CN113421613A - 一种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性的系统及分析方法 - Google Patents

Abstract

一种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性的系统及分析方法，属于免疫治疗反应性分析技术领域。这种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性的系统包括输入模块、分析模块和输出模块。通过总结来自四个独立数据库的1,750名胶质瘤患者的数据建立了这种基于铁死亡水平评价胶质瘤患者免疫治疗反应性的系统，该系统通过计算和比较铁死亡水平，能够预测胶质瘤恶性进展、预后生存期长短、抗肿瘤免疫力的高低以及免疫治疗的反应性。同时，该系统还能够预测通过抑制铁死亡水平是否可改善免疫治疗的功效，能够辅助性的为临床分析及应用作出指导。

Description

一种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性 的系统及分析方法

技术领域

本发明涉及一种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性的系统及分析方法，其属于免疫治疗反应性分析技术领域。

背景技术

使用免疫检查点阻断(ICB、PD-1/L1和CTLA-4)的新兴免疫疗法已被批准用于治疗多种实体癌症，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌和膀胱癌。然而，目前的临床试验表明，只有8%的胶质瘤患者从ICB治疗中受益。因此，迫切需要阐明免疫耐药的机制，从而为克服脑胶质瘤ICB治疗的临床困境提供合理的途径。恶性胶质瘤具有微环境成分复杂的特点，肿瘤细胞在胶质瘤组织中所占比例中位数仅为74%。在胶质瘤进展过程中，胶质瘤细胞选择性地富集免疫调节细胞，如肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、调节性T细胞和髓系抑制细胞，以创造免疫抑制微环境，这已被认为是ICB治疗失败的主要原因。肿瘤不仅通过分泌行为，在程序性细胞死亡(PCD)过程中也能释放丰富的炎性介质、趋化因子和细胞内成分，改变邻近的免疫微环境，从而影响免疫治疗反应性。

铁死亡是一个新发现的PCD过程。它是一种氧化性的，铁依赖性的细胞死亡形式，其特征在于细胞内活性氧（ROS）及脂质过氧化产物增加到致命水平从而导致细胞死亡。大量研究证实了铁死亡在多种癌症发生中的关键作用，例如肝癌、卵巢癌及胶质瘤。但是，现在关于铁死亡的研究主要聚焦在肿瘤细胞上，而忽略了其在肿瘤免疫微环境中的作用。因此，探索铁死亡对胶质瘤免疫微环境的影响将为我们提供关于胶质瘤进展的新见解，甚至可以提高免疫疗法对胶质瘤患者的疗效。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性的系统及分析方法。

为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：一种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性的系统，它包括输入模块、分析模块和输出模块，所述输入模块用于输入待测样本的转录组测序数据。

所述分析模块以待测样本的铁死亡特征性基因集的基因表达数据为输入，采用ssGSEA算法计算待测样本的铁死亡评分，并将待测样本的铁死亡评分与对照值进行比较，以大于或小于对照值确定待测样本的免疫治疗反应性和是否具有免疫抑制性微环境。

所述输出模块用于输出待测样本的免疫治疗反应性和是否具有免疫抑制性微环境的结果。

所述铁死亡特征性基因集包含ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5、ACSL6、ALOX15、ATG5、ATG7、CP、CYBB、FTH1、FTL、FTMT、GCLC、GCLM、GPX4、GSS、HMOX1、LPCAT3、MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3C、NCOA4、PCBP1、PCBP2、PRNP、SAT1、SAT2、SLC11A2、SLC39A14、SLC39A8、SLC3A2、SLC40A1、SLC7A11、STEAP3、TF、TFRC、TP53、VDAC2和VDAC3。

一种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性的分析方法，包含以下步骤：

e）收集胶质母细胞瘤患者的组织样本，对组织块进行转录组测序.

f）输入转录组测序数据，通过ssGSEA算法基于铁死亡特征性基因集计算胶质母细胞瘤患者的铁死亡评分。

g）将步骤f得到的胶质母细胞瘤患者的铁死亡评分与对照值进行比较，如果高于对照值，确定该胶质母细胞瘤患者具有免疫抑制性微环境，对免疫调控点靶向治疗反应性差，如果低于对照值，确定该胶质母细胞瘤患者的免疫微环境为激活状态，对免疫调控点靶向治疗敏感。

所述铁死亡特征性基因集包含ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5、ACSL6、ALOX15、ATG5、ATG7、CP、CYBB、FTH1、FTL、FTMT、GCLC、GCLM、GPX4、GSS、HMOX1、LPCAT3、MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3C、NCOA4、PCBP1、PCBP2、PRNP、SAT1、SAT2、SLC11A2、SLC39A14、SLC39A8、SLC3A2、SLC40A1、SLC7A11、STEAP3、TF、TFRC、TP53、VDAC2和VDAC3。

所述对照值采用以下步骤确定：

a）获取样本数据集，以CGGA、TCGA、GSE6011和Rembrandt四个胶质瘤数据库的1750例数据作为样本数据集，所述1750例数据包含每例样本的基因表达数据。

b）计算铁死亡评分，以样本数据集的铁死亡特征性基因集的基因表达数据为输入，用ssGSEA算法计算步骤a中每例样本的铁死亡评分；

c）确定对照值，计算步骤b中所有胶质母细胞瘤患者铁死亡评分的中位值作为对照值。

本发明的有益效果是：一种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性的系统包括输入模块、分析模块和输出模块。通过总结来自四个独立数据库的1,750名胶质瘤患者的数据建立了这种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性的系统，该系统通过计算和比较铁死亡水平，能够预测胶质瘤恶性进展、预后生存期长短、抗肿瘤免疫力的高低以及免疫治疗的反应性。同时，该系统还能够预测通过抑制铁死亡水平是否可改善免疫调控点靶向治疗的功效，能够辅助性的为临床分析及应用作出指导。

附图说明

图1是铁死亡评分与胶质瘤不良预后的分析曲线图。图中，（A）是CGGA数据库铁死亡评分对胶质瘤生存期影响的曲线图，（B）是CGGA数据库铁死亡评分对胶质母细胞瘤生存期影响的曲线图，（C）是TCGA数据库铁死亡评分对胶质瘤和胶质母细胞瘤生存期影响的曲线图，（D）是GSE16011数据库铁死亡评分对胶质瘤和胶质母细胞瘤生存期影响的曲线图。

图2是铁死亡评分与胶质母细胞瘤免疫反应的关系图。图中，（A）是与铁死亡评分密切相关的基因集的功能富集分析图，（B）是不同铁死亡评分的胶质母细胞瘤在多种免疫相关通路中的富集状态图。

图3是铁死亡对胶质母细胞瘤中的免疫抑制影响图。（A）是不同铁死亡评分的胶质母细胞瘤中的多种免疫反应步骤的活性图，（B）是不同铁死亡评分的胶质母细胞瘤在多种免疫抑制通路的富集状态图，（C）是免疫调控点在不同铁死亡评分的胶质母细胞瘤中的表达差异图。

图4是铁死亡与几种免疫抑制细胞富集的关系图。

图5是不同铁死亡水平的胶质母细胞瘤的免疫微环境的状态图。（A）是TCGA数据库胶质母细胞瘤中铁死亡水平与多种免疫抑制细胞富集的关系图，（B）是GSE16011数据库胶质母细胞瘤中铁死亡水平与多种免疫抑制细胞的富集关系图，（C）是Rembrandt数据库胶质母细胞瘤中铁死亡水平与多种免疫抑制细胞的富集关系图。

图6是抑制铁死亡水平对免疫调控点靶向治疗的反应性及疗效的影响图。（A）是联合使用免疫调控点靶向治疗（抗PD-L1治疗）和铁死亡抑制剂对荷瘤鼠生存影响的效果图，（B）是不同组别中荷瘤鼠肿瘤内CD3及CD8 T细胞含量图，（C）是不同组别中荷瘤鼠体内T细胞杀伤功能的统计图。

图7是采用免疫治疗临床数据分析铁死亡水平和免疫治疗反应性的关系图。

具体实施方式

为使本发明的技术方案更加清楚，下面将结合本发明的实施例， 对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

一种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性的系统包括输入模块、分析模块和输出模块，输入模块用于输入待评价的胶质母细胞瘤患者的转录组测序数据。分析模块以待测样本的铁死亡特征性基因集的基因表达数据为输入，采用ssGSEA算法计算待测样本的铁死亡评分，并将待测样本的铁死亡评分与对照参考值进行比较，以大于或小于对照参考值确定待测样本的免疫治疗反应性和是否具有免疫抑制性微环境。输出模块用于输出待测样本的免疫治疗反应性和是否具有免疫抑制性微环境的结果。

一种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性的分析方法，包含以下步骤：

e）收集胶质母细胞瘤患者的组织样本，对组织块进行转录组测序；

f）输入转录组测序数据，通过ssGSEA算法基于铁死亡特征性基因集计算胶质母细胞瘤患者的铁死亡评分；

g）将步骤f得到的胶质母细胞瘤患者的铁死亡评分与对照值进行比较，如果高于对照值，确定该胶质母细胞瘤患者具有免疫抑制性微环境，对免疫调控点靶向治疗反应性差，如果低于对照值，确定该胶质母细胞瘤患者的免疫微环境为激活状态，对免疫调控点靶向治疗治疗敏感。

对照参考值采用以下步骤确定：

a）获取样本数据集，以CGGA、TCGA、GSE6011和Rembrandt四个胶质瘤数据库的1750例数据作为样本数据集，所述1750例数据包含每例样本的基因表达数据；

b）计算铁死亡评分，以样本数据集的铁死亡特征性基因集的基因表达数据为输入，用ssGSEA算法计算步骤a中每例样本的铁死亡评分；

c）确定对照值，计算步骤b中所有胶质母细胞瘤患者铁死亡评分的中位值作为对照值。

分析模块分别和输入模块、输出模块采用数据通信连接，分析模块分别和输入模块、输出模块采用现有的能够实现上述功能的用于分析存储、输入和输出的芯片或装置。

铁死亡特征基因集的获取过程：在KEGG公共数据库中搜索“ferroptosis”找到铁死亡特征基因集，其中包括：ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5、ACSL6、ALOX15、ATG5、ATG7、CP、CYBB、FTH1、FTL、FTMT、GCLC、GCLM、GPX4、GSS、HMOX1、LPCAT3、MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3C、NCOA4、PCBP1、PCBP2、PRNP、SAT1、SAT2、SLC11A2、SLC39A14、SLC39A8、SLC3A2、SLC40A1、SLC7A11、STEAP3、TF、TFRC、TP53、VDAC2和VDAC3。

分析模块利用GSVA程序包中的ssGSEA算法计算铁死亡评分的过程：载入提前安装的GSVA包，读取患者表达谱，读取铁死亡基因集，导出计算好的评分文件，GSVA程序包作为成熟的软件包可于开放的生信分析软件资源网站Bioconductor上下载。

实施例1

研究铁死亡评分与临床指标的关系。我们研究了CGGA数据库中铁死亡评分在胶质瘤进展中的作用，使用Kaplan-Meier曲线和log-rank分析了铁死亡评分与预后之间的关系。生存曲线表明，与低铁死亡评分相比，高铁死亡评分患者具有较低的总生存期（如图1中A所示）。按级别分类后，在恶性程度最高的胶质母细胞瘤中较高的铁死亡评分依旧预示着较差的总生存期（如图1中B所示）。我们又在TCGA（如图1中C所示）和GSE16011（如图1中D所示）数据库中进行了相同的分析，得出了相同的结论。总体而言，高铁死亡水平的胶质母细胞瘤具有较低的总生存期。

实施例2

研究铁死亡评分与免疫浸润的关系。我们选取了在胶质母细胞瘤中与铁死亡评分高度相关的基因（Pearson相关性 | r |≥0.6）进行基因本体论（GO）分析。除与细胞死亡相关的信号通路外，铁死亡评分还与多种免疫系统过程相关（如图2中A所示）。高铁死亡评分的胶质母细胞瘤患者还在多种免疫相关途径显示富集状态（如图2中B所示），这进一步说明铁死亡在调节肿瘤免疫过程中起重要作用。为了进一步探讨铁死亡与肿瘤免疫之间的关系，我们进行了TIP分析（http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/index.jsp）。以CGGA数据库中样本的全部表达数据为输入，系统地集成了两种现有算法（ssGSEA和CIBERSORT），通过对肿瘤细胞抗原释放基因集、肿瘤抗原呈递基因集、免疫启动和激活基因集、免疫细胞向肿瘤细胞转运基因集、免疫细胞向肿瘤细胞内浸润基因集、T细胞识别肿瘤细胞基因集和杀伤肿瘤细胞基因集几个特定的基因集（几个基因集的组成如表1所示）进行计算，可对机体抗癌免疫状态以及七个肿瘤浸润免疫细胞的比例进行跟踪，分析和展现。通过分析发现，铁死亡评分较高的胶质母细胞瘤患者在抗原释放和呈递（步骤1和2）以及免疫细胞向肿瘤的运输和浸润（步骤4和5）中显示出更高的活性。但是，在铁死亡较高的组中，免疫效应过程（第6步和第7步）受到了抑制（如图3中A所示）。该结果表明，尽管铁死亡有助于免疫应答的起始和加工阶段，但有效的抗肿瘤免疫力仍然受到抑制。GSEA还证明了铁死亡会削弱胶质母细胞瘤中的抗肿瘤免疫作用（如图3中B所示）。此外我们发现，高铁死亡评分的胶质母细胞瘤患者比低评分的胶质母细胞瘤患者表达更多的免疫检查点分子（如图3中C所示），这与“免疫潮汐模型理论”一致，即同时高表达共刺激和共抑制性免疫检查点会导致肿瘤中的免疫抑制表型。从铁死亡对免疫细胞向肿瘤的运输和浸润的积极影响看，铁死亡可导致免疫抑制性微环境。通过Xcell算法（https://xcell.ucsf.edu/）根据64种免疫和基质细胞类型的特定基因表达数据对CGGA数据库中的样本进行细胞类型富集分析。通过分析发现，高铁死亡评分与调节型T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和M2极化巨噬细胞的浸润有关（如图4所示）。在TCGA（如图5中A所示）、GSE16011（如图5中B所示）和Rembrandt（如图5中C所示）数据库中进行了相同分析，得出了相似的结论。这些结果表明，尽管在铁死亡评分高的胶质母细胞瘤患者中免疫细胞更加丰富，但其中大多数导致胶质母细胞瘤免疫抑制微环境的免疫抑制细胞。

表1 特定基因集的组成

实施例3

研究铁死亡与免疫治疗敏感性的关系。为了检测抑制铁死亡是否可以使胶质母细胞瘤对免疫调控点靶向治疗（抗PD-L1治疗）敏感，我们在小鼠原位成瘤模型中，单独使用抗PD-L1抗体，单独使用铁死亡抑制剂ferrostatin-1和联合使用抗PD-L1抗体和铁死亡抑制剂ferrostatin-1治疗小鼠。用Ferrostatin-1和抗PD-L1抗体联合治疗的小鼠具有最长的生存时间和最小的肿瘤大小。抗PD-L1单一疗法可以稍微延长小鼠的生存时间并减小肿瘤的大小（如图6中A所示）。IHC染色显示，联合治疗可显着增加CD3 +和CD8 + T细胞（如图6中B所示）。接下来，我们进行流式细胞术评估CD8 + T细胞的杀伤肿瘤能力。与对照组相比，接受联合治疗显著增加了CD8+IFNγ+ T细胞以及CD8+TNFα+T细胞的浸润（如图6中C所示）。这些发现表明抑制铁死亡显着改善了GBM中的T细胞抗肿瘤免疫力和ICB的治疗功效。以上实验结果说明抑制小鼠体内铁死亡水平增强了其对ICB治疗（抗PD-L1治疗）的反应性及疗效，并将小鼠肿瘤微环境改善成为激活状态，从而使ICB治疗处于有效。

实施例4

为了进一步证实铁死亡水平与ICB治疗的临床治疗反应性之间的关系，我们使用IMvigor210CoreBiologies临床免疫治疗队列进行了进一步的分析。使用相同算法即ssGSEA评分对该队列患者进行铁死亡评分计算，并比较不同铁死亡评分的患者对免疫治疗的反应性是否不同。与铁死亡评分最高的患者相比，铁死亡评分低的患者在抗PD-L1免疫治疗方面有更好的治疗获能和临床反应。此外，无反应性患者的铁死亡评分高于免疫治疗受益者（如图7所示）。这些发现表明，较高的铁死亡水平可导致免疫治疗抵抗。

Claims (3)

1.一种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性的系统，它包括输入模块、分析模块和输出模块，其特征在于，

所述输入模块用于输入待测样本的转录组测序数据；

所述分析模块以待测样本的铁死亡特征性基因集的基因表达数据为输入，采用ssGSEA算法计算待测样本的铁死亡评分，并将待测样本的铁死亡评分与对照值进行比较，以大于或小于对照值确定待测样本的免疫治疗反应性和是否具有免疫抑制性微环境；

所述输出模块用于输出待测样本的免疫治疗反应性和是否具有免疫抑制性微环境的结果；

所述铁死亡特征性基因集包含ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5、ACSL6、ALOX15、ATG5、ATG7、CP、CYBB、FTH1、FTL、FTMT、GCLC、GCLM、GPX4、GSS、HMOX1、LPCAT3、MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3C、NCOA4、PCBP1、PCBP2、PRNP、SAT1、SAT2、SLC11A2、SLC39A14、SLC39A8、SLC3A2、SLC40A1、SLC7A11、STEAP3、TF、TFRC、TP53、VDAC2和VDAC3。

2.一种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性的分析方法，其特征在于，包含以下步骤：

e）收集胶质母细胞瘤患者的组织样本，对组织块进行转录组测序；

f）输入转录组测序数据，通过ssGSEA算法基于铁死亡特征性基因集计算胶质母细胞瘤患者的铁死亡评分；

g）将步骤f得到的胶质母细胞瘤患者的铁死亡评分与对照值进行比较，如果高于对照值，确定该胶质母细胞瘤患者具有免疫抑制性微环境，对免疫调控点靶向治疗反应性差，如果低于对照值，确定该胶质母细胞瘤患者的免疫微环境为激活状态，对免疫调控点靶向治疗敏感；

所述铁死亡特征性基因集包含ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5、ACSL6、ALOX15、ATG5、ATG7、CP、CYBB、FTH1、FTL、FTMT、GCLC、GCLM、GPX4、GSS、HMOX1、LPCAT3、MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3C、NCOA4、PCBP1、PCBP2、PRNP、SAT1、SAT2、SLC11A2、SLC39A14、SLC39A8、SLC3A2、SLC40A1、SLC7A11、STEAP3、TF、TFRC、TP53、VDAC2和VDAC3。

3.根据权利要求1所述的一种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性的系统或根据要求2所述的一种基于铁死亡水平评价胶质母细胞瘤患者免疫治疗反应性的分析方法，其特征在于，所述对照值采用以下步骤确定：

a）获取样本数据集，以CGGA、TCGA、GSE6011和Rembrandt四个胶质瘤数据库的1750例数据作为样本数据集，所述1750例数据包含每例样本的基因表达数据；

b）计算铁死亡评分，以样本数据集的铁死亡特征性基因集的基因表达数据为输入，用ssGSEA算法计算步骤a中每例样本的铁死亡评分；

c）确定对照值，计算步骤b中所有胶质母细胞瘤患者铁死亡评分的中位值作为对照值。

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