CN116994762B - 用于MMDS辅助诊断的M Index模型的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于MMDS辅助诊断的M Index模型的构建方法及应用。本发明以羊水细胞中的特定代谢产物作为检测指标，可快速获得检测结果，进而对患者罹患MMDS的风险进行合理诊断和评估，以及时进行干预或治疗，大大简化了临床检测流程，降低了医疗成本，可有效避免医疗资源的浪费。本发明的M Index模型对于填补实现多发性线粒体功能障碍综合征精准快速诊断评估的空白，更快速、更准确地实现对多发性线粒体功能障碍综合征癌患儿的个体化精准干预或治疗具有重要的现实意义，具有极高的社会价值和市场应用前景。

Description

用于MMDS辅助诊断的M Index模型的构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种基于羊水细胞代谢产物的MIndex模型的构建方法及其应用，特别涉及一种基于羊水细胞代谢产物的用于多发性线粒体功能障碍综合征辅助诊断的M Index模型的构建方法及其应用。
背景技术
多发性线粒体功能障碍综合征（Multiple Mitochondrial DysfunctionSyndrome，MMDS）是由核基因突变引起的一类线粒体疾病，以白质异常和多种呼吸链紊乱为表现。MMDS通常始于婴儿早期，其典型特征是神经发育明显受损、全身肌无力、乳酸酸中毒和高血糖血症、空洞性白质脑病、呼吸衰竭，以及多系统能量代谢功能障碍导致的早期死亡。
MMDS的发病机制主要是由线粒体内铁硫蛋白的装配异常而引起，造成线粒体氧化磷酸化酶的功能缺陷，降低氧摄取、呼吸链的电子流及ATP合成，出现无氧代谢增加、氧自由基产生过多和细胞凋亡。大量研究发现，IBA57、NFU1、BOLA3、ISCA2等基因的异常表达可能与MMDS的发生存在高度关联性，其中IBA57突变引起的MMDS3型最为常见。IBA57基因位于1q42．13，含3个外显子，2个内含子，编码促成生物素合酶和乌头酸酶样线粒体蛋白合成的铁硫簇装配因子。铁硫簇由铁离子和硫离子组成，既可作为电子传递蛋白质的辅基参与能量转移，又可作为某些酶的活性基团参与各种生化反应，参与铁硫蛋白形成。铁硫蛋白靶向参与许多不同细胞途径，如IBA57蛋白功能缺陷影响线粒体中如顺乌头酸酶、硫辛酸合酶等[4Fe-4s]型铁硫蛋白的成熟，当铁硫簇装配受损，许多下游生物化学过程受到影响。
MMDS患儿发病后通常病情会急剧恶化，且临床上暂无有效的治疗或缓解措施，因此MMDS通常会在0-2岁内死亡，致死率极高。由于该病在孕妇产检过程中通过正常的手段无法提前予以诊断，现有的研究均指向IBA57变异与MMDS存在高端关联性，因此通过基因检测手段检测IBA57突变情况以对MMDS进行诊断成为了目前的主流手段。然而，由于缺乏足够的证据证明IBA57等基因具体哪些位点突变是导致MMDS的关键因素，因此在实际操作中可能会存在漏诊的风险；同时，由于基因检测所需要花费的时间周期较长，当检测结果出来时，胎儿已经继续成长发育数周甚至数月，进而可能导致孕妇出现最佳的治疗或干预时机。因此，有必要研究出一种新的辅助诊断途径，从而能够更加快速、准确地对MMDS风险进行提前合理地评估。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中所存在的MMDS难以提前快速诊断的问题，从而提供了一种基于羊水细胞代谢产物的用于多发性线粒体功能障碍综合征辅助诊断的MIndex模型的构建方法及其应用。通过对孕妇羊水细胞内特定代谢产物水平进行检测和分析，从而对腹中胎儿罹患多发性线粒体功能障碍综合征的风险进行提前、快速、合理地评估，避免因诊断干预不及时而导致疾病的进展。
为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。
本发明第一方面提供了一种用于多发性线粒体功能障碍综合征辅助诊断的MIndex模型的构建方法，包括如下步骤：
（1）分别从正常羊水和异常羊水中离心得到羊水细胞，接种于细胞培养皿中；7天后收获细胞，离心后弃上清；所述异常羊水为胎儿确诊为多发性线粒体功能障碍综合征的孕妇的羊水；
（2）对离心弃上清后的羊水细胞进行萃取，离心后取上清液，得到羊水细胞提取物；
（3）加入等体积的3-硝基苯肼甲醇溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺吡啶溶液，混匀后加热进行衍生化，得到衍生化溶液；
（4）衍生化溶液中加入分别经13C标记的3-硝基苯肼甲醇溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺吡啶溶液反应得到的同位素内标液；
（5）加入甲醇-水混合溶液进行稀释后，进行代谢物分析；
（6）对正常孕妇和确诊胎儿为多发性线粒体功能障碍综合征的孕妇这两组中各代谢物水平按照差异程度进行排序，筛选得到存在显著性差异的代谢物；
（7）基于步骤（6）中筛选得到的多发性线粒体功能障碍综合征具有显著相关性的代谢物，并按照如下公式进行与并按照如下公式进行M Index的计算：
M Index=∑N i=1（ki×Level of metabolitei）/N；
其中N代表代谢物的数量，ki表示各代谢物的系数，Level of metabolitei示各代谢物的相对水平。为了便于计算，本发明上下文中各代谢物的相对水平的单位均为pmol/104细胞。
作为优选地，步骤（1）中所述正常孕妇和确诊胎儿为多发性线粒体功能障碍综合征的孕妇的体内胎儿周龄为16-24周。
作为优选地，步骤（3）中采用甲醇-氯仿-水的混合溶剂对羊水细胞进行萃取。
作为优选地，步骤（4）中所述3-硝基苯肼甲醇溶液浓度为100-320mmol/L，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为50-200mmol/L。
作为优选地，步骤（4）中所述衍生化的温度为20-60℃，衍生化的时间为10-120min。
作为优选地，步骤（5）中所述3-硝基苯肼甲醇溶液浓度为100-320mmol/L，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺吡啶溶液浓度为50-200mmol/L。
作为优选地，步骤（5）中所述3-硝基苯肼甲醇溶液的加入体积为所述衍生化溶液的10-50%，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺吡啶溶液的加入体积为所述衍生化溶液的10-50%。
作为优选地，步骤（7）中筛选得到的代谢物选自己酰-L-肉碱（Hexanyl-L-carnitine）、二十碳五烯酸（EPA）、L-戊酰基肉碱（Valeryl-L-carnitine）、二十二碳五烯酸（DPA）、亚油酰基肉碱（Linoleylcarnitine）中的一种或多种；最优选地，步骤（4）中筛选得到的代谢物由己酰-L-肉碱（Hexanyl-L-carnitine）、二十碳五烯酸（EPA）、L-戊酰基肉碱（Valeryl-L-carnitine）、二十二碳五烯酸（DPA）、亚油酰基肉碱（Linoleylcarnitine）组成。
作为优选地，步骤（8）中所述N=5，所述己酰-L-肉碱的ki为6.0652，二十碳五烯酸的ki为0.3024、L-戊酰基肉碱的ki为3.198、二十二碳五烯酸的ki为0.1113，亚油酰基肉碱的ki为8.7800。
作为优选地，所述多发性线粒体功能障碍综合征选自多发性线粒体功能障碍综合征1型（MMDS1）、多发性线粒体功能障碍综合征2型（MMDS2）、多发性线粒体功能障碍综合征3型（MMDS3）、多发性线粒体功能障碍综合征4型（MMDS4）中的一种或多种；最优选地，所述多发性线粒体功能障碍综合征选自多发性线粒体功能障碍综合征3型（MMDS3）。
本发明第二方面提供了根据上述构建方法得到的用于多发性线粒体功能障碍综合征辅助诊断的M Index模型。
作为优选地，所述多发性线粒体功能障碍综合征选自多发性线粒体功能障碍综合征1型（MMDS1）、多发性线粒体功能障碍综合征2型（MMDS2）、多发性线粒体功能障碍综合征3型（MMDS3）、多发性线粒体功能障碍综合征4型（MMDS4）中的一种或多种；最优选地，所述多发性线粒体功能障碍综合征选自多发性线粒体功能障碍综合征3型（MMDS3）。
本发明第三方面提供了检测羊水细胞中代谢产物水平的试剂在制备用于多发性线粒体功能障碍综合征辅助诊断的产品中的应用，所述代谢产物由己酰-L-肉碱、二十碳五烯酸、L-戊酰基肉碱、二十二碳五烯酸组成、亚油酰基肉碱组成。
作为优选地，所述多发性线粒体功能障碍综合征选自多发性线粒体功能障碍综合征1型（MMDS1）、多发性线粒体功能障碍综合征2型（MMDS2）、多发性线粒体功能障碍综合征3型（MMDS3）、多发性线粒体功能障碍综合征4型（MMDS4）中的一种或多种；最优选地，所述多发性线粒体功能障碍综合征选自多发性线粒体功能障碍综合征3型（MMDS3）。
应理解的是，在没有特别说明的情况下，在本发明上下文中，所述羊水细胞中的各项代谢产物均为临床样本生化检测中常用的指标，本领域技术人员有能力根据实际条件来选择具体的检测方法、反应底物和检测设备。例如对于己酰-L-肉碱，可采用肉碱乙酰转移酶作为反应底物来检测，或采用琥珀酸硫激酶作为反应底物进行检测，亦可采用2-酮戊二酸脱氢酶作为反应底物进行检测。上述示例仅用于对部分技术方案进行展示，以便于本领域技术人员更好地理解本发明的基本构思，而并不作为对本发明的任何限制。对于用于检测上述各代谢产物的各种试剂，本领域技术人员可以常规市售获得，也可以自行配制相关检测标准品溶液进行检测，亦可以直接采用气象色谱法、液相色谱法、液质联用法、气质联用法等进行检测，只要能够检测各代谢产物的相关水平即可。
本发明第四方面提供了一种用于对胎儿罹患多发性线粒体功能障碍综合征的风险进行评估的系统，包括：
输入单元，用于输入待评估孕妇的数据；
分析单元，用于对待评估孕妇受试样本中的代谢物水平进行检测，所述代谢物由己酰-L-肉碱（Hexanyl-L-carnitine）、二十碳五烯酸（EPA）、L-戊酰基肉碱（Valeryl-L-carnitine）、二十二碳五烯酸（DPA）、亚油酰基肉碱（Linoleylcarnitine）组成；
评估单元，用于对分析单元分析得到的数据按照如下公式进行计算，以获得孕妇的M Index值，并根据M Index值对孕妇罹患多发性线粒体功能障碍综合征的风险进行评估；所述M Index按照如下公式进行计算：
M Index=∑N i=1（ki×Level of metabolitei）/N；
其中N代表代谢物的数量，ki表示各代谢物的系数，Level of metabolitei表示各代谢物的相对水平。
作为优选地，输入单元中所述数据包括但不限于孕妇的羊水样本数据、羊水细胞样本数据、羊水细胞代谢物样本数据中的一种或多种。
作为优选地，所述评估单元中按照如下标准对孕妇进行评估：
M Index与罹患多发性线粒体功能障碍综合征的风险呈现正相关，M Index越高，罹患多发性线粒体功能障碍综合征的风险相对越高，M Index越低，罹患多发性线粒体功能障碍综合征的风险相对越低。
作为优选地，所述多发性线粒体功能障碍综合征选自多发性线粒体功能障碍综合征1型（MMDS1）、多发性线粒体功能障碍综合征2型（MMDS2）、多发性线粒体功能障碍综合征3型（MMDS3）、多发性线粒体功能障碍综合征4型（MMDS4）中的一种或多种；最优选地，所述多发性线粒体功能障碍综合征选自多发性线粒体功能障碍综合征3型（MMDS3）。
本发明第五方面提供了一种计算机可读的存储介质，其中存储有处理器可执行的指令，所述处理器可执行的指令在处理器执行时执行上述用于对孕妇罹患多发性线粒体功能障碍综合征的风险进行评估的系统。
作为优选地，所述多发性线粒体功能障碍综合征选自多发性线粒体功能障碍综合征1型（MMDS1）、多发性线粒体功能障碍综合征2型（MMDS2）、多发性线粒体功能障碍综合征3型（MMDS3）、多发性线粒体功能障碍综合征4型（MMDS4）中的一种或多种；最优选地，所述多发性线粒体功能障碍综合征选自多发性线粒体功能障碍综合征3型（MMDS3）。
应理解的是，在没有特别说明的情况下，本发明上下文中所述的“模型”即为临床预测模型，本领域技术人员能够理解所述的“模型”为一种产品。临床上通过使用参数/半参数/非参数数学模型来评估受试者当前患有某种疾病的概率或将来发生某种结局的可能性。通过该模型，利用已知特征来计算未知结局发生的概率。临床预测模型一般采用各种回归分析方法建模，回归分析的统计本质是寻找一种定量因果关系，可用于对疾病进行诊断和/或预后评估，从而在诊断治疗决策、患者预后管理、公共卫生资源配置等方面发挥作用。
由于MMDS较为罕见，因此国内外暂无流行病学统计，极易误诊为脑炎及免疫性疾病，且在产检时通过常规医学手段例如B超等无法准确识别该疾病。现有研究已经明确了IBA57、NFU1、BOLA3、ISCA2等基因的异常表达可能与MMDS的发生存在高度关联性。以最为常见的IBA57为例，其中c.286T＞C、c.1053G＞A、c.188G＞A、c.697C＞T等位点突变已经被证实存在致病性。因此，通过检测基因突变情况是目前诊断孕妇胎儿是否患有MMDS的主要手段。然而，在进行基因突变检测时，往往需要对几个基因突变情况同时进行检测，由于对于现有几个关键基因的致病突变位点的研究尚未完全明确，因此并不能全面地、准确地对MMDS进行识别或诊断，甚至可能出现误诊或漏诊的问题。同时，由于基因检测的周期较长，在诊断结果出来后可能已过数周甚至数月，进而导致疾病的快速进展，从而错过最佳的治疗或干预时机。
本发明则对多发性线粒体功能障碍综合征的发病、发展机制进行了深入研究，发现羊水细胞中的特定代谢产物己酰-L-肉碱、二十碳五烯酸、L-戊酰基肉碱、二十二碳五烯酸、亚油酰基肉碱与MMDS存在高度关联性，其中MMDS患者羊水细胞中上述各代谢产物的水平远高于正常孕妇，己酰-L-肉碱、二十碳五烯酸、L-戊酰基肉碱、二十二碳五烯酸以及亚油酰基肉碱等五种代谢物水平的异常升高可能导致了三羧酸循环障碍，使得ATP功能不足，进而影响细胞活动及肌肉等组织的功能，最终严重影响胎儿的正常发育。因此可选择以该代谢产物的表达水平作为检测指标进行MMDS的辅助诊断。并基于该五种代谢物建立了一套用于评估罹患多发性线粒体功能障碍综合征风险的模型，即M Index。通过获取孕妇羊水细胞，并分析其代谢产生的上述各代谢产物水平，进行M Index计算后，可获知孕妇胎儿罹患MMDS的风险。该过程无需对各基因的突变情况进行检测，更加快速；且可覆盖各种基因突变导致的不同MMDS亚型，更加全面。
本发明相对于现有技术具有如下技术效果：
本发明以羊水细胞中的特定代谢产物作为检测指标，无需进行复杂、冗长的基因检测过程，仅需采用现有技术中已经广泛应用的临床检验检测手段（例如生理生化分析等）即可快速获得检测结果，进而对患者罹患MMDS的风险进行合理诊断和评估，以及时进行干预或治疗，大大简化了临床检测流程，降低了医疗成本，可有效避免医疗资源的浪费。同时，由于不同基因突变导致的不同表型的MMDS之间具有高度相似的临床表现，因此通过对羊水细胞中代谢产物的水平分析可覆盖所有表型MMDS的辅助诊断，而无需像基因突变检测一样需要针对各表型分别进行测定。本发明的M Index模型对于填补实现多发性线粒体功能障碍综合征精准快速诊断评估的空白，更快速、更准确地实现对多发性线粒体功能障碍综合征癌患儿的个体化精准干预或治疗具有重要的现实意义，具有极高的社会价值和市场应用前景。
附图说明
图1为MMDS组和正常组中IBA57蛋白表达水平结果示意图。
图2为正常羊水细胞与MMDS羊水细胞差异化表达RNA结果示意图。
图3为对正常羊水细胞与MMDS羊水细胞差异化表达RNA进行GO分析结果示意图。
图4为对正常羊水细胞与MMDS羊水细胞差异化表达RNA进行KEGG分析结果示意图。
图5为对正常羊水细胞与MMDS羊水细胞中五种代谢物水平分析结果示意图。
图6为MMDS受试者胎儿臀部肌肉样病理分析电镜结果示意图（横向）。
图7为MMDS受试者胎儿臀部肌肉样病理分析电镜结果示意图（纵向）。
图8为对MMDS受试者样本中NADH-肌纤维酶免疫组化检测结果示意图。
图9为对MMDS受试者样本中SDH-肌纤维酶免疫组化检测结果示意图。
图10为对MMDS受试者样本中COX-肌纤维酶免疫组化检测结果示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在无特别说明的情况下，本发明上下文中所使用的试剂中，均通过市售获得。羊水细胞通过常规方法进行培养。对于临床样本的获得，均来自于中山大学附属第六医院，临床样本的使用，均与患者签署了知情同意书，相关程序及方法符合医学伦理学要求以及药物临床试验质量管理规范。本发明所使用的实验方法，例如分子生物学实验、细胞实验、Western blot、生物信息学分析、免疫组化等均为本领域的常规方法和技术。
生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有实验至少重复三次。数据的统计分析和可视化由R软件（version 4.1.0）和GraphPad Prism 9.0完成。Pearson和Spearman相关性分析用于计算相关系数。使用Wilcoxon秩和检验或Student’s t-tests比较分析两个连续变量之间的差异，卡方检验或Fisher精确检验用于分类变量间的比较。p＜0.05被认为是一个显著的差异。
实施例1
对确诊为多发性线粒体功能障碍综合征复合杂合胎儿以及正常胎儿，分别于21周龄时通过羊水穿刺收集羊水细胞，检测其中相关蛋白的表达水平，具体步骤如下：
（1）从羊水细胞中分离出线粒体，加入裂解液（1mL RIPA裂解液中含5μL蛋白酶抑制剂，5μL PMSF和5μL磷酸酶抑制剂）于冰上进行裂解。裂解液于预冷的离心机中14000×g离心15分钟。上清液立刻转移入新的离心管中，取少量进行蛋白定量。加入上样缓冲液，100℃金属浴10min后放置于-80℃冰箱备用。
（2）使用PAGE凝胶制备试剂盒（雅酶）根据说明书配制电泳凝胶。将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室，放入电泳槽中，往外槽中加入1×SDS电泳缓冲液，往内槽中加入电泳缓冲液至刚好没过加样孔。根据蛋白定量浓度吸取相同质量的蛋白样品加入加样孔，空白孔加入，对照孔加入蛋白质分子量标准样品。
（3）连接电源，先在80V下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。电泳结束后，将凝胶从玻璃板上切取，覆盖PVDF膜，两边各覆盖6层滤纸，加入转膜三明治夹子中，放入转移槽内，加入预先配好的转移液，接通电极，250mA接通电流，电转移100min。
（4）转移结束后，将膜放置于TBST中，摇床上洗涤2次。洗涤结束后将膜至于5%脱脂奶粉的TBST中，摇床上缓慢摇动1h进行封闭。封闭结束后，将PVDF膜放置于TBST中，摇床上洗涤3次。
（5）根据标准蛋白位置切取PVDF膜条带，放入预先配制好的IBA57一抗溶液中（VDAC作为内参），4℃，摇床上缓慢摇动孵育过夜。取出孵育过一抗的PVDF膜，放置于TBST中，摇床上洗涤3次。
（6）将PVDF膜放置于二抗溶液中，室温摇床上缓慢摇动1h孵育。二抗结束后将PVDF膜放置于TBST中，摇床上洗涤3次。在全自动化学发光荧光分析系统（Euroclone）中滴加发光液，获得图像并分析。
实验结果如图1所示。结果显示，多发性线粒体功能障碍综合征组中的IBA57表达水平明显低于正常组，从而证实了IBA57突变及异常表达与多发性线粒体功能障碍综合征存在直接关联性，并明确了其为多发性线粒体功能障碍综合征3型。然而在对两组受试样品的RNA表达量分析时发现，多发性线粒体功能障碍综合征组和正常组IBA57 RNA表达水平无显著性差异（图中未示出），该结论与蛋白表达水平结果不一致。通过深入分析发现，尽管已经证实了IBA57异常突变是导致多发性线粒体功能障碍综合征患者的高风险因素，然而，由于突变位点并不明确，且部分DNA突变后也并不会影响后续RNA转录过程，因此对于最终IBA57 RNA表达水平并不会产生明显影响；此外，由于位点的突变，会导致翻译过程中蛋白构象发生改变，例如产生折叠等，进而影响蛋白的稳定性导致蛋白快速降解，最终呈现IBA57蛋白低表达。因此，仅通过检测IBA57等基因的表达水平来对多发性线粒体功能障碍综合征进行辅助诊断和预测会缺乏一定的准确性，而倘若对IBA57突变情况进行检测，则会显著增加检测成本和时间，且会因为突变位点不够明确而同样导致检测结果不准确。因此，需要考虑通过除IBA57之外的其他方法以快速、准确地进行多发性线粒体功能障碍综合征的诊断。
对此，通过羊水穿刺收集妊娠21±6周的正常羊水细胞以及诊断为多发性线粒体功能障碍综合征的异常羊水细胞，3000rpm、4℃离心5min，分离羊水细胞置于C-100完全培养基中进行培养（Gibco），并对其中mRNA的表达水平进行检测，具体步骤如下：
（1）将羊水细胞分别培养于6孔板中，待细胞生长至对数期时分别收集1×106个羊水细胞。
（2）向细胞液中加入1mL Trizol溶液，吹打混匀使细胞充分裂解，静置5min；加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分解除，室温静置2min。
（3）4℃下12000g离心10min，可见分为三层，其中RNA在上层水相中，转移至新的RNase-free EP管中；加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，于-20℃静置10min。
（4）4℃下12000g离心10min，收集RNA沉淀，取上清，用75%乙醇洗涤两次，超净台风干，加入20-60μL DEPC水溶解沉淀；总RNA的纯度控制OD260/OD280值在1.8-2.2，同时用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，RNA置于-80℃保存。
（5）取1μg RNA采用oligo d（T）磁珠进行纯化，置于NEB第一链合成反应缓冲液（5×，NEB）中升温进行片段化；使用随机引物和ProtoScript®II逆转录酶合成第一链cDNA；随后利用DNA聚合酶I和RNA酶H进行第二链cDNA的合成；剩余的悬突通过核酸外切酶/聚合酶活性转化为钝端。在DNA片段的3'端腺苷化后，将具有发夹环结构的单指数衔接子连接到DNA片段上。使用AMPureXP珠粒（Beckman Coulter，Beverly）进行尺寸选择。然后用PhusionHi-Fi DNA聚合酶、通用PCR引物和Index（X）引物进行PCR。最后，纯化PCR产物（AMPure XP系统），并在安捷伦生物分析仪2100系统上评估文库质量。根据制造商的说明，在IlluminaNovaSeq TM 6000平台上对文库进行测序，以产生150bp的配对末端读数。
实验结果如图2所示。结果显示，正常羊水细胞与异常羊水细胞在RNA表达上存在显著差异，其中表达上调的RNA有1536种，表达下调的RNA有1277种。
随后，对上述各差异表达的RNA进行GO和KEGG分析, 以预测相关靶基因的功能和基因间的分子相互作用。基因本体的三个领域描述分别如下：细胞组成，细胞的各个部分和细胞外环境；分子功能：基因产物在分子水平上的主要活性，如结合和催化；细胞内发生的决定开始和结束的生物学过程、事件或行为。有关生物学过程、细胞组成和分子功能富集排名前列的GO项如图3所示。KEGG通路分析结果如图4所示，结果显示，差异表达RNA的宿主基因主要与PI3K-Akt信号通路、人乳头瘤病毒感染等密切相关。
实施例2
前述实施例中证实了与多发性线粒体功能障碍综合征相关的影响因素及信号通路等。而在线粒体中，IBA57蛋白是必不可少的，它能促进[4Fe-4S]簇的组装和它们插入受体蛋白中。在Fe/S簇靶向反应之前或反应期间，Isu1上合成的[2F-2S]簇被一个由A型ISC蛋白Isa1（人类ISCA1）、Isa2（ISCA2）和叶酸结合蛋白IBA57组成的蛋白复合物转化为[4Fe-4S]形式。IBA57特异性地参与了线粒体[4Fe-4S]蛋白的成熟过程。对Fe-S簇生物生成及其在真核细胞中的调控的深入理解能够有助于对多发性线粒体功能障碍综合征等疾病的病理生理学的了解，特别是在线粒体中，线粒体必须合成Fe-S簇以纳入柠檬酸循环酶、琥珀酸脱氢酶和呼吸链复合体I-IV中。而通过对多发性线粒体功能障碍综合征组以及正常组样本进行分析发现，IBA57基因的异常表达可能会影响呼吸链复合体的表达。综合前述实施例中的RNA-seq数据以及IBA57突变对呼吸链复合体表达的影响可知，IBA57基因的异常表达可通过PI3K-Akt信号通路影响细胞正常活动，且可能会对呼吸链复合体、柠檬酸循环酶、琥珀酸脱氢酶等产物水平产生显著影响。
在此基础上，考虑可能存在其他代谢产物的表达也与多发性线粒体功能障碍综合征密切相关。对此，对确诊为多发性线粒体功能障碍综合征复合杂合胎儿（阳性组）以及正常胎儿（阴性组），分别于21周龄时通过羊水穿刺收集羊水，检测其中代谢产物的表达水平，具体步骤如下：
（1）取10mL羊水离心后接种沉淀到细胞培养皿中，7天后消化下贴壁的羊水细胞，并定量每组104羊水细胞，弃上清。
（2）采用甲醇、氯仿和水的混合溶剂对羊水细胞进行萃取，离心后取上清液，得到羊水细胞提取物。
（3）1mL羊水细胞提取物中加入1mL的3-硝基苯肼甲醇溶液和1mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺吡啶溶液，漩涡混匀，加热进行衍生化，得到衍生化溶液；所用的3-硝基苯肼浓度为200mmol/L，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为120mmol/L；反应温度为40℃，反应时长60min。
（4）衍生化溶液加入1mL经13C标记的3-硝基苯肼和1mL经13C标记的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应得到的同位素内标液。
（5）加入甲醇水混合溶液稀释，以液相色谱-质谱联用进行氨基酸、酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、有机酸、脂肪酸、糖、胆汁酸等代谢产物的测定。
（6）对阳性组和阴性组两组中各代谢物水平按照差异程度进行排序，筛选得到存在显著性差异的代谢物。
检测结果如图5所示。结果显示，阳性组中包括己酰-L-肉碱、二十碳五烯酸、L-戊酰基肉碱、二十二碳五烯酸以及亚油酰基肉碱在内的五种代谢物水平远高于阴性对照组（****p＜0.0001）。其中阳性组中己酰-L-肉碱水平平均是阴性对照组的6.86倍，二十碳五烯酸水平平均是阴性对照组的6.23倍，L-戊酰基肉碱水平平均是阴性对照组的5.81倍，二十二碳五烯酸水平平均是阴性对照组的5.38倍，亚油酰基肉碱平均是阴性对照组的5.17倍。很明显，己酰-L-肉碱、二十碳五烯酸、L-戊酰基肉碱、二十二碳五烯酸以及亚油酰基肉碱等五种代谢物的水平在一定程度上与多发性线粒体功能障碍综合征有着十分密切的关联性。
随后，基于上述5个与多发性线粒体功能障碍综合征具有显著相关性的代谢指标按照如下公式进行风险指数M Index的计算：
M Index=∑N i=1（ki×Level of metabolitei）/N；
其中N代表所检测的代谢物的数量，本实施例中N=5；ki表示所检测的各代谢物的系数，Level of metabolitei表示所检测的各代谢物的相对水平；其中，己酰-L-肉碱的系数为6.0652、二十碳五烯酸的系数为0.3024、L-戊酰基肉碱的系数为3.198、二十二碳五烯酸的系数为0.1113，亚油酰基肉碱的系数为8.7800。并利用Survminer包（version 0.4.9）确定其cut-off值为0.40。当计算出来的M Index高于cut-off值时，受试者则可能罹患多发性线粒体功能障碍综合征，M Index越大，罹患多发性线粒体功能障碍综合征的风险越高。
为了验证上述代谢物及风险指数M Index的临床预测性能，选择确诊为多发性线粒体功能障碍综合征的受试者进行检测。受试者需为先证一致者，即产妇至少完成过一次或以上受孕并进行生产或引产，本次试验阶段为二次或以上怀孕，且两次生产或引产的胎儿均确诊为多发性线粒体功能障碍综合征。通过对受试者在先生产或引产胎儿的基因以及本次怀孕过程中21周龄时羊水细胞基因分析发现，受试者一孩和二孩均出现了IBA57基因突变，且两次突变的位点均完全相同。另取受试者羊水细胞进行培养，对其中己酰-L-肉碱、二十碳五烯酸、L-戊酰基肉碱、二十二碳五烯酸以及亚油酰基肉碱等5种代谢物水平进行检测。以受试者1和受试者2为例，二者羊水细胞内各代谢物水平分别如下表1所示。
表1 羊水细胞中5种代谢物水平（pmol/104 cells）
经计算，受试者1的M Index为1.403，受试者2的M Index为0.978，均远高于cut-off值，从而可以判定受试者罹患多发性线粒体功能障碍综合征的风险极高，该结论也与受试者的基因检测结果和临床诊断结果相一致，证明了本发明所提供的羊水细胞中5种代谢物水平以及相关的M Index风险指数可以有效评估和预测多发性线粒体功能障碍综合征的发病情况。
通过分析发现，上述各代谢物水平的异常增加可以导致患者体内三羧酸循环障碍，使得ATP功能不足，进而影响细胞的生命活动和胎儿发育。肌肉组织作为人体耗能最大的运动组织，因此在肌肉上验证是否存在线粒体供能不足，肌肉收缩伸展异常。取引产后胎儿臀部肌肉样本于电子显微镜下进行病理检测，检测结果如图6-7所示。结果显示，受试样本中存在肌细胞肌原纤维：排列紊乱，部分肌细胞肌原纤维撕裂、溶解、肌小节消失；肌膜：皱缩。普通HE染色可见骨骼肌水肿，间质未见明显增生，束膜内、肌纤维间隙零星炎细胞浸润。
进一步地，以上述肌肉样本进行免疫组化检测，具体步骤如下：
（1）病理组织切片机将肌肉组织切片至4μm厚度，展于防滑玻片上，65℃，2小时烤干备用。
（2）脱蜡：将载玻片依次放入二甲苯I中浸泡5min→二甲苯II中浸泡5min→二甲苯III中浸泡5min→无水乙醇I 5min→无水乙醇II 5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→75%乙醇5min→ddH2O I 3min→ddH2O II 3min。
（3）封闭过氧化物酶：3%过氧化氢中浸泡10min，PBS清洗5min。
（4）高压抗原修复；配置EDTA修复液加入高压锅中，将载玻片放入锅中，800W，20min后，放至自然冷却。
（5）PBS清洗载玻片2遍，每次3min，用小纸片吸干组织周围水分，组化油笔距离组织边界0.5cm画圈。
（6）油化组织表面：将载玻片浸泡在0.1%PBST中，上下提拉并浸泡3min。
（7）一抗孵育：按说明书比例用抗体稀释液稀释抗体，50uL 4℃孵育过夜后，PBS洗3min，PBST洗3min。
（8）二抗孵育：二抗每组织1滴，覆盖组织表面，37℃孵育1小时后，PBS洗3min，PBST洗3min。
（9）二抗孵育结束后进行染色、清洗和封片处理，并于显微镜下进行检测。
检测结果如图8-10所示。结果显示，受试样本中NADH-肌纤维酶、SDH-肌纤维酶、COX-肌纤维酶均缺失，进一步证实了己酰-L-肉碱、二十碳五烯酸、L-戊酰基肉碱、二十二碳五烯酸以及亚油酰基肉碱等五种代谢物水平的异常升高导致了三羧酸循环障碍，使得ATP功能不足，进而影响细胞活动及肌肉等组织的功能，最终严重影响胎儿的正常发育。
本发明针对多发性线粒体功能障碍综合征的发病、发展机制进行了深入研究，发现羊水细胞中的特定代谢产物己酰-L-肉碱、二十碳五烯酸、L-戊酰基肉碱、二十二碳五烯酸、亚油酰基肉碱与MMDS存在高度关联性，其中MMDS患者羊水细胞中上述各代谢产物的水平远高于正常胎儿，己酰-L-肉碱、二十碳五烯酸、L-戊酰基肉碱、二十二碳五烯酸以及亚油酰基肉碱等五种代谢物水平的异常升高可能导致了三羧酸循环障碍，使得ATP功能不足，进而影响细胞活动及肌肉等组织的功能，最终严重影响胎儿的正常发育。因此可选择以该代谢产物的表达水平作为检测指标进行MMDS的辅助诊断。并基于该五种代谢物建立了一套用于评估罹患多发性线粒体功能障碍综合征风险的模型，即M Index。通过获取孕妇羊水细胞，并分析其代谢产生的上述各代谢产物水平，进行M Index计算后，可获知胎儿罹患MMDS的风险。无需进行复杂、冗长的基因检测过程，仅需采用现有技术中已经广泛应用的临床检验检测手段（例如生理生化分析等）即可快速获得检测结果，进而对患者罹患MMDS的风险进行合理诊断和评估，以及时进行干预或治疗，大大简化了临床检测流程，降低了医疗成本，可有效避免医疗资源的浪费。同时，由于不同基因突变导致的不同表型的MMDS之间具有高度相似的临床表现，因此通过对羊水细胞中代谢产物的水平分析可覆盖所有表型MMDS的辅助诊断，而无需像基因突变检测一样需要针对各表型分别进行测定。本发明的M Index模型对于填补实现多发性线粒体功能障碍综合征精准快速诊断评估的空白，更快速、更准确地实现对多发性线粒体功能障碍综合征患儿的个体化精准干预或治疗具有重要的现实意义，具有极高的社会价值和市场应用前景。
以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1. 一种用于多发性线粒体功能障碍综合征辅助诊断的M Index模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）分别从正常羊水和异常羊水中离心得到羊水细胞，接种于细胞培养皿中；7天后收获细胞，离心后弃上清；所述异常羊水为胎儿确诊为多发性线粒体功能障碍综合征的孕妇的羊水；
（2）对离心弃上清后的羊水细胞进行萃取，离心后取上清液，得到羊水细胞提取物；
（3）加入等体积的3-硝基苯肼甲醇溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺吡啶溶液，混匀后加热进行衍生化，得到衍生化溶液；
（4）衍生化溶液中加入分别经13C标记的3-硝基苯肼甲醇溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺吡啶溶液反应得到的同位素内标液；
（5）加入甲醇-水混合溶液进行稀释后，进行代谢物分析；
（6）对正常孕妇和确诊胎儿为多发性线粒体功能障碍综合征的孕妇这两组中各代谢物水平按照差异程度进行排序，筛选得到存在显著性差异的代谢物；所述代谢物由己酰-L-肉碱、二十碳五烯酸、L-戊酰基肉碱、二十二碳五烯酸、亚油酰基肉碱组成；
（7）基于步骤（6）中筛选得到的多发性线粒体功能障碍综合征具有显著相关性的代谢物，并按照如下公式进行与并按照如下公式进行M Index的计算：
M Index=∑N i=1（ki×Level of metabolitei）/N；
其中N=5，ki表示各代谢物的系数，Level of metabolitei表示各代谢物的相对水平；所述己酰-L-肉碱的ki为6.0652，二十碳五烯酸的ki为0.3024、L-戊酰基肉碱的ki为3.198、二十二碳五烯酸的ki为0.1113，亚油酰基肉碱的ki为8.7800。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中所述正常孕妇和确诊胎儿为多发性线粒体功能障碍综合征的孕妇的体内胎儿周龄为16-24周。
3.检测羊水细胞中代谢产物水平的试剂在制备根据权利要求1或2所述的用于多发性线粒体功能障碍综合征辅助诊断的产品中的应用，其特征在于，所述代谢产物由己酰-L-肉碱、二十碳五烯酸、L-戊酰基肉碱、二十二碳五烯酸组成、亚油酰基肉碱组成。
4.一种用于对胎儿罹患多发性线粒体功能障碍综合征的风险进行评估的系统，其特征在于，包括：
输入单元，用于输入待评估孕妇的数据；所述数据选自孕妇的羊水细胞代谢物样本数据；
分析单元，用于对待评估孕妇的数据中的代谢物水平进行检测，所述代谢物由己酰-L-肉碱、二十碳五烯酸、L-戊酰基肉碱、二十二碳五烯酸、亚油酰基肉碱组成；
评估单元，用于对分析单元分析得到的数据进行计算，以获得羊水的M Index值，并根据M Index值对胎儿罹患多发性线粒体功能障碍综合征的风险进行评估；所述M Index按照如下公式进行计算：
M Index=∑N i=1（ki×Level of metabolitei）/N；
其中N=5，ki表示各代谢物的系数，Level of metabolitei表示各代谢物的相对水平；所述己酰-L-肉碱的ki为6.0652，二十碳五烯酸的ki为0.3024、L-戊酰基肉碱的ki为3.198、二十二碳五烯酸的ki为0.1113，亚油酰基肉碱的ki为8.7800。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述评估单元中按照如下标准对孕妇进行评估：
M Index与罹患多发性线粒体功能障碍综合征的风险呈现正相关，M Index越高，罹患多发性线粒体功能障碍综合征的风险相对越高，M Index越低，罹患多发性线粒体功能障碍综合征的风险相对越低。
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