CN101951926A - 包含微小rna-21抑制剂的增强辐射敏感性的组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了增强辐射敏感性的组合物，其中微小RNA-21抑制剂充当活性成分。所述微小RNA-21抑制剂是互补地结合到微小RNA-21的反义核酸分子。所述组合物可以结合照射给予患者。所述抑制剂可以充当辐射敏化剂，增强这种照射对微小RNA-21表达水平高的癌症，特别是神经胶质瘤的治疗效果。

Description

包含微小RNA-21抑制剂的增强辐射敏感性的组合物
技术领域
本发明涉及增强辐射敏感性的组合物。更具体而言，本发明涉及包含微小RNA-21抑制剂的增强辐射敏感性的组合物，所述微小RNA-21抑制剂通过与微小RNA-21互补结合来抑制微小RNA-21活性。还有，本发明涉及增强微小RNA-21表达水平高的癌症、特别是神经胶质瘤的辐射敏感性的方法。
背景技术
通常，在癌症的治疗中，单独或联合使用手术、放射治疗和化学治疗。在这些癌症治疗中，放射治疗广泛使用于每年渐增数目的癌症患者。
放射治疗现在对于各种癌症的治疗是必需的，但是癌症细胞的辐射抗性和由高剂量辐射引起的对正常组织的损害是放射治疗效率较低的主要原因。为了增加放射治疗的效率，已经对增强辐射敏感性的药物(下文称为“辐射敏感性增强剂”)进行了研究。迄今开发的大部分辐射敏感性增强剂是抗癌剂，诸如紫杉醇、顺铂等。
还有，替拉扎明(tirapazamine)已知为辐射敏感性增强剂，其没有抗癌活性，但已知其仅对含氧量低的肿瘤细胞起作用。进一步，由于含氧量低的肿瘤特有的内部压力，其无法被有效地输送到肿瘤组织之内，这导致放射治疗效率低下。
然而，结合放射治疗，增强辐射敏感性的抗癌剂被有限地使用，这是因为它们引起副作用，即，辐射治疗区域周围的炎症、消化道问题、恶心、呕吐、腹泻等。
一般而言，中枢神经系统癌症从不同的细胞谱系发生，包括神经胶质，诸如星形胶质细胞和少突胶质细胞。根据与邻近微环境的相互作用，星形细胞瘤(星形细胞肿瘤)可以分为弥散型和局限型。局限星形细胞瘤的生长对周围区域侵袭的潜能有限并且边界清楚，而弥散性星形细胞瘤显示肿瘤周边并且侵袭到原发病灶远端的细胞——与肿瘤分级无关。按WHO(世界卫生组织)分类，弥散性星形细胞瘤按恶性渐增的顺序可以分类为低度弥散性星形细胞瘤(II级)、多形性成胶质细胞瘤(III级)和多形性恶性胶质瘤(IV级；GBM)。所有这些三级弥散性星形细胞瘤均是侵袭性的。特别是，GBM在增殖、坏疽和缺氧、血管生成、对脑支撑结构的入侵，以及复发率和转移方面比其它星形细胞瘤恶性程度更高。因此，进行了各种尝试以增强治疗这些癌症的效率。然而，单独的化学治疗不足以治疗星形细胞瘤。在于癌症细胞变得对辐射有抗性方面，放射治疗也存在问题。
另外，连同手术和用抗癌剂治疗一起，如上所述，放射治疗是针对脑肿瘤最广泛使用的疗法之一。然而，不论手术、化学治疗、放射治疗或这些治疗的组合(例如放射治疗和化学治疗，或手术和放射治疗)，WHO-IV级GBM都显示预后差(复发)，存活时间中值小于约一年和五年存活率小于5％。在脑肿瘤的治疗中，放射治疗通过破坏细胞的DNA来起作用，从而抑制细胞周期(DNA损伤检查点)或诱导凋亡来去除不正常的细胞。然而，放射治疗的问题是癌症细胞对辐射的固有抗性和辐射抗性的增加，这可以导致癌症的复发。进一步，抗辐射的癌症细胞变得对抗癌剂有抗性。
因此，对于辐射敏感性增强剂存在迫切的需求，所述辐射敏感性增强剂使固有辐射抗性的癌症细胞对辐射敏感以及以最少的副作用使放射治疗最优化。
微小RNA——其为在各种癌症中发现的小的调节RNA分子——现在作为癌症治疗的新目标被提出。微小RNA通过降解或翻译抑制负向调节它们的目标mRNA，从而起肿瘤抑制或致癌基因的作用。最近的研究已经报道，微小RNA let-7为增强细胞毒性抗癌治疗的重要工具，这是由于其改变辐射应答的能力。在该背景下，本发明人已经研究了辐射敏感性增强剂的发展，强调微小RNA在转录后调节机制中起重要作用。
据报道，微小RNA-21在几乎所有患者的GBM样品中显示高表达水平并且在各种癌症中被过量表达。该报道表明，微小RNA-21充当各种癌症的致癌基因。另外，微小RNA-21被报道与乳腺癌细胞系、结肠直肠癌细胞系和其它癌细胞系中的细胞凋亡、细胞增殖和细胞迁移的调节有关。然而，迄今为止，在现有技术中，既没有报道微小RNA-21过量表达和辐射抗性之间的关系，也没有报道微小RNA-21增强辐射敏感性。
导入本发明，本发明人对辐射敏感性增强剂进行深入和透彻的研究，结果发现，微小RNA-21的表达水平与辐射抗性密切相关以及微小RNA-21抑制剂有效地增强癌症细胞对辐射的敏感性。
发明内容
【技术问题】
因此，本发明的一个目的是提供增强辐射敏感性的组合物，其包含微小RNA-21抑制剂。
本发明的另一个目的是提供增强癌症辐射敏感性的方法，所述癌症具有高的微小RNA-21表达水平。
本发明的一个进一步的目的是提供放射治疗，其包含结合照射给予所述组合物。
【技术方案】
依照其一个方面，本发明涉及增强对辐射的敏感性的组合物，其包含微小RNA-21抑制剂。
如本文所用，术语“微小RNA-21抑制剂”拟指降低微小RNA-21的细胞内表达或活性的药剂。更详细地，所述药剂直接作用于微小RNA-21或间接作用于微小RNA-21的上调物，以在转录水平降低微小RNA-21的表达、促进表达的微小RNA-21的降解或破坏微小RNA-21的活性，从而减少微小RNA-21的表达水平或活性。
通常，微小RNA由染色体上的内含子编码并且转录为初级转录物，所述初级转录物然后在细胞核中被Drosha加工成较短的结构，其称为前体微小RNA(前miRNA)。在核输出蛋白的调节下核输出之后，这些前miRNA在细胞质中通过与Dicer相互作用被进一步加工成成熟的、约22bp长的miRNA，所述Dicer与进行基因沉默功能的RNA干扰沉默复合体(RISC)相关(Nat Rev Mol Cell Biol 6，376-385；2005)。以降低微小RNA-21的表达水平或抑制活性为功能，根据本发明的微小RNA-21抑制剂对微小RNA-21调节的途径具有明显的影响。
只要其对微小RNA-21显示抑制活性，任意药剂在本发明中均可用作微小RNA-21抑制剂，而没有限制。通常有用的是生物分子、化合物或植物或动物的分离物，它们可以使用本领域中周知的标准技术应用于细胞，诸如核酸或多肽。用于本发明的微小RNA-21抑制剂的实例包括与微小RNA-21碱基序列互补的反义核酸分子、以及微小RNA-21-特异性siRNA、RNA适配子、和对与微小RNA-21互补的反义核酸分子具有较高偏好的核酶。
如本文所用，术语“互补”拟指具有两种不同的核苷酸序列的相应碱基彼此配对的能力，即，在其间形成Watson-Crick碱基配对。
与微小RNA-21碱基序列互补的反义核酸分子互补地结合于细胞中微小RNA-21的单链片段，以降低微小RNA-21的加工效率，从而抑制微小RNA-21的表达以及抑制微小RNA-21的活性。用于本发明的微小RNA-21分子可以以单链或双链的形式存在。成熟的微小RNA分子主要是呈单链形式，而前体微小RNA是部分自互补的，以形成双链结构(例如，茎环结构)。本发明的反义核酸分子可以与前体微小RNA的单链片段互补或与成熟的微小RNA分子互补。本发明的微小RNA-21抑制剂针对的微小RNA-21的核苷酸序列可通过参考美国国立卫生研究院(NIH)的数据库GenBank和参考miRBASE(http://microRNA.sanger.ac.uk/)公开地获得，例如，人微小RNA-21(miRBASE(http://microRNA.sanger.ac.uk/)ID：hsa-mir-21(前体形式的登录号MI0000077(ID：hsa-mir-21)和成熟形式的登录号MIMAT0000076(ID：hsa-miR-21，SEQ IDNO.2)))。
作为通过RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-PNA(肽核酸)相互作用结合于微小RNA-21以调节微小RNA-21的活性的非酶核酸化合物，本发明的反义核酸分子可以与微小RNA-21互补，以便它们的一个连续序列结合于微小RNA-21碱基序列或它们可以部分自互补以形成结合于环状微小RNA-21的环结构。
还有，互补地结合于根据本发明的微小RNA-21的反义核酸分子优选抗寡核苷酸(反寡核苷酸，anti-oligonucleotides)的形式，其在导入细胞中时可以抑制微小RNA-21的表达、显示对内源性核酸酶诸如核酸外切酶和核酸内切酶的抗性，以及在细胞内被选择性地修饰成稳定形式。
在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”拟指由天然存在的糖、核碱基和糖间键组成的核苷酸单体低聚物或聚合物，以及拟指具有起类似作用的非天然存在部分的修饰的或取代的核苷酸低聚物。由于期望的性质诸如，例如，增强的细胞吸收和在核酸酶存在情况下增强的稳定性，这些取代的低聚物相对于天然形式通常是优选的，以及可以以本领域中周知的方式进行选择。寡核苷酸可以全部或部分被取代。另外，本发明的抗寡核苷酸可以包括修饰的低聚物模拟物诸如肽核酸(PNA)和锁定核酸(LNA)，以增加寡核苷酸对其目标的亲和力以及给目标序列提供错配耐受性。
还有，用于本发明的抗寡核苷酸的实例包括天然寡核苷酸、硫代磷酸寡脱氧核糖核苷酸、二硫代磷酸寡脱氧核糖核苷酸、甲基磷酸寡脱氧核糖核苷酸、氨基磷酸寡脱氧核糖核苷酸、H-磷酸寡脱氧核糖核苷酸、寡脱氧核糖核苷酸三酯、α-异头寡脱氧核糖核苷酸、肽核酸以及修饰的寡核苷酸，包括人造核酸和核酸-修饰的化合物，但不限于这些。
另外，本发明的抗寡核苷酸与微小RNA-21的单链碱基序列互补以及可以包括双链或单链DNA、双链或单链RNA、DNA/RNA杂合物、DNA和RNA类似物，以及具有碱基、糖或骨架修饰的寡核苷酸。本发明的寡核苷酸可以以这样的方式使用周知的技术修饰，所述方式为在核酸酶存在的情况下增加稳定性和抗性。如在本领域中所已知的，修饰可以见于寡核苷酸骨架、糖部分或碱基中，但不限于这些。在核糖核苷酸中的修饰一般在核糖部分的2′位，所述核糖部分带有包含1-6个饱和或不饱和碳原子的-O-低碳烷基、或带有具有2-6个碳原子的-O-芳基或烯丙基，其中这些-O-烷基、芳基或烯丙基可以被例如氨基或卤基团(例如，卤基、羟基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或氨基)取代或未被取代。作为说明性和非限制性的实例，本发明的寡核苷酸在3’和5’末端区之一或两者处具有至少四个或五个连续的2’-O-烷基化核糖核苷酸。2’-O-烷基化基团的实例包括2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-O-丙基和2′-O-丁基，但不限于这些。
与根据本发明的微小RNA-21的碱基序列互补的反义核酸分子可以使用例如化学合成或重组的标准分子生物学技术分离或制备，或者可以商业获得。本发明的抗寡核苷酸长度优选15至40nt以及更优选由SEQ ID NO.1的碱基序列组成。
另一方面，与微小RNA-21碱基序列互补的本发明的反义核酸分子可以以表达载体的形式提供，以便输送进入细胞。
可以使用各种转染技术将本发明的反义核酸分子导入细胞中，所述转染技术包括DEAE-葡聚糖、核蛋白或脂质体-介导的DNA转染。就这一点而言，反义核酸分子可以锚定在运载体上，所述运载体允许将其有效输送进入细胞中。优选地，运载体是载体——不论是病毒或非病毒。用于本发明的病毒载体的实例包括源自慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒和禽痘病毒的载体，优选慢病毒，但不限于这些。慢病毒——一种逆转录病毒——可以有效地感染分裂细胞和非分裂细胞，这是因为其预整合复合物(病毒“壳”)可以穿过核孔或目标细胞的完整核膜。
本发明的反义核酸分子导入细胞引起癌症细胞辐射敏感性增强。在本上下文中，术语“导入”拟含义是将外源DNA通过转染或转导输送进入细胞。转染可以使用本领域中周知的各种方法实施，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、聚凝胺(polybrene)-介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染胺试剂转染和原生质体融合。转导指外源DNA在感染的基础上经由病毒或病毒载体颗粒转移到另一个细胞的过程。
用于本发明的微小RNA-21抑制剂包括微小RNA-21-特异性siRNA、RNA适配子和核酶。
在本发明中，用作微小RNA-21抑制剂的siRNA含义是特异性地剪切微小RNA-21分子以诱导RNA干扰(RNAi)的双链体RNA。优选地，本发明的siRNA具有由有义RNA链和反义RNA链组成的核苷酸序列，所述有义RNA链全部或部分与微小RNA-21核酸序列同源以及所述反义RNA链与其互补，其在细胞中与微小RNA-21杂交。
作为微小RNA-21抑制剂用于本发明的RNA适配子指可以采用特异性三维构象的核酸配体，所述三维构象适于结合于微小RNA-21以与其形成复合体，在其上显示拮抗效应。适配子通常可以是长度为15～50ny的短核酸分子，其被折叠成预先确定的二级或三级结构，例如，茎环结构。优选地，适配子以小于10-6、10-8、10-10或10-12的kd结合到目标分子。适配子对目标分子的特异性可以非常高。进一步，适配子可以由许多核糖核苷酸单元、脱氧核糖核苷酸单元或两种核苷酸单元的混合物组成。还有，适配子可以进一步包含一个或更多个修饰的碱基、糖或磷酸酯骨架单位。
核酶—作为微小RNA-21抑制剂用于本发明——是催化分子内或分子间化学反应的RNA分子。不仅是在天然系统中发现的基于核酶的核酸酶，而且不同种类的核酶也用于本发明中，所述不同种类的核酶类似于核酸聚合酶进行催化，诸如锤头状核酶、发夹型核酶和四膜虫核酶。进一步，虽然在天然系统中没有发现，但被改造来催化细胞中特定反应的核酶也可以使用。核酶可以剪切RNA或DNA底物，以及优选RNA底物。通常，核酶识别目标底物，结合到目标底物以及然后剪切目标底物。识别是基于其间的碱基配对相互作用，以允许目标特异性剪切。
如本文所用，术语“辐射敏感性增强”拟指使细胞对辐射更敏感，从而增强放射治疗的疗效。具体而言，当应用于癌症细胞的放射治疗时，辐射敏感性增强剂确保癌症细胞死亡增加和癌症细胞生长抑制增加。
由于通过，例如，减少细胞中微小RNA-21的表达水平显示对微小RNA-21抑制活性，本发明的微小RNA-21抑制剂降低细胞对辐射的抗性，即，增强细胞对辐射的敏感性。包含根据本发明的微小RNA-21抑制剂的增强辐射敏感性的组合物可以靶向于可应用放射治疗的任意细胞，以及优选用于癌症细胞辐射敏感性的增强。
自然地，根据本发明增强辐射敏感性的组合物可以应用于由于表达微小RNA-21而辐射抗性增加的所有癌症细胞。其可以应用于具有高微小RNA-21表达水平的癌症细胞的基因治疗，所述癌症优选包括神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、子宫癌、胃癌和慢性淋巴细胞白血病，以及更优选神经胶质瘤，但不限于这些。
另外，包含根据本发明的微小RNA-21抑制剂的组合物可以通过细胞周期调控而增加辐射敏感性。
由于具有将细胞阻滞在G2/M期的细胞周期调控活性，本发明的微小RNA-21抑制剂可以使细胞对辐射更敏感。真核细胞通过细胞周期增殖，所述细胞周期由四个不同时期组成：G1期、S期(DNA合成)、G2期和M期(有丝分裂)。间期中的第一期——从之前的M期结束直至DNA合成的开始——称为G1期。在G1期中——其比其它期长，细胞显示最高的代谢活性。响应于外部信号，正常细胞从G1期进展到S期以及然后G2期，接着进行有丝分裂和细胞分裂。在不存在外部信号的情况下，正常细胞进入称为G0期的静止状态，其为细胞已经离开周期和停止分裂的静止期。相反，癌症细胞按照与外部信号无关的细胞周期持续增殖，不断进行DNA合成和有丝分裂。细胞周期的调控因此导致癌症细胞生长的抑制。由于其阻滞细胞周期的能力，本发明的微小RNA-21抑制剂可以显著地增强由辐射提供的细胞阻滞效应。
在本发明的实施方式中，微小RNA-21表达和辐射抗性之间的关系通过分析抗辐射细胞系中微小RNA-21的表达水平进行检查，所述抗辐射细胞系诸如源自U251细胞系的RRC7、包括U373和U87的GBM细胞系以及LN18。与亲代细胞系U251相比，观察到RRC7微小RNA-21表达水平增加至1.6倍。对于GBM，U373和U87中微小RNA-21的表达水平被测定为正常细胞星形胶质细胞的4.7倍以及2倍。相反，LN-18细胞系的微小RNA-21水平与星形胶质细胞相比降低为0.3倍(图1)。
另一方面，微小RNA-21表达水平与辐射抗性的相关性通过克隆形成试验利用测定抗辐射细胞系RRC7、U373、U87和LN18的辐射抗性进行证明。在本上下文中，对具有高微小RNA-21表达水平的癌症细胞系，诸如乳腺癌细胞系、肺癌细胞系和子宫癌细胞系分析辐射抗性。RRC7被发现对辐射的抗性比亲代细胞系大，如克隆形成试验所测定。另外观察到，微小RNA-21表达水平均高的GBM细胞系U373和U87对辐射显示高抗性，而测得低水平表达微小RNA-21的成胶质细胞瘤LN18为低辐射抗性，这暗示微小RNA-21的表达与辐射抗性相关(图2)。
进一步，为了检测微小RNA-21的过量表达能否调控细胞周期，在用抗微小RNA-21抑制内在微小RNA-21功能下，将U373细胞系暴露于辐射。发现抗微小RNA-21-处理组与对照组相比对辐射的G2/M期细胞阻滞增强，其中抗微小RNA阴性对照转导进入所述对照组(图3)。
还有，在微小RNA-21过量表达和辐射抗性之间相关性的基础上，进行试验来确定通过过量表达抗微小RNA-21来抑制微小RNA-21是否导致对辐射的敏感性增加。详细地，在用抗mir-21转导后24小时，高微小RNA-21表达水平的GBM细胞系U373被暴露于0、1、2和4Gy的辐射剂量。将细胞系培养两周，以及每两天用新鲜培养基进行替换。发现通过用抗mir-21处理和通过暴露于辐射来抑制微小RNA-21的组与对照组相比辐射敏感性显著增加(图4)。
实验中获得的结果暗示，微小RNA-21抑制剂抑制细胞中微小RNA-21的活性，从而使细胞对辐射更敏感。
在一个实施方式中，包含根据本发明的微小RNA-21抑制剂的增强辐射敏感性的组合物可以进一步包含药学上可接受的载体(vehicle)和用药学上可接受的载体进行配制。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”拟指运载体(carrier)或稀释剂，其不破坏成分的药学活性和性质以及不刺激待处理的对象。对于用于本发明组合物的液体配制物，药学上可接受的载体优选适于灭菌。本发明的活性成分可以用选自下列的一种进行配制：盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糖溶液、甘油、乙醇及其组合，以及如果需要，结合其它传统的添加剂，包括抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂等。可选地，本发明的组合物可以用稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂配制成注射剂、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。
包含根据本发明的微小RNA-21抑制剂和药学上可接受的载体的组合物可以配制成任意剂型——不论口服或非口服，以及为了方便给药和统一给药量可以是单位剂型。根据本发明的药物制剂可以经下列途径给药：口服、直肠、鼻、局部(推注和舌下)、透皮、阴道或肠胃外(肌肉、皮下、静脉内)途径或通过吸入或吹入。
用本发明的组合物配制的口服剂型的实例包括片剂(tablets)、糖锭(troches)、锭剂、水溶性或油性悬浮液、粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊、糖浆或和酏剂。对于片剂或胶囊配制物，有用的是添加剂，包括粘合剂，诸如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉或甘薯淀粉；以及润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠或聚乙二醇。除这些添加剂外，对于胶囊配制物，也可以使用液体运载体，诸如脂肪油。
为了用于肠胃外给药，本发明的组合物可以配制成经由皮下、静脉内或肌肉途径的注射剂、栓剂或经由吸入的喷雾剂，诸如气雾剂。注射剂可以通过这样的方式进行制备：将本发明的组合物与稳定剂或缓冲剂在水中混合，以提供溶液或悬浮液，所述溶液或悬浮液以单位剂量被包装，诸如安瓿或小瓶。对于栓剂，本发明的组合物可以用传统的基质诸如可可脂或其它甘油酯，或灌肠剂进行配制。呈水分散浓缩物或湿粉末形式的本发明的组合物可以用抛射剂进行配制，以制备气雾喷雾剂。
依照其另一个方面，本发明涉及使用包含微小RNA-21抑制剂的增强辐射敏感性的组合物使癌症细胞对辐射敏感的方法。还有，本发明提供癌症细胞的放射治疗，包含给予本发明的组合物。
如本文所用，术语“给药或给予”拟含义是使用任意适合的方法将本发明的药物组合物导入到对象，举例而言，使用病毒或非病毒技术输送微小RNA-21抑制剂，例如，反义核酸分子。当导入到癌症细胞中时，本发明的组合物降低微小RNA-21的表达水平或活性，从而增强细胞对辐射的敏感性。
只要其确保使本发明的组合物到达感兴趣的组织，可以采用任意途径给药。例如，本发明的组合物可以口服、直肠、局部及外部、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、透皮、鼻内、胸内、眼内或皮内给药。优选地，本发明的抗癌组合物可以局部给药到癌症组织中。
根据本发明的癌症的放射治疗包括以药学有效量给予本发明的增强辐射敏感性的组合物。在本上下文中，术语“治疗有效量”含义是肿瘤细胞有效地变为对辐射敏感的量。适合的总日剂量可以由主治医师在合理的医学判断范围内确定，这对本领域技术人员而言是显而易见的。任意具体患者的具体治疗有效剂量水平可以根据许多因素而变化，包括期望的反应的类型和程度、具体的组合物，包括根据意图用途的任意其它药剂的使用、患者的年龄、体重、一般健康状态、性别和饮食、给药时间、给药途径，以及组合物的排泄速率；治疗持续时间和照射的量；与具体组合物联合或同时使用的其它药物；以及医学领域中周知的类似因素。因此，适于本发明目的的增强辐射敏感性的组合物的有效量优选充分考虑上述因素进行确定。在一些情况下，本发明的增强辐射敏感性的组合物也可以结合照射给药；这种治疗可以是特别有益的，因为微小RNA-21抑制剂可以充当辐射敏感性增强剂，增强这种照射的疗效。
进一步，根据本发明的放射治疗可以应用于任意动物，所述动物随着微小RNA-21表达水平渐增而辐射抗性增加。动物的实例包括牛、猪、羊、马、狗和猫以及人和灵长类动物。根据本发明的放射治疗也可以应用于任意癌症，所述癌症的特征是由微小RNA-21的表达产生的辐射抗性，以及优选应用于具有高微小RNA-21表达水平的癌症，包括神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、子宫癌、胃癌和慢性淋巴细胞白血病，但不限于这些。
如本文所用，术语“放射治疗”或“放疗”拟包括给予癌症细胞本发明的组合物和使癌症细胞暴露于辐射。照射含义是电离辐射以及特别是γ辐射，尤其是现在普遍使用的由线性加速器或放射性核素所发出的。放射性核素对肿瘤的照射可以是外部的或内部的。优选地，在照射肿瘤之前多达一个月，特别是多达10天或一周，开始给予本发明的组合物。此外，分次对肿瘤照射以及在第一次和最后一次照射期之间的间隔内维持组合物给药是有利的。组合物的量、照射的剂量以及照射剂量的间歇将取决于一系列参数，诸如肿瘤的种类、其位置、患者对化学治疗或放射治疗的反应。还有，近距离放射疗法、放射性核素治疗、外照射(external beam radiation)治疗、温热疗法(冷冻消融、高热治疗)、放射外科、带电粒子放射治疗、中子放射治疗和光动力学治疗可以包括在用于本发明的放射治疗的范围内。
【有益效果】
当结合照射使用时，包含根据本发明的微小RNA-21抑制剂的增强辐射敏感性组合物可以增强对辐射具有抗性的各种癌症的放射治疗的疗效。
附图说明
图1a是显示抗辐射细胞克隆RRC7和亲代细胞系U251中微小RNA-21相对表达水平的图，以及图1b是显示脑肿瘤细胞系U87、U373和LN 18中微小RNA-21相对表达水平的图。
图2显示抗辐射细胞克隆RRC7和亲代细胞系U251(a)以及U373、U87、LN18(脑肿瘤细胞系)、MCF-7和MB-MDA-231(乳腺癌细胞系)、A549(肺癌细胞系)和HeLa(子宫癌细胞系)(b)的存活分数相对于照射剂量绘制的图。
图3是显示抗微小RNA-21对G2/M期阻滞的增强效果的图。
图4a和4b是显示抗微小RNA-21对辐射敏感性的增强效果的图。
具体实施方式
通过下列实施例可获得本发明的更好理解，所述实施例被提出进行说明，而不被解释为限制本发明。实施例1：抗辐射细胞克隆的建立和脑肿瘤细胞中微小RNA-21表 达水平<1-1>细胞培养
如下培养细胞。
(1)在37℃、5％CO2培养箱中，在湿气氛下，在补充有10％FBS(胎牛血清，Gibco BRL，U.S.A.)和100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM(WelGENE，Korea或GIBCO BRL，U.S.A.)中，培养脑肿瘤细胞系U87、U373、LN-18和U251。
(2)在37℃、5％CO2培养箱中，在湿润气氛下，在补充有10％FBS(台牛血清，Gibco BRL，U.S.A.)和包含100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM(WelGENE，Korea)中，培养乳腺癌细胞系MCF7和MB-MDA-231。
(3)在37℃、5％CO2培养箱中，在湿润气氛下，在补充有10％FBS(胎牛血清，Gibco BRL，U.S.A.)、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640(WelGENE，Korea)培养基中，培养肺癌细胞系A549。<1-2>抗辐射细胞克隆的建立
为了建立抗辐射细胞克隆，将U251多形性成胶质细胞瘤(GBM)细胞系暴露于辐射并且培养，以形成集落。更详细地，当以70～80％汇合生长时，使用Gammacell Elite照射器(给药速率：3Gy/min)，以3Gy的剂量，用来自137Cs γ射线源的辐射，每三天一次，在室温下照射U251细胞。6个月期间每三天一次暴露于3Gy的γ辐射后存活的细胞集落被收集，并且在培养皿上生长成预先确定的群落。将如此获得的抗辐射细胞株命名为RRC7。<1-3>肿瘤细胞系和抗辐射细胞克隆(RRC7)中微小RNA-21的表达水平
进行试验，通过实时PCR分析抗辐射细胞克隆(RRC7)和脑肿瘤细胞系的微小RNA-21表达水平，检测微小RNA-21的表达水平是否与辐射抗性有关。
另外，进行试验，通过实时PCR分析正常细胞星形胶质细胞和脑肿瘤细胞系U87、U373和LN18的微小RNA-21表达水平，检测微小RNA-21的表达水平是否在正常细胞和脑肿瘤细胞之间存在差异。
更详细地，当细胞在6-孔板上以70～80％汇合生长时，移除培养基，接着用DBPS将细胞洗涤两次。使用TRI试剂(Invitrogen，U.S.A.)如下所述分离总RNA。首先，为了从核蛋白复合物提取总RNA，将细胞用1ml的TRI试剂处理并且室温下温育5分钟(min)。然后，向细胞中加入每1ml TRI试剂0.2ml的氯仿以及用手猛烈振荡15秒(sec)，然后室温下温育3min。4℃下12,000×g离心15min得到总RNA层。将如此获得的总RNA层与0.5ml异丙醇混合并且4℃下12,000×g离心10min，以提供总RNA沉淀，然后用75％EtOH洗涤所述沉淀。在除去75％EtOH后，将所述沉淀干燥并且使其溶于DEPC-H2O中。使用分光光度计对总RNA进行定量和定性分析。将总RNA稀释成浓度25ng/μl，然后进行实时PCR，其中使用mirVanaTM qRT-PCR miRNA检测试剂盒(Ambion，U.S.A.)对成熟微小RNA-21的表达水平进行定量。在用ABI 7500实时PCR系统监测下，以95℃下变性10min开始，使PCR进行40个循环，包括95℃下15sec和60℃下60sec。
抗辐射细胞克隆RRC7的微小RNA-21表达水平是亲代细胞系U251的1.6倍(图1a)。发现肿瘤细胞系U87和U373以比正常星形胶质细胞增加至1.5至4.5倍的水平分别过量表达微小RNA-21。相反，LN18中微小RNA-21的表达水平减少至0.3倍(图1b)。实施例2：根据微小RNA-21的表达水平的辐射抗性
为了检测辐射抗性与微小RNA-21表达水平的相关性，使用克隆形成试验分析抗辐射细胞系RRC7和脑肿瘤细胞系U251、U373、U87和LN18的辐射抗性。
还在高微小RNA-21水平的乳腺癌细胞系、肺癌细胞系和子宫癌细胞系中测量辐射抗性。
如下所述进行克隆形成试验。将抗辐射细胞系RRC7、脑肿瘤细胞系U251、U373、U87和LN18、乳腺癌细胞系MCF-7和MB-MDA-231、以及肺癌细胞系A549和子宫癌细胞系HeLa——全部在对数期中——收获并且悬浮在新鲜细胞培养基中。将每个悬浮液以每个培养皿中100个细胞的密度接种到60mm培养皿中，一式三份。接种后24小时，将细胞暴露于辐射。以0Gy(对照)、2Gy、4Gy和8Gy(实验组)的剂量将γ辐射照射到U373、U87和LN18(脑肿瘤细胞系)、MCF-7和MB-MDA-231(乳腺癌细胞系)、A549(肺癌细胞系)和HeLa(子宫癌细胞系)中。将RRC7和U251暴露在0Gy(对照)、3Gy、6Gy和9Gy(实验组)的剂量下。照射后，将细胞培养2周，并且每隔一天提供新鲜培养基。对于集落鉴定，用Diff-quik溶液(Sysmex，Japan)将细胞染色并且计数由50或更多个细胞组成的集落。
结果，较高的微小RNA-21内在表达水平与较高的辐射抗性直接相关。也发现，抗辐射细胞克隆RRC7显示比U251脑肿瘤细胞系高的辐射抗性(图2a)。
另外观察到，微小RNA-21水平都相对高的脑肿瘤细胞系U373和U87比微小RNA-21水平相对低的LN-18细胞系更具辐射抗性(图2b)。还有，观察到HeLa、A549和MCF7具有类似于脑肿瘤细胞系U373和U87的辐射抗性(图2b)。
因此，克隆形成试验显示，微小RNA-21的表达水平与辐射抗性密切相关。实施例3：针对微小RNA-21的抗寡核苷酸(抗微小RNA-21)在将细 胞阻滞在G2/M期中的用途
为了检测抑制微小RNA-21活性是否导致细胞周期的阻滞，在用抗微小RNA-21和辐射处理后，分析U373-具有高微小RNA-21表达水平的脑肿瘤细胞系——的细胞周期。
将与微小RNA-21互补的抗微小RNA-21转导入细胞中以抑制微小RNA-21活性。为了参照，使用抗微小RNA.阴性对照(Dharmacon，U.S.A.)。使用Cell Line Nucleofector试剂盒T溶液(Amaxa，U.S.A.)通过电穿孔进行转导。
将细胞等分入15ml的锥形管中并且以1,000rpm离心5min。将如此收获的细胞用DPBS洗涤两次并且以90×g离心10min。其后，将细胞悬浮在100μl的T溶液中，所述T溶液包含100nM抗微小RNA-21，接着使用Amaxa电穿孔仪进行电穿孔。立即，将细胞悬浮在补充有10％FBS的1ml DMEM中，以及然后在37℃下、在补充有10％FBS的DMEM中稀释成2×105个细胞的群。将每个稀释液接种到60mm培养皿中，一式三份，并且在37℃下温育24小时。
如下测量细胞周期。在温育24小时后，以8Gy的剂量照射细胞。随后，将照射组与对照组(0Gy)一起在细胞培养箱中温育24小时。然后，将细胞等分入15ml锥形管中并且以1,000rpm离心5min。将如此收获的细胞用DPBS洗涤两次并且悬浮在500μl冰冷的DPBS中。将细胞悬浮液加入到4.5ml冰冷的70％EtOH中并且振荡混合。在冰箱中4℃下温育16小时使细胞固定。将细胞在4℃下以1,500rpm离心15min，以及将如此获得的细胞沉淀用冰冷的DPBS洗涤两次并且悬浮在1ml的PI溶液(碘化丙锭100μg/ml，无DNase的RNase 20μg/ml，0.1％Triton X-100)中，然后，37℃下温育15min。在4℃下以1,500rpm离心15min后，将细胞沉淀悬浮在1ml冰冷的DPBS中。将细胞悬浮液转移到FACS管中，所述FACS管被放进FACS Calibur(BD science，U.S.A.)中进行细胞周期测量。
结果，在用抗微小RNA-21抑制内在微小RNA-21功能下，将U373细胞系暴露于辐射。发现抗微小RNA-21-处理组与对照组相比，增强了辐射的G2/M期细胞阻滞，所述对照组中转导了抗微小RNA-阴性对照(图3)。实施例4：针对微小RNA-21的抗寡核苷酸(抗微小RNA-210增加辐 射敏感性的用途
为了检测抑制微小RNA-21活性是否导致辐射敏感性增加，在用抗微小RNA-21和辐射处理后，测定U373和U87——两者均为具有高微小RNA-21表达水平的脑肿瘤细胞系——的辐射抗性。
将与微小RNA-21互补的抗微小RNA-21转导入细胞，以抑制微小RNA-21活性。为了参照，使用抗微小RNA-阴性对照(Dharmacon，U.S.A.)。使用Cell Line Nucleofector试剂盒T溶液(Amaxa，U.S.A.)通过电穿孔进行转导。
将细胞等分入15ml的锥形管中并且以1,000rpm离心5min。将如此收获的细胞用DPBS洗涤两次并且以90×g离心10min。其后，将细胞悬浮在100μl的T溶液中，所述T溶液包含100nM抗微小RNA-21，接着使用Amaxa电穿孔仪进行电穿孔。立即，将细胞悬浮在补充有10％FBS的1ml DMEM中，以及然后在37℃下、在补充有10％FBS的DMEM中稀释成1×103个细胞的群。将每个稀释液一式三份接种到60mm培养皿中并且在37℃下温育24小时。
在转导后，以0Gy、1Gy、2Gy和4Gy的剂量照射U373和U87细胞并且将其培养两周，每隔一天将培养基更换成新鲜的培养基。对于集落鉴定，用Diff-quik溶液(Sysmex，Japan)将细胞染色并且计数由50或更多个细胞组成的集落。
发现实验组U87和U373——其中内在微小RNA-21活性通过用抗微小RNA-21处理被抑制——比用抗微小RNA-阴性对照转导的细胞更具辐射敏感性(图4a和4b)。
因此，所述结果显示微小RNA-21与辐射抗性的密切相关性，这暗示抗微小RNA-21可以用于使细胞对辐射敏感。
工业实用性
如迄今所描述的，本发明的微小RNA-21抑制剂，特别是互补地结合于微小RNA-21的反义核酸分子，使癌症细胞对辐射敏感并且显示没有诸如细胞毒性的副作用。
因此，包含根据本发明的微小RNA-21抑制剂的增强辐射敏感性的组合物可用于癌症的放射治疗——所述癌症由于其中高微小RNA-21表达水平已经变得对辐射有抗性。
序列表
<110>国立癌中心
<120>包含微小RNA-21抑制剂的增强辐射敏感性的组合物
<130>OPA08052
<150>KR-10-2008-0071891
<151>2008-07-23
<160>2
<170>Kopatentln 1.71
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗微小RNA 21寡核苷酸序列
<400>1
tcaacatcag tctgataagc ta            22
<210>2
<211>22
<212>RNA
<213>hsa-miR-21的成熟序列
<400>2
uagcuuauca gacugauguu ga            22

Claims (15)

1.增强辐射敏感性的组合物，其包含微小RNA-21抑制剂。
2.权利要求1中所述的增强辐射敏感性的组合物，其中所述微小RNA-21抑制剂为互补地结合于微小RNA-21碱基序列的反义核酸分子。
3.权利要求1中所述的增强辐射敏感性的组合物，其中所述微小RNA-21抑制剂选自siRNA、RNA适配子和核酶，其特征都是对微小RNA-21的特异性。
4.权利要求2中所述的增强辐射敏感性的组合物，其中所述反义核酸分子是抗寡核苷酸。
5.权利要求4中所述的增强辐射敏感性的组合物，其中所述抗寡核苷酸长度为15至40个核苷酸。
6.权利要求4中所述的增强辐射敏感性的组合物，其中所述抗寡核苷酸具有SEQ ID NO.1的碱基序列。
7.权利要求1中所述的增强辐射敏感性的组合物，其适于使癌症对辐射敏感，所述癌症的微小RNA-21水平高。
8.权利要求7所述的增强辐射敏感性的组合物，其中所述癌症选自神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、子宫癌、胃癌和慢性淋巴细胞白血病。
9.权利要求1中所述的增强辐射敏感性的组合物，其中所述微小RNA-21抑制剂具有细胞周期调节活性。
10.权利要求4至6之一中所述的增强辐射敏感性的组合物，其中所述抗寡核苷酸存在于用于输送到细胞中的表达载体中。
11.权利要求10中所述的增强辐射敏感性的组合物，其中所述表达载体是源自病毒的病毒载体，所述病毒选自慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒和禽痘病毒。
12.权利要求1至4之一中所述的增强辐射敏感性的组合物，进一步包含药学上可接受的载体。
13.增强癌症的辐射敏感性的方法，包括将权利要求1至4之一所述的组合物应用于所述癌症，所述癌症的微小RNA-21表达水平高。
14.癌症的放射治疗，包括结合照射给予权利要求1至4之一所述的组合物。
15.权利要求14中所述的放射治疗，其中所述癌症选自神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、子宫癌、胃癌和慢性淋巴细胞白血病。
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