CN114732907B

CN114732907B - Ddx11蛋白作为dna损伤标志蛋白或放化疗治疗肿瘤靶点的应用

Info

Publication number: CN114732907B
Application number: CN202210076606.8A
Authority: CN
Inventors: 白琛俊; 黄昕; 高山山; 关华; 周平坤
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2022-01-21
Filing date: 2022-01-21
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-01-21
Also published as: CN114732907A

Abstract

本发明提供了DDX11蛋白作为DNA损伤标志蛋白或放化疗治疗肿瘤靶点的应用，属于分子生物学和生物医药技术领域。本发明首次公开DDX11蛋白与DNA损伤标志蛋白共定位于DNA损伤位点，DDX11蛋白可以作为检测细胞DNA损伤的标志物。降低DDX11基因或蛋白的表达能提高包括宫颈癌与乳腺癌细胞在内的肿瘤细胞对化疗药物和放疗的敏感性，从而抑制肿瘤细胞生长，达到杀伤肿瘤的目的。可见，本发明提供的DDX11蛋白作为DNA损伤标志蛋白或放疗、DNA损伤化疗药物治疗肿瘤靶点可有效用于宫颈癌与乳腺癌治疗方案选择和/或预后评估中，提供的以DDX11为靶点的新型宫颈癌与乳腺癌诊断剂和/或治疗剂具有临床应用前景。

Description

DDX11蛋白作为DNA损伤标志蛋白或放化疗治疗肿瘤靶点的应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物医药技术领域，具体涉及DDX11蛋白作为DNA损伤标志蛋白或放化疗治疗肿瘤靶点的应用。

背景技术

DNA损伤产生的原因分为两种：(1)自发的DNA损伤与外界刺激产生的DNA损伤。自发的DNA损伤主要由水解氧化反应、DNA复制压力以及ROS等细胞中天然存在的生理生化活动引发的。DNA与周围环境中分子固有的化学反应也可导致DNA损伤，从而引发遗传性疾病和癌症的发生。(2)外界环境中物理以及化学物质如：也会对DNA造成损害。物理因素中最常见的是高能量的射线，比如：紫外线UV以及电离辐射等。很多化学物质也会对DNA造成损伤，很多诱导DNA损伤的化学物质被广泛用于临床上肿瘤的治疗。比如顺铂、喜树碱、依托泊苷等。DNA损伤一方面对人体正常细胞基因组造成损伤，诱发疾病包括肿瘤的产生；另一方面，利用放疗、DNA损伤化疗药物等手段诱导肿瘤细胞发生DNA损伤，进而杀伤肿瘤细胞，是临床治疗肿瘤的常用手段。

当人体细胞基因组发生损伤后，DNA修复蛋白比如：γH2AX、53BP1、ATM、DNA-PKcs等聚集到损伤位点，对损伤位点进行修复，这些修复蛋白常备用于标记DNA损伤的产生以及损伤的强度。

解螺旋酶DDX11属于XPD解螺旋酶家族，由位于人第12号染色体断臂上的ChlR1/DDX11基因编码，共有970个氨基酸残基，102kd，为一种具有保守的ATP酶/解螺旋酶核心结构域以及Fe-S簇的DNA与RNA解螺旋酶。DDX11与XPD、RECQ1、FANCJ、RTEL1等DNA损伤修复相关蛋白高度同源，与其同源蛋白相似，DDX11基因突变可导致遗传学疾病的发生。DDX11蛋白Q263A、C754P、K897缺失等位点突变可导致华沙破裂综合症(WABS)。DDX11在DNA损伤修复、染色质粘合等多种细胞生命活动中发挥功能。然而目前DDX11可作为DNA损伤的标志蛋白，以及DDX11作为肿瘤放化疗靶点的研究还没有报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供DDX11蛋白的新应用，具体的，作为DNA损伤标志基因或蛋白或作为放化疗治疗肿瘤靶点的应用。

本发明提供了DDX11蛋白作为DNA损伤标志蛋白的应用。

优选的，所述DDX11蛋白与其它DNA损伤标志蛋白共聚集在细胞DNA损伤位点；

所述其它DNA损伤标志蛋白包括以下一种或几种：γH2AX、CtIP、BRCA1和53BP1。

优选的，所述细胞DNA损伤是由电离辐射或DNA损伤化疗药物诱导产生。

本发明提供了DDX11基因或蛋白作为放疗、DNA损伤化疗药物治疗肿瘤靶点中的应用。

优选的，所述DDX11蛋白作为DNA损伤化疗药物治疗肿瘤靶点是通过下调DDX11蛋白表达量，提高细胞对化疗药物或放疗的敏感性。

本发明提供了一种DDX11蛋白或DDX11基因的抑制剂在制备预防和/或治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。

优选的，DDX11蛋白的抑制剂包括DDX11蛋白的抗体和/或DDX11蛋白的结合蛋白。

优选的，DDX11基因的抑制剂包括以下一种或几种：DDX11基因特异性的RNAi、DDX11基因特异性的microRNA和抑制DDX11基因启动子的抑制剂。

优选的，所述癌症包括宫颈癌和/或乳腺癌。

本发明提供了一种治疗宫颈癌和/或乳腺癌的药物，包括药学上可接受的辅料和有效量的以下一种活性成分：DDX11蛋白的抑制剂和DDX11基因的抑制剂。

本发明提供了一种体外治疗性抑制肿瘤细胞增殖的方法，在DDX11蛋白抑制剂或DDX11基因抑制剂存在的条件下，采用放化疗方法处理肿瘤细胞。

本发明提供了DDX11蛋白作为DNA损伤标志蛋白或放疗、DNA损伤化疗药物治疗肿瘤靶点的应用。本发明首次发现DDX11蛋白在DNA损伤后与γH2AX、53BP1、BRCA1共定位于DNA损伤位点。在不同肿瘤细胞系(HeLa、MD231)中敲低DDX11蛋白表达能减弱肿瘤细胞电离辐射处理后的细胞存活率，增强顺铂、喜树碱、依托泊苷对肿瘤增殖活性的抑制作用。可见，本发明提供了新的DNA损伤标志蛋白，新的宫颈癌与乳腺癌治疗靶点，该靶点可有效用于宫颈癌与乳腺癌治疗方案选择和/或预后评估，从而为本领域提供了一种新颖的结宫颈癌与乳腺癌诊断剂和/或治疗剂，具有临床应用前景。

附图说明

图1为辐射诱导HeLa细胞DNA损伤后，DDX11蛋白与DNA损伤标志蛋白的共定位结果；图1A是辐射诱导HeLa细胞DNA损伤后，DDX11蛋白与DNA损伤标志蛋白γH2AX共定位到DNA损伤位点结果，图1B是辐射诱导HeLa细胞DNA损伤后，DDX11蛋白与DNA损伤标志蛋白BRCA1共定位到DNA损伤位点结果，图1C是辐射诱导HeLa细胞DNA损伤后，DDX11蛋白与DNA损伤标志蛋白53BP1共定位到DNA损伤位点结果；

图2A是DDX11 siRNA敲低Westernbloting验证结果，图2B为敲低DDX11蛋白的HeLa细胞经电离辐射后细胞存活情况，图2C为敲低DDX11蛋白的MD231细胞经电离辐射后细胞存活情况；

图3为敲低DDX11蛋白抑制HeLa与MD231细胞经喜树碱、依托泊苷、顺铂处理后细胞增殖结果，其中图3A为抑制HeLa细胞的结果，图3B为抑制MD231细胞的结果。

具体实施方式

本发明提供了DDX11蛋白作为DNA损伤标志蛋白的应用。

在本发明中，免疫荧光实验检测结果表明，DDX11蛋白与DNA损伤标志蛋白γH2AX、BRCA1、53BP1在辐射诱导人宫颈癌细胞HeLa细胞DNA损伤后共定位到DNA损伤位点，这表明DDX11蛋白可以作为DNA损伤标志蛋白，用于细胞DNA损伤的诊断或检测。所述其它DNA损伤标志蛋白优选包括以下一种或几种：γH2AX、CtIP、BRCA1和53BP1。所述细胞DNA损伤是由电离辐射或DNA损伤化疗药物诱导产生。DNA损伤化疗药物优选为依托泊苷、顺铂、喜树碱。

在本发明中，通过敲减人宫颈癌细胞HeLa和人乳腺癌细胞MD231中DDX11基因或蛋白的，使DDX11基因和蛋白的表达量降低，与野生型细胞相比，敲低DDX11蛋白表达能增加HeLa与MD231细胞对电离辐射敏感性，并且DDX11蛋白敲低后的HeLa与MD231细胞的存活率显著低于未敲低组，同时敲低DDX11蛋白表达还能增加化疗药物(顺铂、喜树碱、依托泊苷)对HeLa与MD231细胞增殖活性的抑制作用，有利于抗癌药物的发挥。可见，所述DDX11蛋白作为DNA损伤化疗药物治疗肿瘤靶点优选通过下调DDX11蛋白表达量，提高细胞对化疗药物或放疗的敏感性。

鉴于敲减DDX11蛋白或DDX11基因的表达有利于癌症细胞对抗癌药物以及化疗措施的敏感性，本发明提供了一种DDX11蛋白或DDX11基因的抑制剂在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。

在本发明中，DDX11蛋白的抑制剂优选包括DDX11蛋白的抗体和/或DDX11蛋白的结合蛋白。DDX11基因的抑制剂优选包括以下一种或几种：DDX11基因特异性的RNAi、DDX11基因特异性的microRNA和抑制DDX11基因启动子的抑制剂。在本发明中，所述DDX11基因特异性的RNAi包括siDDX11；所述siDDX11包括DDX11 siRNA1和DDX11 siRNA2。所述DDX11siRNA1的核苷酸序列优选如下：5′-UCCUGCAUG GCUGAGAGC CAGGCUU-3′(SEQ ID NO：1)。所述DDX11 siRNA2的核苷酸序列优选如下：5′-CCAACUGGCACUGGGAAGUCCUUAA-3′(SEQ ID NO：2)。

在本发明中，所述药物中除活性成分DDX11蛋白或DDX11基因的抑制剂外，还优选包括药学上可接受的辅料。术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。所述的药学上可接受的载体包括但不限于：水、盐水、缓冲液、甘油、乙醇、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

在本发明中，通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

在本发明中，所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药途径等。

在本发明中，所述应用适用于所有种类癌症，例如宫颈癌和/或乳腺癌。在本发明实施例中，以宫颈癌细胞和乳腺癌细胞为例加以说明所述抑制剂的药物机理，但不能理解为对本发明保护范围的限制。

本发明提供了一种治疗宫颈癌和/或乳腺癌的药物，包括药学上可接受的辅料和有效量的以下一种活性成分：DDX11蛋白的抑制剂和DDX11基因的抑制剂。所述药物与上述技术方案中所述药物相同，在此不做赘述。所述药物联同放化疗治疗方式在治疗肿瘤或癌症中的应用。所述放化疗治疗方式包括放疗和化疗药物。本发明对所述放疗的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的放疗方法即可，例如电离辐射。所述化疗药物优选包括顺铂、喜树碱和依托泊苷中的一种或几种。

在本发明中，基于敲减DDX11蛋白或DDX11基因的表达有利于癌症细胞对抗癌药物以及化疗措施的敏感性，提供了一种体外治疗性抑制肿瘤细胞的方法，在DDX11蛋白抑制剂或DDX11基因抑制剂存在的条件下，采用放化疗方式处理肿瘤细胞。实验结果表明，DDX11基因或蛋白抑制组呈现更好的肿瘤细胞抑制、杀伤效果。本发明对所述肿瘤细胞没有特殊限制，采用本领域所熟知的肿瘤细胞即可，例如宫颈癌细胞和/或乳腺癌。

下面结合实施例对本发明提供的DDX11蛋白作为DNA损伤标志蛋白或放化疗治疗肿瘤靶点的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明。

实施例1

一.材料与方法

1.实验材料

(1)人宫颈癌细胞HeLa(军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所)和人乳腺癌细胞MD231(军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所)。

(2)抗-DDX11抗体(购自Abcam)，抗-53BP1抗体(购自Santa Cruz)，抗-BRCA1抗体(购自Santa Cruz)，抗-γH2AX抗体(购自Millipore)

2.实验方法

(1)免疫荧光实验具体步骤如下：

①固定：Co⁶⁰射线4Gy剂量照射HeLa细胞1h后，吸弃细胞上清，PBS洗两次，然后使用3％多聚甲醛室温固定细胞15分钟。

②破膜：吸弃多聚甲醛，PBS洗3次，使用0.5％Triton-100室温处理细胞5min，使细胞膜通透。

③封闭：吸弃Triton-100，PBS洗三次，使用10％胎牛血清(Sigma)室温封闭细胞1小时。

④一抗孵育：吸弃胎牛血清，分别用γH2AX、53BP1、BRCA1与DDX11抗体(1：200稀释)室温孵育细胞1h。

⑤二抗孵育：吸弃一抗，PBS洗三次，使用羊抗兔与羊抗鼠荧光二抗(1：200稀释，Jackson’s Lab)室温孵育细胞1h。

⑥封片：吸弃二抗，PBS洗三次，将铺有细胞的盖玻片盖于滴有封片剂的载玻片上。

⑥拍照：将上述样品用激光共聚焦显微镜100×油镜下观察，拍照。

结果见图1。免疫荧光实验表明，电离辐射诱导HeLa细胞DNA损伤后，DDX11与γH2A共定位于DNA损伤位点(图1A)，DDX11与53BP1共定位于DNA损伤位点(图1B)，DDX11与γBRCA1共定位于DNA损伤位点(图1C)。通过免疫荧光实验分别检测DDX11蛋白与DNA损伤标志蛋白γH2AX、BRCA1、53BP1在辐射诱导HeLa细胞DNA损伤后共定位到DNA损伤位点。

实施例2

使用实验室已筛选出的siDDX11分别敲减HeLa和MD231细胞株中DDX11 mRNA表达水平，然后进行WesternBlotting验证敲减效果，最后通过克隆形成实验检测在HeLa和MD231细胞株中分别瞬时敲减DDX11对电离辐射处理后细胞存活的影响。

1.敲减的具体操作步骤：

将HeLa和MD231细胞株细胞分别生长至60％～70％浓度，用lipo2000转染终浓度为100nm siRNA至细胞培养基中，lipo2000：siRNA为1：2.5(体积比)，每24h转染一次，转染后6h更换新鲜培养基，得到敲减后的细胞株。siRNA包括DDX11 siRNA1(5′-UCCUGCAUGGCUGAGAGCCAGGCUU-3′，SEQ ID NO：1)和DDX11 siRNA2

(5′-CCAACUGGCACUGGGAAGUCC UUAA-3′，SEQ ID NO：2)。

2.通过WesternBlotting检测HeLa与MD231细胞中DDX11蛋白敲低效果。WesternBlotting具体步骤如下：

①细胞加入RIPA裂解液(北京索莱宝科技有限公司)，其中RIPA裂解液中含有1×PMSF(索莱宝)和1×蛋白酶和磷酸酶抑制剂(CST，USA)，冰上放置30min，4℃、12000g离心20min，取上清转移到新的1.5ml EP管中。

②BCA法(Thermo fisher，USA)测定总蛋白浓度。

③12％SDS-PAGE电泳，检测GAPDH表达的上样量为10ug，检测MTH2表达的上样量为40μg。

④转膜，将PAGE中的蛋白电转移到PVDF膜上(Millipore，USA)。

⑤免疫封闭，使用5％脱脂牛奶封闭2h。

⑥一抗孵育，抗-NUDT5抗体的稀释比例为1：1000，抗-GAPDH抗体稀释比例为1：2000，4℃过夜，TBST洗5次，每次5min。

⑦二抗孵育，山羊抗兔IgG-HRP(碧云天生物技术有限公司，1：2000)，室温孵育2h，TBST洗5次，每次5min。

⑧曝光，将显示液(Millipore，USA)1：1混合后均匀滴加到条带上，进行曝光显色。

敲减后的HeLa和MD231细胞株经WesternBlotting检测，结果见图2A。采用DDX11siRNA1或DDX11 siRNA2敲减HeLa和MD231中DDX11基因，结果表明，敲减后的细胞中DDX11蛋白的表达量明显下降，这表明成功获得了低表达DDX11的HeLa和MD231细胞株。

实施例3

采用不同剂量的电离辐照处理敲减后的HeLa和MD231细胞的结果

1.处理方法

①HeLa和MD231细胞铺60mm培养皿，每孔5×10⁵个细胞。

②12h后，使用RNAiMAX(Thermo Fisher，USA)转染50nM siDDX11和siControl(5’-UAAGGCUAUGAAGAGAUAC-3’，SEQ ID NO:3)。

③转染后24h，再次使用RNAiMAX(Thermo Fisher，USA)转染50nM siDDX11和siControl，6h后按照以下要求铺特定细胞数于60mm培养皿，加入4ml新鲜培养基：0Gy200细胞；1Gy 200细胞；2Gy400细胞；4Gy 1000细胞；8Gy 2000细胞。

④待细胞铁壁后(大约6h)对上述细胞分别进行0Gy、1Gy、2Gy、4Gy、8Gy的Co⁶⁰电离辐照。

⑤将细胞继续培养15天后，吸弃上清，用PBS洗两次后，甲醇固定30分钟，然后吉姆萨染色1h，对细胞克隆进行计数统计。

2.统计方法

软件SPSS statistics version 19.

(1)Student’st-test比较两组均值；

(2)Kaplan-Meieranalysis计算总的生存率(OS)，the log-ranktest比较两组OS。

敲低DDX11蛋白的HeLa细胞存活率结果见图2B，敲低DDX11蛋白的MD231细胞存活率结果见图2C。在电离辐射剂量2Gy、4Gy、8Gy处理条件下，DDX11敲低的HeLa与MD231细胞存活率显著低于未敲低组。

实施例4

CCK-8实验检测在HeLa和MD231细胞株中分别瞬时敲减DDX11对顺铂、喜树碱、依托泊苷处理后细胞活力的影响。具体步骤如下：

1.处理方法

①HeLa和MD231细胞铺96孔板，每孔1×10⁴个细胞。

②12h后，使用RNAiMAX(Thermo Fisher，USA)转染50nM siDDX11和siControl，每组24个复孔。

③转染后6h，分别用Selleck公司顺铂(终浓度2μm/L)、喜树碱(终浓度2μm/L)、依托泊苷(终浓度2μm/L)处理细胞；

④分别在转染后24h、48h和72h，使用CCK-8试剂盒(全式金)检测450nm处吸光度。

2.统计方法

软件SPSS statistics version 19.

(1)Student’st-test比较两组均值；

实验结果

DDX11蛋白敲低增加化疗药物顺铂、喜树碱、依托泊苷对HeLa与MD231细胞增殖活性的抑制作用。

CCK-8实验结果表明在HeLa(图3A)与MD231(图3B)细胞株中敲减DDX11蛋白后，顺铂、喜树碱、依托泊苷对HeLa与MD231细胞增殖活性的抑制作用明显增强，细胞增殖减弱。

由上述实施例可知，DDX11蛋白在DNA损伤后与γH2AX、53BP1、BRCA1共定位于DNA损伤位点。在不同肿瘤细胞系(HeLa、MD231)中敲低DDX11蛋白减弱肿瘤细胞电离辐射处理后的细胞存活率，增强顺铂、喜树碱、依托泊苷对肿瘤增殖活性的抑制作用。因此，DDX11可作为DNA损伤的新标志物，抑制DDX11蛋白表达增加肿瘤细胞的放化疗敏感性，因此DDX11蛋白是DNA损伤放化疗手段肿瘤治疗的潜在新靶点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> DDX11蛋白作为DNA损伤标志蛋白或放化疗治疗肿瘤靶点的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uccugcaugg cugagagcca ggcuu 25

<210> 2

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccaacuggca cugggaaguc cuuaa 25

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

uaaggcuaug aagagauac 19

Claims

1.一种DDX11基因的抑制剂在制备治疗癌症时提高对放疗敏感性的药物中的应用，所述放疗的方法为电离辐射处理；

所述DDX11基因的抑制剂为核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DDX11 siRNA1或核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DDX11 siRNA2；

所述癌症为宫颈癌和/或乳腺癌。