CN114875153B - 非小细胞肺癌精准化疗预测靶标crtac1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种预测非小细胞肺癌患者的化疗敏感性的新型生物标志物及其应用，本发明通过检测癌组织中CRTAC1mRNA或者蛋白表达水平，进一步预测非小细胞肺癌患者在接受以顺铂为基础的化疗方案的疗效，同时也可作为顺铂为主化疗的敏感性的增效靶点。

Description

非小细胞肺癌精准化疗预测靶标CRTAC1及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种预测非小细胞肺癌患者的化疗敏感性的新型生物标志物及其应用，通过检测癌组织中CRTAC1 mRNA或者蛋白表达水平，进一步预测非小细胞肺癌患者在接受以顺铂为基础的化疗方案的疗效，同时也可作为顺铂为主化疗的敏感性的增效靶点。
背景技术
肺癌位居全球癌症相关死亡原因之首，其中非小细胞肺癌(Non-small cell lungcancer,NSCLC)是肺癌中最主要的组织学类型，约占肺癌的85％。目前，NSCLC仍是一种预后较差的疾病，其预后状况与患者所处的病理分期阶段休戚相关，其五年生存率可从IB期的68％降低至IVA-IVB期的0％～10％，呈直线下降趋势。随着筛查性计算机断层扫描技术的普及，肺癌规范化诊疗措施不断完善，使患者发现癌症时间不断提前，但在现如今的个性化医疗时代，精准地将正确有效的治疗药物与适合的患者相匹配也是提高患者全身治疗疗效的关键。多年来，化疗被广泛用于非小细胞肺癌患者的全身治疗，是NSCLC患者治疗的基石，可作为早期手术切除的NSCLC患者的辅助化疗、晚期转移性NSCLC患者的姑息治疗以及局部晚期NSCLC患者的双模式或多模式治疗的一部分，贯穿在整个病程当中。
非小细胞肺癌标准的一线化疗用药方案常是以顺铂为基础的双药化疗。但从1978年顺铂用于临床治疗起，近四十多年来,新的化疗药物鲜有出现，化疗在NSCLC治疗的疗效未能再有进一步的突破。因个体化差异所带来的化疗耐药及不良反应的产生依然十分明显。而且，目前化疗药物的组合以及给予剂量和疗程的选择，很大一部分是依据多年的临床经验积累，如从癌症的类型及恶性程度、患者的年龄及健康状况等方面进行判断，不具有针对性，因此无法掌握合理的用药时机，难以达到最佳疗效。在接受顺铂化疗的患者中，只有小部分患者可达到完全反应从中受益，而其他患者将遭受化疗的副作用甚至会引起病灶扩大转移。随着研究人员逐渐将药物基因组学作为实现个体化用药的手段，不断从基因的视角入手去剖析与肿瘤化疗相关的基因，以便找寻到可提高化疗敏感性并减轻药物毒性的分子标志物。对于化疗病人来说，在接受化疗前，若能通过筛查与自身顺铂化疗敏感性相关的分子标志物的表达水平，判断顺铂化疗的有效性，进行肿瘤精准治疗，对延长患者生存期至关重要。
202010579044X的发明《抑制肺腺癌的靶标CRTAC1及其应用》告知了以下内容：CRTAC1基因表达的增强剂能用于制备治疗肺腺癌的药物，过表达CRTAC1抑制肺腺癌细胞增殖，过表达CRTAC1抑制裸鼠皮下成瘤能力，过表达CRTAC1抑制肺腺癌细胞迁移和侵袭，过表达CRTAC1抑制裸鼠肺转移灶的形成。但是，作为本行业的常识，CRTAC1的基因功能不能为化疗敏感性提供指导性信息。
目前，现有临床上顺铂为主化疗的敏感性尚无明确的增效靶点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种应用于非小细胞肺癌接受顺铂化疗过程中进行化疗敏感性预测的生物标志物CRTAC1，其在NSCLC顺铂化疗治疗策略的选择上具有重大的指导作用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种预测非小细胞肺癌患者的化疗敏感性的生物标志物CRTAC1。
本发明还同时提供了上述预测非小细胞肺癌患者的化疗敏感性的生物标志物CRTAC1的应用：非小细胞肺癌患者肺癌组织中CRTAC1的表达水平可用于指导临床顺铂化疗。
作为本发明的应用的改进：CRTAC1表达越高顺铂化疗敏感性强。
作为本发明的应用的进一步改进：过表达CRTAC1可通过提高顺铂对非小细胞肺癌细胞的杀伤作用，并促进顺铂诱导的非小细胞肺癌细胞的凋亡，进而增强非小细胞肺癌细胞对顺铂治疗的化疗敏感性。
本发明还同时提供了一种指导非小细胞肺癌患者是否适合顺铂化疗的试剂盒：检测非小细胞肺癌组织中CRTAC1的表达水平。
作为本发明试剂盒的改进：检测非小细胞肺癌患者癌组织中CRTAC1的蛋白或mRNA表达水平。
本发明还同时提供了促进CRTAC1基因表达的试剂在制备用于提高接受顺铂治疗的非小细胞肺癌患者化疗敏感性的药物中的应用：促进CRTAC1基因表达的试剂为CRTAC1基因过表达质粒。
作为本发明应用的改进：包括CRTAC1基因过表达质粒的构建，其核苷酸基因序列NCBI Gene ID号为：55118，非小细胞肺癌化疗药物为顺铂。
说明：顺铂常用于非小细胞肺癌患者的一线化疗、IB期-III期非小细胞肺癌患者的术后辅助化疗、晚期转移性NSCLC患者的姑息治疗以及局部晚期NSCLC患者的双模式或多模式治疗的一部分。
本发明首次公开了CRTAC1在非小细胞肺癌顺铂为主的化疗过程中的作用，可在体内外提高非小细胞肺癌细胞对顺铂的敏感性。同时，GEO数据集中显示在接受以顺铂为基础的化疗的NSCLC患者中，CRTAC1表达水平高的患者的总生存期明显高于表达低的患者，进一步构建细胞及动物荷瘤模型，结果表明CRTAC1与NSCLC的顺铂化疗疗效密切相关。综上提示CRTAC1很大可能作为NSCLC化疗疗效预测的潜在分子标志物。
本发明所采取的技术方案如下：通过生物信息学技术分析GEO数据集中接受顺铂化疗的非小细胞肺癌患者的临床信息，并验证NSCLC细胞系中CRTAC1的蛋白表达与其相应的顺铂半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)值之间的关系。进一步利用ATP实验和流式细胞术检测CRTAC1对NSCLC细胞系顺铂敏感性的影响，且通过构建裸鼠皮下瘤模型并给予相应的顺铂治疗探究CRTAC1在体内对NSCLC顺铂敏感性的影响。
本发明以NSCLC细胞系A549、H1299、H1975、HCC827、H226细胞为模型，通过构建过表达CRTAC1和敲低CRTAC1的NSCLC细胞株，发现CRTAC1在体外显著抑制顺铂作用下的NSCLC细胞活性并促进顺铂诱导的NSCLC细胞凋亡。同样，在裸鼠荷瘤模型中，CRTAC1联合顺铂显著抑制体内NSCLC细胞的致瘤能力。结合GEO数据集中的发现CRTAC1表达水平与接受顺铂治疗的NSCLC患者的总生存期呈显著正相关，以及在NSCLC细胞中验证得到CRTAC1蛋白表达与NSCLC细胞对顺铂的敏感性呈显著正相关。由此，更加佐证了CRTAC1在提高NSCLC化疗疗效过程中的作用，以及通过检测CRTAC1的表达对顺铂这类临床化疗用药的选择的指示作用。
综上所述，本发明公开了一个非小细胞肺癌细胞化疗敏感性相关的预测标志物CRTAC1及其应用。本发明在细胞水平并结合动物模型及数据库临床预后信息，发现CRTAC1可具有提高顺铂处理下的非小细胞肺癌细胞化疗敏感性的作用。本发明首次发现CRTAC1作为非小细胞肺癌细胞的顺铂为主化疗的疗效增敏剂，在非小细胞肺癌顺铂为主的化疗过程中发挥着重要作用。
需要强调说明的是：目前已知的肺腺癌靶标包括EGFR、ALK、ROS1、BRAF、NTRK、PD-L1，其可预测肺腺癌患者接受靶向治疗的获益情况，若存在EGFR突变阳性、ALK重排阳性、ROS1重排阳性、BRAF V600E突变阳性、NTRK基因融合阳性、PD-L1表达阳性这类遗传异常的肺腺癌患者可接受相应靶向药物的有效治疗。但现有的这些肺腺癌靶标均不具备预测顺铂化疗疗效及提高顺铂敏感性的性能。因此，对于这类肺腺癌靶标检测结果为阴性的患者，NCCN指南通常推荐的治疗方式为以顺铂为主的初始细胞毒性药物治疗方案，常遇到化疗不敏感的情况，所以，多年来肺癌5年生存期维持在15-25％。而本发明的优势在给予顺铂治疗的NSCLC患者中CRTAC1水平与患者预后呈正相关，且在NSCLC细胞中CRTAC1高表达可提高顺铂的抗肿瘤能力，这为CRTAC1作为顺铂治疗效果的预测性生物标志物及开发顺铂增效靶点有着重要指示作用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为CRTAC1与非小细胞肺癌的顺铂化疗疗效密切相关图；
图1中：
A为生物信息学分析GEO数据集中的接受以顺铂为基础的化疗的NSCLC患者的总生存期与CRTAC1表达水平相关性的结果；
B为蛋白免疫印迹实验检测非小细胞肺癌细胞系中CRTAC1蛋白的表达水平；
C为ATP实验检测0～40uM的顺铂处理NSCLC细胞系48h下的细胞活性曲线，并比较不同NSCLC细胞系对顺铂的IC50结果值；
D为对NSCLC细胞系中CRTAC1蛋白表达值与其顺铂IC50值进行Pearson相关性分析；
Low：低表达，High：高表达，p<0.05表示存在显著性差异，r为相关性系数，-值表示呈负相关。
图2为CRTAC1在体外增强NSCLC细胞对顺铂的敏感性图
图2中：
A为已成功构建稳定过表达CRTAC1的H1299、HCC827、H226细胞系；
以H1299为例，Vector代表空载对照细胞株；CRTAC1代表过表达CRTAC1稳转细胞株；B为已成功构建瞬时敲低CRTAC1的A549和H1975细胞系；
以A549为例，CTL代表转染空白对照细胞株，Si CRTAC1-1、Si CRTAC1-2、SiCRTAC1-3分别代表转染沉默CRTAC1表达的siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3；
C-E为在H1299、HCC827、H226细胞系中过表达CRTAC1后，进行ATP实验检测经不同浓度梯度顺铂处理下的细胞活性水平；
F-G为在A549和H1975细胞系中敲低CRTAC1后，进行ATP实验检测经不同浓度梯度顺铂处理下的细胞活性水平；
H-M为在H1299、HCC827、H226细胞系中过表达CRTAC1后，运用流式细胞术检测经顺铂诱导下的细胞凋亡水平改变及相关数据分析；
N-Q为在A549和H1975细胞系中敲低CRTAC1后，通过流式细胞术检测顺铂作用下的细胞凋亡率水平及相关数据分析。
图3为CRTAC1在体内提高NSCLC细胞荷瘤模型对顺铂的敏感性
A为构建NSCLC细胞荷瘤模型及接受顺铂治疗的操作流程图；
B为经顺铂治疗30天后，各组裸鼠荷瘤模型图；
C为接受顺铂治疗30天后，取下的裸鼠皮下瘤组织图；
D为每三天记录四组皮下瘤的长度及宽度并将体积计算结果绘制成动态监测图；
E为各组经顺铂治疗后取下的皮下瘤组织的平均肿瘤重量结果统计图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加明了，下面将对本发明实施例中的技术方案进行详细具体地描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1)运用GraphPad Prism 7软件对GEO数据集中98例接受以顺铂为基础的辅助化疗的非小细胞肺癌患者的生存信息进行Kaplan-Meier生存分析，针对上述数据集中非小细胞肺癌患者CRTAC1 mRNA表达值进行排序，其CRTAC1 mRNA表达值中位数(median)为6.032055，满足高于中位数的患者属于高表达组(>median；n＝49)，反之，满足低于中位数的患者属于低表达组(>median；n＝49)，对两组的总生存期进行t-test分析，p<0.05表明相比较的两组数据有显著性差异(图1A)；
2)利用蛋白免疫印迹实验检测包括A549、H2170、H1975、H1299、H226、H520及HCC827细胞在内的不同NSCLC细胞系中CRTAC1蛋白的表达水平，发现A549、H2170及H1975细胞系中CRTAC1蛋白表达水平相对于H1299、H226、H520及HCC827细胞系较高(图1B)；
3)通过运用不同浓度梯度(0～40μM)的顺铂处理7株NSCLC细胞系48h，得出每种NSCLC细胞系的顺铂IC50值，处理方式具体为：
①取处于对数生长期的NSCLC细胞系A549、H2170、H1975、H1299、H226、H520及HCC827进行种板，设置六个递增的顺铂处理浓度梯度组，分别为0、2.5、5、10、20、40μM顺铂，每个浓度组设置五个复孔，以每孔3000个细胞量种板于96孔板，10％FBS的RPMI-1640培养基量为200μl/孔；
②细胞种板贴壁后，将原培养基弃去，更换为200μl/孔的0.1％FBS的RPMI-1640培养基，饥饿细胞12h；
③细胞饥饿12h后，更换为经10％FBS的RPMI-1640培养基稀释40mM顺铂储存液至终浓度为2.5、5、10、20、40μM，以200μl/孔的量加入相应的96孔板内，0μM顺铂处理组每孔中加入含0.2μl DMF(顺铂储存液溶剂)的200μl 10％FBS的RPMI-1640培养基，置于5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养48h；
④经顺铂作用细胞48h后，检测细胞内ATP含量以反映顺铂对细胞的毒性作用，每孔加入25μl PBS缓冲液及25μl试剂(由普洛麦格(北京)生物技术有限公司的型号为G7571的/>发光法细胞活力检测试剂盒提供)后，置于微量振荡器中振荡2min，使细胞充分裂解，室温避光孵育10min；
⑤每孔吸取40μl细胞裂解液转入黑色96孔板中，用化学发光分析仪测定细胞内ATP含量的相对数值；
⑥在Graphpad prism7统计软件中输入相应的数据，X轴为顺铂浓度梯度的数值，Y轴为每个浓度对应的五个复孔的细胞ATP含量相对数值，绘制成细胞毒性曲线，并通过将X轴的浓度值分析转换成为对数形式，进行数据拟合，从而计算出每种NSCLC细胞的顺铂IC50值。
如图1C所示，根据细胞毒性曲线计算出7种NSCLC细胞株A549、H2170、H1975、H1299、H226、H520及HCC827的顺铂IC50值分别为9.494、11.37、4.519、14.85、14.52、12.47、18.41μM。结果发现A549、H2170及H1975这类CRTAC1蛋白表达水平相对较高的NSCLC细胞系，其顺铂IC50值均低于HCC827、H1299、H226及H520这类CRTAC1蛋白表达水平相对较低的NSCLC细胞系。因此，可得知：NSCLC细胞系中CRTAC1蛋白水平与NSCLC细胞的化疗疗效反应具有一定的相关性。
4)将不同NSCLC细胞系中CRTAC1蛋白表达水平与其顺铂IC50值进行Pearson相关性分析，结果显示，NSCLC细胞系中CRTAC1蛋白表达水平与其顺铂IC50值呈反比，相关系数r高达0.78，p<0.05，表明CRTAC1与NSCLC细胞系的顺铂IC50值呈显著的负相关(图1D)。因此，可得知：NSCLC细胞系中CRTAC1蛋白表达水平高低预示NSCLC细胞对顺铂的敏感性。
实施例2
1)选取了三株常用且顺铂IC50值相对较高的NSCLC细胞株H1299、HCC827和H226细胞作为研究对象，在H1299、HCC827和H226细胞中感染GFP-CRTAC1质粒及GFP空载质粒病毒上清，并用Puromycin药物筛选，成功构建稳定转染H1299-CRTAC1、HCC827-CRTAC1、H226-CRTAC1细胞株及其对照细胞株H1299-Vector、HCC827-Vector、H226-Vector。采用蛋白免疫印迹实验鉴定NSCLC细胞株中CRTAC1蛋白过表达效果，以β-Actin蛋白作为内参；
图2A：CRTAC1表示稳定转染GFP-CRTAC1质粒的NSCLC细胞中内源性CRTAC1蛋白的表达水平，而GFP-CRTAC1代表稳定过表达带GFP标签的外源性CRTAC1蛋白的表达水平。因此，可得知：稳定过表达外源性CRTAC1蛋白的H1299、HCC827、H226细胞株及其稳定转染空载体的对照细胞(Vector)构建成功。
构建过表达CRTAC1质粒相关序列的引物如下：
CRTAC1全长序列Forward 5'-GGTGTCGCCCTGGCTGACTT-3'
CRTAC1全长序列Reverse 5'-GAGAACTTGGGTGAGGCGATGTC-3'。
2)选取了两株顺铂IC50值相对较低的NSCLC细胞株A549和H1975，利用siRNA技术敲低CRTAC1的表达。分别将3个设计好的siRNA(Si CRTAC1-1、Si CRTAC1-2、Si CRTAC1-3)及阴性对照(siRNA-CTL)瞬时转染至NSCLC细胞株A549和H1975，特异性沉默CRTAC1的表达，利用蛋白印迹实验鉴定A549和H1975中CRTAC1蛋白的沉默效率，以β-Actin作为内参。根据图2B可得出以下结论：在A549及H1975细胞中，较siRNA-CTL组，Si CRTAC1-2和Si CRTAC1-3组具有较好的敲低效率。
构建敲低CRTAC1的siRNA相关序列的引物如下：
3)运用ATP实验评估CRTAC1对NSCLC细胞化疗敏感性影响：
①将步骤1)中的NSCLC细胞CRTAC1过表达组和步骤2)中的NSCLC细胞Si CRTAC1组作为实验组，而步骤1)中的NSCLC细胞Vector组和步骤2)中的NSCLC细胞siRNA-CTL组作为对照组，待实验组及对照组细胞生长到达对数生长期时，将其从培养皿中消化下来，收集至1.5mL Ep管中，离心洗涤后，重悬计数，在96孔板中将每组细胞以每孔3000个细胞的量重悬于200μl10％RPMI-1640培养基中进行细胞种板，设置六个依次递增的顺铂处理浓度梯度组，分别为0、2.5、5、10、20、40μM顺铂，每个浓度组设置五个复孔，计算每孔应加入的细胞体积；
②待12h细胞贴壁完全后，以200μl/孔的含0.1％FBS的10％RPMI-1640培养基进行饥饿12h；
③饥饿完成后，更换为经10％FBS的RPMI-1640培养基稀释40mM顺铂储存液至终浓度为2.5、5、10、20、40μM，以200μl/孔的量加入相应的96孔板内，0μM顺铂处理组每孔中加入含0.2μl DMF(顺铂储存液溶剂)的200μl 10％FBS的RPMI-1640培养基，置于5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养48h；
④取出顺铂处理48h后的细胞，进行细胞内ATP含量检测：甩去96孔板中的培养基后，吸水纸吸去残余的培养基。每孔先用25μl PBS缓冲液清洗一次，再向各孔中依次加入25μl PBS缓冲液及25μl试剂(由普洛麦格(北京)生物技术有限公司的型号为G7571的/>发光法细胞活力检测试剂盒提供)，将96孔板置于微量振荡器中，以1200rpm振荡2min，使细胞完全裂解，释放细胞内的ATP，吸取40ul各孔振荡后的液体转入黑色96孔板中；将黑色96孔板于室温避光静置10min，使荧光信号稳定；
⑤将黑色96孔板置于化学发光检测仪中检测细胞内ATP含量的相对数值，依照各组结果数值绘制成细胞毒性曲线。
结果如图2C-E所示，在20μM顺铂作用48h下，与对照组相比，过表达CRTAC1的H1299细胞的细胞活性从66％下降至45％，HCC827组细胞活性从63％下降至33％，H226组的细胞活性从58％下降至25％，表明在一定顺铂浓度处理下，过表达CRTAC1较对照组可显著促进NSCLC细胞死亡，约20％～30％左右。而经20μM顺铂处理48h后，在A549细胞株中，与转染siRNA-CTL组相比，Si CRTAC1-2及Si CRTAC1-3组的细胞活性提高了13～16％(图2F)，同样在H1975细胞中，与转染siRNA-CTL组相比，Si CRTAC1-2及Si CRTAC1-3组的细胞活性提高了8～10％(图2G)，这表明敲低CRTAC1的表达可显著抑制顺铂对NSCLC细胞的杀伤作用。因此，可得知以下结论：CRTAC1可增强顺铂对NSCLC细胞系的细胞毒性作用。
4)利用流式细胞术分析在顺铂处理下CRTAC1的表达高低对NSCLC细胞的细胞凋亡的影响：
①将步骤1)中的NSCLC细胞CRTAC1过表达组和步骤2)中的NSCLC细胞Si CRTAC1组作为实验组，而步骤1)中的NSCLC细胞Vector组和步骤2)中的NSCLC细胞siRNA-CTL组作为对照组。各实验组和对照组根据顺铂处理的浓度分为三个亚组，分别为0、10、20μM顺铂组。从实验组和对照组中取适量细胞铺板于6孔板中，使其贴壁后的细胞密度达30～40％；
②待各组细胞贴壁完全后，更换为0.1％FBS的RPMI-1640培养基进行饥饿；
③饥饿12h后，10μM顺铂处理组和20μM顺铂处理组更换为经10％FBS的RPMI-1640培养基稀释溶于DMF的顺铂储存液至终浓度为10、20μM并在中加入相应浓度的顺铂，在5％CO2、37℃的培养箱中生长48h。
④顺铂处理48h后收集细胞样本：将培养基上清收集至15mL离心管中，细胞通过不含EDTA的胰酶温和地消化，加入培养基终止消化并收集细胞至离心管中，1200rpm，离心5min。吸弃培养基，PBS重悬细胞沉淀，将其吸取至1.5mL去酶Ep管中，离心洗涤一次；
⑤向其中加入500μl1×结合缓冲液重悬细胞。向各组中分别加入5μl Annexin V-APC和10μl 7-AAD，轻柔吹打混匀后，置于暗处室温孵育5min。
⑥将样品置于流式细胞仪吸样处进行检测分析。将早期凋亡细胞比率与晚期凋亡细胞比率相加作为总体细胞凋亡率，进行统计学分析。在20μM顺铂作用48h下，与对照组相比，过表达CRTAC1的H1299组的细胞凋亡率从21.7％上升至37.5％(图2H-I)，HCC827组细胞凋亡率从24.3％上升至40％(图2J-K)，H226组的细胞凋亡率从33.8％上升至68％(图2L-M)，这一致的结果表明过表达CRTAC1组的细胞凋亡率显著高于对照组。而经20μM顺铂处理48h后，在敲低CRTAC1组的NSCLC细胞株中，与转染siRNA-CTL组相比，Si CRTAC1-2及SiCRTAC1-3组的A549细胞凋亡率降低了26～36％(图2N-O)，同样在H1975细胞中，与转染siRNA-CTL组相比，Si CRTAC1-2及Si CRTAC1-3组的细胞凋亡率降低了15～19％(图2P-Q)，同样表明敲低CRTAC1组的细胞凋亡率显著低于对照组。
综上结果，可得知：CRTAC1可促进顺铂诱导的NSCLC细胞的细胞凋亡。
实施例3：
1)本发明用于构建裸鼠皮下成瘤模型的实验动物从江苏集萃药康生物技术有限公司订购。所有裸鼠的遗传背景均为BALB/c品系，雌性，3～4周龄，于温州医科大学实验动物中心SPF级实验区域进行饲养。所有的动物实验研究均经过温州医科大学实验动物伦理委员会所批准。
2)裸鼠皮下成瘤实验：
①复苏液氮中冻存的H1299-CRTAC1稳定过表达CRTAC1细胞及H1299-Vecter对照细胞，运用10％FBS的RPMI-1640培养基将其置于5％CO2、37℃的细胞培养箱中进行培养；
②当各组细胞处于对数生长期且镜下观察到细胞状态良好时，运用0.25％的胰蛋白酶处理，轻柔消化贴壁细胞，将两组所有的细胞悬液分别收集于已标记好的50ml离心管中，1200rpm，离心5min。弃上清，再用适量PBS缓冲液离心洗涤一次；
③用1mlPBS缓冲液重悬细胞，轻柔吹打混匀后，取10μl细胞悬液进行稀释，稀释倍数为100倍。计数稀释后的细胞悬液中每毫升细胞量，比例换算后，取出动物实验所需的细胞量于15mL离心管中，以5×107个细胞/mL PBS缓冲液的浓度向其中加入相应的PBS缓冲液进行稀释，充分混匀后，将细胞混合液分装至1.5mL Ep管中，放置在冰上运输到动物实验中心；
④将打好耳标的裸鼠随机分为两组，每组数量为12只。混匀两组Ep管中的细胞悬液，用1mL的无菌注射器吸取100μl细胞悬液，把其中含有的5×106个H1299-Vector细胞或H1299-CRTAC1细胞皮下注射至裸鼠右侧背部；
⑤如图3A所示，建模后7天，待两组荷瘤裸鼠的皮下瘤可触及时，将其随机分为两个亚组，一组为CDDP组，一组为Vehicle组，每个组有6只裸鼠。CDDP组的裸鼠以3mg/kg的浓度给予顺铂腹腔注射治疗，顺铂的剂量是基于之前的研究参考，顺铂经PBS缓冲液稀释成浓度为0.3mg/ml的工作液。Vehicle组的裸鼠以等量的含0.3mg/ml对照溶剂DMF的PBS缓冲液进行腹腔注射治疗。化疗周期为每3天一次，共10次。同时每次记录下皮下瘤的长宽数据，使用通用公式计算肿瘤体积，并称量裸鼠体重。治疗30天后，对裸鼠荷瘤模型进行拍照记录，并解剖切除皮下肿瘤组织，PBS清洗后称重并对瘤组织进行拍照。所得结果如图3B-E所示，可获得以下结论：CRTAC1可在体内显著提高NSCLC细胞荷瘤模型对顺铂的敏感性。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 瓯江实验室
温州医科大学
<120> 非小细胞肺癌精准化疗预测靶标CRTAC1及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtgtcgccc tggctgactt 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagaacttgg gtgaggcgat gtc 23

Claims (5)

1.生物标志物CRTAC1的检测试剂在制备预测非小细胞肺癌患者的顺铂化疗敏感性药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：非小细胞肺癌患者肺癌组织中CRTAC1的表达水平可用于指导临床顺铂化疗。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：CRTAC1表达越高顺铂化疗敏感性越强。
4.促进CRTAC1基因表达的试剂在制备用于提高接受顺铂治疗的非小细胞肺癌患者化疗敏感性的药物中的应用，其特征在于：促进CRTAC1基因表达的试剂为CRTAC1基因过表达质粒。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：包括CRTAC1基因过表达质粒的构建，其核苷酸基因序列NCBI Gene ID号为：55118，非小细胞肺癌化疗药物为顺铂。
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