CN114075604B - 胶质母细胞瘤预后预测评分模型及其在指导临床精准诊疗中的应用 - Google Patents

胶质母细胞瘤预后预测评分模型及其在指导临床精准诊疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了胶质母细胞瘤预后预测评分模型及其在指导临床精准诊疗中的应用，所述评分模型中包括GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2，根据该评分模型可对胶质母细胞瘤患者的预后和治疗效果进行准确预测，高评分提示所述胶质母细胞瘤患者的预后较差，使用胶质瘤临床一线孤儿药、EGFR‑AKT通路抑制剂、脂肪酸合成代谢抑制剂的多靶点联合治疗策略可使患者获益，该评分模型在临床上具有非常好的应用价值。

Description

胶质母细胞瘤预后预测评分模型及其在指导临床精准诊疗中 的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及胶质母细胞瘤预后预测评分模型及其在指导临床精准诊疗中的应用。
背景技术
脑胶质瘤（Glioma）是中枢神经系统中发病率最高的原发性恶性肿瘤，大约占颅内肿瘤的80%，其恶性程度高，5年病死率在全身各系统肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌。2016年世界卫生组织（WHO）根据病理学上的细胞恶性程度，将胶质瘤分为I、II、III、IV四个级别，通常把I/II级胶质瘤视为低级别胶质瘤，III/IV级胶质瘤多视为高级别胶质瘤。作为WHO IV级的胶质瘤，胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）约占颅内肿瘤的50%，是临床诊疗难度最大的疾病之一，发病时常处于疾病发展后期，已有明显的占位进而影响患者的生理功能，严重威胁人民健康。胶质母细胞瘤的进展迅速，且对传统放化疗敏感性差，目前临床常规采用外科手术切除辅以同步放化疗的治疗策略，但疾病治疗效果不佳，患者中位生存期一般不超过18个月。
随着高通量测序技术不断应用到胶质瘤发病机理和诊断研究中，以及胶质瘤分子病理诊断的不断发展，科学家们揭示了胶质母细胞瘤发生发展过程中的染色质变化、潜在关键基因和信号通路。相关研究表明，胶质母细胞瘤以7号染色体扩增和10号染色体缺失为标志性特征，其中，位于7号染色体的EGFR基因常发生拷贝数增加和EGFR-vIII突变，导致酪氨酸激酶受体信号通路发生配体非依赖性持续激活。目前，针对EGFR的靶向抑制剂（EGFR-TKI）已经发展到第三代，以奥西替尼（Osimertinib，AZD-9291）、吉非替尼（Gefitinib）为代表药物，在非小细胞肺癌等肿瘤的临床试验中获得良好收效，但吉非替尼在胶质母细胞瘤治疗中未见显著抑瘤效果，患者总体生存期没有延长。因此，EGFR-TKI单独给药不是一个理想的胶质母细胞瘤治疗策略。
近年来，肿瘤免疫治疗为患者带来了希望。以PD-1/PD-L1为药物靶点的免疫检查点抑制剂/单克隆抗体药物是其代表药物，通过阻断肿瘤细胞对杀伤性T细胞的程序诱导死亡而提高肿瘤中浸润的具有杀伤作用的效应T细胞，进而增强免疫系统对肿瘤的杀伤效果。但由于肿瘤发生部位在大脑，是人体为数不多的免疫豁免器官，又有血脑屏障存在，导致肿瘤微环境中基本没有T细胞浸润，胶质母细胞瘤成为著名的免疫抑制型“冷肿瘤”，这也是免疫检查点药物对胶质母细胞瘤疗效不佳的主要原因。此外，肿瘤旺盛的能量代谢也对微环境具有重塑作用。肿瘤细胞需要与微环境中其他细胞竞争并不断汲取营养物质，以应对自身的生长需求。同时还会释放代谢物到微环境中，这些代谢物会进一步影响免疫细胞杀伤肿瘤的能力。例如，胶质母细胞瘤细胞可通过PTRF-cPLA2调控轴增加胞内溶血性磷脂酰胆碱水平，进而提高细胞和微环境中的ATP和腺苷水平，诱导CD8+T细胞发生耗竭。因此，靶向肿瘤代谢有望从限制能量供给和调节免疫微环境双方面抑制肿瘤生长。
综上所述可知，目前临床上亟待一个可以达到胶质母细胞瘤精准诊断、判断预后、并给出个体化治疗方案的精准诊疗评判标准及相关的预测模型。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于弥补目前本领域存在的技术空白，提供一种胶质母细胞瘤预后预测模型及其在临床精准诊疗中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了一种用于胶质母细胞瘤预后预测和/或指导临床多靶点联合治疗的基因群。
进一步，所述基因群包括EGFR-AKT信号通路相关基因和/或脂肪酸合成代谢通路相关基因；
优选地，所述EGFR-AKT信号通路相关基因包括GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA中的一种或多种；
优选地，所述脂肪酸合成代谢通路相关基因包括ACSS3、ACSL3、ELOVL2中的一种或多种；
更优选地，所述基因群为GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2中的一种或多种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述基因群为CHI3L1、EGFR、ACSL3；
在本发明的另一具体实施方式中，所述基因群为GFAP、CHI3L1、EGFR、ACSL3；
在本发明的另一具体实施方式中，所述基因群为GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2。
本发明的第二方面提供了检测样本中本发明第一方面所述的基因群表达水平的试剂在制备用于胶质母细胞瘤预后预测和/或指导临床多靶点联合治疗的产品中的应用。
进一步，所述试剂包括通过数字成像技术、蛋白免疫技术、染料技术、核酸测序技术、核酸杂交技术、色谱技术、质谱技术、二代测序技术中的一种或多种检测样本中所述基因群表达水平的试剂。
进一步，所述试剂包括检测所述基因群mRNA表达水平的试剂；
优选地，所述试剂为检测与所述基因群转录的mRNA互补的cDNA的水平的试剂；
优选地，所述试剂为引物或探针。
进一步，所述试剂包括检测所述基因群蛋白表达水平的试剂；
优选地，所述试剂为检测所述基因群编码的多肽或蛋白水平的试剂；
优选地，所述试剂为抗体或抗体片段或亲和性蛋白。
进一步，所述样本包括受试者的外周血样本、血清样本、血浆样本、尿样本、唾液样本、组织样本；
优选地，所述样本为受试者的组织样本，在本发明的具体实施方式中，所述受试者优选为胶质母细胞瘤患者。
进一步，在本发明的具体实施方式中，本发明通过对胶质母细胞瘤患者术后的肿瘤组织中GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2共7个基因的表达水平进行定量分析，进而对所述胶质母细胞瘤患者的预后及治疗疗效进行预测；
优选地，所述7个基因的表达水平为基因mRNA定量表达水平；
优选地，所述基因表达水平的检测方法为转录组测序。
本发明的第三方面提供了一种用于胶质母细胞瘤预后预测和/或指导临床多靶点联合治疗的产品。
进一步，所述产品包含检测本发明第一方面所述的基因群表达水平的试剂；
优选地，所述产品为体外诊断产品；
更优选地，所述体外诊断产品为体外诊断试剂盒；
优选地，所述试剂包括检测所述基因群mRNA表达水平的试剂和/或检测所述基因群蛋白表达水平的试剂；
更优选地，所述试剂为引物、探针、抗体、抗体片段、亲和性蛋白中的一种或多种。
进一步，所述产品还包含总RNA抽提试剂、逆转录试剂、二代测序试剂中的一种或多种。
本发明中所述基因群表达水平的检测可以采用本领域已知的测定方法，包括但不限于检测所述基因的RNA转录物的量或所述基因编码的多肽的量的方法；
所述基因的RNA转录物可通过本领域已知的方法转化为与其互补的cDNA，通过测定互补cDNA的量可以获得RNA转录物的量。基因的RNA转录物或与其互补的cDNA的量，可以针对样本中总RNA或总cDNA的量或者针对一组管家基因的RNA转录物或与其互补的cDNA的量来标准化；
所述RNA转录物可以通过例如杂交、扩增或者测序的方法来检测和量化，包括但不限于将RNA转录物与探针或者引物杂交的方法，通过基于聚合酶链式反应（PCR）的各种定量PCR技术或测序技术检测RNA转录物或其对应cDNA产物的量的方法。所述定量PCR技术包括但不限于荧光定量PCR、实时PCR或半定量PCR技术。所述测序技术包括但不限于Sanger测序、二代测序、三代测序和单细胞测序等。优选地，所述测序技术为二代测序，更优选地为靶向RNA-seq的转录组测序技术。
本发明的第四方面提供了一种用于胶质母细胞瘤预后预测和/或指导临床多靶点联合治疗的装置。
进一步，所述装置包括：
(1) 数据获取模块，用于获取待测胶质母细胞瘤患者样本中的本发明第一方面所述的基因群表达谱数据；
(2) 预测模块，用于将所述数据获取模块得到的基因群表达谱数据作为输入数据提供给预测模型，所述预测模型基于胶质母细胞瘤患者的基因群表达谱数据而对所述胶质母细胞瘤患者的预后及治疗疗效进行预测；
(3) 预测结果获取模块，用于获取所述预测模块中预测模型的输出结果，得到待测胶质母细胞瘤患者的预后及治疗疗效预测结果；
优选地，所述预测模型为Cox回归模型；
更优选地，所述Cox回归模型为LASSO Cox回归模型；
最优选地，所述预测模型的公式为风险评分=
Figure 375103DEST_PATH_IMAGE001
，其中，N为用于预测 预后的基因数，Expi为每个基因的表达水平，Ci为每个基因的回归系数；当风险评分高于中 位数时，患者预后不良，采用胶质瘤临床一线孤儿药、EGFR-AKT通路抑制剂、脂质代谢抑制 剂的多靶点联合治疗策略可使患者获益；当风险评分低于中位数时，患者预后良好；
最优选地，在TCGA、CGGA和Rembrandt数据集中，所述中位数分别为15.536、4.708、22.462；
在TCGA数据集中，当风险评分高于15.536时，患者预后不良，当风险评分低于15.536时，患者预后良好；
在CGGA数据集中，当风险评分高于4.708时，患者预后不良，当风险评分低于4.708时，患者预后良好；
在Rembrandt数据集中，当风险评分高于22.462时，患者预后不良，当风险评分低于22.462时，患者预后良好；
最优选地，所述基因为GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2中的一种或多种；
最优选地，所述胶质瘤临床一线孤儿药为替莫唑胺；
最优选地，所述EGFR-AKT通路抑制剂为MK-2206或奥西替尼；
最优选地，所述脂质代谢抑制剂为MK-803或阿托伐他汀。
进一步，所述脂质代谢抑制剂是为了抑制脂肪酸代谢引起的胆固醇增加和能量代谢。
本发明的第五方面提供了一种计算机设备。
进一步，所述计算机设备包括存储器和处理器，所述存储器存储有程序，所述处理器执行所述程序时实现如下方法：
获取待测胶质母细胞瘤患者样本中的本发明第一方面所述的基因群表达谱数据；
将所述基因群表达谱数据作为输入数据提供给预测模型；
输出待测胶质母细胞瘤患者的预后及治疗疗效预测结果；
优选地，所述预测模型为Cox回归模型；
更优选地，所述Cox回归模型为LASSO Cox回归模型；
最优选地，所述预测模型的公式为风险评分=
Figure 455055DEST_PATH_IMAGE001
，其中，N为用于预测 预后的基因数，Expi为每个基因的表达水平，Ci为每个基因的回归系数；当风险评分高于中 位数时，患者预后不良，采用胶质瘤临床一线孤儿药、EGFR-AKT通路抑制剂、脂质代谢抑制 剂的多靶点联合治疗策略可使患者获益；当风险评分低于中位数时，患者预后良好；
最优选地，在TCGA、CGGA和Rembrandt数据集中，所述中位数分别为15.536、4.708、22.462；
在TCGA数据集中，当风险评分高于15.536时，患者预后不良，当风险评分低于15.536时，患者预后良好；
在CGGA数据集中，当风险评分高于4.708时，患者预后不良，当风险评分低于4.708时，患者预后良好；
在Rembrandt数据集中，当风险评分高于22.462时，患者预后不良，当风险评分低于22.462时，患者预后良好；
最优选地，所述基因为GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2中的一种或多种；
最优选地，所述胶质瘤临床一线孤儿药为替莫唑胺；
最优选地，所述EGFR-AKT通路抑制剂为MK-2206或奥西替尼；
最优选地，所述脂质代谢抑制剂为MK-803或阿托伐他汀。
本发明的第六方面提供了一种计算机可读存储介质。
进一步，所述计算机可读存储介质上存储有程序，所述程序被执行时实现如下方法：
获取待测胶质母细胞瘤患者样本中的本发明第一方面所述的基因群表达谱数据；
将所述基因群表达谱数据作为输入数据提供给预测模型；
输出待测胶质母细胞瘤患者的预后及治疗疗效预测结果；
优选地，所述预测模型为Cox回归模型；
更优选地，所述Cox回归模型为LASSO Cox回归模型；
最优选地，所述预测模型的公式为风险评分=
Figure 543096DEST_PATH_IMAGE001
，其中，N为用于预测 预后的基因数，Expi为每个基因的表达水平，Ci为每个基因的回归系数；当风险评分高于中 位数时，患者预后不良，采用胶质瘤临床一线孤儿药、EGFR-AKT通路抑制剂、脂质代谢抑制 剂的多靶点联合治疗策略可使患者获益；当风险评分低于中位数时，患者预后良好；
最优选地，在TCGA、CGGA和Rembrandt数据集中，所述中位数分别为15.536、4.708、22.462；
在TCGA数据集中，当风险评分高于15.536时，患者预后不良，当风险评分低于15.536时，患者预后良好；
在CGGA数据集中，当风险评分高于4.708时，患者预后不良，当风险评分低于4.708时，患者预后良好；
在Rembrandt数据集中，当风险评分高于22.462时，患者预后不良，当风险评分低于22.462时，患者预后良好；
最优选地，所述基因为GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2中的一种或多种；
最优选地，所述胶质瘤临床一线孤儿药为替莫唑胺；
最优选地，所述EGFR-AKT通路抑制剂为MK-2206或奥西替尼；
最优选地，所述脂质代谢抑制剂为MK-803或阿托伐他汀。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
本发明首次提供了一种全新的用于胶质母细胞瘤精准诊疗的评分模型，以患者肿瘤组织EGFR-AKT信号通路激活状态和脂肪酸合成代谢旺盛程度来作为患者生存预后判别的参数，即通过检测患者肿瘤组织中GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2基因表达水平并进行综合评分来作为评判参数；高评分提示所述胶质母细胞瘤患者的预后较差，使用胶质瘤临床一线孤儿药、EGFR-AKT通路抑制剂、脂质代谢抑制剂的多靶点联合治疗策略可使患者获益。
附图说明
图1显示临床GBM患者单细胞测序的整体情况结果图，其中，A图：经过降维获得26个细胞簇，B图：26个细胞簇的差异表达基因热图，C图：细胞类型鉴定结果，D图：各细胞类型的标志基因小提琴图，E图：各患者肿瘤组织的细胞分布，F图：肿瘤细胞inferCNV分析；
图2显示RTK通路与脂肪酸合成代谢通路的相关情况结果图，其中，A图：根据6个基因可将肿瘤细胞分成4群，B图：6个基因的表达分布图，C图：4群细胞差异基因热图，D图：根据6个基因表达将数据库中患者分为3群后的生存曲线，E图：RTK通路基因与脂肪酸合成代谢通路基因相关性分析；
图3显示TCGA数据库的RTK-脂肪酸基因集评分系统对GBM患者预后判别效果分析的结果图，其中，A图：WHO不同分级患者的评分结果，B图：该评分与肿瘤纯度的相关性分析，C图：高低评分患者的生存期分析，D图：胶质瘤患者各影响因素的单因素/多因素COX回归分析；
图4显示CGGA数据库的RTK-脂肪酸基因集评分系统对GBM患者预后判别效果分析的结果图，其中，A图：WHO不同分级患者的评分结果，B图：该评分与肿瘤纯度的相关性分析，C图：高低评分患者的生存期分析，D图：胶质瘤患者各影响因素的单因素/多因素COX回归分析；
图5显示Rembrandt数据库的RTK-脂肪酸基因集评分系统对GBM患者预后判别效果分析的结果图，其中，A图：WHO不同分级患者的评分结果，B图：该评分与肿瘤纯度的相关性分析，C图：高低评分患者的生存期分析，D图：胶质瘤患者各影响因素的单因素/多因素COX回归分析；
图6显示临床GBM肿瘤样本RNA测序与代谢组学联合分析结果图，其中，A图：EGFR与ACSS3、ACSL3、ELOVL2表达以及各个代谢物水平的热图，B图：4个基因表达水平与代谢物水平的相关性热图，C图：EGFR表达水平与胆固醇水平热图；
图7显示EGFR-AKT和胆固醇合成的抑制剂对细胞能量代谢和增殖的影响的结果图，其中，A图：Seahorse实验探讨MK-2206和MK-803对原代细胞TBD0220（EGFR通路激活）的能量代谢水平和ATP生成水平的影响，B图：Seahorse实验探讨EGFR-vIII过表达及MK-2206和MK-803对胶质瘤细胞系U87-MG细胞的能量代谢水平和ATP生成水平的影响，C图：ATP试剂盒探讨MK-2206和MK-803对TBD0220和U87-MG的ATP生成影响，D图：MK-2206和MK-803对TBD0220和U87-MG细胞克隆能力的影响，E图：MK-2206和MK-803对TBD0220和U87-MG增殖能力的影响；
图8显示单独给药和联合给药对荷瘤小鼠肿瘤成像结果和生存结果影响的结果图，其中，A图：单独给药和联合给药对荷瘤小鼠的肿瘤细胞生长影响成像图，B图：单独给药和联合给药对荷瘤小鼠生存时间影响的统计结果图，C图：单独给药和联合给药对荷瘤小鼠肿瘤生物发光水平影响的统计结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1 临床胶质母细胞瘤（GBM）样本获取和单细胞测序
1、样本来源
纳入本研究的胶质母细胞瘤患者共5例，在胶质母细胞瘤住院患者手术前均同患者及患者家属说明了实验情况并同其签订了知情同意书，每例患者术后样本进行多点取材，共取12个样本。
2、临床胶质母细胞瘤样本获取
(1) 待外科手术取出胶质母细胞瘤患者的胶质瘤后，使用手术刀获取肿瘤组织不同位置的肿瘤样本，每处取黄豆粒大小即可，注意避开坏死区域和凝血血块区域；
(2) 使用生理盐水清洗掉组织表面的血液，即刻放入美天旎组织保存液中，使用封口膜进行封口，4℃保存。
3、单细胞测序及分析
(1) 将获取的临床胶质母细胞瘤样本放到4℃运送箱中，寄送公司进行单细胞悬液制备和建库测序；
(2) 将测序下机数据进行整合分析，去除批次效应，对比参考基因组获得稀疏矩阵；
(3) 使用R语言Seurat v3.7.2 R包进行数据过滤、降维聚类后，获得26个细胞簇，可视化二维UMAP图见图1A，图中显示共包含26个细胞簇；
(4) 对比每个细胞簇中的基因表达情况，找出top10基因，并用热图进行可视化，得到的结果图见图1B，图中显示了26个细胞簇的差异表达基因；
(5) 利用细胞类型鉴定数据库CellMarker中的数据信息进行比对，获得细胞类型信息并使用UMAP图可视化，得到的结果图见图1C，图中显示了不同的细胞类型；
(6) 使用小提琴图可视化不同细胞类型的标志基因的表达情况，得到的结果图见图1D，图中显示了不同细胞类型的标志基因；
(7) 将12个GBM样本的细胞分布情况用UMAP图可视化，得到的结果图见图1E，图中显示了各患者肿瘤组织的细胞分布；
(8) 以非肿瘤细胞的基因表达作为参照，使用inferCNV R包进行肿瘤细胞拷贝数变异情况，并用热图可视化，得到的结果图见图1F，图中显示了肿瘤细胞拷贝数变异结果；
(9) 将单细胞数据中的肿瘤细胞亚型分离出来进行单独分析，通过降维聚类后以UMAP图可视化；
(10) 利用GFAP、CHI3L1、OLIG2、SOX6、EGFR、PDGFA的表达情况将单细胞肿瘤数据的细胞群划分为4群，并可视化，得到的结果图见图2A和图2B，图中显示了4种细胞群及其基因表达情况；
(11) 计算出4群细胞各自的top50基因并热图可视化，得到的结果图见图2C，图中显示了4种细胞群的差异基因。
4、实验结果
临床GBM患者肿瘤样本单细胞测序后获得26个细胞簇（见图1A），对比各簇差异基因和各细胞标志基因后获得7种细胞类型，其中肿瘤细胞占大多数（见图1C），并有7号染色体扩增和10号染色体缺失的GBM典型特征（见图1F）。利用GBM经典标志基因GFAP（代表星形胶质细胞来源）、CHI3L1（高表达提示预后不良）、OLIG2和SOX6（代表少突胶质细胞来源）的表达水平将肿瘤细胞进行区分，可将肿瘤细胞分成3群，分别是GFAP和CHI3L1阳性群（代表经典型和间质型GBM，预后较差）、OLIG2和SOX6阳性群（代表前神经元型GBM，预后相对较好）、以及全阴性群。在GFAP和CHI3L1阳性群细胞中有一群EGFR和PDGFA（代表RTK通路激活状态，通常阳性表达代表预后差）阳性表达的细胞，因此利用这两个基因进一步将该群细胞细分成2群。对比这4群细胞的差异基因，发现在GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA阳性细胞群中存在脂肪酸合成代谢通路的3个基因（ACSS3、ACSL3、ELOVL2）高表达（见图2C），表明了星形胶质细胞来源且RTK通路激活的肿瘤细胞存在旺盛的脂肪酸合成代谢，这一结果提示EGFR信号通路激活状态和脂肪酸合成代谢旺盛程度与GBM患者的预后密切相关，即基因GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2的表达水平和与GBM患者的预后密切相关，GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2可作为GBM患者预后预测的潜在生物标志物。
实施例2 利用胶质母细胞瘤数据库进行分析
本实施例使用TCGA、CGGA和Rembrandt数据库中的胶质母细胞瘤数据进行生物信息学分析，采用的分析软件为R语言，以验证评判标准的性能。
1、实验方法
(1) 数据下载：TCGA数据在UCSC XENA（https://xenabrowser.net/）网站进行下载，CGGA和Rembrandt数据在CGGA官网（http://www.cgga.org.cn/）进行下载，均包括基因表达数据和临床数据；
Figure 200343DEST_PATH_IMAGE002
(2) 使用GFAP、CHI3L1、OLIG2、SOX6的表达值，按照以下公式进行计算，小于中位数的患者为G3组，大于中位数的患者为G1+G2组；
Figure DEST_PATH_IMAGE003
(3) 在G1+G2组中进一步使用EGFR和PDGFA表达值进行计算，大于中位数的患者为G1组，小于中位数的患者为G2组；
(4) 计算G1、G2、G3患者的生存期，并绘制生存曲线，得到的结果图见图2D，图中显示了根据6个基因表达将数据库中患者分为3群后的生存曲线；
(5) 计算数据库中EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2基因的表达相关性，相关性分析的结果图见图2E，图中显示了RTK通路基因与脂肪酸合成代谢通路基因相关性的结果；
(6) 患者评分：使用GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2基因的表达值和对应患者的生存期做单因素COX回归分析，求得各自基因的β值，将这7个基因的β值与对应基因表达值的乘积相加，即获得该患者的综合评分，也就是RTK-脂肪酸基因集评分；
(7) 根据WHO级别对患者进行分组，条形图展示每组患者的综合评分，TCGA、CGGA和Rembrandt数据库中的GBM样本测序/芯片数据对应得到的结果图见图3A、图4A、图5A，图3A、图4A、图5A分别代表TCGA、CGGA和Rembrandt数据库中WHO不同分级患者的评分结果；
(8) 使用ESTIMATE方法计算出患者的肿瘤纯度，使用散点图展示患者综合评分与肿瘤纯度的关系，TCGA、CGGA和Rembrandt数据库中的GBM样本测序/芯片数据对应得到的结果图见图3B、图4B、图5B，图3B、图4B、图5B分别代表TCGA、CGGA和Rembrandt数据库中WHO不同分级患者的评分与肿瘤纯度之间的相关性；
(9) 根据综合评分中位数对患者进行分组，并进行生存曲线绘制，TCGA、CGGA和Rembrandt数据库中的GBM样本测序/芯片数据对应得到的结果图见图3C、图4C、图5C，图3C、图4C、图5C分别代表TCGA、CGGA和Rembrandt数据库中高低评分胶质母细胞瘤患者的生存期分析结果；
(10) 选择性别、年龄、WHO分级、IDH突变情况、1p/19q共缺失情况、MGMT启动子甲基化水平等参数，GFAP、CHI3L1、OLIG2、SOX6、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2基因的表达水平，以及Group分组和综合评分分组，进行单因素/多因素COX回归分析，TCGA、CGGA和Rembrandt数据库中的GBM样本测序/芯片数据对应得到的结果图见图3D、图4D、图5D，图3D、图4D、图5D分别代表TCGA、CGGA和Rembrandt数据库中胶质母细胞瘤患者各影响因素的单因素/多因素COX回归分析结果。
2、实验结果
通过TCGA、CGGA、Rembrandt数据库中的GBM样本测序/芯片数据和对应的临床数据分析发现，EGFR、PDGFA与ACSS3、ACSL3、ELOVL2呈现良好相关性（见图2E）；利用GFAP、CHI3L1、OLIG2、SOX6、EGFR、PDGFA的表达水平分布将数据库中患者进行分群，生存期分析发现GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA阳性患者的生存期最短，而OLIG2和SOX6阳性患者的生存期相对最长。于是将每个患者肿瘤中GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA和ACSS3、ACSL3、ELOVL2的表达水平进行整合，做成一个评分系统（评分模型），发现该评分可显著提示患者GBM分级，高评分预示WHO高级别，高评分患者的中位生存期比低评分患者显著缩短4倍，可用于GBM患者的预后预测。随后进行单因素和多因素COX回归分析（见图3D，图4D，图5D），上述结果显示WHO分级（高级别预示患者预后不良）、IDH突变状态（神经肿瘤研究公认的指标，野生型通常预示患者预后不良）对患者预后均有良好预测能力（P<0.05）；整合的评分系统与之相比也同样具有良好预测能力（P<0.05）；1p/19q共缺失状态在单因素COX分析时结果尚可（P<0.05），但多因素COX分析时1p/19q共缺失状态并无显著差异（P>0.05），表明了本发明提供的该评分系统可与WHO分级、IDH突变状态等经典方法同样具有判别胶质瘤患者预后的能力，强于1p/19q共缺失方法，进一步表明了该评分系统可作为独立判别胶质瘤患者生存预后的又一有力方法；
所述由GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2联合构成的用于预测胶质母细胞瘤患者预后的评分模型的诊断效能较好，AUC值为0.7516，所述GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2中的任意3-7个基因联合对胶质母细胞瘤患者预后预测的诊断效能结果见表1，结果显示，CHI3L1+EGFR+ACSL3三者联合的AUC值高达0.7947，表明了GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2中的一种或多种能够应用于胶质母细胞瘤患者的预后预测中，且具有较好的诊断效能。
表1 基因对胶质母细胞瘤预后预测的诊断效能
Figure 930401DEST_PATH_IMAGE004
实施例3 临床GBM样本RNA测序和非靶向代谢组学分析
1、实验方法
(1) 收集临床GBM患者12例，经患者及家属同意后取术后新鲜的胶质瘤组织样本黄豆粒大小，注意避开坏死区域和凝血血块区域，每例患者术后样本进行多点取材，共取63个样本；
(2) 使用生理盐水清洗掉组织表面的血液，放入冻存管中，即刻液氮速冻，干冰寄送公司进行RNA提取建库测序，以及代谢物萃取检测；
(3) 将测序下机数据和代谢组学数据进行整合分析；
(4) 提取EGFR、ACSS3、ACSL3、ELOVL2基因表达水平，以及脂肪酸合成代谢物磷脂酰胆碱（PC）、溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、溶血磷脂酰乙醇胺（LysoPE）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰丝氨酸（PS）的代谢物水平，使用热图可视化，得到的结果图见图6A，图中显示了EGFR与ACSS3、ACSL3、ELOVL2的表达水平以及各个代谢物的水平；
(5) 计算基因表达水平和脂肪酸合成代谢物水平的相关性，使用热图可视化，得到的结果图见图6B，图中显示了EGFR与ACSS3、ACSL3、ELOVL2的表达水平与各个代谢物的水平的相关性；
(6) 提取EGFR表达水平，以及胆固醇合成代谢物水平，使用热图可视化，得到的结果图见图6C，图中显示了EGFR的表达水平与胆固醇的水平。
2、实验结果
由于预后差的GBM患者存在脂肪酸合成代谢基因高表达，因此收取临床GBM患者术后新鲜肿瘤样本进行RNA测序和非靶向代谢组学分析，结果发现EGFR、ACSS3、ACSL3、ELOVL2基因的表达水平呈显著正相关。作为脂肪酸合成代谢的终产物，通过非靶向代谢组学分析发现细胞内磷脂酰胆碱和胆固醇水平与EGFR表达水平呈正相关，溶血性磷脂酰胆碱与EGFR表达水平呈负相关（见图6）。以上结果进一步证实了星形胶质细胞来源且RTK通路激活的GBM肿瘤细胞，其脂肪酸合成代谢通路也是异常激活状态。
实施例4 Seahorse线粒体压力实验、细胞ATP水平检测
1、Seahorse线粒体压力实验
(1) 常规培养胶质瘤细胞U87-MG和原代胶质瘤细胞TBD0220（EGFR通路激活）；
(2) 将细胞铺到Seahorse细胞板中，每个孔15,000个细胞；
(3) 细胞贴壁后，进行加药处理，分别加入5 μM MK-2206、5 μM MK-803、以及对应体积的DMSO；
(4) 检测前一晚，使用水化液对探针板进行水化，放于37℃无CO2培养箱过夜；
(5) 提前1小时配制好检测培养基，待细胞处理24 h后，尽弃细胞培养基，使用检测培养基洗涤细胞两次后，各孔加入500 μL检测液，放于37℃无CO2培养箱中静置1 h；
(6) 期间在探针板中加入试剂盒中提供的相应浓度的Oligomycin、FCCP、Retenone and Antimycin A药物到各自的加药孔中，放入机器进行质检；
(7) 待质检结束以及细胞板静置结束后，将细胞板放入机器，进行检测，时长约2h；
(8) 检测加入不同药物后的耗氧率（O2 consumption rate，OCR），结束后，导出数据进行分析作图。
2、细胞ATP水平检测
(1) 将细胞铺到6孔板中，按照实施例4中所述的刺激条件进行加药刺激；
(2) 24 h后，使用PBS洗涤细胞2次，加入试剂盒中的细胞裂解液，移液枪吹下细胞并转移至1.5 mL管中；
(3) 按照试剂盒的操作步骤，使用ATP标准品进行标准曲线的制备绘制，以及样品孔加样检测；
(4) 根据标准曲线计算样品中的ATP水平。
3、实验结果
作为RTK通路的关键受体，EGFR接收外界刺激后会向下激活PI3K-AKT信号通路，引起SREBP1切割，从而上调脂肪酸合成代谢通路的关键酶，因此选择特异性AKT磷酸化抑制剂MK-2206来阻断EGFR-AKT信号通路。胆固醇合成的关键步骤是HMG-CoA还原酶催化酯酰辅酶A生成甲羟戊酸，因此选择HMG-CoA还原酶抑制剂MK-803阻断该通路。通过Seahorse线粒体压力实验，发现EGFR激活可增强细胞能量代谢水平，分别加入两个抑制剂MK-2206、MK-803均可以导致细胞能量代谢异常，引起ATP生成显著降低（见图7A、图7B、图7C）。
实施例5 克隆形成实验
1、实验方法
(1) 常规培养胶质瘤细胞U87-MG和原代胶质瘤细胞TBD0220；
(2) 消化细胞为单细胞悬液并计数，以500个/孔的密度铺细胞到6孔板中；
(3) 待细胞贴壁后，弃去原有培养基，进行药物刺激，MK-2206浓度为1 μM，MK-803浓度为1 μM；
(4) 10-12天后，肉眼可见细胞克隆形成，此时使用PBS洗涤细胞2次，加入4%多聚甲醛室温固定10 min；
(5) PBS洗涤2次后，每孔加入1 mL 0.2%结晶紫染色液进行染色，室温慢摇2 h；
(6) 染色后，使用PBS冲洗干净，空气干燥，拍照记录。
2、实验结果
克隆形成实验的结果显示，分别加入两个抑制剂MK-2206、MK-803均可以导致细胞能量代谢异常，引起ATP生成显著降低，最终导致细胞生长缓慢，细胞克隆数急剧降低（见图7D）。
实施例6 细胞增殖实验
1、实验方法
(1) 常规培养胶质瘤细胞U87-MG和原代胶质瘤细胞TBD0220；
(2) 消化细胞为单细胞悬液并计数，以2000个/孔的密度铺细胞到6个96孔板中；
(3) 待细胞贴壁后，弃去原有培养基，进行药物刺激，MK-2206浓度为5 μM，MK-803浓度为5 μM；
(4) 每天取出1个96孔板，加入CCK-8试剂，37℃反应1 h；
(5) 取出细胞板，使用酶标仪读取每孔的波长在450 nm处的吸光度值；
(6) 共检测6天，并整合分析，绘制增殖曲线。
2、实验结果
结果显示，分别加入两个抑制剂MK-2206、MK-803均可以导致长时间阻断胆固醇合成对肿瘤细胞生长抑制更好（见图7E）。
实施例7 体内动物实验
1、实验方法
(1) 选择6周龄16-18 g重的雌性裸鼠，每组10只；
(2) 选择原代胶质瘤细胞TBD0220进行成瘤；
(3) 使用水合氯醛麻醉小鼠，将其固定在立体定位仪上；
(4) 使用手术刀划开头皮，使用注射器针头在颅骨上钻一个眼，位置在前囟和后囟中间中线偏右2 mm处；
(5) 进针，深度3 mm，退针1 mm，开始注射，速度为1 μL/min，每只小鼠注射3 μL，细胞总量为30万；
(6) 注射后，静置1 min退针，使用细线缝合头皮；
(7) 造模7天后，开始给药治疗，MK-2206和MK-803为口服灌胃给药，TMZ为腹腔给药，共给药14天；
(8) 每7天进行小鼠活体成像，记录瘤体信号；
(9) 每天观察小鼠状态，记录生存期。
2、实验结果
结果显示，使用患者来源的原代肿瘤细胞TBD0220（存在RTK通路和脂肪酸合成代谢通路异常激活）进行裸鼠原位接种，接种7天后给药治疗，发现两个抑制剂MK-2206和MK-803分别单独给药的疗效不是很理想，但与替莫唑胺（TMZ）联合给药可显著抑制胶质母细胞瘤小鼠体内肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠生存时间一倍以上（见图8A、图8B和图8C）；
以上结果证实，利用上述7个基因（GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2）建立的评判标准不仅可以独立准确判别胶质母细胞瘤患者的生存预后，对于高评分患者还可指导临床使用RTK通路抑制剂和降脂药联合替莫唑胺的治疗策略；
为了验证TMZ和MK-2206联合、TMZ和MK-803联合是否存在协同增效的作用，对其抑制率进行了计算，分别得到了TMZ和MK-2206联合、TMZ和MK-803联合对胶质母细胞瘤的抑制率，其中，不同浓度的TMZ和MK-2206联合对胶质母细胞瘤的抑制率见表2，不同浓度的TMZ和MK-803联合对胶质母细胞瘤的抑制率见表3；
表2 不同浓度的TMZ和MK-2206联合对胶质母细胞瘤的抑制率
Figure 864859DEST_PATH_IMAGE005
表3 不同浓度的TMZ和MK-803联合对胶质母细胞瘤的抑制率
Figure 999169DEST_PATH_IMAGE006
利用金氏公式表达式q=EA+B/(EA+EB-EA×EB)判断两者联合（TMZ和MK-2206、TMZ和MK-803）对胶质母细胞瘤的治疗效果是否具有协同增效的作用，其中，EA+B为TMZ和MK-2206、TMZ和MK-803对胶质母细胞瘤的抑制率，EA为TMZ对胶质母细胞瘤的抑制率，EB为MK-2206或MK-803对胶质母细胞瘤的抑制率；若q=0.85-1.15为单纯叠加，1.15＜q＜20为协同，q＞20为显著协同，q＜0.85为拮抗，即q＞1.15时即可判定两者联合（TMZ和MK-2206、TMZ和MK-803）对胶质母细胞瘤的治疗存在协同增效的作用，而非单纯叠加；
根据表2和表3的结果，采用上述公式对TMZ和MK-2206联合、TMZ和MK-803联合对胶质母细胞瘤的治疗效果是否为协同增效进行判断，计算得到的q值见表4和表5，结果显示，TMZ和MK-2206联合对胶质母细胞瘤的治疗不存在协同增效的作用，而TMZ和MK-803联合对胶质母细胞瘤的治疗存在协同增效的作用，其中，TMZ和MK-803的摩尔浓度比为100-500：1-5，在该摩尔浓度比的范围内，TMZ和MK-803联合对胶质母细胞瘤的治疗存在协同增效的作用。
表4 TMZ和MK-2206两者联合的q值及其作用效果
Figure DEST_PATH_IMAGE007
表5 TMZ和MK-803两者联合的q值
Figure 550236DEST_PATH_IMAGE008
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.检测样本中基因群表达水平的试剂在制备用于胶质母细胞瘤预后预测产品中的应用，其特征在于，所述基因群为GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2组合。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过数字成像技术、蛋白免疫技术、染料技术、核酸测序技术、核酸杂交技术、色谱技术、质谱技术、二代测序技术中的一种或多种检测样本中所述基因群表达水平的试剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测所述基因群mRNA表达水平的试剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测所述基因群蛋白表达水平的试剂。
5.一种用于胶质母细胞瘤预后预测的装置，其特征在于，所述装置包括：
(1) 数据获取模块，用于获取待测胶质母细胞瘤患者样本中的基因群表达谱数据，所述基因群为GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2组合；
(2) 预测模块，用于将所述数据获取模块得到的基因群表达谱数据作为输入数据提供给预测模型，所述预测模型基于胶质母细胞瘤患者的基因群表达谱数据而对所述胶质母细胞瘤患者的预后进行预测；
(3) 预测结果获取模块，用于获取所述预测模块中预测模型的输出结果，得到待测胶质母细胞瘤患者的预后预测结果；
所述预测模型为Cox回归模型；
所述Cox回归模型为LASSO Cox回归模型；
所述预测模型的公式为风险评分=
Figure DEST_PATH_IMAGE001
，其中，N为用于预测预后的基因数， Expi为每个基因的表达水平，Ci为每个基因的回归系数；当风险评分高于中位数时，患者预 后不良，当风险评分低于中位数时，患者预后良好。
6.一种计算机设备，其特征在于，所述计算机设备包括存储器和处理器，所述存储器存储有程序，所述处理器执行所述程序时实现如下方法：
获取待测胶质母细胞瘤患者样本中的基因群表达谱数据，所述基因群为GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2组合；
将所述基因群表达谱数据作为输入数据提供给预测模型；
输出待测胶质母细胞瘤患者的预后预测结果；
所述预测模型为Cox回归模型；
所述Cox回归模型为LASSO Cox回归模型；
所述预测模型的公式为风险评分=
Figure 134152DEST_PATH_IMAGE001
，其中，N为用于预测预后的基因数， Expi为每个基因的表达水平，Ci为每个基因的回归系数；当风险评分高于中位数时，患者预 后不良，当风险评分低于中位数时，患者预后良好。
7.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述计算机可读存储介质上存储有程序，所述程序被执行时实现如下方法：
获取待测胶质母细胞瘤患者样本中的基因群表达谱数据，所述基因群为GFAP、CHI3L1、EGFR、PDGFA、ACSS3、ACSL3、ELOVL2组合；
将所述基因群表达谱数据作为输入数据提供给预测模型；
输出待测胶质母细胞瘤患者的预后预测结果；
所述预测模型为Cox回归模型；
所述Cox回归模型为LASSO Cox回归模型；
所述预测模型的公式为风险评分=
Figure 582451DEST_PATH_IMAGE002
，其中，N为用于预测预后的基因 数，Expi为每个基因的表达水平，Ci为每个基因的回归系数；当风险评分高于中位数时，患 者预后不良，当风险评分低于中位数时，患者预后良好。
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