤樣本進行定量即時PCR。於24個肺腫瘤病患樣本中之20個發現具有過量表現之TOPK，經與DDX5標準化後，TOPK顯示較高的訊號；其中DDX5為一新穎的肺腺癌內對照組55，可用以控制模版的置入量是相同的。於肺腺癌中，TOPK平均表現程度高於該等鄰近非腫瘤肺組織樣本約5倍，如箱型圖所分析(圖1C)。接著，吾人檢測及比較於人類肺纖維母細胞株IMR90及一群肺癌細胞株的TOPK蛋白表現程度。如圖1D所示，於肺癌細胞株中，TOPK蛋白顯著地表現，而於IMR90細胞中則無法偵測到。再者，相較於較低侵入性之CL1-0細胞，於高度侵入性CL1-5細胞株中，TOPK的蛋白表現程度較高。
3. TOPK之過量表現促進肺癌細胞株之細胞移動及侵入
由於TOPK之表現與肺癌細胞的侵入性有關，因此，TOPK的表現很有可能於癌症轉移中扮演重要的角色。吾人因此探討於NSCLC細胞中過量表現TOPK是否可影響細胞移動或侵入；其中該NSCLC細胞株具有低程度之內生性TOPK表現，如：CL1-0及H1299細胞。吾人將對照組載體及以Flag標籤的TOPK表現質體，分別暫時性地轉染入CL1-0及H1299細胞中，並測試TOPK對於細胞移動、侵入及細胞增生之影響。如所預期的，相較於對照組細胞，於CL1-0及H1299細胞中過量表現外源Flag標籤的TOPK，導致細胞移動增加3.1倍(CL1-0)及2.8倍(H1299)、以及細胞侵入增加約2倍(CL1-0及H1299細胞)(圖2A及B)。所觀察到的TOPK移動及侵入促進能力係大幅度地取決於其激酶活性，此係由於過量表現一催化不活化之TOPK(TOPK-KD)於細胞移動或侵入上不具顯著效果。此外，雖然TOPK被報導於高度增生細胞中過量表現(Simons-Evelyn et al 2001)，然而異位地過量表現TOPK於24小時不會顯著地影響細胞增生，顯示TOPK可增強肺癌細胞之移動及侵入能力，而不會促進增生。
4. PI3K/AKT-依賴訊號對於TOPK所誘導的細胞移動十分重要
腫瘤細胞具有與增強之轉移相關的廣泛之移動及侵入機轉範圍46。為了探討何種訊號傳遞路徑可能參與於肺癌細胞中TOPK-所媒介的細胞移動，吾人使用特定的藥理性抑制劑以探討三個已知的訊號路徑，即MEK/ERK、p38及PI3K/AKT路徑。於CL1-0細胞中異位表現TOPK所刺激增加之細胞移動經LY294002處理後被強烈地降低，U0126及SB203580則抑制至一較小的程度(圖3A)。再者，相較於對照組及TOPK-KD-表現細胞，可於TOPK-WT-表現的CL1-0細胞中觀察到提高的AKT-Ser473磷酸化程度。相似結果可從H1299細胞中得到(圖 3C)。綜合上述，該等資料指出PI3K/AKT路徑涉及TOPK所誘導的細胞移動。
5.於TOPK過量表現之細胞中，AKT磷酸化及PTEN表現程度為逆相關
PTEN係為一脂質磷酸酶，其係藉由負向地控制PI3K/AKT訊號路徑而作為一腫瘤抑制劑。PTEN的不活化常導致於多種腫瘤類型中AKT活性的增加，包含肺腺癌64,68。於多種不同腫瘤細胞株中異位表現PTEN，可於多種已知之PI3K訊號路徑的生物性功能上發揮抑制效果，如：移動40。關於TOPK如何調節PI3K/AKT路徑，吾人發現，相較於對照組及TOPK-KD轉染細胞，於TOPK-WT-過量表現之細胞的PTEN蛋白表現程度是降低的(圖3B至C)。為了提供額外的證據以支持此發現，係以TOPK異位表現於人類肺纖維母細胞株IMR90進行評估，該細胞不含有可偵測的內源性TOPK。儘管IMR90轉染效率低，過量表現TOPK導致PTEN之負調控、AKT-Ser473磷酸化之正調控及增強的細胞移動(圖3D)，此結果與吾人其他觀察一致。
6. siRNA所媒介的內生性TOPK耗盡可抑制肺癌細胞移動及PI3K/AKT訊號傳遞
為了進一步確認TOPK影響細胞移動是藉由調控PI3K/PTEN/AKT訊號傳遞路徑，吾人接著檢測TOPK專一性之siRNAs是否可於A549細胞中，影響細胞移動及活化內生性AKT。吾人將三個化學合成的TOPK專一性之siRNAs(si-TOPK1~3)及一不規則的對照組siRNA(負對照組)轉染入A549細胞中，並於轉染後48小時分析TOPK之表現程度。數據顯示於TOPK siRNA轉染細胞中，TOPK蛋白係以不同的程度被降低了，此與細胞移動的降低呈現一致性(圖4A)。與先前研究相符，TOPK耗盡之細胞的移動能力降低並 非細胞增生速率之不同所造成，如細胞增生試驗所示。此外，數據指出，相較於以對照組處理者或不規則對照組細胞所觀察者，於TOPK耗盡之細胞中，AKT-Ser473磷酸化大幅度降低；且此降低的發生與PTEN蛋白表現程度的增加呈現平行關係(圖4A，左圖)。相似的結果亦可於H23細胞中觀察到(圖4B)。綜合上述，該等結果加強了TOPK調控PI3K/PTEN/AKT訊號傳遞路徑之證據性。
7. TOPK藉由減緩PTEN所媒介的負向調控以誘導PI3K/AKT依賴之細胞移動
為了測定TOPK是否藉由調控PTEN蛋白表現程度，以媒介AKT依賴的細胞死亡，吾人先檢測以LY294002(PI3K抑制劑)同時處理細胞，是否可影響TOPK所誘導的PTEN之減少。如圖3B所示，LY294002之存在可顯著地抑制AKT的磷酸化，但對於TOPK所誘導之PTEN降低則無效果。再者，當PTEN被異位地表現時，TOPK誘導的AKT-Ser473磷酸化係以劑量依賴方式被阻斷(圖5A)。由於PTEN-G129E，其缺乏脂質磷酸酶活性，對於TOPK媒介的AKT活化具有較小的效果，因此，數據指出PTEN的脂質磷酸酶活性對於負調控肺癌細胞之AKT活性很重要，且TOPK可藉由負調控PTEN的蛋白表現程度以促進AKT依賴的細胞移動(圖5B)。
8. TOPK於肺癌中作為不佳的預後之標記
為了提供一獨立的評估，TOPK表現的預後值遂藉由分析119個人類肺癌樣本之免疫反應性而決定，其與吾人之微陣列研究(圖1)所檢測者不同，具有已知之臨床追蹤記錄。相對於低的TOPK表現程度(分數為0及1)，高腫瘤TOPK表現程度(分數為2及3)與具有減少之總存活率及無疾病存活率的病患有更強的關連性(圖6)。TOPK表現程度與肺癌的臨床病理特性之間的關連性摘要於表1中。
test))。SD代表標準差。#腫瘤階段、腫瘤、淋巴結、及遠端轉移狀況係根據肺癌分期之國際分期法分類。
於肺癌中TOPK之過量表現係與晚期(p<0.001)及淋巴結轉移(p=0.01)有關。該單變量存活分析證明TOPK分數與初級腫瘤(T)、淋巴結(N)及轉移(M)之病理檢定，於總存活率及無疾病存活率上具有影響(表2)。
該多變量分析亦顯示TOPK分數與M狀況可顯著地影響總存活率及無疾病存活率(請參閱表2)。綜觀而言，吾人資料指出於肺癌中，高程度之TOPK可被作為一獨立的預後因子。
9.於肺癌病患中，TOPK表現程度與PTEN表現程度為逆關連性
為了探討於肺癌病患中TOPK及PTEN間的交互作用，吾 人於一系列之肺癌組織切片進行TOPK及PTEN之IHC分析。於正常肺、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌中，TOPK及PTEN之代表性IHC染色呈現相反之染色分佈趨勢(圖7)。吾人接著藉由IHC分析以探討PTEN之預後顯著性。圖9顯示相對於低的PTEN表現程度(分數0及1)，高的PTEN表現程度(分數2及3)強烈地與較佳之總存活率及無疾病存活率相關連。PTEN表現程度與肺癌之臨床病理特性的關連性摘要於表3-1。該多變量分析顯示PTEN分數(p=0.025)、N狀況(p=0.022)及M狀況(p=0.001)顯著地影響總存活率(表3-2)。然而，如藉由多變量分析之評估，該PTEN分數強烈地但非顯著地影響無疾病存活率(p=0.086)。吾人進一步於一系列人類肺癌組織切片中探討TOPK及PTEN表現程度間之逆關連性。於肺癌樣本之IHC分析中顯示TOPK及PTEN表現程度間之逆關連性(圖8A)，其相關係數為-0.221(p=0.016)，即如以Spearman's無母數關連檢定所分析者(表3-3)。
TOPK與PTEN程度間之逆關連性(係以Spearman's無母數關連檢定所檢定，相關係數為-0.221，p=0.016)。
再者，相較於具有低TOPK及高PTEN表現之病患，當一起考量高TOPK及低PTEN之表現時，其係與不佳的總存活率(p<0.001)及無疾病存活率(p=0.002)關連(圖8B-C)。
TOPK的總存活率及無疾病存活率之HR係高於淋巴結狀況(N)者，且接近遠端轉移狀況(M)者(請參閱表2)。利用TOPK及PTEN兩者之表現程度進行次群組分析進一步顯示，相較於具有低TOPK/高PTEN程度之病患組別，具有高TOPK及低PTEN程度之病患，就總存活率及無疾病存活率而言，具有顯著較不佳之結果。再者，低TOPK/高PTEN組之5年存活機率係高於具有高TOPK/低PTEN表現之病患三倍以上(請參閱圖8及圖9)。該結果指出TOPK表現係與PTEN表現有臨床關連性，且可被作為一獨立的預後因子，用以預測具有肺癌病患之治療結果。
綜觀上述於具有切除第I期肺腺癌之病患中TOPK預後值之結果，較年長之年齡及TOPK過量表現於多變量分析中可作為總存活率之顯著獨立的預後指標。於多變量分析中，TOPK過量表現亦為無復發存活率之顯著預後因子。於本研究中，TOPK過量表現係顯著地與不佳的總存活率及無復發存活率相關。
10.剔弱TOPK以減低癌幹細胞之特性
TOPK已被暗指可作為一增生性神經前驅細胞專一性MAPK激酶，其於神經前驅細胞之增生及自我再生扮演十分重要的角色。此外，TOPK最近被發現於癌幹細胞為根基之標記的清單中83。類癌幹細胞(cancer stem-like cell，CSC)，為一群有限數目之次群，其具有自我再生及進行不對稱分裂之能力，可產生代表多數腫瘤族群之分化的子代。因CSCs通常具移行能力及化學抗性，該等特徵皆非常可能造成局部晚期肺癌的不良反應。
以下為三種分離肺部CSCs之方法。第一種為側群分析，其係仰賴表現在幹細胞群中之ABC轉運蛋白使螢光Hoechst 33342染料流出的能力。不含Hoechst 33342染料之細胞，即指側群細胞(SP細胞)，已在各種不同腫瘤類型被描述其富含類幹細胞特性。以人類肺癌為例，自肺癌細胞株中分離出之SP細胞在少至1,000個，即可於小鼠中產生腫瘤；而與SP細胞相似數量之非SP細胞則無法生成腫瘤84。第二種，藉由幹細胞表面標記的細胞外部分，以流式細胞儀分選出腫瘤細胞，此為另一種常用於分離CSCs之策略。CD133為一細胞表面糖蛋白，其由五個穿膜區域及兩個大型的糖化細胞外迴圈所組成，其近來被報導可作為肺部CSCs之標記85。與其他癌幹細胞研究相似，部分的肺腫瘤衍生之CD133+細胞可於活體外(in vitro)以懸浮的腫瘤球形式培養於一適當的無血清培養基中以進行擴增。該富含CD133+細胞之球體可抵抗化學療法，推測可能的CD133+肺CSCs亦可抵抗傳統的化學療法。最後，另一種辨識幹細胞群之方法係基於醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)活性。ALDH酵素為一群細胞內酵素，其透過細胞的醛類氧化作用而參與細胞之去毒化作用、分化作用及抗藥作用。從NCI-H358及NCI-H125肺癌細胞株中分離出之ALDH+細胞富含腫瘤生成性之CD133+癌細胞。此外，高程度之ALDH1蛋白表現與不佳之病患預後有關，此與ALDH+肺腫瘤細胞富含肺癌幹細胞之假設一致86。
為了評估TOPK於癌幹細胞中之角色，吾人使用先前已建立之TOPK剔弱細胞株進行如上所述之側群分析、ALDH活性試驗及腫瘤球體形成試驗。結果顯示，將TOPK剔弱後，可顯著地減少癌幹細胞特性，如SP細胞、ALDH+細胞及腫瘤球體形成之減少(圖10)。
11.於M期細胞中，H2AX被辨識為一與TOPK進行交互作用之蛋白
為了找尋TOPK可能之受質，吾人先前已於非同步及停滯於M期的HeLa細胞中進行過GST-TOPK及GST-TOPK(KD；激酶失活)之下拉試驗(pull down assay)。藉由LC/Mass/Mass分離及辨識出特定之相互作用之蛋白。H2AX為於M期細胞中與TOPK呈現明顯交互作用之候選者之一(資料未顯示)。為了驗證TOPK及H2AX間之交互作用，吾人分別暫時性轉染Flag-TOPK-WT及Flag-TOPK-KD表現質體入293T或H1299細胞中，並藉由實行免疫沈澱法以分析其間之交互作用。如圖11所示，於M期細胞中，H2AX與TOPK進行交互作用，而於非同步的細胞中，僅有相當微弱的交互作用可被偵測到。既然TOPK於M期被磷酸化及活化，從H2AX及TOPK於M期之交互作用可推測出H2AX可能為TOPK之受質。
12.將TOPK剔弱(Knockdown)會減少順鉑(cisplatin)所誘發的γ-H2AX，且增加對於順鉑所誘發之細胞死亡的敏感性
使用GST下拉試驗及LC/Mass/Mass，吾人辨識出H2AX為可能與TOPK進行交互作用的蛋白。接著，吾人以M期細胞溶解物驗證該兩蛋白間之交互作用(圖11)。H2AX為編碼組蛋白H2A之數種基因中之一者。因此，該H2AX蛋白可用以形成組蛋白，進而影響DNA結構。當DNA雙鏈斷裂(double-strand break，DSB)時，H2AX會於絲胺酸139上進行磷酸化，此磷酸化H2AX稱作伽瑪-H2AX(γ-H2AX)。對於組 蛋白之磷酸化形式於DNA修復上之角色尚未瞭解透徹。但可瞭解的是，由於此等修飾作用，DNA變得較不壓縮。既然TOPK可與H2AX交互作用，且可能會影響到其磷酸作用，吾人接著探討TOPK之存在是否會影響DNA損害之反應，例如由順鉑(cisplatin)所誘發之H2AX磷酸化所帶來之肺癌細胞的細胞死亡。
以鉑為主之結合性化學療法(即，順鉑)被認為是NSCLC之第一線照護療法。順鉑之功效係透過高程度之DNA損害而構成，以引導細胞進行細胞凋亡或細胞週期之停止。為了要評估TOPK於DNA損害反應上之角色，吾人因此於順鉑治療的肺癌細胞中測定γ-H2AX之表現。以TOPK siRNA暫時性地轉染A549細胞中。轉染48小時後，將細胞以順鉑處理不同的時間長度，如圖12A所示。於35 μM順鉑的治療下(此濃度是於經順鉑治療之病患血清中所發現之濃度87)，於對照組細胞中，γ-H2AX可被誘發生成，且於12小時達到高峰(圖12B)。此外，於A549細胞中，藉由siRNA剔弱TOPK顯著地降低由順鉑所誘發的γ-H2AX。相似的結果亦可於TOPK shRNA穩定轉染的細胞中被證實(圖12C)。該等結果顯示TOPK可能於維持順鉑所誘發之H2AX磷酸化作用中扮演一角色。
由於順鉑所誘發之H2AX磷酸化作用的降低可能意味著較無效之DNA損害之修復，吾人因此檢測該降低是否可能與經順鉑治療所導致之較高度的細胞毒殺性有關連性。吾人進行如圖12A所示之相似的試驗，並分析經順鉑治療48小時後細胞的存活性。如圖13所示，相較於對照組細胞，順鉑於TOPK剔弱的細胞中導致較多的細胞死亡(shTOPK-3、shTOPK-4及shNC分別為：16.2%、13.6%及25.7%)，顯示TOPK可能藉由維持與γ-H2AX有關之DNA損害之修復而於DNA損害反應中扮演一角色，其可能影響到接連的細胞死亡。
13. TOPK之剔弱促進順鉑於不同肺癌細胞中所誘發的細胞毒殺作用
先前已分析不同肺癌細胞株之TOPK表現程度(資料未顯示)。吾人分別挑選了高度及低度TOPK表現的細胞，以用於過量表現或剔弱TOPK並測定其經順鉑處理後所呈現之敏感性。近來，吾人測試了剔弱TOPK以促進順鉑於其他肺癌細胞上所誘發之細胞毒殺作用之效果，如CL152及CL141細胞。雖然順鉑於CL152細胞中誘發了將近90%的細胞死亡，剔弱TOPK進一步提升了順鉑於該等細胞之細胞毒殺效用(圖14)。吾人的研究結果顯示TOPK因應順鉑治療所媒介的保護效果可能不具細胞種類專一性。此外，吾人亦證明了剔弱TOPK會降低EGF所誘發的AKT磷酸化作用(圖15)，顯示TOPK表現程度亦可能於細胞對抗吉非替尼(gefitinib)上有功效，吉非替尼為上皮生長因子受器(epidermal growth factor receptor，EGFR)的酪胺酸激脢區域之抑制劑，如PC9及PC9/GR(EGFR-突變外顯子19(T790M)；具吉非替尼抗性)細胞。
II.臨床試驗數據及組織微陣列構築
材料及方法
從1995至2007年，自台北榮民總醫院收集帶有第I期腺癌之214位病患的手術病理檔案，以用於本研究。所有病患皆經具療效的手術切除，接著伴隨著完整的肺門及縱隔淋巴結切除。手術切除後，病患皆無接受輔助的化學療法或放射療法。該病理切片係經兩位病理專家(T.-Y.C.及Y.-C.Y.)審閱。評估以下的病理參數：腫瘤大小、腫瘤分化的程度、腫瘤壞死、及血管淋巴管侵犯。挑選腫瘤組織之具代表性的部分供組織微陣列之構築，其含有至少兩個3-mm核心的腫瘤組織，該腫瘤組織係從每個病例之石蠟包埋中取得。病患之總存活率係從手術日至死亡日來進行計算，且最後一次追蹤時仍存活的病患亦 納入審查。無復發存活率係以手術日至復發日(無論是局部的或遠端的)來測量，且最後一次追蹤時無疾病或已死亡而無疾病復發之證據的病患亦納入審查。
免疫組織化學(IHC)染色及計分
樣本處理及免疫組織化學步驟係以先前所述之方式進行27。從組織微陣列中製備5微米厚度之切片。對於TOPK的IHC染色而言，用以辨識TOPK之單株抗體(Cell Signaling)係以1：100之稀釋倍數進行作用1小時。接著，該等切片係以生物素化之二級抗體進行作用10分鐘。以帶有3-胺基-9-乙基咔唑的卵白素-辣根過氧化酶共軛物(DAKO LSAB組；DAKO，洛杉磯，加州，美國)作為呈色劑。最後，將所有切片以蘇木素進行對比染色。
免疫反應的強度係分級如下：0(陰性)、1(微陽性)、2(中陽性)、及3(強陽性)(請參閱圖16)。百分比例之分數係藉由陽性染色細胞的百分比率以半定量方式評估：0(0%)、1(<=10%)、2(11至50%)、及3(51至100%)。每一個樣本之IHC分數係以強度分數及百分比例之分數之乘積來記錄，範圍從0至9。
統計分析
卡方檢定係用於評估臨床病理參數及TOPK IHC分數間之關連性。對於存活率之分析，以下變數被用以評估：年齡、性別、抽煙狀況、腫瘤大小、腫瘤分化、腫瘤壞死、血管淋巴管侵犯、及TOPK IHC分數。存活曲線係以Kaplan-Meier法作圖，並以對數等級檢定(log-rank test)進行比較。單變量及多變量分析係利用SPSS軟體(18.0版；SPSS，芝加哥，伊利諾伊州，美國)，藉由Cox比例風險模式的平均值來進行分析。當p<0.05時，統計分析被認為具有顯著差異。
結果
平均追蹤時間為61.5個月，其範圍為0.2至126個月內。該214個病患之人數統計特徵係摘要於表4中。
於追蹤期間，65個病患(30.4%)發展成腫瘤復發(21個病患為局部復發、55個病患為遠端轉移)。
TOPK免疫組織化學染色係於腫瘤細胞的細胞質中偵測。於214個病患間，TOPK IHC分數的分佈如下：31個病患為0、14個病患為1、15個病患為2、9個病患為3、15個病患為4、73個病患為6、及57個病患為9。69個病患(32.2%)之TOPK IHC分數小於或等於3，而剩下的145個病患(67.8%)之TOPK IHC分數大於3。TOPK IHC分數大於3被認為是TOPK過量表現。
吾人分析不同臨床病理參數及TOPK IHC分數<=3及TOPK IHC分數>3之間的關連性。TOPK ICH分數>3之病患 的平均追蹤時間顯著地較短(p<0.001)。血管淋巴管侵犯亦於TOPK ICH分數>3之病患中被發現地更為頻繁(p=0.030)。如表5所示，其他臨床病理參數與TOPK表現則無顯著的關連性。
再者，吾人分析病患之年齡、性別、抽煙狀況、腫瘤大小、病理性腫瘤分化、腫瘤壞死、血管淋巴管侵犯、及TOPK IHC分數對於總存活率的預後值。於超過65歲之病患的總存活率顯著地較差(p=0.001)，其具有腫瘤大小>3 cm(p=0.013)、腫瘤壞死的存在(p=0.001)、血管淋巴管侵犯的存在(p=0.003)、及TOPK IHC分數>3(p<0.001)(請參閱表5)。
具有TOPK IHC分數<=3及>3之病患的Kaplan-Meier總存活曲線如圖17所示。多變量Cox回歸分析顯示，65歲以上之年齡(風險率[HR]=2.21；95%信賴區間[CI]，1.39至3.53，p=0.001)以及TOPK IHC分數>3(HR=3.46；95% CI，1.98至6.04；p<0.001)可分別作為總存活率之預測因子(請參閱表6)。
吾人進一步分析無復發存活率之預後因子。腫瘤大小>3cm(p=0.007)、不佳的分化(p=0.013)、腫瘤壞死的存在(p=0.001)及TOPK IHC分數>3(p=0.026)係與不佳的無復發存活率相關(表7)。
具有TOPK IHC分數<=3及TOPK IHC分數>3之病患的Kaplan-Meier無復發存活曲線如圖18所示。於多變量Cox回歸分析下，僅TOPK IHC分數>3(HR=2.25，95% CI，1.14至4.44，p=0.019)可作為無復發存活率之獨立的預測因子(表8)。
結論，無論是單獨TOPK的過量表現，或與PTEN的低程度表現組合，可作為一顯著地預後標記，用以預測經切除第I期腺癌病患之縮短的總存活率及無復發存活率。TOPK可應用於協助辨識經手術切除第I期腺癌之高風險的病患，以進行輔助性療法或更密切之追蹤。
可確信的是屬於本發明領域之具有通常技藝者，基於本文之敘述且無須進一步闡述，即可利用本發明至其最廣泛之範疇。因此，所提供之說明書及申請專利範圍應被理解為僅用於示例性用途，而非意欲以任何方式來侷限本發明之範疇。
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本發明前述摘要，以及下述之詳細說明，當搭配附加之圖式閱讀時，將可更有助於理解。
圖式中：
圖1顯示於肺腺癌中，TOPK表現係為正調控的；其中(A)源自27個肺腺癌病患之TOPK(219148_at)、EGFR(201984_s_at)及AURKA(208079_s_at)的微陣列表現圖譜，係經HG-U133A晶片表現圖譜標準化(左圖)；以及不同組的25個肺腺癌病患樣本，係使用HG-U133 plus 2.0晶片進行微陣列分析(右圖)；該箱型圖係以群組分類顯示資料之分佈且於腫瘤組織及鄰近非腫瘤組織間具統計上顯著差異(p<0.0001，左圖；p<0.001，右圖)；(B)比較30個良性腫瘤及220個轉移性腫瘤(前兩個圖)間之TOPK微陣列表現圖譜並顯示於箱型圖中(p<0.001)；5個市售可得之腦組織及6個源自肺腺癌的腦轉移樣本間之不同的TOPK表現程度亦顯示於圖中(p=0.043)；(C)24個肺腺癌病患之樣本中TOPK之mRNA量係以Q-RT-PCR測量，該樣本係來自圖A左圖之病患。每組成對樣本之結果係以DDX5 mRNA之量進行標準化，並作圖於箱型圖中(p=0.004)；(D)收集BEAS-2B、BES-6、IMR90細胞以及一群肺癌細胞株並進行免疫墨點分析，以偵測TOPK表現。β-微管蛋白染色亦被包含其中作為置入量之控制。(IMR90：人類肺纖維母細胞株；A549、H23、CL1-0及CL1-5：人類肺腺癌細胞株；H1299：人類肺上皮癌細胞株)；圖2提供TOPK過量表現之結果，其提升肺癌細胞株之移動及侵入性；其中(A)CL1-0或(B)H1299細胞係以空載體(vehicle；Veh)或pCMV2-Flag-TOPK(WT)或pCMV2-Flag-TOPK(KD)質體暫時性轉染。於轉染後22小時，將一部份之細胞收穫，藉由免疫墨點法以偵測TOPK、β-微管蛋白或肌動蛋白(下排)；其他部分之細胞則種於有基質 膠(Matrigel)包覆或無包覆的transwell insert或96孔盤上，並再進行培養24小時；藉由MTT法以量化細胞之生長；計算移動細胞(中圖)及侵入細胞的數目(下圖)，並以相較於空載體對照組(n=3~6)之相對移動或侵入倍數表示(＊P<0.05，＊＊P<0.01，＊＊＊P<0.001)；圖3顯示於肺癌細胞及肺纖維母細胞中TOPK調控PTEN/PI3K/AKT訊號路徑；其中(A)CL1-0細胞係以載體對照組或pCMV2-Flag-TOPK質體進行暫時性轉染，經轉染後22小時，將細胞種於transwell insert上，接著再培養24小時；在計算移動細胞前，將三種不同的藥物抑制劑U0126、SB203580及LY294002(10 μM)加入各別的transwell insert中，接著再培養2小時；隨後計量移動細胞的數目，並以相對於轉染載體及未處理之細胞組(Veh./NT)之細胞移動倍數表示；(B)一部份取自(A)的細胞藉由免疫墨點法偵測磷酸化-AKT(Ser473)、AKT、PTEN、及TOPK。將載體對照組、pCMV2-Flag-TOPK(WT)、或pCMV2-Flag-TOPK(KD)質體暫時性轉染於CL1-0(C，左圖)、H1299(C，右圖)、及IMR90(D)細胞中；經轉染後22小時，收穫一部份細胞進行免疫墨點法，如(B)所示；TOPK過量表現的IMR90細胞之細胞移動及細胞存活率亦以前述方式進行評估(D，右圖)(＊P<0.05，＊＊P<0.01，＊＊＊P<0.001)；圖4提供於肺癌細胞株中，剔弱TOPK以提升PTEN的表現及降低AKT活化作用之結果；其中A549(A)及H23(B)細胞係不以不規則的siRNA(Veh)或以不規則的siRNA(Neg.)、或三個TOPK專一性siRNA中一者(siTOPK)進行轉染；經轉染後48小時，收穫一部份之細胞，藉由免疫墨點法以偵測TOPK、PTEN、磷酸化-AKT(Ser473)、AKT、及β-微管蛋白；將一部份細胞種於transwell insert上，並再培養24小時。接著計算移動細胞的數目(A及B，右圖)(＊P<0.05，＊＊P<0.01，＊＊＊P<0.001)； 圖5提供PTEN過量表現逆轉TOPK所媒介的AKT活化；其中H1299(A)及CL1-0(B)細胞係以載體對照組、pFlag-CMV2-TOPK(WT)、pFlag-CMV2-TOPK(KD)及pFlag-CMV2-PTEN或pFlag-CMV2-PTEN(G129E)質體於所指之不同組合進行暫時性轉染。經轉染後22小時，將細胞收穫並藉由免疫墨點法偵測磷酸化-AKT(Ser473)、AKT、PTEN及TOPK；圖6提供TOPK過量表現於肺癌中作為不佳預後之標記；其中(A)顯示於代表性肺癌樣本中TOPK蛋白表現程度。TOPK表現程度係根據TOPK之細胞質染色強度來定量。根據染色強度，可將結果分成兩組：低度表現組係指沒有染色呈現者(染色強度分數=0)或於少於10%之細胞可測得陽性染色者(染色強度分數=1)；高度表現組係指於10%至30%之細胞可測得陽性免疫染色者(染色強度分數=2)或高於30%之細胞可測得陽性免疫染色者(染色強度分數=3)。119個肺癌病患之總存活率(B)及無疾病存活率(C)的Kaplan-Meier圖，係以TOPK表現程度進行分類；圖7提供正常肺組織及肺癌樣本之石蠟切片的內生性PTEN及TOPK蛋白表現之IHC染色；其中藉由免疫組織化學法可於正常肺(a)、腺癌(b、i、j、k、l)及鱗狀細胞癌(c及d)中測得內生性之PTEN表現；其顯示於正常肺及腺癌樣本中，PTEN蛋白於細胞質高度表現，且於腺癌(adenocarcinoma，AdCA)樣本2至4及鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)樣本中則有微弱或不存在PTEN蛋白表現；於腺癌(m、n、o、p)、及鱗狀細胞癌(g及h)樣本中，藉由免疫組織化學法可測得內生性TOPK表現；其顯示於腺癌樣本2至4及SCC樣本(g)中，可測得高度的細胞質TOPK染色；黃色箭頭係指於SCC(g)及AdCA(m、n、p)中TOPK高度之細胞膜表現；以及於正常肺(e)及腺癌樣本1(f)中， 微弱至不存在之TOPK表現；於(o)之比例尺代表50 μm；以及於(p)之比例尺代表200 μm；圖8提供TOPK及PTEN表現間之逆關連性於肺癌中作為一具潛力之預後因子；其中(A)顯示TOPK及PTEN於系列切片之免疫組織化學染色；其顯示TOPK量及PTEN量之間的逆相關性。119個病患於高度TOPK表現及低度PTEN表現時，其總存活率(B)及無疾病存活率(C)；圖9提供PTEN之負調控的結果作為肺癌之不佳預後的標記；其中(A)顯示於代表性肺癌樣本中PTEN蛋白表現程度；PTEN量係根據PTEN於細胞質染色強度而定量；119個肺癌病患以PTEN表現程度區分時，其總存活率(B)及無疾病存活率(C)的Kaplan-Meier圖；圖10提供剔弱TOPK之結果，其降低於A549細胞之癌幹細胞特性；其中(A)為Hoechst染料排除分析之結果，顯示於穩定轉染TOPK shRNA之A549細胞中，SP細胞的百分比劇烈地降低；(B)為ALDH活性分析之結果，顯示剔弱TOPK會降低ALDH+細胞之數量；以及(C)初級腫瘤球分析之結果，一種CSCs之自我再生能力的測量方式，其顯示於TOPK剔弱細胞中降低之腫瘤球形成。於此之照片顯示兩次試驗之具代表性影像(原放大倍率，×200)；圖11呈現TOPK於M期與H2AX交互作用；其中H1299細胞係以載體對照組(Veh.)及pCMV2-Flag-TOPK(WT)及(KD)質體分別暫時性轉染。經轉染後24小時，將一部分之Flag-TOPK表現細胞以諾可達唑(nocodazole)(75 ng/ml)處理24小時，其可作為M期休止細胞，而其他部分之細胞則不與諾可達唑作用以作為非同步的細胞(asynchronizied，Asc.)。接著收穫細胞，藉由M2珠以進行免疫沈澱法，並隨後進行免疫墨點法。
圖12提供剔弱TOPK之結果，其顯著地降低順鉑(cisplatin)所誘發的γ-H2AX，其中(A)為於TOPK siRNA 及shRNA轉染之A549細胞中，偵測順鉑所誘發的H2AX磷酸化之示意圖；A549細胞以不規則的對照組(siNC)、siTOPK-1(SEQ ID NO：1)、及siTOPK-2(SEQ ID NO：2)暫時性轉染(B)、或A549-Luc細胞以shNC、shTOPK-3(SEQ ID NO：3)、及shTOPK-4(SEQ ID NO：4)穩定轉染(C)，並以順鉑(35 μM)處理達所指時間。收穫細胞供免疫墨點法偵測磷酸化-H2AX(γ-H2AX)、H2AX、及TOPK的表現。
圖13提供TOPK剔弱之結果，其敏感化細胞對於順鉑所誘發的細胞死亡，其中分別以shNC(對照組)、shTOPK-3(SEQ ID NO：3)、及shTOPK-4(SEQ ID NO：4)穩定轉染的A549-Luc細胞係以順鉑(35 μM)處理；經過48小時，以MTT法檢測細胞存活率(n=5，＊P<0.05，＊＊P<0.01)。
圖14顯示於CL152細胞中將TOPK剔弱可促進順鉑所誘發的細胞死亡。分別以不規則的對照組(siNC)、siTOPK-1(SEQ ID NO：1)、及siTOPK-2(SEQ ID NO：2)暫時性轉染的CL152細胞係以順鉑(35 μM)處理。經過48小時，以MTT法檢測細胞存活率(n=3，＊＊P<0.01)。
圖15提供於A549-Luc細胞中剔弱TOPK的結果，其降低EGF所誘發之AKT磷酸化作用。將shNC、shTOPK-3(SEQ ID NO：3)、及shTOPK-4(SEQ ID NO：4)穩定轉染的A549-Luc細胞培養於無血清之環境中達24小時。如所示，加入EGF(20 ng/ml)達0~30分鐘以刺激細胞。接著，收穫細胞並藉由免疫墨點法偵測pAKT、AKT及TOPK之表現。
圖16提供於第I期肺腺癌之TOPK表現之結果；其中免疫反應之強度係以0(陰性)(A)、1(微弱陽性)(B)、2(中度陽性)(C)、及3(強度陽性)(D)記錄；圖17提供根據TOPK IHC分數之總病患存活率之結果；其中相較於該等具有低度TOPK IHC分數(<=3)者，具有高度TOPK IHC分數(>3)之病患具有較不佳之存活率(p<0.001)；以及 圖18顯示根據TOPK IHC分數之無復發存活率；其中相較於該等具有低度TOPK IHC分數(<=3)者，具有高度TOPK IHC分數(>3)之病患具有較不佳之無復發存活率(p=0.026)。
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