CN110885886B - 一种胶质母细胞瘤鉴别诊断及胶质瘤生存预后的分型方法 - Google Patents

一种胶质母细胞瘤鉴别诊断及胶质瘤生存预后的分型方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种胶质母细胞瘤生存预后的检测方法，该方法是：检测胶质母细胞瘤组织中特异性表达基因CBX3、BARD1、EGFR、IFRD1、CTSS、STAT1、GUCY1A3和MOBP的表达水平，根据所检测基因的表达水平预测胶质母细胞瘤患者生存预后，高表达CBX3、BARD1、EGFR、IFRD1、CTSS或/和STAT1的胶质瘤患者生存时间较短；高表达GUCY 1A3或/和MOBP的胶质瘤患者生存时间较长。本发明还提供了一种对胶质母细胞瘤进行预后分型方法，胶质母细胞瘤组织中CBX3、BARD1、EGFR、IFRD1、CTSS或/和STAT1高表达的为预后生存时间较短型；质母细胞瘤组织中GUCY 1A3或/和MOBP高表达的为预后生存时间较长。

Description

一种胶质母细胞瘤鉴别诊断及胶质瘤生存预后的分型方法
技术领域
本发明属于生物及医学技术领域，涉及肿瘤的诊断及生存预后的分型方法，具体涉及胶 质母细胞瘤鉴别诊断及胶质瘤生存预后的分型方法。
背景技术
胶质瘤是起源于神经胶质细胞的肿瘤，世界卫生组织依据组织病理学特征将其分为星形 细胞瘤，少突胶质瘤，原星形少突胶质瘤的分类在2016版分类标准中已不再单独存在[1]。胶 质母细胞瘤，即IV级星形细胞瘤，约占所有恶性中枢神经系统肿瘤的47.1％[2]，是原发性恶 性脑肿瘤中死亡率最高的肿瘤，目前胶质瘤治疗以手术切除为主，辅以放疗、化疗等，然而 预后仍较差，其中位生存期仅12-15个月[3]。因此寻找新的治疗方法及治疗靶点及其预后评价 等是目前胶质瘤研究中亟待解决的问题。
胶质瘤生物遗传学的发展,表明其发生发展是由多基因参与的复杂过程。随着神经分子病 理学的发展，发现了一系列胶质瘤诊断和预后相关的生物标志物，并逐步应用于临床诊断和 治疗中。2016年WHO神经系统肿瘤白皮书首次在组织学表型基础上加入了基因表型特征 对中枢神经系统肿瘤进行分类，加入的分子检测内容包括IDH、ATRX、1p/19q、EGFR扩增、 PTEN缺失、TP53变异及新加入的H3K27M突变等[1]。不同类型胶质瘤中存在不同的分子 标志物。星形细胞瘤常发生IDH、P53和ATRX基因突变，ATRX突变提示预后良好；而少突胶质瘤中1p/19q共缺失发生率很高，存在1p/19q共缺失的少突胶质瘤生长缓慢，并对化疗敏感[4]。IDH1(R132H)突变可以通过直接测序或免疫组化技术检测，在胶质瘤任何级别中都是独立预后因素[5]。发生IDH突变的患者无进展生存期和总生存期较未发生突变者更长[6]。胶质母细胞瘤中还存在PTEN突变，提示预后较差。除此之外还有MGMT[7]，可用于预 测患者对替莫唑胺化疗的敏感性。基于分子检测的新版指南是一次重要的改革，对疾病诊断治疗具有重要的指导意义，对患者预后具有更好的预测价值，这说明生物标志物检测在今后 脑胶质瘤发展中的重要地位，也迫切需要我们发现更多、更为精确的特异性胶质瘤标志物或分子靶标，以提供胶质母细胞瘤生存预后的检测及分型的新方法。
人类基因组计划的大规模开展，产生了海量的基因组序列数据和信息，为我们寻找生物 标志物提供了重要的工具。基因表达谱芯片是基因芯片的一种，可以对不同个体的组织内 mRNA或逆转录cDNA的表达水平进行检测和分析，判断这些基因表达的个体特异性、病变 特异性、组织特异性等，在探索疾病发展的过程提供了重要的作用。目前基因表达谱芯片研究很多，但大部分仅局限于单个研究。由于各个研究来自不同样本类型，如癌组织和癌细胞 株，研究的样本数量和质量也不相同，因此各个研究之间的结果常常存在不一致性。Meta分 析可以突破芯片间异质性的限制，系统性地结合公开的不同研究者的基因表达数据，扩大样 本量，同时考虑到基因表达变化的方向和幅度差异，有利于发现稳定和可靠的基因，找出疾 病相关的最为可靠的分子生物标志物[8]。表达数据的整合meta分析的方法已经应用在乳腺癌[9]，前列腺癌[10]，肝癌[11]和肺癌等研究中，然而目前胶质瘤中研究较少。
基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus，简称GEO)是由美国国家生物技术信 息中心(NCBI)创立的第一个高通量基因表达信息的公共贮存库，含有很多由研究者发布的 通过微阵列收集到的基因相关数据信息。2010年，癌症基因组图谱计划(TheCancer Genome Atlas，TCGA)建立了基于胶质瘤样本的全基因表达谱数据库。这些公共数据库为我们的meta 分析提供了丰富的资源。
发明内容
本发明的任务之一是提供一种胶质母细胞瘤鉴别诊断的检测方法。本发明的另一个任务 是提供一种对胶质瘤进行预后分型方法。本发明的又一个任务是提供一种胶质母细胞瘤生存 预后的检测方法
实现本发明的技术方案是：
本发明提供的胶质母细胞瘤特异性鉴别诊断的方法，包括以下步骤：
(1)检测以下所列4个胶质母细胞瘤组织中特异性表达基因中的一个或多个的表达水 平：CBX3、IFRD1、CTSS和GUCY1A3；
(2)根据步骤(1)的检测结果进行胶质母细胞瘤的特异性诊断，高表达CBX3、IFRD1、 CTSS、或/和低表达GUCY1A3的胶质瘤患者为胶质母细胞瘤的可能性较大。
本发明提供的对胶质瘤进行预后分型方法，包括以下步骤：
(1)检测以下所列4个胶质母细胞瘤组织中特异性表达基因中的一个或多个的表达水 平：CBX3、IFRD1、CTSS和GUCY1A3；
(2)根据步骤(a)的检测结果对胶质瘤进行预后分型：CBX3、IFRD1或/和CTSS高表达的为预后生存时间较短型；GUCY1A3高表达的为预后生存时间较长型。
本发明提供的胶质母细胞瘤生存预后的检测方法，包括以下步骤：
步骤一：检测以下所列4个胶质母细胞瘤组织中特异性表达基因中的一个或多个的表达 水平：CBX3、IFRD1、CTSS和GUCY1A3；
步骤二：根据步骤一的检测结果预测胶质母细胞瘤生存预后，高表达CBX3、IFRD1或/ 和CTSS的胶质瘤患者预后生存时间较短；高表达GUCY 1A3的胶质瘤患者预后生存时间较 长。
本发明通过对GEO数据库中胶质瘤表达数据集进行收集及筛选，系统性地分析胶质瘤不 同病理分型之间的差异表达数据，构建胶质母细胞瘤中特异性的差异表达谱，并利用TCGA 数据库进行验证，并探究其预后意义。通过文献分析，筛选出更稳定更有价值更具创新性的肿瘤标志物，为阐明胶质母细胞瘤发生、发展的分子机制提供理论基础，为胶质瘤的诊断、 预后、分型及治疗提供依据。
本发明实施提供了胶质母细胞瘤特异性分子标志物的生物信息学筛选研究资料，通过对 公共数据库中的胶质瘤基因芯片进行筛选，在分子水平对不同病理类型胶质瘤进行分析，筛 选出胶质母细胞瘤特异性基因，并分析其在胶质瘤预后中的作用。本发明找到了胶质母细胞瘤中4个创新性特异性表达基因，其中3个上调基因，1个下调基因，发现4个基因对胶质 瘤预后有意义，高表达CBX3，IFRD1，CTSS的胶质瘤患者生存时间较短，而高表达GUCY1A3 的胶质瘤患者生存时间较长，对临床治疗具有重要价值。
附图说明
图1：芯片分析流程图，图中各缩略词为：GEO，基因表达综合数据库；GBM，胶质母细胞瘤；A，星形细胞瘤；OD，少突胶质瘤；NG，非胶质瘤脑组织；TCGA，癌症基因组图 谱计划；GO：基因本体论；KEGG：京都基因与基因组百科全书。
图2：联合P值Meta分析方法选择图，对胶质母细胞瘤与非胶质瘤脑组织组中训练集 9个不同数据集的差异表达基因进行分析，选择四种不同的meta分析算法(maxP、minP、roP、AW)。Y轴代表差异表达基因的数量，X轴代表错误发现率。由图中可以看出，fisher法得到的差异基因数目最多。缩略词：AW，自适应加权统计量；FDR，错误阳性率。
图3胶质母细胞瘤和非胶质瘤脑组织组的训练集9块芯片中437个差异基因的热图，
列代表样本，行代表mRNA表达水平。标签1代表胶质母细胞瘤，标签0代表非胶质瘤脑组织。颜色刻度中蓝色代表低表达，红色代表高表达。由图中可以看出，胶质母细胞瘤与非胶质瘤脑组织样本能较好区分开。
图4胶质母细胞瘤和非胶质瘤脑组织组训练集的维恩图，对联合p值和联合效应量检测 到的差异表达基因进行维恩图分析，通过对两种方法取交集，得出了322个差异基因。
图5胶质母细胞瘤和非胶质瘤脑组织组训练集322个基因的GO和KEGG富集分析。
图6联合P值Meta分析方法选择图，对胶质母细胞瘤与非胶质瘤脑组织组中测试集7 个不同数据集的差异表达基因进行分析，选择四种不同的meta分析算法(maxP、minP、roP、 AW)。Y轴代表差异表达基因的数量，X轴代表错误发现率。由图中可以看出，fisher法得到 的差异基因数目最多。缩略词：AW，自适应加权统计量；FDR，错误阳性率。
图7胶质母细胞瘤和非胶质瘤脑组织组的测试集7块芯片中471个差异基因的热图，
列代表样本，行代表mRNA表达水平。标签1代表胶质母细胞瘤，标签0代表非胶质瘤脑组织。颜色刻度中蓝色代表低表达，红色代表高表达。由图中可以看出，胶质母细胞瘤与非胶质瘤脑组织样本能较好区分开。
图8胶质母细胞瘤和非胶质瘤脑组织组测试集的维恩图，对联合p值和联合效应量检测 到的差异表达基因进行维恩图分析，通过对两种方法取交集，得出了188个差异基因。
图9胶质母细胞瘤和非胶质瘤脑组织组中训练集和测试集的维恩图，对训练集和测试集 筛选出的差异表达基因进行维恩图分析，通过将其取交集，得出了33个共有差异基因。
图10胶质母细胞瘤与星形细胞瘤组21块芯片中920个差异基因的热图,列代表样本， 行代表mRNA表达水平。标签1代表胶质母细胞瘤，标签0代表星形细胞瘤。颜色刻度中蓝色代表低表达，红色代表高表达。由图中可以看出，胶质母细胞瘤与星形细胞瘤样本能较好区分开。
图11胶质母细胞瘤与少突胶质瘤组12块芯片中482个差异基因的热图，列代表样本， 行代表mRNA表达水平。标签1代表胶质母细胞瘤，标签0代表少突胶质瘤。颜色刻度中蓝色代表低表达，红色代表高表达。由图中可以看出，胶质母细胞瘤与少突胶质瘤样本能较好区分开。
图12胶质母细胞瘤三组meta分析差异表达基因的维恩图,通过对三组寻找出的差异基 因进行维恩图分析，共得出了8个共有差异基因。缩略词：GBM，胶质母细胞瘤；A，星形细胞瘤；OD，少突胶质瘤。
图13 8个胶质母细胞瘤特异性差异表达基因的TCGA-GBMLGG验证图，图中缩略词：GBM，胶质母细胞瘤；A，星形细胞瘤；OD，少突胶质瘤；NG，非胶质瘤脑组织。星号(*) 含义：p值<0.0001(****)；p值<0.001(***)；p值<0.01(**)；p值<0.05(*)。
图14 TCGA-GBMLGG数据库中6个高表达差异基因的ROC分析，采用接受者工作特征曲线(ROC)和曲线下面积(AUC)统计量，评估TCGA-GBMLGG数据库中的6个高表 达基因区分实验组和对照组的诊断效能。图A为胶质母细胞瘤和非胶质瘤脑组织组；图B为 胶质母细胞瘤和星形细胞瘤组；图C为胶质母细胞瘤和少突胶质瘤组。
图15 TCGA-GBMLGG数据集中8个高表达基因的生存分析曲线图，红线代表基因的相 对高表达，而蓝线表示基因的相对低表达。P值<0.05代表具有统计学意义。图中显示，高表 达CBX3、BARD1、CTSS、EGFR、IFRD1、STAT1的胶质瘤患者生存时间较短，而高表达GUCY1A3及MOBP的患者生存时间较长。
具体实施方式
实施例1：胶质母细胞瘤特异性分子标志物的生物信息学筛选
1.目的：通过对公共数据库中的胶质瘤基因芯片进行筛选，在分子水平对不同病理类型 胶质瘤进行分析，筛选出胶质母细胞瘤特异性基因，并分析其在胶质瘤预后中的作用。
2.材料与方法
2.1 GEO芯片数据检索与处理
2.1.1 GEO芯片数据检索
在GEO数据库网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中筛选关键词为“glioma”,研究 类别为“expression profiling by array”的实验研究，截止日期为2016年12月31日。芯片纳 入标准为：物种为人类；对照研究；未行放疗或化疗；可以获得原始数据或标准化后的数据； 样本必须包括胶质母细胞瘤，且另外至少含有下列中一种：非胶质瘤脑组织，星形细胞瘤，少突胶质瘤；若一个研究团队有多个数据集，选择样本最完善的数据集。根据最新的2016版 WHO指南进行病理分型，将少突星形细胞瘤剔除。星形细胞瘤限定为II-III级，IV级星形细 胞瘤统一为胶质母细胞瘤。
2.1.2数据预处理
使用R软件(R 3.3.0)中的limma包[39]对每块芯片进行单独预处理，使用RMA法对原 始数据进行背景校正、标准化及log2转换。使用aggregate函数包对重复的多个探针数据采 用取平均值方法进行合并。
2.1.3数据集分组
对所有芯片数据集进行分组，第一组为含有胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)与非胶 质瘤脑组织(non-glioma，NG)样本的数据集合(GBM vs NG)，将其分为训练集和测试集， 分别找出差异基因，再取交集；第二组为含有胶质母细胞瘤和星形细胞瘤(astrocytoma，A) 样本的数据集合(GBM vs A)；第三组为胶质母细胞瘤和少突胶质瘤(oligodendroglioma，OD) 样本的数据集合(GBM vs OD)。
2.2 GEO芯片数据分析
MetaOmics是由美国匹茨堡大学的Tseng等开发的一组基于R语言可用于基因芯片数据 进行meta分析的流程[40]。目前包括用于数据质控的metaQC、用于差异基因分析的metaDE、 以及用于功能富集分析的metaPath。在我们的研究中，主要运用了前两种分析，功能富集分 析主要使用Database for Annotation,Visualization,and IntegratedDiscovery(DAVID)数据库进行。本研究中数据集的meta分析流程如图1所示。
2.2.1数据准备
将每块芯片整理成可读入R软件的矩阵形式，第一列是基因名称(每一个基因名称都具 有唯一性)，第一行是样本编号，第二行是样本病理类别标签，其中定义0为对照组，1为实 验组，剩余的是基因表达值的矩阵。
2.2.2基因合并
由于不同的芯片数据集中的基因数目不一致，通过MetaDE.Merge函数，提取出所有数 据集中的共同基因用于后续分析。
2.2.3基因过滤
在分析过程中，有些基因在样本间平均信号强度较低或者标准差较低，这些基因在生物 学上可能是不表达或者无意义的，因此需要对其进行剔除。采用Meta.filter函数剔除平均信 号强度和标准差位于前10％的基因。
2.2.4质量控制
MetaQC程序用于芯片数据质量监控，包含有6种量化且客观的质量控制指标，IQC(内 部质量控制指标)、EQC(外部质量控制指标)、AQCg(基因差异表达质量控制指标的一致性)、 AQCp(通路差异表达质量控制指标的一致性)、CQCg(基因质量控制准确性指标)、CQCp(通 路质量控制准确性指标)，这些指标可用于确定基因芯片能否纳入整合分析。
2.2.5差异基因分析
使用联合p值和联合效应量两种方法进行差异基因的分析，并绘制热图。
联合p值法整合了来自单个实验的p值以找出在所有数据集中具有较大效应量的基因。 使用fisher,maxP,roP,and AW四种方法，对其获得的差异基因数量进行比较，由于各种方法 都有局限性，选择差异基因数量最多的方法进行后续分析。通过校正t检验和置换法(置换次数＝300)来推断P值，使用Benjamini-Hochberg校正对多重假设检验进行校正。效应量<0为上调基因，效应量>0为下调基因。
联合效应量法将每个数据集的效应量汇集成一个整合效应量，使用随机效应模型，获得 汇集效应量及其标准误。对于每个芯片集中的每个基因，计算Hedges'adjusted g效应量[41]。 计算z统计量作为每个基因的汇集效应量与其标准误的比率，并将结果与标准正态分布进行 比较以获得名义p值。使用Benjamini-Hochberg校正方法对P值进行多重假设检验校正。效 应量>0为上调基因，效应量<0为下调基因。
2.3运用DAVID软件对差异基因进行功能注释
DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov)可对基因进行批量检索，对其功能进行全面注 释[42]，其中基因本体论(Gene Ontology，GO)分析包括生物过程，细胞组成，分子功能， DAVID也可以做KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科 全书)通路分析。
2.4 TCGA-GBMLGG临床表达验证、ROC曲线分析
从Cbioportal中下载TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/)中胶质母细胞瘤数据 集及低级别胶质瘤数据集(TCGA-GBMLGG)，包含原始三级水平的RNAseq数据及完善的临床信息。
使用TCGA-GBMLGG等数据集中的基因及临床数据，对最终差异基因进行进一步验证。 同时利用TCGA-GBMLGG数据集进行各个基因在不同组别中的受试者工作特性曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)分析。绘制ROC曲线，并计算曲线下面积(Area Under Curve，AUC)作为基因诊断胶质瘤的效率指标。
2.5 TCGA-GBMLGG生存分析
使用TCGA-GBMLGG等数据集中的基因及临床资料进行Kaplan-Meier生存分析。采用 Kaplan-Meier法统计各个基因对胶质瘤患者预后的影响，采用时序检验(Log-ranktest)进行 显著性评价。
2.6统计学方法
采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 6软件进行作图及统计学分析。当多组数据满足正态分 布、方差齐时，采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验。当非正态分布或方差不齐 时，多组整体比较采用Kruskal-Wallis H检验，组内两两比较采用Mann-whitneyU。所有数据 均行正态分布和方差齐性检验。P值小于0.05被认为具有统计学意义。
3.结果
3.1 GEO芯片数据筛选结果
按照前述方法，最终纳入31块来自于GEO数据库的芯片，生成了包含1277个胶质母细胞瘤、427个星形细胞瘤、189个少突胶质瘤、150个非胶质瘤脑组织的组合数据集。芯 片信息见表1。GSE68928，GSE4271，GSE4412这三块芯片具有不同的平台，分别作为两块 芯片进行处理。
对所有芯片数据集进行分组，第一组(GBM vs NG)包括16块芯片，含有679个GBM和150个NG，再分为训练集(9块)和测试集(7块)；第二组(GBM vs A)包括21块芯片， 含有852个GBM，427个A；第三组(GBM vs OD)包括12块芯片，含有590个GBM，189 个OD(分组情况见表2)。
表1胶质瘤芯片基本信息表
 
表2胶质瘤数据集分组信息
 
缩略词：GBM，胶质母细胞瘤；A，星形细胞瘤；OD，少突胶质瘤；NG，非胶质瘤脑组织；vs，比较。
3.2胶质母细胞瘤与非胶质瘤脑组织组的差异表达谱
对GBM vs NG组进行质量检测发现16块芯片均通过质检，因此均纳入后续meta分析， 一共包括679个GBM，150个NG。采用训练集－验证集的方法进行分析，使用较大的数据集(9块芯片)作为训练集，使用较小的数据集(7块芯片)作为测试集，因此训练集中含有406个GBM，101个NG，测试集中含有273个GBM，49个NG。使用联合p值和联合效应 量两种方法来寻找训练集9块芯片中胶质母细胞瘤中的差异基因。由于所有样本及芯片集中 存在较大的异质性，我们设定了比较严格的统计学标准，只有两种分析方法同时满足错误发现率(False Discovery Rate，FDR)值<1×10-19者才认为是差异基因。我们计算fisher,maxP,roP,AW四种方法得出的差异基因(见图2)，发现fisher法得到的差异基因是最多的。通过Fisher对数法整合p值我们找到了437个差异基因，绘制分层聚类图发现GBM与NG样本能 较好区分开(见图3)。通过联合效应量找到了393个差异基因。我们使用维恩图对两种分析 方法的结果取交集，最终得出了322个差异基因(见图4)，这些基因不仅在所有芯片中具有 综合的较大的效应量，且在芯片中都有统计学意义。
为了揭示这些基因的生物学功能，我们进一步通过DAVID 6.8软件对这322个基因进行 功能注释，结果发现癌症通路、钙通路、Wnt信号通路等是最显著的富集通路。富集最明显 的GO过程包括转录、DNA模板(生物过程)，细胞质(细胞组成)，与ATP结合(分子功 能)(见图5)。
我们使用相同的方法寻找测试集7块芯片中胶质母细胞瘤的差异基因。Fisher对数法整 合p值所得到的差异基因数量仍是四种方法中最多的(见图6)。通过Fisher对数法整合p值 我们找到了471个差异基因，绘制分层聚类图发现GBM与NG样本能较好区分开(见图7)； 通过整合效应量我们找到了285个差异基因。我们仍然采用较为严格的FDR<1×10-19的统 计标准对两种方法进行评判。最终通过维恩图法进行综合分析，得到188个差异基因(见图 8)。
进一步通过维恩图对训练集与测试集差异基因结果取交集，我们最终得出33个在胶质母 细胞瘤中持续差异表达的基因(见图9)，包括28个上调基因及5个下调基因(见表3)。
表3胶质母细胞瘤和非胶质瘤脑组织组差异基因
缩略词：FDR，错误发现率。
然而，由于上述分析中只包含了胶质母细胞瘤及非胶质瘤脑组织的样本，有可能这33个 差异基因在其他病理类型胶质瘤中也存在异常表达。因此，我们接下来探究这33个基因是否 是胶质母细胞瘤特异性异常表达的基因，其在其他类型胶质瘤中是否也是异常表达。
3.3胶质母细胞瘤与星形细胞瘤组的差异表达谱
我们分析另外21块包含有852个胶质母细胞瘤及427个星形细胞瘤样本的芯片，研究发 现共有920个基因在Fisher对数法整合p值后差异表达(FDR<0.05)，绘制分层聚类图发现 胶质母细胞瘤与星形细胞瘤样本能较好区分开(见图10)。
3.4胶质母细胞瘤与少突胶质瘤组的差异表达谱
进一步在12块包含有590个胶质母细胞瘤及189个少突胶质瘤的芯片中进行分析，结果 显示，Fisher对数法整合p值后有482个差异基因(FDR<0.05)，绘制分层聚类图发现胶质母 细胞瘤与少突胶质瘤样本能较好区分开(见图11)。
3.5胶质母细胞瘤中特异性差异基因表达谱
使用维恩图法对三次meta分析的结果进行整合分析(见图12)，找到了8个差异基因(见 表4、表5)，它们在胶质母细胞瘤中持续性且特异性差异表达，其中上调基因有6个(BARD1、 CBX3、CTSS、EGFR、IFRD1、STAT1)，下调基因有2个(MOBP、GUCY1A3)。这些基因 可以将胶质母细胞瘤从非胶质瘤脑组织及其他类型胶质瘤中鉴别出来，因此，有望成为胶质 母细胞瘤特异性诊断及治疗的靶点。
表4胶质母细胞瘤中特异性差异表达基因
3.6 TCGA-GBMLGG验证结果
TCGA-GBMLGG数据中包括158个胶质母细胞瘤，193个星形细胞瘤，188个少突胶质瘤，130个少突星形细胞瘤，及5个非胶质瘤脑组织，总共674例。
将8个基因(BARD1、CBX3、CTSS、EGFR、IFRD1、MOBP、STAT1、GUCY1A3)在 TCGA-GBMLGG数据中进一步验证。结果显示，8个基因(6个上调，2个下调)的表达量 在GBM vs NG、GBM vs A、GBM vs OD三个组中均存在统计学学意义，验证了我们先前的结果(见图13)。
通过ROC曲线分析6个上调基因(BARD1、CBX3、CTSS、EGFR、IFRD1、STAT1) 在GBM vsNG、GBM vs A、GBM vs OD三个组别中的敏感性和特异性,使用AUC评估6个 基因的诊断效果(见图14，表6)。
在GBM vs NG组中，6个基因的AUC均大于0.85，说明这6个基因对于胶质母细胞瘤与非胶质瘤脑组织有很好的鉴别诊断效能，其中CBX3的诊断效能最高，AUC＝1。在GBM vs A组中，CBX3、CTSS、IFRD1、STAT1的AUC均大于0.7，对于胶质母细胞瘤和星形细 胞瘤的鉴别诊断具有一定的预测效能，而EGFR预测效能较低，AUC＝0.584。
在GBM vs OD组中，除EGFR(AUC＝0.593)外，其他5个基因的AUC均大于0.8， 对于胶质母细胞瘤和少突胶质瘤的鉴别诊断具有较好的预测效能。
表6 TCGA-GBMLGG数据库中6个上调基因ROC分析结果
3.6 TCGA-GBMLGG生存分析结果
为了探究这8个基因在胶质瘤患者生存中是否具有预后意义，采用Kaplan-Meier生存曲 线进行分析。结果显示，在TCGA-GBMLGG数据库中，高表达CBX3、BARD1、CTSS、EGFR、IFRD1、STAT1的胶质瘤患者生存时间较短，而高表达GUCY1A3及MOBP的患者生存时间 较长(见图15)。
本研究通过对胶质瘤的芯片数据进行meta分析，尝试找到在胶质母细胞瘤中特异性表 达的基因。通过对16块基因芯片进行meta分析，找到了33个差异基因在胶质母细胞瘤中 相对非胶质瘤脑组织持续异常表达，为了排除在星形细胞瘤和少突胶质瘤也异常表达的差异 基因，我们进一步在21块和12块基因芯片中找出在胶质母细胞瘤中特异性表达的基因，共 8个，其中高表达者6个，低表达者2个。通过阅读文献，发现4个基因为胶质瘤创新性基 因，目前文献报道甚少，其中上调基因有3个(CBX3、CTSS、IFRD1)，下调基因有1个(GUCY1A3)。组织蛋白酶S(cathepsin S，CTSS)与多种肿瘤过程相关，如肿瘤细胞转 移、血管生成、介导细胞外基质降解等，本发明证实胶质瘤中CTSS表达增高提示了较差的 预后；鸟苷酸环化酶1可溶性亚基α3(guanylate cyclase 1soluble subunit alpha 3，GUCY1A3)是VEGF的上游调控基因，本发明发现胶质瘤中高表达GUCY1A3的患者生存 时间较长；干扰素相关发育调节因子1(interferon-related developmental regulator 1，IFRD1)在多种细胞中表达，然而其在胶质瘤中的研究未见报道，在我们的研究中，IFRD1是胶质母细胞瘤中特异性高表达，且与胶质瘤较差预后有关；Chromobox protein homolog 3(CBX3)是异染色质蛋白家族的成员，本发明研究发现胶质瘤中高表达CBX3提示预后较 差。
我们通过使用meta分析的方式将公共数据进行二次挖掘并反复验证，这种方法不仅能克 服以往研究样本量偏小、不同研究异质性大的缺点，还能有效利用科研资源，为肿瘤新型分 子标志物研究提供了新途径。
5.结论：通过对公共数据库中的芯片数据进行检索及二次数据挖掘，我们综合分析了31块 芯片和TCGA-GBMLGG，共2587个病例，得出以下结论：(1)本发明找到了胶质母细胞瘤 中4个创新性特异性表达基因，其中3个上调基因，1个下调基因，为胶质母细胞瘤分子标 志物的研究建立了丰富的理论基础。(2)发现4个基因对胶质瘤预后有意义，高表达CBX3， IFRD1，CTSS的胶质瘤患者生存时间较短，而高表达GUCY1A3生存时间较长，对临床治疗 具有重要参考价值。
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本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范 围之内。

Claims (2)

1.一种制备胶质瘤预后分型模型的方法，包括以下步骤：
(a)检测以下所列4个胶质母细胞瘤组织中特异性表达基因中的一个或多个的表达水平：CBX3、IFRD1、CTSS和GUCY1A3；
(b)根据步骤(a)的检测结果对胶质瘤进行预后分型：CBX3、IFRD1或/和CTSS高表达的为预后生存时间较短型；GUCY1A3高表达的为预后生存时间较长型。
2.一种制备胶质母细胞瘤生存预后模型的方法，包括以下步骤：
步骤一：检测以下所列4个胶质母细胞瘤组织中特异性表达基因中的一个或多个的表达水平：CBX3、IFRD1、CTSS和GUCY1A3；
步骤二：根据步骤一的检测结果预测胶质母细胞瘤生存预后，高表达CBX3、IFRD1或/和CTSS的胶质瘤患者预后生存时间较短；高表达GUCY 1A3的胶质瘤患者预后生存时间较长。
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