CN104619353A - 与miR-21和miR-29a相关的方法和组合物、外切体抑制和癌症转移 - Google Patents

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Abstract

本发明提供材料和方法与如下发现相关：肿瘤分泌型.miR-21和miR-29a可以通过以下方式发挥作用：作为配体与免疫细胞中的Toll样受体家族受体-鼠TLR7和人TLR8结合，触发导致肿瘤生长和转移的TLR介导转移前炎症反应。因此，通过作为TLR的旁分泌激动剂发挥起作用，分泌型miRNA是肿瘤微环境的关键调节物。miRNA的这种作用机制是在中肿瘤-免疫系统通讯，在肿瘤生长和扩散中和在癌症治疗中重要的。

Description

与miR-21和miR-29a相关的方法和组合物、外切体抑制和癌症转移
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年5月9日提交的美国临时申请号61/644,980和2011年12月13日提交的美国临时申请号61/569,862的权益，所述文献的公开内容出于全部目的通过引用方式并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明借助在R01CA135030和R01CA124541下的美国政府财政支持作出，得益于美国国家健康研究所。美国政府在本发明中享有某些权利。
序列表的引用
本申请通过USPTO EFS-WEB服务器以电子方式提交，如MPEP§1730II.B.2(a)(A)中授权并阐述，并且这份电子提交包括以电子方式提交的序列表(SEQ ID)。将这个序列表的完整内容出于全部目的通过引用方式并入本文。序列表在电子方式提交的txt文件上标示如下：604_53483_SEQ_LIST_2012-066.txt，创建于2012年12月11日，并且大小3,171字节。
背景技术
微RNA是调节基因表达的19-24个核苷酸长度的非编码性小RNA(ncRNA)，并且在大部分类型的癌症中异常表达。MiRNA也已经在癌症患者的血液中检测到，并且可以充当循环性生物标记。外切体(exosome)内部的分泌型miRNA可以从细胞转移至细胞，并且可以通过与其靶信使RNA的规范结合调节接收细胞中的基因表达。
微RNA(miRNA)调节基因表达并与蛋白质直接相互作用。Toll样受体家族成员(即，鼠TLR7和人TLR8)可以识别并结合树突细胞和B-淋巴细胞上的病毒单链RNA(ssRNA)序列，导致细胞活化和细胞因子产生。TLR是哺乳动物天然免疫系统借以识别存在正在入侵的病原体的受体家族。鼠TLR7和人TLR8均与位于胞内内体中的20个核苷酸(nt)长度的单链RNA(ssRNA)结合并由其激活，所述单链RNA代表这两种受体的生理配体。
已知各种类型的细胞产生外切体(也称作微泡、微粒子、核外粒体(ectosome)或argosome)并排放至它们的周围环境中。将外切体在组织学上视为无明显功能的细胞残片。然而，日益增长的大量实验数据已经提出外切体具有众多生物学活性。例如，显示血小板衍生的微泡通过膜表面蛋白质刺激选择的细胞(例如，Thromb.Haemost.(1999),82:794，或J.Biol.Chem.(1999),274:7545)。在其他例子中，报道了血小板微泡中生物活性脂质对某些靶细胞的特定影响(例如，J.Biol.Chem.(2001),276:19672；或Cardiovasc.Res.(2001),49(5):88)。在另外的其他例子中，血小板微泡通过转移某些表面组分至动员的细胞增加动员的CD34+内皮细胞的黏附作用(例如，Blood(2001),89:3143)。最近，还已经显示微泡包含RNA，所述RNA至少部分地反映外切体从中起源的细胞的RNA含量。
不承认这个章节中公开的背景技术在法律上构成现有技术。
发明领域
本发明涉及生物技术和药物，包括miRNA和癌症。
发明简述
在第一广泛方面，miRNA由周围肿瘤微环境中的癌细胞分泌于外切体(也称作微泡)内部。外切体含有的miRNA，即，miR-21和miR-29a，可以被包围癌细胞的免疫细胞吞噬并且随后与免疫细胞中存在的Toll样受体8(TLR8)结合。作为结果，TLR8激活并且免疫细胞释放白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)，它们增加肿瘤生长和转移潜能。肿瘤分泌型miR-21和miR-29a可以通过作为配体与免疫细胞中TLR的受体结合、触发导致肿瘤生长和转移的TLR介导转移前炎症反应来发挥作用。因此，通过作为TLR的旁分泌激动剂发挥起作用，分泌型miRNA是肿瘤微环境的关键调节物。miRNA的这种作用机制参与肿瘤-免疫系统通讯并且在肿瘤生长和扩散中是重要的，并且因此在癌症治疗中重要。
本发明的实施方案提供一种抑制至少一种癌细胞转移的方法，所述方法包括减少至少一种癌细胞中miR-21和/或miR-29a的水平并抑制转移。
还提供此类方法，其中通过选自基因治疗、小分子或生物制品的手段减少miR-21和/或miR-29a。
还提供此类方法，其中通过施用至少一种外切体抑制剂减少miR-21和/或miR29a。
还提供此类方法，其中通过施用反义miR-21和/或反义miR-29a减少miR-21和/或miR-29a。
还提供此类方法，其中通过施用锁核酸抗miR-21抑制剂和/或锁核酸抗miR-29a抑制剂减少miR-21和/或miR-29a。
本发明的实施方案提供了抑制至少一种癌细胞的TLR介导转移前反应的方法，所述方法包括减少至少一种表达TLR的癌细胞中miR-21和/或miR-29a的水平并抑制TLR介导的转移前反应。
还提供此类方法，其中表达的TLR是TLR7或TLR8。
本发明的实施方案提供了抑制至少一种癌细胞的肿瘤生长的方法，所述方法包括减少至少一种癌细胞中miR-21和/或miR-29a的水平并抑制肿瘤生长。
本发明的实施方案提供了抑制至少一种表达miR-21和miR-29a的癌细胞中toll样受体的miR-21和miR-29a激动作用的方法，所述方法包括减少至少一种表达miR-21和miR-29a的癌细胞中miR-21和/或miR-29a的水平并抑制toll样受体的miR-21和miR-29a激动作用。
本发明的实施方案提供了抑制至少一种癌细胞转移的方法，所述方法包括减少靠近至少一种癌细胞的至少一种非癌细胞中miR-21和/或miR-29a的水平。
本发明的实施方案提供了组合物，所述组合物包含在至少一种可药用载体或赋形剂中的至少一种锁核酸抗-21抑制剂和至少一种锁核酸抗-29a抑制剂。
还提供这类组合物，所述组合物还包含其它化疗化合物。
还提供了缓解癌症受试者中癌症转移的方法，所述方法包括施用本文中的组合物至癌症受试者。
本发明的实施方案提供了增加癌症受试者中总体生存的方法，所述方法包括施用本文中的组合物至癌症受试者。
还提供了减少癌症受试者中肿瘤发病数(multiplicities)的方法，所述方法包括施用本文中的组合物至癌症受试者。
本发明的实施方案提供了诊断受试者中癌症转移风险的方法，所述方法包括：a.)鉴定与对照相比相对的miR-21和miR-29a表达，并且b.)如果与对照相比，受试者具有增加的miR-21和miR-29a表达，则在该受试者中诊断增加的癌转移风险，或c.)如果与对照相比，受试者不具有增加的miR-21和miR-29a表达，则在该受试者中诊断没有增加的癌转移风险。
还提供这类方法，所述方法还包括基于诊断设计治疗计划。
还提供这类方法，所述方法还包括基于诊断实施治疗。
还提供这类方法，所述方法还包括施用至少一种外切体抑制剂。
还提供这类方法，所述方法还包括当诊断癌转移时施用至少一种反义miR-21和/或反义miR-29a。
还提供这类方法，所述方法还包括基于诊断确定预后。
还提供这类方法，所述方法包含：a.)从测试样品逆转录miR-21RNA和miR-29a RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，所述测试样品从受试者获得；b.)将靶寡脱氧核苷酸与包含miR-21特异性和miR-29a特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交谱；和c.)将步骤(b)的图谱与对照比较。
还提供此类方法，其中步骤c.)包括将测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱比较。
还提供此类方法，其中步骤c.)包括将测试样品杂交谱与样品相关的miR水平数据库、统计结果或表格比较。
还提供此类方法，其中微阵列中包含至少一种其它miR。
本发明的实施方案提供了诊断受试者中转移前炎症反应风险的方法，所述方法包括：a.)鉴定与对照相比相对的miR-21和miR-29a表达，并且b.)如果与对照相比，受试者具有增加的miR-21和miR-29a表达，则在该受试者中诊断增加的转移前炎症反应风险，或c.)如果与对照相比，受试者不具有增加的miR-21和miR-29a表达，则在该受试者中诊断没有增加的转移前炎症反应风险。
还提供这类方法，所述方法还包括当诊断癌转移时施用至少一种反义miR-21和/或反义miR-29a。
还提供此类方法，其中癌症是选自以下的肺癌：Lewis肺癌；鳞状细胞癌；非小细胞肺癌；小细胞肺癌。
还提供此类方法，其中癌症是选自以下的腺癌：肺泡基底上皮腺癌；肺腺癌；结肠腺癌；子宫颈腺癌、前列腺腺癌；乳腺腺癌；食道腺、胰腺癌；和胃腺癌。
根据附图阅读时，本领域技术人员将从以下详细描述明了本发明实施方案的各种目的和优点。
附图简述
本专利或申请文件可以含有一张或多张以彩色完成的图和/或一张或多张照片。带有彩图和/或照片的本专利或专利申请公开文件的副本将在要求和支付必要费用时由美国专利商标局提供。
图1源自肺癌细胞系和HEK-293细胞的外切体中miRNA的水平。(图1A)代表从A-549纯化的外切体获得的NanoString miRNA谱的散射图。红线表示50次代码计数的阈值。(图1B)与HEK-293纯化的小泡相比，通过定量实时PCR验证A-549和SK-MES纯化的外切体中的NanoString结果。该实验一式六份实施；结果表示为均值±SD。**P<0.0001。
图2.miR-21和miR-29a在内体中与鼠TLR7和人TLR8相互作用。(图2A)用细胞示踪剂(蓝色)染色并用Lyso示踪剂内体标志物(红色)染色以及与HEK-293分泌的CD9-GFP外切体(绿色)共培养的RAW264.7细胞的共聚焦图像。共定位以黄色指示(复合图像)。(图2B)用内体Lyso示踪剂(蓝色)、加GFP标签的TLR8(TLR8-GFP)(绿色)和Cy5缀合的成熟miRNA(miRNA-Cy5)(红色)共转染的HEK-293细胞的共聚焦图像。共定位以黄色指示(复合图像)。(图2C)通过定量实时PCR检测到的TLR8-HEK-293细胞中针对TLR8的免疫共沉淀物(分别是IPTLR8/miR-16、IPTLR8/miR-21和IPTLR8/miR-29a)内的miR-16、miR-21和miR-29a水平。将结果显示为均值±SD。**P<0.001。(图2D)采用针对TLR8-GFP复合物的抗-GFP抗体对源自TLR8-GFP-HEK-293细胞的免疫沉淀物进行的免疫印迹法。(图2E)对小鼠肿瘤进行的miR-29a的LNA-ISH(蓝色)。(图2F)miR-29a小鼠肿瘤中CD9(红色)和miR-29a(蓝色)的ISH。共表达以黄色指示(复合图像)。(左下方)采用低倍放大率的复合图像指示肿瘤界面处CD9和miR-29a的共表达。(右下方)相应的红色/绿色/蓝色图像(miR-29a以蓝色着染并且CD9以棕色着染)。
图3.miR-21、miR-29a和miR-147诱导TLR激活。(图3A和图3B)TNF-α(图3A)和IL-6(图3B)的ELISA，所述ELISA对分离自WT小鼠(n＝4)和TLR7-/-小鼠(n＝4)并用所示miRNA的Dotap制剂处理的腹膜巨噬细胞进行。(图3C)用所示miRNA处理的WT小鼠和TLR7-/-小鼠脾细胞中CD69的流式细胞计数分析。(图3D)使用以C.聚(I:C)展示的结果的图示作为TLR3介导CD69激活的阳性对照。(图3E)单用Dotap处理或用所示miRNA的Dotap制剂处理的TLR7-和TLR8-HEK-293细胞中的NF-κB活性。分别使用Gardiquimod和ssRNA40作为TLR7介导NF-κB激活和TLR8介导NF-κB激活的阳性对照。(图3F)TLR8-HEK-293细胞中的NF-κB活性，所述细胞用编码显性阴性形式的TLR8(TLR8DN)的质粒或其空载体对应物(CMV)转染并单用Dotap处理或用所示成熟miRNA的Dotap制剂处理。(图3G和图3H)，对人PBMC进行的TNF-α(图3G)和IL-6(图3H)的ELISA，所述人PBMC从两位健康供体的血液分离并单用Dotap处理或用所示成熟miRNA的Dotap制剂处理。使用ssRNA40序列作为TLR8介导的细胞因子分泌的阳性对照。A-H中的结果显示为均值±SD。*P<0.05；**P<0.01。(图3I和图3J)对人PBMC进行的TNF-α和IL-6的ELISA，所述人PBMC用成熟miR-27b和miR-574-5p的Dotap制剂处理24小时。使用与单独的Dotap和与miR-16温育作为阴性对照。一式三份实施实验。结果展示为平均数±SD。*P<0.01；**P<0.0001。
图4.miRNA诱导的TLR7激活增加小鼠中肺部发病数的形成。(图4A和图4B)对腹膜巨噬细胞的条件培养基进行的TNF-α(图4A)和IL-6(图4B)的ELISA，所述腹膜巨噬细胞从WT小鼠(n＝3)和TLR7-/-小鼠(n＝3)分离，与RPMI(培养基；阴性对照)或从LLC细胞纯化的外切体温育48小时。(图4C和图4D)脾细胞中CD69的流式细胞计数分析，所述脾细胞从如图4A和图4B中那样处理的WT小鼠和TLR7-/-小鼠分离。(图4E)在尾部注射LLC细胞后WT(n＝7)和TLR7-/-(n＝7)小鼠的Kaplan-Meier曲线。(图4F)WT小鼠组和TLR7-/-小鼠组中肺内检测到的不同肿瘤发病数的代表性图像。(图4G)在尾部注射LLC细胞后，WT小鼠组和TLR7-/-小鼠组中的肿瘤发病数。(图4H)以LLC细胞注射的B6小鼠中的肿瘤发病数，所述LLC细胞用LNA抗-乱序RNA(对照；n＝6)、LNA抗-miR-16(n＝6)或LNA抗-miR-21/29a(n＝6)转染。(图4I)用如所示那样转染的LLC细胞注射的小鼠中肺的代表性图像。图4A-E、G和H中的结果显示为均值±SD。*P<0.05；**P<0.01；***P≤0.005。
图5.在人巨噬细胞中miR-29a和IL-6的共表达。在人肺癌样品上进行的miR-29a(Nuance倒置图像)(描述为荧光蓝，左上小图)和IL-6(荧光红，右上小图)的LNA-ISH。复合图像(左下小图)以荧光黄显示共表达miR-29a和IL-6的巨噬细胞。右下小图是相应的RGB图像：其与复合图像的比较证实，在肿瘤界面处表达miR-29a的巨噬细胞也仅共表达IL-6(见箭头)。相反，不表达miR-29a的巨噬细胞也不表达IL-6。
图6.依赖miR-21和miR-29a(和TLR介导的)的TNF-α分泌需要NF-κB。(图6A)与miR-16、miR-21和miR-29a的Dotap制剂温育或用LPS(作为阳性对照)处理的RAW264.7细胞中磷酰p65的免疫印迹。使用黏着斑蛋白作为归一化子以显示相等蛋白质载量。(图6B)对RAW264.7细胞的条件培养基进行的TNF-α的ELISA测定，其中所述细胞用编码显性阴性形式IκBα(B细胞中κ轻链多肽基因增强子的核因子抑制剂α，显示为“IκBαDN”)、显性阴性形式Iκκ2(B细胞中κ轻链多肽基因增强子抑制剂激酶β，“Iκκ2DN”)的质粒或作为对照的相应空载体(显示为“EV”)转染。测定法在细胞用所示miRNA的Dotap制剂处理后进行48小时。该实验一式三份实施并且数据展示为平均数±s.d.*，P<0.05。(图6C)研究miR-21和miR-29a的序列中的结构特征。将TLR8-HEK-293细胞与所示成熟miRNA的Dotap制剂参考图14(图6B))温育24小时，并且进行QUANTIBlue测定法。使用单独的Dotap作为阴性对照，并且使用ssRNA40作为NF-κB激活的阳性对照。该实验一式四份实施并且展示为平均数±s.d.。**，P<0.0001。
图7.用含有miRNA的外切体进行的功能研究。(A)RNA中miR-16、miR-21、miR-27b和miR-29a的定量实时PCR，所述RNA从LLC细胞和A-549细胞的上清液中的外切体提取。实施一式三份实验并且展示为平均数±s.d.。**，P<0.0001。(图7B，7C)对腹膜巨噬细胞的条件培养基进行的TNF-α(图7B)和IL-6(图7C)的ELISA，所述腹膜巨噬细胞从WT(n＝3)B6小鼠分离并且与含有外切体的LLC上清液(条件培养基)或与通过超速离心移除外切体后的LLC上清液(超离培养基)温育。(图7D)通过细胞荧光测定术检测到的CD69激活，所述细胞荧光测定术对分离自WT B6小鼠(n＝3)并如同图7B和图7C中那样处理的脾细胞进行。数据展示为平均数±s.d.。**，P<0.005。(E)用LLC释放的外切体处理的TLR8-HEK-293细胞中的NF-κB激活。TLR8-HEK-293细胞不作预处理(“外切体”组)或用巴弗洛霉素A预处理(“外切体+Bafilo”组)。作为阳性对照，TLR8-HEK-293细胞用含有TLR8激活物ssRNA40的人工外切体处理(“ssRNA40”组)。实验实施9次，并且展示为平均数±s.d.。**，P<0.0005(“外切体”对“外切体+Bafilo”)。(图7F)LLC细胞用LNA抗乱序RNA(对照)或针对miR-16的LNA抗miRNA(LNA抗miR-16)和同时针对miR-21和miR-29a的LNA抗miRNA(LNA抗miR-21/29a)转染。在48小时后收集细胞并且从LLC细胞和自其上清液纯化的外切体提取RNA。在LLC细胞中(左小图，标称为“LLC细胞”)，和自其上清液纯化的外切体(右小图，标称为“LLC外切体”)中均通过定量实时PCR检测到全部三种miRNA的水平。实施一式三份实验并且展示为平均数±s.d.。**，P<0.001。(图7G)B6小鼠中的肺部发病数，所述小鼠用野生型LLC细胞注射，随后注射二甲基亚砜(DMSO)(n＝5，组“LLC wtctrl”)；用野生型LLC细胞注射，随后注射miRNA和外切体释放抑制剂GW4869(n＝5，组“LLC wt-GW4869”)或用野生型LLC细胞注射，随后注射GW4869和两次尾静脉内拯救注射LLC衍生的外切体(n＝5，组“LLCwt-GW4869拯救”)。数据展示为均值±s.d.。*，P<0.05；**，P<0.005。
图8.仅表达miR-29a的癌细胞才能够形成肺肿瘤发病数。小鼠形成的肺部发病数中miR-29a(左小图)和抗miR-29a(右小图)的原位杂交，所述小鼠注射以采用LNA抗miR-21/29a转染的LLC细胞。蓝色是探针染色并且粉红色是复染。这幅图像代表来自以LNA抗miR-21/29a注射的小鼠的所研究的全部发病数中的研究结果。
图9.miR-16、miR-21和miR-29a沉默对LLC细胞生物学的影响。(图9A)用LNA抗乱序RNA(对照)、LNA抗miR-16或组合的LNA抗miR-21和29a(LNA抗miR-21/29a)转染后24小时、48小时和72小时所测定的LLC细胞生长曲线。(图9B)在所示时间点对转染的LLC细胞的MTS测定法。LLC生存力表现为通过在490nm读取平板所获得的OD值。(图9C)转染后48小时收集和通过细胞荧光测定术进行的LLC细胞的细胞周期测定法。(图9D)对转染的LLC进行的侵入性测定法。将每种处理的细胞侵入百分数相对于对照(LNA抗乱序RNA)归一化。(图9E)转染的LLC细胞移行测定法，其中通过将细胞在transwell中与补充10％FBS的培养基温育6小时或与无血清培养基温育24小时评估所述细胞。(图9F)用LLC细胞皮下注射的异体移植裸鼠(n＝9)中的肿瘤生长，其中所述细胞用LNA抗乱序RNA(对照)、LNA抗miR-16(LNA抗miR-16)或LNA抗miR-21和miR-29a(LNA抗miR-21/29a)转染。数据相对于对照归一化。除非另外说明，否则实施一式三份实验并且展示为平均数±s.d.。**，P<0.005。
图10.MiRNA由外切体中的癌细胞分泌并且可以抵达并结合周围免疫细胞的内体中的TLR7(小鼠中)或TLR8(人类中)。作为结果，TLR被激活并且免疫细胞释放细胞因子，如TNF-α和IL-6，这促进癌生长和散布。
图11.CD9、CD63和miR-29a的分布。(图11A)CD9和CD63的免疫印迹显示来自A-549和SK-MES的上清液中的纯化级分富含CD9和CD63蛋白，两种熟知的外切体标志物。(图11B)进行对经加工用于miR-29a原位杂交的小鼠肿瘤样品统计分析。如通过Nuance系统所测量，当癌细胞的蓝色信号大于背景染色至少5倍时，将癌细胞视为miR-29a阳性。在多个200X视域中对测试的不同载玻片计数miR-29阳性癌细胞，随后通过使用InStat软件，确定均值±s.d.。**，P<0.005。
图12.在人肺癌中CD9主要在肿瘤界面处产生。(图12A)在人肺癌样品上进行的外切体标志物CD9的ISH。箭头描述在肿瘤界面处红色着染的高度富集CD9的细胞。苏木素复染为蓝色。(图12B)人肺癌样品中肿瘤界面的高倍放大率，如小图A中所见。CD9主要位于显示巨噬细胞常见的卵圆/折叠胞核和硕大细胞质特征的细胞中。
图13.在肿瘤界面处miR-29a与巨噬细胞标志物F-11、与TLR7受体共表达，但是不与癌相关性上皮标志物细胞角蛋白共表达。(图13A)对小鼠肿瘤进行的LNA-ISH显示miR-29a和巨噬细胞标志物F-11仅在肿瘤界面的层次共表达，但是不在相邻的正常肺中共表达。Nuance转换的图像将miR-29a描述为荧光蓝并将F-11描述为荧光绿，同时荧光黄表示它们共表达。(图13B)将小鼠肿瘤针对miR-29aLNA-ISH和癌相关性上皮标志物细胞角蛋白AE1/3染色。miR-29a阳性的细胞(荧光蓝)仅与肿瘤中的细胞角蛋白(荧光黄)共定位，而不与存在细胞miR-29a阳性和细胞角蛋白阴性的肿瘤界面中的细胞角蛋白共定位。(图13C)在小鼠肿瘤上的miR-29a和TLR7的LNA-ISH。Nuance转换的图像将miR-29a显示为荧光蓝并且将TLR7显示为荧光绿。它们的共表达由荧光黄信号指示。
图14.miRNA序列分析。(图14A)显示成熟miR-147(SEQ IDNO:3)和miR-574-5p(SEQ ID NO:2)的序列与RNA33(SEQ ID NO:1)的序列之间相似性的BLAST分析。RNA33对应于一种富含GU的寡核苷酸，其中已经展示所述寡核苷酸分别通过人TLR8和鼠TLR7诱导人免疫细胞和鼠免疫细胞中的细胞因子分泌。精确匹配碱基以红色突出显示。(图14B)在点突变研究中加以考虑的miRNA序列(按出现顺序分别是SEQ ID NOS4-12)的名单。miR-21序列在G18和U20中突变(红色)，而miR-29a在U20和U21中突变：这些碱基用占据miR-16序列中相同位置的碱基替换。还产生具有两个所考虑的点突变的组合的序列。
发明详述
遍及本公开，通过标示引用提到多种出版物、专利和公开的专利说明书。这些出版物、专利和公开的专利说明书的公开内容因而通过引用的方式并入本公开中，以更充分地描述本发明所属的现有技术。
本文中描述并申请肿瘤分泌型miR-21和miR-29a也可以通过以下方式发挥作用：作为配体结合与免疫细胞中的Toll样受体家族受体鼠TLR7和人TLR8结合，触发TLR介导的转移前炎症反应，这最终可以导致肿瘤生长和转移。因此，通过作为TLR的旁分泌激动剂发挥起作用，分泌型miRNA是肿瘤微环境的关键调节物。miRNA的这种作用机制参与肿瘤-免疫系统通讯并且在肿瘤生长和扩散中是重要的，并且因此代表一种用于癌症治疗的新靶。
本文中显示外切体(也称作微泡)中由肿瘤细胞分泌的miR-21和miR-29a可以与TLR8(和TLR7)结合并且激活免疫细胞中的这些受体，导致TLR介导的NF-κB激活和转移前炎性细胞因子分泌。先前已经显示通过激活髓样细胞中的TLR2:TLR6复合物，胞外基质蛋白聚糖多功能蛋白聚糖的肿瘤分泌诱导促炎反应。本文中显示通过激活免疫细胞上的TLR8反应，肿瘤分泌型miRNA还参与促肿瘤炎症过程。作为结果，当这个旁分泌环完整时，肿瘤细胞倾向于更多地转移。发明人的数据确定了一种miRNA、外切体中的miRNA和多种外切体作为TLR受体家族激动剂，并且显示它们影响肿瘤微环境和相关的相互作用。另外，影响癌细胞分泌外切体的药物显著地减少细胞的转移潜能，并且可以通过用处理的细胞所分泌的外切体注射带瘤小鼠拯救这种影响。
如在本文中可互换地使用，“miR基因产物”、“微RNA”、“miR”或“miRNA”指来自miR基因的未加工或加工的RNA转录物。因为miR基因产物不翻译成蛋白质，所以术语“miR基因产物”不包括蛋白质。未加工的miR基因转录物也称作“miR前体”，并且一般包括约70-100个核苷酸长度的RNA转录物。可以通过用RNA酶(例如，Dicer、Argonaut、RNA酶III(例如，大肠杆菌RNA酶III))消化，将miR前体加工成19-25个核苷酸的活性RNA分子。这种19-25个核苷酸的活性RNA分子也称作“加工的”miR基因转录物或“成熟”miRNA。
19-25个核苷酸的活性RNA分子可以通过天然加工途径(例如，使用完整细胞或细胞裂解物)或通过人工加工途径(例如，使用分离的加工酶，如分离的Dicer、Argonaut或RNA酶III)从miR前体获得。可以理解，19-25个核苷酸的活性RNA分子也可以在不必要从miR前体加工而来的情况下通过生物合成或化学合成直接产生。除非另外说明，否则当本文中通过名称提到微RNA时，该名称既对应于前体形式，又对应于成熟形成。
在本发明主题的一个方面，描述了用于分析哺乳动物的生物样品的方法，在所述方法中从包含多个不同RNA分子的活受试者获得外切体。随后富集并区分这些外切体以基于一个或多个不同RNA分子产生结果。RNA分析可以包括分析单一RNA、至少两种不同的RNA或整个RNA图谱。结果随后与受试者病状的诊断(例如，癌症或癌症的临床分期，包括癌前期)或预后/诊断相关。
如本文所用，“受试者”可以是患有或疑似患有癌症的任何哺乳动物。在一个优选实施方案中，受试者是患有或疑似患有癌症的人。
可以在从受试者获得的生物样品的细胞中测量至少一种miR基因产物的水平。例如，可以从疑似患有癌症的受试者取出组织样品，通过常规活组织检查技术。在另一个实施方案中，可以从受试者取出血液样品，并且可以通过标准技术分离白细胞用于DNA提取。血液或组织样品优选地在开始放疗、化疗或其他治疗性疗法之前从受试者获得。相应的对照组织或血液样品，或对照参比样品，可以从受试者的未患病组织、从正常人类个体或正常个体的群体，或从对应于受试者样品中大部分细胞的培养细胞获得。对照组织或血液样品随后连同来自受试者的样品一起加工，因而从来自受试者样品的细胞中的给定miR基因产生的miR基因产物的水平可以与来自对照样品的细胞的相应miR基因产物水平比较。可选地，参比样品可以从测试样品独立获得并加工(例如，在不同的时间)，并且从来自测试样品的细胞中的给定miR基因产生的miR基因产物的水平可以与来自参比样品的相应miR基因产物水平比较。
可以相对于一个或多个RNA表达标准物确定对照样品和正常样品中的相对miR基因表达。标准物可以包括例如miR基因表达零水平、标准细胞系中的miR基因表达水平、受试者的未患病组织中的miR基因表达水平或事先对正常人对照群体获得的miR基因表达平均水平。例如，对照可以是一种具有肿瘤样品中平均miR表达水平数据库，其中所述肿瘤样品来自许多患者样品、或存在miR表达的原发性肿瘤样品、来自存在疑似转移的受试者或源于患有相同类型原发性癌症的另一个受试者的原发性肿瘤样品。“对照”因此可以反映肿瘤细胞类型(例如原发性与转移性或正常与癌性)之间的比较。对照可以是已知的疾病状态。可以相对于另一个时间点进行对照比较，例如：既往健康组织样品、诊断前样品、诊断后样品、治疗前样品、缓解期间的样品和/或处于不同癌症分期的样品。
可以使用适于检测生物样品中RNA表达水平的任何技术测量样品中miR基因产物的水平。用于确定生物样品(例如，细胞、组织)中RNA表达水平的合适技术(例如，RNA印迹分析、RT-PCR、原位杂交)是本领域技术人员熟知的。在一个特定实施方案中，使用RNA印迹分析检测至少一种miR基因产物的水平。例如，可以通过在核酸提取缓冲液存在的情况下均化随后离心，从细胞纯化细胞总RNA。将核酸沉淀，并通过DNA酶处理和沉淀移除DNA。随后将RNA分子根据标准技术通过在琼脂糖凝胶上凝胶电泳进行分离并转移至硝酸纤维素滤膜。随后将RNA通过加热固定在滤膜上。使用与所讨论RNA互补的适当标记的DNA探针或RNA探针，实现特定RNA的检测和定量。见，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook等人(编著)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第7章，所述文献的完整公开内容通过引用的方式并入。
用于给定miR基因产物的RNA印迹杂交的合适探针(例如，DNA探针、RNA探针)可以从本文提供的核酸序列产生并包括但不限于与目的miR基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％互补性的探针以及与目的miR基因产物具有完全互补性的探针。用于制备标记DNA探针和RNA探针的方法和其与靶核苷酸序列杂交的条件在Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook等人(编著)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第10章和第11章中描述，所述文献的公开内容通过引用方式并入本文。
例如，核酸探针可以例如用以下标记：放射性核素如3H、32P、33P、14C或35S；重金属；能够作为标记配体的特异性结合对子成员发挥作用的配体(例如，生物素、抗生物素蛋白或抗体)；荧光分子；化学发光分子；酶等。
可以通过Rigby等人,(1977),J.Mol.Biol.113:237-251的切刻翻译法或通过Fienberg等人,(1983),Anal.Biochem.132:6-13的随机引发法，将探针标记成高比活性，所述文献的完整公开内容通过引用方式并入本文。后者是从单链DNA或从RNA模板合成高比活性32P-标记探针的所选方法。例如，根据切刻翻译法通过用高度放射的核苷酸替换事先存在的核苷酸，可以制备比活性完全超过108cpm/微克的32P-标记核酸探针。
随后可以通过使杂交的滤膜暴露于照相胶片进行杂交的放射自显影检测。通过杂交的滤膜对暴露的照相胶片进行光密度扫描，提供对miR基因转录物水平的精确测量。使用另一个方法，miR基因转录物水平可以用计算机化成像系统定量，如从Amersham Biosciences,Piscataway,NJ可获得的Molecular Dynamics400-B2DPhosphorimager。
其中放射性核素标记DNA探针或RNA探针不可行的情况下，随机引物法可以用来将类似物，例如，dTTP类似物5-(N-(N-生物素酰-ε-氨基己酰基)-3-氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸掺入探针分子中。可以通过与生物素结合蛋白(如抗生物素蛋白、链霉亲和素和抗体(例如，抗生物素抗体))反应检测到生物素酰化的探针寡核苷酸，其中所述生物素结合蛋白与荧光染料或产生颜色反应的酶结合。
除RNA印迹和其他RNA杂交技术之外，可以使用原位杂交技术完成RNA转录物水平的确定。这项技术需要比RNA印迹技术更少的细胞并且涉及将完整细胞沉积到显微镜盖玻片上并用含有放射性核酸探针或否则标记核酸探针(例如，cDNA或RNA)的溶液探测细胞的核酸含量。这项技术特别充分地适用于分析来自受试者的组织活检样品。原位杂交技术的实施在美国专利号5,427,916中更详细地描述，所述文献的完整公开内容通过引用方式并入本文。用于给定miR基因产物的原位杂交的合适探针可以从本文提供的核酸序列产生并包括但不限于与目的miR基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％互补性的探针以及与目的miR基因产物具有完全互补性的探针，如上文所述。
也可以通过逆转录miR基因转录物，随后通过聚合酶链反应(RT-PCR)扩增逆转录转录物，确定细胞中miR基因转录物的相对数目。可以与内标物(例如，来自相同样品中存在的“持家基因”的mRNA的水平)相比，定量miR基因转录物的水平。用作内标物的合适的“持家基因”包括例如肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。用于进行定量性和半定量RT-PCR及其变体的方法是本领域技术人员熟知的。
在一些情况下，可能想要同时确定样品中多个不同miR基因产物的表达水平。在其他情况下，可能想要确定与癌症相关的全部已知miR基因的转录物的表达水平。评估数百个miR基因或基因产物的癌特异性表达水平是费时的，并且需要大量总RNA(例如，每次RNA印迹至少20μg)和要求放射性同位素的放射自显影技术。
为克服这些限制，可以构建微芯片(即，微阵列)样式的寡核苷酸文库，它含有对一组miR基因特异的成套寡核苷酸(例如，寡脱氧核苷酸)探针。使用这种微阵列，可以通过以下方式确定生物样品中多种微RNA的表达水平：逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸并且使它们杂交以探测微阵列上的寡核苷酸以产生杂交谱或表达谱。测试样品的杂交谱随后可以与对照样品的杂交谱比较，以确定癌转移细胞和/或复发细胞中哪种微RNA具有改变的表达水平。如本文所用，“探针寡核苷酸”或“探针寡脱氧核苷酸”指能够与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。“靶寡核苷酸”或“靶寡脱氧核苷酸”指待检测的分子(例如，借助杂交)。“miR特异性探针寡核苷酸”或“对miR特异的探针寡核苷酸”意指具有下述序列的探针寡核苷酸，所述序列经选择以杂交至特定miR基因产物或杂交至特定miR基因产物的逆转录物。
特定样品的“表达谱”或“杂交谱”实质上是样品状态的指纹；尽管两种状态可以具有类似表达的任何特定基因，但是同时评价许多基因允许产生该细胞状态独有的基因表达谱。即，正常组织可以与癌细胞区分，并在癌细胞类型内部，可以确定不同的预后状态(例如，良好或不良长期存活前景)。通过比较处于不同状态的细胞的表达谱，获得关于哪种基因在这些状态的每一者中重要(包括基因上调和下调)的信息。鉴定在癌细胞或正常细胞中差异性表达的序列以及导致不同预后结局的差异性表达，允许以许多方式利用这种信息。例如，可以评价特定治疗方案(例如，以确定化疗药物是否发挥作用以改善特定患者中的长期预后)。类似地，可以通过将患者样品与已知的表达谱比较，作出或证实诊断。另外，这些基因表达谱(或个体基因)允许筛选抑制miR或疾病表现谱或将不良预后谱转化成较好预后谱的候选药物。
微阵列可以从产生自已知miRNA序列的基因特异性寡核苷酸探针制备。该阵列可以含有针对每种miRNA的两个不同寡核苷酸探针，一种探针含有活性成熟序列和其他对miRNA的前体特异。该阵列也可以含有对照，如仅因一些碱基而不同于人直向同源物的一个或多个小鼠序列，所述小鼠序列可以充当杂交严格性条件的对照。也可以把来自两个物种的tRNA和其他RNA(例如，rRNA、mRNA)印刷在微芯片上，从而提供用于特异性杂交的相对稳定的阳性内对照。也可以在微芯片上包括用于非特异性杂交的一个或多个适宜对照。为此目的，基于与任何已知的miRNA不存在任何同源性，选择序列。
可以使用本领域已知的技术制造微阵列。例如，将具有适宜长度(例如，40个核苷酸)的探针寡核苷酸在C6位置处进行5'-胺修饰并使用市售微阵列系统(例如，GeneMachine OmniGridTM100微阵列点样器和Amersham CodeLinkTM活化型载玻片)印刷。通过用标记引物逆转录靶RNA制备与靶RNA相对应的标记cDNA寡聚物。在第一链合成后，使RNA/DNA杂交分子变性以降解RNA模板。如此制备的标记靶cDNA随后与微阵列芯片在杂交条件下杂交，例如，在25℃时6X SSPE/30％甲酰胺持续18小时，随后在37℃在0.75X TNT中洗涤40分钟。在阵列上固定的探针DNA识别样品中互补性靶cDNA的位置处，杂交发生。标记的靶cDNA标出阵列上结合发生的确切位置，从而允许自动检测和定量。输出由一系列杂交事件组成，所述事件指示患者样品中特定cDNA序列的相对丰度并因此指示相应的互补性miR的相对丰度。根据一个实施方案，标记的cDNA寡聚物是从生物素标记引物制备的生物素标记cDNA。随后通过使用例如链霉亲和素-Alexa647缀合物直接检测含有生物素的转录物并利用本领域已知的常规扫描方法扫描，处理微阵列。阵列上每个点的图像强度与患者样品中相应miR的丰度成正比。
对于miRNA表达检测，阵列的使用具有几个优点。首先，可以在一个时间点在相同样品中鉴定几百个基因的总体表达。第二，通过精心设计寡核苷酸探针，可以鉴定成熟分子和前体分子二者的表达。第三，与RNA印迹分析相比，芯片需要少量RNA，使用2.5μg总RNA，提供可重复结果。相对有限数目的miRNA(每个物种数百个)允许用针对每个物种的不同寡核苷酸探针构建用于几种物种的共同微阵列。这种工具将允许分析多种条件下每种已知miR的跨物种表达。
除用于特定miR的定量性表达水平分析之外，可以使用含有与绝大部分miRNA组(miRNome)、优选地整个miRNA组相对应的miRNA特异性探针寡核苷酸的微芯片来实施miR基因表达概况分析，以分析miR表达模式。不同的miR特征标识可以与既定的疾病标志物相关或与疾病状态直接相关。
根据本文所述的表达概况分析法，定量地逆转录来自源于疑似具有癌症谱(例如转移或复发)受试者的样品中的总RNA以提供一组与样品中RNA互补的标记靶寡脱氧核苷酸。所述靶寡脱氧核苷酸随后与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供该样品的杂交谱。结果是描述样品中miRNA表达模式的样品杂交谱。该杂交谱包含源于来自样品的靶寡脱氧核苷酸与微阵列中miRNA特异性探针寡核苷酸结合的信号。可以将该图谱记录为存在或不存在结合作用(信号与零信号)。更优选地，记录的图谱包括来自每个杂交的信号的强度。将该图谱与从正常样品(例如非癌对照样品)产生的杂交谱比较。该信号指示癌谱的存在或受试者中形成的倾向性。
用于测量miR基因表达的其他技术也处于本领域能力范围内，并且包括用于测量RNA转录和降解速率的多种技术。
本发明的实施方案还提供确定预后的方法。不利预后的例子包括但不限于低存活率和病情快速进展。
在某些实施方案中，通过以下方式测量至少一种miR基因产物的水平：逆转录源自从受试者获得的测试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，将所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交谱，并且将测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱比较。
因此，本发明的实施方案涵盖治疗受试者中癌症的方法。该方法包括施用有效量的至少一种分离的反义miR基因产物，或分离的其变体或生物活性片段，从而抑制受试者中癌细胞的转移、复发或增殖。施用至受试者的分离的反义miR基因产物可以与内源野生型miR基因产物互补或者它可以互补于其变体或生物活性片段。
如本文定义，miR基因产物的“变体”指与相应野生型miR基因产物具有小于100％同一性并拥有相应野生型miR基因产物的一种或多种生物学活性的miRNA。这类生物学活性的例子包括但不限于抑制与转移或复发相关的细胞过程(例如，细胞分化、细胞生长、细胞死亡)。这些变体包括物种变体和作为miR基因中一个或多个突变(例如，置换、缺失、插入)的结果的变体。在某些实施方案中，变体与相应的野生型miR基因产物至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。
如本文定义，miR基因产物的“生物学活性片段”指miR基因产物的RNA片段，所述RNA片段拥有相应的野生型miR基因产物的一种或多种生物学活性。如上文描述，这类生物学活性的例子包括但不限于抑制与转移或复发相关的细胞过程。在某些实施方案中，生物学活性片段具有至少约5、7、10、12、15或17个核苷酸长度。在一个特定实施方案中，分离的miR基因产物可以与一种或多种其它抗癌治疗组合地施用至受试者。合适的抗癌治疗包括但不限于化疗、放疗及它们的组合(例如，放化疗)。
如本文所用，术语“治疗”指缓解与疾病或病状(例如，肺癌转移和/或复发)相关的症状，包括预防或延迟疾病症状的发作和/或减轻疾病或病状的症状的严重性或频率。术语“受试者”和“个体”在本文中限定成包括动物，如哺乳动物，包括但不限于灵长类、奶牛、羊、山羊、马、犬、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他牛、羊、马、犬、猫、啮齿类、或鼠物种。在一个优选的实施例中，动物是人。
锁核酸(LNA)，有时称作不可及RNA，是修饰的RNA核苷酸/寡核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分以连接2'氧和4'碳的额外桥进行修饰。桥部“锁定”核糖处于3'-内构象。LNA核苷酸可以在需要时与寡核苷酸中的DNA残基或RNA残基混合。这类寡聚物是化学合成的并且是可商业获得的。
如本文所用，分离的miR基因产物的“有效量”是足以抑制患有癌转移和/或复发的受试者中癌细胞增殖的量。通过考虑以下因素，如受试者的尺寸和重量；疾病侵入程度；受试者年龄、健康和性别；施用途径；和施用是区域性或全身性，本领域技术人员可以容易地确定待施用至给定受试者的miR基因产物的有效量。
例如，分离的miR基因产物有效量可以基于待治疗的肿瘤块的近似重量。可以通过计算肿瘤块的近似体积确定肿瘤块的近似重量，其中1立方厘米的体积大致等于1克。基于肿瘤块重量的分离的miR基因产物的有效量可以处于约10-500微克/克肿瘤块范围内。在某些实施方案中，肿瘤块可以是至少约10微克/克肿瘤块、至少约60微克/克肿瘤块或至少约100微克/克肿瘤块。
分离的miR基因产物的有效量也可以基于待治疗的受试者的近似或估计体重。优选地，这类有效量以肠胃外或肠内方式施用，如本文所述。例如，施用至受试者的分离的miR基因产物的有效量可以是从约5-3000微克/kg体重、从约700-1000微克/kg体重或大于约1000微克/kg体重。
本领域技术人员也可以容易地确定用于施用分离的miR基因产物至给定受试者的适宜剂量方案。例如，可以将miR基因产物施用至受试者一次(例如，作为单次注射或蓄积)。可选地，可以将miR基因产物向受试者受试者施用一次或二次持续约3日至约28日，更具体地约7日至约10日的时间。在特定剂量方案中，将miR基因产物一日施用1次持续7日。在剂量方案包括多次施用的情况下，可以理解，施用至受试者的miR基因产物的有效量可以包括在整个剂量方案范围内施用的基因产物的总量。
如本文所用，“分离”的miR基因产物是通过人类干预而合成或改变或从天然状态解除的一种miR基因产物。例如，将合成的miR基因产物或与其天然状态的共存材料部分地或完全分离的miR基因产物视为“分离”。分离的miR基因产物可以按基本上纯化的形式存在，或可以在已经向其递送miR基因产物的细胞中存在。因而，将人为递送至细胞或在细胞中表达的miR基因产物视为“分离的”miR基因产物。将细胞内部中从miR前体分子产生的miR基因产物也视为“分离的”分子。根据本发明的实施方案，本文所述的分离的miR基因产物可以用于制造治疗受试者(例如，人类)中癌症转移和/或复发的药物。如本文所用，miR基因产物可以宽泛地包括抗-miR或已鉴定的miR的反义、部分或完整互补物。
可以使用许多标准技术，获得分离的miR基因产物。例如，可以使用本领域已知的方法化学合成地或重组地产生miR基因产物。在一个实施方案中，使用适当保护的核糖核苷磷酰亚胺和常规DNA/RNA合成仪，化学地合成miR基因产物。合成性RNA分子或合成试剂的商业供应商例如包括Proligo(Hamburg,德国)、Dharmacon Research(Lafayette,CO,美国)、Pierce Chemical(Perbio Science分部,Rockford,IL,美国)、Glen Research(Sterling,VA,美国)、ChemGenes(Ashland,MA,美国)和Cruachem(Glasgow,英国)。
可选地，可以使用任何合适的启动子，从重组环状或线性DNA质粒表达miR基因产物。从质粒表达RNA的合适启动子例如包括U6或H1RNA聚合酶III启动子序列，或巨细胞病毒启动子。选择其他合适的启动子处于本领域能力范围内。本发明实施方案的重组质粒也可以包含用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或调节型启动子。
可以通过标准技术，从培养的细胞表达系统分离从重组质粒表达的miR基因产物。从重组质粒表达的miR基因产物也可以递送至癌细胞并在癌细胞中直接表达。在下文更详细地讨论重组质粒递送miR基因产物至癌细胞的用途。
miR基因产物可以从分立的重组质粒表达，或它们可以从相同的重组质粒表达。在一个实施方案中，miR基因产物从单一质粒表达为RNA前体分子，并且该前体分子由合适的加工系统(包括但不限于癌细胞内部现存的加工系统)加工成有功能的miR基因产物。其他合适的加工系统例如包括体外果蝇细胞裂解物系统(例如，如授予Tuschl等人的美国公开的专利申请号2002/0086356中所述，所述文献的完整公开内容通过引用方式并入本文)和大肠杆菌RNA酶III系统(例如，如授予Yang等人的美国公开的专利申请号2004/0014113中所述，所述文献的完整公开内容通过引用方式并入本文)。
选择适于表达miR基因产物的质粒、用于将核酸序列插入质粒中以表达该基因产物的方法和递送重组质粒至目的细胞的方法处于本领域能力范围内。见，例如，Zeng等人,(2002),Molecular Cell9:1327-1333；Tuschl(2002),Nat.Biotechnol,20:446-448；Brummelkamp等人,(2002),Science296:550-553；Miyagishi等人,(2002),Nat.Biotechnol.20:497-500；Paddison等人,(2002),Genes Dev.16:948-958；Lee等人,(2002),Nat.Biotechnol.20:500-505；和Paul等人,(2002),Nat.Biotechnol.20:505-508，所述文献的完整公开内容通过引用方式并入本文。
在一个实施方案中，表达miR基因产物的质粒包含在CMV中期-早期启动子控制下编码miR前体RNA的序列。如本文所用，“在启动子控制下”意指编码miR基因产物的核酸序列位于该启动子的3'，从而该启动子可以启动miR基因产物编码序列的转录。
也可以从重组病毒载体表达miR基因产物。构思了miR基因产物可以从两个分立的重组病毒载体表达，或从相同的病毒载体表达。从重组病毒载体表达的RNA可以通过标准技术从培养的细胞表达系统分离，或可以在癌细胞中直接表达。在下文更详细地讨论重组病毒载体递送miR基因产物至癌细胞的用途。
本发明实施方案的重组病毒载体包含编码miR基因产物的序列和用于表达RNA序列的任何合适启动子。合适的启动子包括但不限于U6或H1RNA聚合酶III启动子序列或巨细胞病毒启动子。选择其他合适的启动子处于本领域能力范围内。本发明实施方案的重组病毒载体也可以包含用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或调节型启动子。
可以使用能够接受miR基因产物的编码序列的任何病毒载体，例如，从腺病毒(AV)；腺联病毒(AAV)；逆转录病毒(例如，慢病毒(LV)、弹状病毒、鼠白血病病毒)；疱疹病毒等衍生的载体。可以通过将载体用源自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原进行假病毒化或或如果适宜通过置换不同的病毒衣壳蛋白，调整病毒载体的嗜性。
例如，本发明实施方案的慢病毒载体可以用来自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、Mokola等的表面蛋白进行假病毒化。可以通过将载体工程化以表达不同衣壳蛋白血清型，使得本发明实施方案的AAV载体靶向不同细胞。例如，表达血清型2基因组上血清型2衣壳的AAV载体称作AAV2/2。AAV2/2载体中的这种血清型2衣壳基因在可以由血清型5衣壳基因替换以产生AAV2/5载体。用于构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术处于本领域能力范围内；见，例如，Rabinowitz,J.E.等人,(2002),J.Virol.76:791-801，所述文献的完整公开内容通过引用方式并入本文。
选择适用于本发明实施方案中的重组病毒载体、用于将表达RNA的核酸序列插入该载体的方法、递送该重组病毒载体至目的细胞的方法、以及对所表达RNA产物的回收处于本领域能力范围内。见，例如，Dornburg(1995),Gene Therap.2:301-310；Eglitis(1988)，Biotechniques6：608-614；Miller(1990),Hum.Gene Therap.1:5-14；和Anderson(1998),Nature392:25-30，所述文献的完整公开内容通过引用方式并入本文。
特别合适的病毒载体是从AV和AAV衍生的那些。用于表达miR基因产物的合适AV载体、用于构建重组AV载体的方法和用于递送该载体至靶细胞中的方法在Xia等人,(2002),Nat.Biotech.20:1006-1010中描述，所述文献的完整公开内容通过引用方式并入本文。用于表达miR基因产物的合适AAV载体、用于构建重组AAV载体的方法和用于递送所述载体至靶细胞中的方法在Samulski等人,(1987),J.Virol.61:3096-3101；Fisher等人,(1996),J.Virol.,70:520-532；Samulski等人,(1989),J.Virol.63:3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；国际专利申请号WO94/13788；和国际专利申请号WO93/24641中描述，所述文献的完整公开内容通过引用方式并入本文。在一个实施方案中，miR基因产物从包含CMV中期早期启动子的单个重组AAV载体表达。
在某个实施方案中，重组AAV病毒载体包含在人U6RNA启动子控制下与多聚T终止序列有效连接的编码miR前体RNA的核酸序列。如本文所用，“与多聚T终止序列有效连接”意指编码有义链或反义链的核酸序列以5'方向紧邻于多聚T终止信号。从载体转录miR序列期间，多聚T终止信号起到终止转录的作用。
可以通过直接测量或通过从原发性或转移性肿瘤块的尺寸估计，确定受试者身体内癌细胞的数目。例如，可以通过设计成检测癌细胞特征性表面标志物的免疫组织学方法、流式细胞术或其他技术测量受试者中癌细胞的数目。
miR基因产物也可以通过任何合适的肠内或肠胃外施用途径施用至受试者。用本发明方法的合适肠内施用途径例如包括口服、直肠或鼻内递送。合适的肠胃外施用途径例如包括血管内施用(例如，静脉内快速浓注注射、静脉内输注、动脉内快速浓注、动脉内输注和导管滴注至血管系统中)；组织周围和组织内注射(例如，肿瘤周围和肿瘤内注射、视网膜内注射或视网膜下注射)；皮下注射或蓄积、包括皮下输注(如通过渗透泵)；直接施加至目的组织、例如通过导管或其他放置装置(例如，视网膜丸粒剂或栓剂或包含多孔、非多孔或凝胶状材料的植入物)；和吸入。特别合适的施用途径是注射、输注和直接注射至肿瘤中。
在本发明的方法中，可以将miR基因产物作为裸RNA，与递送试剂组合或作为包含表达miR基因产物或miR基因表达抑制化合物的序列的核酸(例如，重组质粒或病毒载体)施用至受试者。合适的递送试剂例如包括Mirus Transit TKO亲脂性试剂；LIPOFECTIN；脂质转染胺(lipofectamine)；cellfectin；聚阳离子(例如，聚赖氨酸)和脂质体。
包含表达miR基因产物的序列的重组质粒和病毒载体和用于递送这类质粒和载体至癌细胞的技术在本文中讨论和/或是本领域熟知的。
在一个特定实施方案中，脂质体用来向受试者递送miR基因产物(或包含编码它们的序列的核酸)。脂质体也可以增加基因产物或核酸的血液半寿期。用于本发明实施方案中的合适脂质体可以从形成囊泡的标准脂质组成，所述脂质通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇，如胆固醇。通过考虑诸多因素如合乎需要的脂质体大小和脂质体在血流中的半寿期，指导脂类的选择。用于制备脂质体的多种方法是已知的，例如，如Szoka等人,(1980),Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467；和美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所述，所述文献的完整公开内容通过引用方式并入本文。
用于本发明方法中的脂质体可以包含将脂质体靶向癌细胞的配体分子。优选与癌细胞中优势的受体结合的配体，如与肿瘤细胞抗原结合的单克隆抗体。
用于本发明方法中的脂质体也可以如此修饰，从而避免被单核细胞巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。这类修饰的脂质体具有在表面上或掺入脂质体结构的调理抑制部分。在一个特别优选的实施方案中，脂质体可以同时包含调理作用抑制部分和配体。
用于制备脂质体中的调理作用抑制部分一般地是与脂质体膜结合的巨大亲水聚合物。如本文所用，当调理作用抑制部分以化学或物理方式与脂质体膜接合，例如通过脂溶性锚形体嵌入膜自身中或通过与膜脂的活性基团直接结合时，调理作用抑制部分“与脂质体膜结合”。这些调理作用抑制性亲水聚合物形成显著降低脂质体被MMS和RES摄入的保护性表面层；例如，如美国专利号4,920,016中所述，所述文献的完整公开内容通过引用方式并入本文。
适于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选地是具有约500至约40,000道尔顿和更优选地约2,000至约20,000道尔顿的数均分子量的水溶性聚合物。这类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)或其衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸酯；合成性聚合物，如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；线型、分枝或树状物聚酰胺型胺；聚丙烯酸；多元醇，例如，与羧基或氨基化学连接的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合适的。此外，调理作用抑制性聚合物可以是PEG和聚氨基酸、多糖、聚酰胺型胺、聚亚乙基胺或多核苷酸的嵌段共聚物。调理作用抑制性聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸(例如，半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉菜胶)的天然多糖；(线型或分枝)胺化多糖或低聚糖；或(例如，与碳酸衍生物反应，同时导致连接羧基)的羧化多糖或低聚糖。优选地，调理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时称作“聚乙二醇化脂质体”。
调理作用抑制部分可以通过众多熟知技术的任一项与脂质体膜结合。例如，PEG的N-羟琥珀酰亚胺酯可以与磷脂酰-乙醇胺脂溶性固定物结合并且随后与膜结合。类似地，通过在60℃使用Na(CN)BH3和溶剂混合物如30:12比率的四氢呋喃和水进行还原性胺化，葡聚糖聚合物可以用十八烷基脂溶性锚形体衍生化。
用抑制调理作用的部分修饰的脂质体比未修饰的脂质体在循环中保持的时间长得多。出于这个原因，这类脂质体有时称作“隐形脂质体”。已知隐形脂质体积累在组织中，由多孔或“泄漏性”微血管输入。因此，以这类微血管缺陷为特征的组织(例如，实体瘤(例如，肺癌转移灶和/或复发灶))将高效地积累这些脂质体；见Gabizon，等人,(1988),Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,18:6949-53。此外，通过阻止脂质体明显积累于肝和脾中，借助RES减少摄入降低了隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用抑制部分修饰的脂质体特别适用于递送miR基因产物(或包含编码其序列的核酸)至肿瘤细胞。
在施用它们至受试者之前，miR基因产物可以根据本领域已知的技术配制为药物组合物，有时称作“药品”。因此，本发明的实施方案涵盖用于治疗癌转移和/或复发的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种分离的miR基因产物，或分离的其变体或生物活性片段，和可药用载体。
实施例
鉴定癌细胞衍生的外切体中释放的特定miRNA。
为了鉴定哪种miRNA存在于肿瘤分泌的外切体中，从A-549和SK-MES肺癌细胞系的上清液分离外切体。首先，对纯化的上清液外切体级分评估已知的两种外切体标志物CD9和CD63的富集(图11A)。通过实施NanoString分析，观察到9种miRNA(miR-16、miR-21、miR-27b、miR-29a、miR-133a、miR-193a-3p、miR-544、miR-563和miR-1283)以高于50代码计数的表达水平存在于源自两种细胞系的外切体中(图1A)。
表1：在A-549和SK-MES肺癌细胞系分泌的外切体中所含并其代码计数高于50的miRNA的NanoString代码计数。
为验证这些数据，使用来自A-549和SK-MES的相同外切体衍生RNA和从HEK-293细胞上清液纯化的外切体衍生的RNA，我们对全部9种miRNA(外加miR-15a作为阴性对照)进行定量实时PCR。我们证实miR-15a表达在三个细胞系的任一细胞系的外切体中检测不到并且miR-16的表达在三个细胞系之间无显著差异(图1B)。然而，miR-21、miR-27b和miR-29a的表达在源自A-549和SK-MES细胞的外切体中比来自HEK-293细胞的外切体中显著更高(P<0.001)，显示分泌型miRNA的癌特异性样式(图1B)。未通过定量实时PCR证实miR-133a、miR-193a-3p、miR-544、miR-563和miR-1283的NanoString表达数据。
癌释放的外切体中的miRNA可以抵达并结合TLR。
因为鼠TLR7和人TLR8均位于胞内内体中，所以对细胞释放的外切体是否能够抵达“接受”细胞中含有TLR的内体进行初步探究。因此，将事先用编码与GFP缀合的CD9外切体标志物的质粒转染的HEK-293细胞与用活性蓝细胞示踪剂染色的RAW264.7鼠巨噬细胞(其中含有TLR的内体还用红色Lyso示踪剂标记)共培养。观察到RAW巨噬细胞并入HEK-293细胞释放的CD9-GFP外切体，并且这些外切体与内体在RAW细胞中共定位(图2A)。接下来，我们询问胞外miR-16、miR-21和miR-29a是否可以抵达胞内内体内部的TLR8。为此目的，使用目的miRNA的Dotap脂质体制剂(模拟其中封闭有它们的外切体)。将不表达TLR8的HEK-293细胞用表达加GFP标签的TLR8蛋白的质粒转染。在48小时后，将细胞用含有Cy5缀合的成熟miR-16、miR-21或miR-29a的Dotap脂质体制剂处理，并且随后添加蓝色Lyso示踪剂至标记物细胞内体的培养基。对全部三种miRNA均检测到miRNA、TLR8和内体的共定位(图2B)，显示外源miRNA可以抵达细胞内体中的TLR8。为了确定这些miRNA是否与TLR8结合，我们对表达GFP-TLR8并用Dotap-miR-16、Dotap-miR-21、Dotap-miR-29a或单独Dotap处理的HEK-293细胞中的TLR8进行免疫共沉淀分析并且通过定量实时PCR确定miRNA水平。虽然miR-16几乎在GFP-TLR8免疫共沉淀物中检测不到，但是miR-21表达和miR-29a表达高度地富集(>50倍)(图2C)。还用单独的Dotap或用5'-生物素酰化miR-16、miR-21或miR-29a的Dotap制剂处理表达GFP-TLR8的HEK-293细胞。作为阳性对照，将细胞用5'-生物素酰化的ssRNA40(一种先前经证实激活TLR8的20mer ssRNA)处理。在免疫共沉淀miRNA和ssRNA40后，在ssRNA40处理的细胞、miR-21处理的细胞和miR-29a处理的细胞中检测到TLR8(图2D)，但是在用单独的Dotap或用Dotap-miR-16处理的细胞中未检测到TLR8。为了研究这种相互作用是否还在体内发生，我们用注入尾部后倾向于定位到肺的Lewis肺癌(LLC)细胞注射B6小鼠并在注射后15日分析肺肿瘤。通过ISH，我们显示miR-29a由癌细胞产生并且不由相邻正常肺组织中的细胞产生(图2E和图11B)。这些研究结果还在人原发性肺癌样品中得到证实，其中还在肿瘤-正常组织界面处的巨噬细胞在观察到外切体标志物CD9的富集(图12)。另外，通过锁核酸原位杂交(LNAISH)，观察到miR-29a和外切体共定位于小鼠肺癌和人肺癌的样品中肿瘤-正常组织界面处(图2F)，但是未定位于距肿瘤1mm的正常组织中。另外，我们显示，虽然miR-29a与癌相关性上皮标志物细胞角蛋白在肿瘤中心共定位(证实癌细胞是miR-29a的主要生产者)，但是在肿瘤周边，miR-29a与巨噬细胞标志物F-11共表达，但是不与细胞角蛋白共表达，从而显示miR-29a存在于巨噬细胞中的肿瘤界面处(图13A和13B)。我们还显示miR-29a与巨噬细胞的TLR7共定位于肿瘤界面处(图13C)。总体，这些数据表明癌细胞分泌外切体中的miR-29a并且这种miRNA与巨噬细胞中的TLR7和TLR8共定位于肿瘤-正常组织界面处。
癌释放的外切体中的miRNA功能地激活TLR。
进行实验以确定miRNA-TLR相互作用是否是有功能的并评估目的miRNA是否诱导其产生因TLR激活增加的细胞因子如TNF-α和IL-6的分泌。我们从WTB6小鼠和TLR7-/-B6小鼠分离腹膜巨噬细胞。将细胞用单独的Dotap处理或用miR-16、miR-21、miR-29a和miR-147的Dotap制剂处理，并且进行TNF-α和IL-6的ELISA。在功能测定法中，还包括miR-147和-574-5p，因为它们具有通过激活TLR8和TLR7诱导细胞因子产生(类似于RNA33)的病毒衍生成熟序列(图14A)。虽然单独的Dotap和Dotap-miR-16不诱导细胞因子分泌，但是miR-21、miR-29a和miR-147增加WT中的TNF-α和IL-6产生，但是不增加TLR7-/-小鼠中的TNF-α和IL-6产生(图3A和图3B)。我们还用相同的miRNA处理来自WT和TLR7-/-小鼠的脾细胞并评估在炎症和增殖中发挥作用并也被TLR3激活的CD69(细胞的早期活化标志物)的表达。聚肌苷酸:聚胞苷酸[聚I:C)](一种已知的TLR3激动剂)充当阳性对照。细胞荧光测量显示miR-21、miR--29a和miR-147在来自WT的脾细胞中诱导CD69激活，但在来自TLR7-/-小鼠的脾细胞中不诱导CD69激活，而miR-16或单独的Dotape则不是这样(图3C和3D)，这表明这些miRNA诱导TLR7介导的脾细胞活化。
为了研究miRNA诱导的TLR激活是否也在人细胞中发生，在HEK-293细胞中进行NF-κB报道分子测定法。NF-κB(一种调节几个细胞因子基因表达的转录因子)由几种TLR激活，包括仅结合ssRNA的人TLR即TLR7和TLR8。因此，我们用单独的Dotap或用miR-16、miR-21、miR-29a或miR-147的Dotap制剂处理表达人TLR7或TLR8的HEK-293细胞(此后，分别称为TLR7-HEK-293细胞和TLR8-HEK-293细胞)并进行NF-κB报道分子测定法。作为阳性对照，分别使用Gardiquimod和ssRNA40(TLR7和TLR8的特异性激动剂)。在TLR8-HEK-293细胞中，NF-κB仅被每种测试的miRNA(除miR-16之外)激活(图3E)。这些结果表明在人细胞中，miRNA诱导的NF-κB激活由TLR8介导并且不由TLR7介导。为证实这个结论，用编码显性阴性形式的TLR8(TLR8DN)的质粒转染TLR8-HEK-293细胞并用目的miRNA处理这些细胞。在TLR8DN细胞中，消除miR-21和miR-29a对NF-κB的激活(图3F)。另外，来自两位健康供体的表达TLR7和表达TLR8的人外周血单核细胞细胞(PBMC)还与单独的Dotap或miR-16、miR-21、miR-27b、miR-29a、miR-147、miR-574-5p或ssRNA40的Dotap制剂温育，并且进行TNF-α和IL-6的ELISA。除了用单独的Dotap处理和用Dotap-miR-16处理的PBMC之外，其他miRNA的每一者和ssRNA40均诱导TNF-α和IL-6的产生(图3G-3J)。另外，在人原发性肺肿瘤中，我们观察到miR-29a和巨噬细胞中的IL-6在肿瘤界面处共表达(图5)。有趣地，仅在肿瘤界面处miR-29a阳性巨噬细胞还是IL-6阳性的(图5)。
还观察到miR-21-和-29a诱导的TNF-α和IL-6分泌需要NF-κB途径激活，因为磷酰p65受miR-21和-29a诱导(但是不受miR-16诱导)，并且采用IκBα或Iκκ2显性负性质粒转染减少RAW264.7细胞中的TNF-α分泌(图6A和6B)。总体，数据显示外切体中由肺癌细胞分泌的miRNA可以与巨噬细胞中的TLR8在肿瘤界面处结合并诱导TLR8-介导的NF-κB激活和NF-κB介导的促炎细胞因子TNF-α和IL-6分泌。
还研究了miR-21和miR-29a的序列中哪种结构特征赋予激活TLR8的能力。观察到，不同于miR-16，miR-21和miR-29a均在核苷酸区域18-21中出现GU基序(对于miR-21，是GUUG，并且对于miR-29a，是GGUU)，并且GU基序在激活TLR的RNA33中占优势(图14A)。因此，一项实验通过将miR-21序列中的第18、20和18+20号碱基和miR-29a序列中的第20、21和20+21号碱基置换为miR-16的每种特定位置的相应碱基而破坏GU基序(图14B)。观察到对于miR-21和miR-29a二者而言，第20号碱基在调节TLR介导的NF-κB激活方面非常重要，其中miR-21第18号碱基中的G-U突变在TLR8-HEK-293细胞中显著增加miR-21激活TLR8(图6C)。总之，确定成熟miRNA序列中核苷酸的特定性质和位置参与TLR活化。
癌释放的外切体中的miRNA通过结合并激活周围免疫细胞中的TLR影响肿瘤生长和扩散。
LLC细胞不是肺转移的标准模型，但是代表炎症相关肺癌的熟知模型。已经展示宿主髓样细胞诱导的TNF-α分泌对于以LLC细胞注射的小鼠的肺中发病数的形成是重要的。因而，推断受肺癌分泌的miRNA刺激的免疫细胞诱导的细胞因子分泌可能参与LLC肺部发病数的形成。
从LLC细胞和A-549细胞的上清液纯化外切体并通过定量实时PCR对其评估miR-16、miR-21、miR-27b和-29a。LLC细胞释放最高水平的miR-16、miR-21和miR-29a(图7A)，证实这些细胞代表良好模型。LLC衍生的外切体(或作为对照的空培养基)与分离自WT小鼠或TLR7-/-小鼠的腹膜巨噬细胞共培养并且在外切体存在的情况下和相对于TLR7-/-小鼠在WT小鼠中观察到显著增加的TNF-α分泌和IL-6分泌(图4A和4B)。还将LLC衍生的外切体(或作为对照的空培养基)与分离自WT小鼠或TLR7-/-小鼠的脾细胞共培养，并且在外切体存在的情况下和相对于TLR7-/-小鼠在WT小鼠中观察到显著更高的CD69激活(图4C和4D)。最后，进行LLC上清液的超速离心并且将条件培养基或超速离心(并假定外切体耗尽)的培养基与WT小鼠腹膜巨噬细胞和脾细胞共培养，并且证实移除外切体显著地减少巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6和WT小鼠脾细胞激活CD69(图7B-7D)。
有趣地，在外切体存在的情况下，还在TLR7-/-小鼠中观察到一些TNF-α和IL-6分泌和CD69激活，显示这些小泡还携带能够激活细胞因子分泌和CD69激活的其他信号。还将LLC衍生的外切体(或作为阳性对照的ssRNA40)与WT TLR8-HEK-293细胞或与用巴弗洛霉素A(一种扰动内体功能的抗生素)预处理的TLR8-HEK-293细胞共培养，并且在巴弗洛霉素A存在的情况下观察到显著减少的NF-κB激活(P<0.0005)(图7E)。接下来，将LLC细胞注入WT小鼠和TLR7-/-小鼠的尾部并且评估动物的总体生存和尸体剖检后肺部发病数的数目。Kaplan-Meier曲线显示注射LLC的WT小鼠相对于TLR7-/-小鼠的总体生存显著较短(P<0.001)(图4E)。另外，在注射LLC的WT小鼠中，的肺肿瘤发病数显著地比注射LLC的TLR7-/-小鼠中更高(发病数的平均数目分别是13.8与3.8；P<0.05)(图4F和4G)。这些数据证实TLR7激活在肺癌发病数形成中的重要性。
最后，为了评估从肺癌外切体释放的miRNA在TLR7激活中和在转移过程中的作用，通过锁核酸(LNA)抗-miRNA抑制剂使LLC细胞中的miR-16表达和miR-21和miR-29a的合并表达沉默。在抗-miRNA转染后，源自这些细胞的外切体中被沉默的miRNA的水平减少(图7F)。将转染的细胞注入B6小鼠的尾静脉，并计数肺部发病数。用在其外切体不表达miR-21/29a的LLC细胞注射过的小鼠形成较少肺部发病数(图4H和4I)。还观察到用LLC细胞注射时，以GW4869(miRNA和外切体分泌的抑制剂)处理的WT小鼠产生显著较低的肺部发病数数目。在GW4869处理的小鼠中静脉内注射LLC衍生的外切体时，可以至少部分地拯救这种效应(图7G)。我们进一步研究在用抗乱序RNA LLC或抗-miR-21/29a LLC注射过的小鼠中哪种miRNA在癌细胞和相邻的正常肺组织中表达。在用抗乱序RNA LLC注射的小鼠形成的肺肿瘤中的癌细胞呈抗乱序寡核苷酸阳性。
有趣地，在用抗-miR-21/29a LLC细胞注射的小鼠中，定位于肺中的全部癌细胞均呈miR-29a表达阳性和抗-miR-29a寡核苷酸表达阴性(图8)。这些研究结果表明仅其中miR-29a没有被LNA抗-miR-21/29a转染成功沉默的LLC细胞能够定位到肺。
为了排除以下可能性：观察到的差异由不相关于其外切体释放的miRNA沉默作用引起，研究了miR-16和-21/29a沉默对LLC生物学的影响。当沉默miR-16或miR-21/29a时，没有观察到LLC生长曲线、细胞生存力、细胞周期、LLC侵袭力或LLC移行能力方面或体内异体移植小鼠模型中肿瘤生长方面的差异(图9)。结果显示外切体中由肿瘤细胞分泌的miR-21和miR-29a可以与TLR8(和TLR7)结合并且激活免疫细胞中的这些受体，导致TLR介导的NF-κB激活和转移前炎性细胞因子分泌。先前已经显示通过激活髓样细胞中的TLR2:TLR6复合物，胞外基质蛋白聚糖多功能蛋白聚糖的肿瘤分泌诱导促炎反应。本文中现在显示通过激活免疫细胞上的TLR8反应，肿瘤分泌的miRNA在促肿瘤炎症过程中发挥重要作用。作为结果，当这个旁分泌环完整时，肿瘤细胞倾向于产生更多的肺部发病数。虽然LLC细胞不是肺癌转移的标准模型，但是数据确定miRNA作为特定受体家族的激动剂的作用机制并且这种机制参与肿瘤微环境相互作用。
miR-21和miR-29a与TLR7和TLR8的结合诱导免疫细胞的活化(由CD69激活指示)并且这种作用不由结合于人TLR7介导。另外，在肺癌体内小鼠模型[用Lewis肺癌(LLC)细胞注射的小鼠]中，显示通过结合至TLR7，外切体中癌细胞分泌的miR-21和miR-29a偏好地转移到肺并且与其中这种机制受损的TLR敲除小鼠相比，减少总体生存。另外，影响癌细胞分泌外切体的药物显著地减少LLC细胞的转移潜能，并且可以通过用LLC细胞所分泌的外切体注射带瘤小鼠拯救这种影响。
本文的研究结果是miRNA充当能够以激素样方式结合并激活受体的配体，具有超出癌症范围之外的更广泛意义。例如，这些机制影响自身免疫疾病和炎性疾病。这由以下机制揭示：癌细胞与周围的免疫细胞交互作用并诱导它们释放增加肿瘤生长和扩散的细胞因子。本研究显示肿瘤微环境在癌生长和散布中的重要性并且为开发抗癌治疗提供分子靶。
方法
细胞培养物、转染和处理。
除非另外指明，否则全部细胞系均从美国典型培养物保藏中心购买。将人HEK-293细胞使用标准条件维持并在补充有10％(vol/vol)FBS的DMEM(Gibco)中培育。将人HEKBlue-TLR7和TLR8293细胞(Invivogen)(分别显示为TLR7-HEK-293或TLR8-HEK-293)在补充有10％(vol/vol)FBS、Normocin(50μg/ml)、杀稻瘟素(10μg/ml)和Zeocin(100μg/ml)(Invivogen)的DMEM中培养。
将人A-549和SK-MES和鼠LLC细胞在补充有10％(vol/vol)FBS的RPMI1640中维持。将RAW264.7细胞在补充有20％(vol/vol)FBS的DMEM中维持。使用脂质转染胺LTX和外加试剂(Invitrogen)遵循制造商的说明书，转染全部细胞。
对于全部实验，将细胞用与Dotap脂质体转染试剂(Roche)复合的15μg HPLC纯化的合成性miRNA(Integrated DNA Technologies)如先前所述那样处理。
对于采用巴弗洛霉素A的实验，将TLR8-HEK-293细胞以每孔200,000个细胞密度接种在24孔平板中。次日，将细胞与10nM巴弗洛霉素A(Sigma)预温育30分钟并且随后用从LLC细胞纯化的外切体在10nM巴弗洛霉素A存在或不存在时处理24小时。采集并收获细胞上清液，并进行QUANTI-Blue测定法。
外切体纯化。
在细胞处理后指示的时间点从提到的全部细胞采集无血清条件培养基。随后以14,000×g持续15分钟收获培养基以消除细胞残片。通过使用外切体沉淀溶液(ExoQuick；System Bioscience)遵循制造商的说明书，沉淀外切体。
免疫荧光
将HEK-293细胞在转染前24小时接种到60-mm平板上并允许生长到50％汇合度。随后将它们用1μg编码GFP-TLR8的质粒(Origene)转染。在48小时后，将细胞用如上文所述的与Cy-5荧光团缀合的所示成熟miRNA寡聚物处理，用PBS洗涤4次并且与1:25,000稀释于PBS中的Lyso示踪剂蓝色DND-22(Invitrogen)温育15分钟。
对于采用生理外切体的免疫荧光实验，将HEK-293细胞用1μg编码GFP-CD9的质粒(Origene)转染。在24小时后，使细胞脱离并且与事先以密度700,000个细胞/ml接种到40-mm盖玻片上并用蓝色细胞示踪剂(Invitrogen)染色的RAW264.7细胞共培养。在30分钟温育后，允许HEK-293细胞沉降，共培养物最终用1:25,000稀释于PBS中的Lyso示踪剂红色DND-99(Invitrogen)染色，并且用共聚焦显微镜分析这些盖玻片。
测定法
使用Trizol试剂(Invitrogen)并遵循制造商的说明书，一式六份加工细胞和从300μl SKMES和A-549条件培养基纯化的外切体用于RNA提取。通过Nanodrop测定法(Nanodrop分光光度计2000)估计RNA浓度和质量，并且使用100ng作为miRNA样品制备反应的输入。根据制造商的说明书进行全部样品制备(NanoStringTechnologies)。小RNA样品的制备涉及将特定的DNA标签连接到每种成熟miRNA的3'末端上。将设计成这些标签归一化miRNA的解链温度以及为样品中的每个miRNA种类提供独特标示。使用反向互补桥接寡核苷酸指导每种miRNA与其所指定标签连接，在多重连接反应中完成加标签。在连接反应后，移除过多的标签和桥接物，并且所产生的物质与一组miRNA:标签特异性捕获及条码化报道分子探针杂交。采用5μl5倍稀释的样品制备反应物，根据制造商的说明书进行杂交反应。全部杂交反应均在64℃温育最少18小时。遵循制造商的说明书使用Prep Station(NanoStringTechnologies)，纯化杂交的探针以除去过多捕获探针和报道分子探针并且将转录物特异性三元复合物固定在包被的链霉亲和素的块(cartridge)上。遵循制造商的说明书在数字式分析仪(NanoString Technologies)上实施数据采集以计数独立荧光条码并定量每份样品中存在的靶RNA分子。对于每个测定法，进行高密度扫描(600个视域)。为了分析，仅进一步考虑在两个细胞系中具有大量≥50的代码计数(2倍于25代码计数的平均阴性对照)的miRNA。选择图1A的阈值以消除背景噪声并确定所鉴定的miRNA的水平代表真实的外切体富集。一个通道中全部阴性对照探针计数的标准偏差的平均数及乘积可以是定义为该通道的背景。因此并且还如在NanoString表达数据分析指南中所推荐，我们如下操作：
1.对于每个通道，计算全部阴性对照计数的平均数。
2.对于每个通道，计算全部阴性对照计数的标准偏差。
3.将标准偏差的乘积添加该平均数。具体而言，在添加至平均数之前，标准偏差乘以2。
4.因而确定背景阈值。
5.为了将分析限于在外切体中真正过量表达的那些miRNA，通过由进一步加倍该背景阈值(如4中计算)，使用甚至更严格的阈值。这种计算产生阈值51.04，这修约到50。
定量实时PCR。
根据制造商的说明书，采用TaqMan微RNA分析试剂盒(AppliedBiosystems)，一式三份进行miRNA的定量实时PCR分析。RNU44(人样品)或snoRNA234(鼠样品)用来归一化针对从细胞提取的RNA的定量实时PCR。
总RNA浓度用来归一化在从外切体纯化的miRNA进行的定量实时PCR。
免疫共沉淀实验。
将TLR8-HEK-293细胞用所示的miRNA处理并在37℃温育20分钟。随后将它们用1.5ml冰冷的PBS充分洗涤，收集，并且通过在冰上与150μl多核糖体裂解缓冲液温育5分钟进行裂解。裂解物最终在干冰中冷冻1小时，并且随后以14,000g持续15分钟收获。将100μl每种裂解物添加至50μl A/G蛋白(Santa Cruz)，所述A/G蛋白事先与25μl NT2缓冲液5％BSA预温育1小时并且随后与100μl抗TLR8抗体在转动下在4℃预温育过夜。将裂解物进一步与珠(根据制造商的操作方案，用NT2缓冲液充分洗涤)(Mylteni)在终体积850μl的NT2缓冲液中温育，其中所述NT2缓冲液补充有1μl1M DTT和34μl0.5M EDTA。免疫沉淀在4℃转动下进行5小时。将珠用NT2缓冲液洗涤4次并且在55℃与100μl NT2缓冲液和蛋白酶K(Qiagen)温育30分钟，随后用Trizol提取RNA并加工用于实时分析，作为先前所报道。
如下进行TLR8的miRNA免疫沉淀。将TLR8-GFP-HEK-293细胞用5'-生物素酰化的成熟miR-16、miR-29或RNA40(15μg/ml终浓度)在37℃处理20分钟。先前所描述固定并裂解细胞，并且根据制造商的说明书，通过使用链霉亲和素缀合的磁珠(Miltenyi)进行免疫共沉淀。用抗-GFP抗体检测TLR8-GFP蛋白。
蛋白质印迹法。
将细胞在PBS中洗涤，刮取并收集在15ml管中，随后以1,500g持续10分钟收获。将沉淀物重悬于补充有蛋白酶抑制剂(Roche)的NP-40细胞裂解缓冲液(Invitrogen)中在4℃持续30分钟。最终以14,000g持续10分钟收获悬液并收集含有溶解的蛋白质的上清液。遵循制造商的说明书使用Bio-Rad蛋白质测定法(Bio-Rad)对蛋白质定量，并将30μg是每份样品加载于标准Tris-HCl4-20％预制凝胶(Bio-Rad)上，转移到PVDF膜上并用抗-GFP(Novus Biologicals)和抗-TLR8(SantaCruz)抗体探测。使用同种型匹配的辣根过氧化物酶缀合的第二抗体(GE Healthcare)，随后进行化学发光检测(Denville Scientific,Inc.)。另外，对于免疫印迹法，使用以下抗体：抗-CD9和抗-CD63(SantaCruz)，以及抗-磷酰p65(Cell Signaling)。先前已经公开了用于蛋白质/微RNA以及蛋白质/蛋白质共表达分析的LNA-ISH Our方案。简言之，使用5'加洋地黄甙标签的LNA探针(Exiqon)进行针对微RNA的原位杂交。在原位杂交后，我们使用来自Ventana Medical Systems的Benchmark LT自动化系统，根据制造商的说明书对CD9(1:200，抗原修复30分钟)、TLR7(1:250，抗原修复30分钟)和IL-6抗体(1:300，抗原修复30分钟)进行免疫组织化学。随后用Nuance系统(剑桥研究所)分析数据，所述Nuance系统分离不同生色原的基于比色的信号，将这些信号转换成基于荧光的信号，随后使用基于计算机的分析系统混合它们。
动物
WT B6小鼠、B6TLR7-/-小鼠和裸鼠从Jackson Laboratories购买。将年龄和性别匹配(7周龄雄性)的7只WT B6小鼠和7只TLR7-/-B6小鼠用1.8×106个LLC细胞在尾静脉注射并追踪存活。在死亡时或在注射后36日处死存活的小鼠时进行尸体剖检，并将肺转移的发病数照相和计数。
在每组六只7周龄雄性B6小鼠(总计n＝18)中采用抗-miRNA转染的LLC细胞实施体内实验。“LNA抗乱序RNA”指用下述LLC细胞注射的鼠，其中所述LLC细胞以作为对照使用的LNA抗乱序RNA转染；“LNA抗-miR-16”指用下述LLC细胞注射的鼠，其中所述LLC细胞以LNA抗-miR-16转染；“LNA抗-miR-21/29a”指用下述LLC细胞注射的鼠，其中所述LLC细胞以LNA抗-miR-21和LNA抗-miR-29a转染。将小鼠用1.8×106个LLC细胞在尾静脉注射并且15日后处死。进行尸体剖检，并将肺部发病数照相和计数。
在15只雄性7周龄B6小鼠中采用LLC细胞实施体内拯救实验。将小鼠用1.8×106个LLC细胞在尾静脉中以300μL体积(T0)注射。在4日(T4)后，对10小鼠启动GW4869(1.25mgkg-1d-1)(一种还能够减少分泌的外切体中miRNA含量的外切体分泌抑制剂)腹内注射，并且对5只小鼠启动DMSO(GW4869的溶剂)腹内注射作为对照，每日一次连续5日。在第一次注射GW4869后1周(T11)，将GW4869处理的小鼠中5只小鼠的尾部用1mL从WT LLC上清液外纯化的切体注射。3日后，相同的小鼠稍后接受LLC衍生外切体的第二次注射(T14)。将全部小鼠在T18处死，进行尸体剖检，并计数肺部发病数。
还将用上述抗-miRNA转染的LLC细胞皮下注射至9只裸鼠的左侧腹部(8×106个细胞/小鼠，每种条件三只小鼠)，并后续3周监测肿瘤生长。一周一次使用数字式卡尺评估肿瘤尺寸。通过测量肿瘤的长度(l)和宽度(w)并计算出体积(V＝lw2/2)，确定肿瘤体积。
这项研究中使用的全部方法均符合联邦指南和俄亥俄州立大学动物管理与使用委员会的制度政策。
原代人细胞和鼠细胞的分离。
通过收获脾和制备单细胞悬液制备源自WT和TLR7-/-年龄匹配和性别匹配小鼠的总脾细胞。使用红细胞裂解缓冲液(eBioscience)通过渗透性裂解消除红细胞。将总脾细胞接种在96孔板中(每孔200μL培养基中1×106个细胞)并且随后用合成性miRNA或用纯化的外切体刺激18小时。将细胞用藻红蛋白缀合的抗-CD69(BioLegend)抗体染色并使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)分析。
从WT和TLR7-/-年龄匹配和性别匹配小鼠分离源自腹腔的巨噬细胞。
通过Ficoll-Paque(Pharmacia)离心(500×g)遵循制造商的说明书，将PBMC从健康供体的肝素化血液分离并立即铺种用于刺激。人PBMC或鼠腹膜巨噬细胞(300,000个细胞)用合成性miRNA刺激24小时；随后使用多重分析物ELISArray试剂盒(SABiosciences)遵循制造商的说明书，对条件培养基进行的TNF-α和IL-6的ELISA。
生长曲线、细胞生存力和细胞周期。
为确定生长曲线，将细胞以密度10,000个细胞/ml接种在48孔平板中。在24、48和72小时后，收集细胞并用血球计(Beckman Coulter)计数。遵循制造商的说明书，用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓(MTS)-Cell Titer96Aqueous One Solution细胞增殖测定法，(Promega)检验细胞生存力。通过向每个孔添加20μl MTS检出代谢活跃的细胞。在1小时温育后，在多标记计数器(Bio-Rad Laboratories)中分析平板。通过碘化丙啶染色(PBS中的50μg/ml在)在甲醇中固定的细胞随后流式细胞分析(FACScan Becton-Dickinson)，进行细胞周期分析。
细胞移行和侵入。
通过使用transwell移行室(Corning)评估细胞穿过3D-胞外基质移行和侵入。简而言之，对于移行，将transwell在室温用PBS1％BSA饱和1小时。将LNA-转染的细胞接种在transwell上室中并在37℃温育6小时或24小时。下室用无血清培养基或补充有10％FBS的血清填充，如所示。在24小时或6小时后，将滤器洗涤、固定并用考马斯亮兰(Sigma-Aldrich Corp.)染色。在显微镜下计数已经侵入到滤器下半表面的细胞。对于侵入实验，将transwell在4℃用80μg/ml基质胶(Becton Dickinson)包被过夜并且随后在室温用PBS1％BSA饱和2小时。随后将LNA转染的细胞如上文所述的加工并允许侵入基质直至24小时。
NF-κB活性测定法。
通过QUANTI-Blue测定法(Invivogen)评估NF-κB活性。HEK-Blue-TLR7活性和TLR8293细胞允许验证刺激相应TLR后NF-κB的激活。通过将TLR7和TLR8基因和与5个NF-κB和AP-1结合位点融合的IFN-α最小启动子控制下的优化分泌型胚碱性磷酸酶报道基因(SEAP)共转染至HEK-293细胞中，获得这两个细胞系。用TLR7或TLR8配体激刺激活了NF-κB和AP-1，这引起SEAP产生。可以采用QUANTI-Blue(一种在碱性磷酸酶存在的下变成紫色/蓝色的检测培养基)容易地确定SEAP的水平。以14,000g持续15分钟消除残片，收获从处理的TLR7-HEK-293和TLR8-HEK-293细胞衍生的上清液；随后转移20μl至96孔板中并添加至180μl QUANTI-Blue溶液(Invivogen)。随后将平板在37℃温育1-3小时并且通过用分光光度计在620-655nm读取平板确定SEAP水平(SpectraMax，MolecularDevices)。
数据的统计分析。
除非另外说明，统计数据展示为均值±SD。通过斯氏t检验或通过ANOVA检验伴以Bonferroni校正，计算显著性。使用SPSS统计软件(IBM)，采用对数秩(Mantel-Cox)方法计算Kaplan-Meier存活曲线。
对于LNA-ISH分析，通过使用InStat软件计算平均值和SD，并且借助InStat通过斯氏t检验确定显著性。
虽然已经参照各种实施方案描述本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明实质范围的情况下，可以做出各种变化并且可以用等同物替换其要素。此外，可以作出许多修改以使特定情形或材料适应于本发明的教授内容而不脱离其实质范围。因此，本发明不意在限于本文中公开的为实施本发明所构思的具体实施方案，本发明反而将包括落入权利要求范围内的全部实施方案。

Claims (66)

1.抑制至少一种癌细胞转移的方法，包括减少至少一种癌细胞中miR-21和/或miR-29a的水平并抑制转移。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过选自基因治疗、小分子或生物制品的手段减少miR-21和/或miR-29a。
3.根据权利要求1所述的方法，其中通过施用反义miR-21和/或反义miR-29a减少miR-21和/或miR-29a。
4.根据权利要求1所述的方法，其中通过施用至少一种外切体抑制剂减少miR-21和/或miR29a。
5.根据权利要求1所述的方法，其中通过施用锁核酸抗miR-21抑制剂和/或锁核酸抗miR-29a抑制剂减少miR-21和/或miR-29a。
6.抑制至少一种癌细胞的TLR介导转移前反应的方法，包括减少至少一种表达TLR的癌细胞中miR-21和/或miR-29a的水平并抑制TLR介导的转移前反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其中通过选自基因治疗、小分子或生物制品的手段减少miR-21和/或miR-29a。
8.根据权利要求6所述的方法，其中通过施用反义miR-21和/或反义miR-29a减少miR-21和/或miR-29a。
9.根据权利要求6所述的方法，其中通过施用至少一种外切体抑制剂减少miR-21和/或miR29a。
10.根据权利要求6所述的方法，其中通过施用锁核酸抗miR-21抑制剂和/或锁核酸抗miR-29a抑制剂减少miR-21和/或miR-29a。
11.根据权利要求6所述的方法，其中表达的TLR是TLR7或TLR8。
12.抑制至少一种癌细胞的肿瘤生长的方法，包括减少至少一种癌细胞中miR-21和/或miR-29a的水平并抑制肿瘤生长。
13.根据权利要求12所述的方法，其中通过选自基因治疗、小分子或生物制品的手段减少miR-21和/或miR-29a。
14.根据权利要求12所述的方法，其中通过施用反义miR-21和/或反义miR-29a减少miR-21和/或miR-29a。
15.根据权利要求12所述的方法，其中通过施用至少一种外切体抑制剂减少miR-21和/或miR29a。
16.根据权利要求12所述的方法，其中通过施用锁核酸抗miR-21抑制剂和/或锁核酸抗miR-29a抑制剂减少miR-21和/或miR-29a。
17.抑制至少一种表达miR-21和miR-29a的癌细胞中toll样受体的miR-21和miR-29a激动作用的方法，包括减少至少一种表达miR-21和miR-29a的癌细胞中miR-21和/或miR-29a的水平并抑制toll样受体的miR-21和miR-29a激动作用。
18.根据权利要求17所述的方法，其中通过选自基因治疗、小分子或生物制品的手段减少miR-21和/或miR-29a。
19.根据权利要求17所述的方法，其中通过施用反义miR-21和/或反义miR-29a减少miR-21和/或miR-29a。
20.根据权利要求17所述的方法，其中通过施用至少一种外切体抑制剂减少miR-21和/或miR29a。
21.根据权利要求17所述的方法，其中通过施用锁核酸抗miR-21抑制剂和/或锁核酸抗miR-29a抑制剂减少miR-21和/或miR-29a。
22.抑制至少一种癌细胞转移的方法，包括减少至少一种癌细胞中miR-21和/或miR-29a的水平。
23.根据权利要求22所述的方法，其中通过选自基因治疗、小分子或生物制品的手段减少miR-21和/或miR-29a。
24.根据权利要求22所述的方法，其中通过施用反义miR-21和/或反义miR-29a减少miR-21和/或miR-29a。
25.根据权利要求22所述的方法，其中通过施用至少一种外切体抑制剂减少miR-21和/或miR29a。
26.根据权利要求22所述的方法，其中通过施用锁核酸抗miR-21抑制剂和/或锁核酸抗miR-29a抑制剂减少miR-21和/或miR-29a。
27.一种组合物，其包含在至少一种可药用载体或赋形剂中的至少一种锁核酸抗-21抑制剂和至少一种锁核酸抗-29a抑制剂。
28.根据权利要求27所述的组合物，还包含其它化疗化合物。
29.一种缓解癌症受试者中癌转移的方法，包括施用根据权利要求27所述的组合物至癌症受试者。
30.一种增加癌症受试者中总体生存的方法，包括施用根据权利要求27所述的组合物至癌症受试者。
31.一种减少癌症受试者中肿瘤发病数的方法，包括施用根据权利要求27所述的组合物至癌症受试者。
32.抑制至少一种癌细胞的炎症标志物表达的方法，包括减少至少一种癌细胞中miR-21和/或miR-29a的水平。
33.根据权利要求32所述的方法，其中通过选自基因治疗、小分子或生物制品的手段减少miR-21和/或miR-29a。
34.根据权利要求32所述的方法，其中通过施用反义miR-21和/或反义miR-29a减少miR-21和/或miR-29a。
35.根据权利要求32所述的方法，其中通过施用至少一种外切体抑制剂减少miR-21和/或miR29a。
36.根据权利要求32所述的方法，其中通过施用锁核酸抗miR-21抑制剂和/或锁核酸抗miR-29a抑制剂减少miR-21和/或miR-29a。
37.抑制至少一种癌细胞的肺肿瘤发病数的方法，包括减少至少一种肺癌细胞中miR-21和/或miR-29a的水平。
38.根据权利要求37所述的方法，其中通过选自基因治疗、小分子或生物制品的手段减少miR-21和/或miR-29a。
39.根据权利要求37所述的方法，其中通过施用反义miR-21和/或反义miR-29a减少miR-21和/或miR-29a。
40.根据权利要求37所述的方法，其中通过施用至少一种外切体抑制剂减少miR-21和/或miR29a。
41.根据权利要求37所述的方法，其中通过施用锁核酸抗miR-21抑制剂和/或锁核酸抗miR-29a抑制剂减少miR-21和/或miR-29a。
42.一种诊断受试者中癌转移风险的方法，包括：
a.鉴定与对照相比相对的miR-21和miR-29a表达，
b.如果与对照相比，受试者具有增加的miR-21和miR-29a表达，则在受试者中诊断增加的癌转移风险，或
c.如果与对照相比，受试者不具有增加的miR-21和miR-29a表达，则在受试者中诊断没有增加的癌转移风险。
43.根据权利要求42所述的方法，还包括基于诊断设计治疗计划。
44.根据权利要求42所述的方法，还包括基于诊断实施治疗。
45.根据权利要求42所述的方法，还包括当诊断肺癌转移时施用至少一种反义miR-21和/或反义miR-29a。
46.根据权利要求42所述的方法，还包括基于诊断确定预后。
47.根据权利要求42所述的方法，还包括：
a.逆转录来自测试样品的miR-21RNA和miR-29a RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，所述测试样品从受试者获得；
b.将靶寡脱氧核苷酸与包含miR-21特异性和miR-29a特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交谱；并且
c.将步骤(b)的谱与对照比较。
48.根据权利要求47所述的方法，其中步骤c)包括将测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱比较。
49.根据权利要求47所述的方法，其中步骤c)包括将测试样品杂交谱与样品相关的miR水平数据库、统计结果或表格比较。
50.根据权利要求47所述的方法，其中微阵列中包含至少一种其它miR。
51.一种诊断受试者中炎症反应风险的方法，包括：
a.鉴定与对照相比相对的miR-21和miR-29a表达，
b.如果与对照相比，受试者具有增加的miR-21和miR-29a表达，则在受试者中诊断增加的炎症反应风险，或
c.如果与对照相比，受试者不具有增加的miR-21和miR-29a表达，则在受试者中诊断没有增加的炎症反应风险。
52.根据权利要求51所述的方法，其中炎症反应是转移前炎症反应。
53.根据权利要求51所述的方法，还包括基于诊断设计治疗计划。
54.根据权利要求51所述的方法，还包括基于诊断实施治疗。
55.根据权利要求51所述的方法，还包括当诊断癌转移时施用至少一种反义miR-21和/或反义miR-29a。
56.根据权利要求51所述的方法，还包括基于诊断确定预后。
57.根据权利要求51所述的方法，包括：
逆转录来自测试样品的miR-21RNA和miR-29a RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，所述测试样品从受试者获得；
将靶寡脱氧核苷酸与包含miR-21特异性和miR-29a特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交谱；并且
将杂交步骤的谱与对照比较。
58.根据权利要求57所述的方法，其中比较步骤包括：将测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱比较。
59.根据权利要求57所述的方法，其中比较步骤包括：将测试样品杂交谱与样品相关的miR水平数据库、统计结果或表格比较。
60.根据权利要求57所述的方法，其中微阵列中包含至少一种其它miR。
61.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中癌症是选自以下的肺癌：Lewis肺癌；鳞状细胞癌；非小细胞肺癌；小细胞肺癌。
62.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中癌症是选自以下的腺癌：肺泡基底上皮腺癌；肺腺癌；结肠腺癌；子宫颈腺癌、前列腺癌；乳腺癌；食道腺癌、胰腺癌；和胃腺癌。
63.一种治疗耐化疗癌症的方法，包括：施用抗miR-29a至有需求的受试者。
64.一种治疗受试者中癌症的方法，包括(a)从受试者获得含有外切体的体液样品，(b)从体液样品分离外切体，(c)检测(b)的外切体中的一种或多种生物标记，其中一种或多种生物标记包括miR-29a和miR-21，并且(c)如果检测到外切体中升高的miR-29a水平和miR-21水平，则用反义miR-29a/miR-21治疗受试者。
65.一种用于辅助诊断或监测受试者中癌症进展或消退的方法，包括(a)从有需要的受试者获得含有外切体的体液样品，(b)从体液样品分离外切体，(c)检测(b)的外切体中的一种或多种生物标记，其中一种或多种生物标记包括miR-29a和miR-21并且其中检测到外切体中的生物标记与受试者中的癌症相关，因而辅助诊断或监测癌症的进展或消退。
66.根据权利要求65所述的方法，其中一种或多种生物标记可以由生物途径中所述生物标记上游或下游存在的分子或分子的可度量片段替换。
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