KR101734018B1 - 비타민 b6 결합 핵산 전달체 및 이를 이용한 유전자 암치료 - Google Patents

비타민 b6 결합 핵산 전달체 및 이를 이용한 유전자 암치료 Download PDF

Info

Publication number
KR101734018B1
KR101734018B1 KR1020140095959A KR20140095959A KR101734018B1 KR 101734018 B1 KR101734018 B1 KR 101734018B1 KR 1020140095959 A KR1020140095959 A KR 1020140095959A KR 20140095959 A KR20140095959 A KR 20140095959A KR 101734018 B1 KR101734018 B1 KR 101734018B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
vbpea
cancer
vitamin
complex
Prior art date
Application number
KR1020140095959A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150014399A (ko
Inventor
정종훈
샴하비 팬디
반가지 가르그
정필훈
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Publication of KR20150014399A publication Critical patent/KR20150014399A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101734018B1 publication Critical patent/KR101734018B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/02—Hydroxymethyl-, formyl- and related transferases (2.1.2)
    • C12Y201/02001—Glycine hydroxymethyltransferase (2.1.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 비타민 B6 결합 핵산 전달체(Vitamin B6 PEA, VBPEA) 및 상기 핵산 전달체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 핵산 전달체에 치료 핵산이 결합된 핵산 전달 복합체 및 해당 복합체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 약학제제에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 상기 유전자 전달체, 유전자 전달 복합체, 또는 이를 포함하는 약학제제를 이용한 유전자 치료에 관한 것이다. 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)는 기존에 존재하는 핵산 전달체들보다 현저히 높은 핵산 전달율을 가지며, DNA와 결합시 결합체의 세포 독성은 거의 없고, 생체 내 형질전환 효율 또한 매우 높은 것을 확인하였다. 또한, siRNA를 통한 유전자 사일런싱 효율도 높으며, 이를 이용하여 암세포에 높은 세포사멸 및 세포 증식 억제를 일으킬 수 있는 것을 확인함으로써, 항암 용도로 사용될 수 있음을 확인하였다 이에 따라, 본 발명의 핵산 전달체는 실험적인 유전자 전달체의 용도 뿐 아니라, 이를 구성하는 치료 핵산에 따라 다양한 질환에 대하여 유전자 치료 분야에서 폭넓게 사용될 수 있다.

Description

비타민 B6 결합 핵산 전달체 및 이를 이용한 유전자 암치료{Vitamin B6 coupled gene transporter and cancer gene therapy using the same as a gene carrier}
본 발명은 비타민 B6 결합 핵산 전달체(Vitamin B6 PEA, VBPEA) 및 상기 핵산 전달체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 핵산 전달체에 치료 핵산이 결합된 핵산 전달 복합체 및 해당 복합체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 약학제제에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 상기 유전자 전달체, 유전자 전달 복합체 또는 이를 포함하는 약학제제를 이용한 유전자 치료에 관한 것이다.
유전자 치료(gene therapy)는 치료 핵산을 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포 내에서 새로운 단백질이 발현되도록 하여 질병을 치료하는 것으로, 질병의 증상을 치료하는 것이 아니고 질병의 원인을 치료하여 제거하는 방식이다. 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료에 비해서 우수한 선택성을 가질 수 있고 다른 치료법으로는 조절하기 힘든 질병의 치료율 및 치료 속도를 개선하여 오랜 기간 동안 적용할 수 있다. 치료 핵산으로서 DNA는 생체 내 효소에 의한 가수분해에 취약하고 세포 내로 유입되는 효율이 낮기 때문에, 효과적인 유전자 치료를 위해서는 치료 핵산을 원하는 표적세포로 안전하게 전달하여 높은 발현효율의 달성을 가능케 하는 핵산 전달체(gene carrier)를 개발하는 것이 필요하다.
유전자 전달체는 독성이 낮거나 없어야 하며, 유전자를 선택적이고 효과적으로 원하는 세포에 전달할 수 있어야 한다. 이러한 핵산 전달체는 크게 바이러스성과 비바이러스성으로 나눌 수 있다. 최근까지 임상 실험에는 핵산 전달체로 형질도입 효율이 높은 바이러스성 벡터(viral vector)가 사용되었다. 그러나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노바이러스와의 복합체(adeno-associated virus)와 같은 바이러스성 벡터는 제조과정이 복잡할 뿐만 아니라, 면역원성, 감염 가능성, 염증 유발, 비특이적 DNA의 삽입 등의 안전성 문제와 수용할 수 있는 DNA의 크기가 한정되어 있다는 문제로 인해 인체에 적용하기엔 한계가 많다. 이에 현재는 비바이러스성 벡터(non-viral vector)가 바이러스성 벡터의 대용으로 각광을 받고 있다.
비바이러스성 벡터는 최소한의 면역반응으로 반복 투여할 수 있고, 특정 세포로의 특이적 전달이 가능하며, 저장 안정성이 우수하고, 대량 생산이 용이하다는 장점을 가지고 있다. 이러한 비바이러스성 벡터의 예로는 양이온성 리포좀(liposome) 계열로서 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 알킬암모늄(alkylammonium), 양이온성 콜레스테롤 유도체(cationic cholesterol derivatives), 그라미시딘(gramicidin) 등이 있다.
최근 비바이러스성 벡터 중 양이온성 고분자가 음전하를 띠는 DNA와 이온결합을 통한 복합체를 형성할 수 있기 때문에 많은 관심을 불러일으키고 있다. 이러한 양이온성 고분자에는 폴리-L-라이신(PLL), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산], 폴리아미도아민 덴드리머, 폴리[N,N'-(다이메틸아미노)에틸]메타크릴레이트(PDMAEMA) 등이 포함되며, 이들은 DNA를 압축하여 나노입자를 형성함으로써 효소분해로부터 DNA를 보호하고, 빠르게 세포 안으로 침투하여 엔도좀(endosome)에서 빠져나올 수 있도록 도와준다. 대부분의 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 비해 생분해성, 낮은 독성, 비면역원성, 사용상의 간편함 등의 장점을 가지나, 상대적으로 낮은 형질도입 효율, 제한적인 입자 크기 등의 문제점을 가지고 있다.
특히, 비바이러스성 벡터로 사용되는 대부분의 양이온성 고분자는 혈청 농도가 낮은 환경인 시험관 내에서는 높은 형질도입 효율을 나타내지만, 생체 내 환경에서는 혈청에 존재하는 각종 인자에 의하여 양이온성 고분자/유전자 복합체의 형질도입 효율이 심각하게 저해되어 유전자의 세포 내 유입이 원활하지 않다는 문제점이 있다. 이는 생체 내에서는 양이온성 고분자/유전자 복합체의 표면에 과도한 양전하가 발생하여 혈장 단백질 및 혈액 구성성분과의 비특이적 상호작용이 유발되기 때문이다. 따라서, 시험관 내의 무혈청 배지 또는 혈청이 매우 낮은 농도로 존재하는 환경이 아닌, 다량의 혈청이 존재하는 생체 내에서는 양이온성 고분자의 형질도입 효율이 현저히 저하되며, 이를 생체 내에 그대로 적용하는 경우에는 폐, 간 및 비장에서의 응집, 축적과, 나아가 망상내피계에 의한 옵소닌화(opsonization) 및 제거를 유발할 수 있기 때문에, 상기 양이온성 고분자의 치료적 적용은 크게 제한되지 않을 수 없다. 비바이러스성 벡터로서 가장 광범위하게 연구되고 있는 폴리에틸렌이민(PEI) 역시 생체 내 형질도입 효율이 현저히 떨어지며, 높은 세포독성 및 낮은 혈액 적합성으로 인한 유전자의 낮은 발현 효과 등의 문제점을 갖고 있다. 따라서, 기존의 비바이러스성 벡터의 장점은 그대로 유지하면서 형질도입 효율을 증강시킨 핵산 전달체의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 비타민 B6(VB6)는 세포의 생장이나 증식에 필요한 DNA 생합성을 포함한 다양한 세포 대사에 작용하는 조효소(coenzyme)로, 세포막에 존재하는 VB6 수송체(VB6 transporting membrane carrier, VTC)에 의해서 촉진확산(facillitated diffusion)되어, 세포 내로 유입된다. 특히, 암세포에서는 세포의 생장 및 증식이 활발하게 일어남에 따라, 암세포는 일반 성체 세포에 비하여 비타민 B6를 다량으로 요구하는 특징이 있다.
이에 본 발명자들은 세포독성은 낮으면서 높은 형질도입 효율을 나타내며, 특히 암세포에 중점적으로 유전자를 전달할 수 있는 핵산 전달체를 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 비타민 B6와 폴리에스터 아민을 결합한 핵산 전달체를 개발하고, 세포막에 존재하는 비타민 B6 수용체를 이용하여 유전자와 상기 전달체를 결합한 복합체의 세포막 접근성을 증대시킴으로써, 높은 형질전환 효율을 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허공보 제10-2010-0001563호 (2010.01.03)
Adv Drug Deliv Rev. 2002. 54. 715-58
본 발명의 하나의 목적은 핵산 전달체로서 세포독성을 나타내지 않으면서 형질전환 효율이 현저히 향상된 비타민 B6 결합 핵산 전달체(Vitamin B6 PEA, VBPEA)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 비타민 B6 결합 핵산 전달체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 비타민 B6 결합 핵산 전달체에 치료 핵산을 결합시킨 핵산 전달 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 전달 복합체를 유효성분으로 함유하는 유전자 치료용 약학제제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 비타민 B6 결합 핵산 전달체(Vitamin B6 PEA, VBPEA)를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112016046668450-pat00070
상기 식에서, n은 1 내지 500 사이의 정수이다. 상기 화학식에서 빨간 부분은 폴리에틸렌이민 유래의 부분, 파란 부분은 글라이세롤 디메타크릴레이트 유래의 부분, 초록 부분은 비타민 B6 유래 부분에 해당한다.
본 발명에 따른 비타민 B6 결합 핵산 전달체(Vitamin B6 PEA, VBPEA)는 저분자량 폴리에틸렌이민(PEI)과 글라이세롤 디메타크릴레이트(Glycerol dimethacrylate, GDM)와의 마이클 부가반응(Micheal addtion reaction)에 의해 폴리에스터아민(poly(ester-amine), PEA)을 제조하고, 이에 활성형 비타민 B6(pyridoxal 5'phosphate, PLP)를 반응시켜 제조될 수 있다.
본 발명에서 용어, "폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)"은 일차, 이차 및 삼차 아미노기를 갖고, 1,000 내지 100,000 g/mol의 몰 질량을 갖는 양이온성 고분자로서, 음이온성을 갖는 핵산을 효과적으로 압축하여 콜로이드 입자로 만들며, pH 반응성의 완충능력으로 인한 높은 유전자전달 효율을 가져 시험관 내 및 생체 내에서 유전자를 다양한 세포에 효과적으로 전달할 수 있다. 본 발명에서 폴리에틸렌이민은 하기 화학식 2로 표시되는 선형(linear) 또는 하기 화학식 3으로 표시되는 분지형(branched-type)일 수 있으며, 그 분자량은 세포독성을 고려하여 저분자량, 바람직하게는 50 내지 10,000 Da(중량 평균 분자량 기준)이다. 폴리에틸렌이민은 물, 알코올, 글리콜, 다이메틸포름아마이드, 테트라하이드로퓨란, 에스테르류 등에 용해되고, 고분자량의 탄화수소류, 올레산(oleic acid), 다이에틸에테르에는 용해되지 않는다.
[화학식 2]
Figure 112014071310113-pat00002
[화학식 3]
Figure 112014071310113-pat00003
본 발명의 용어, "글라이세롤 디메타크릴레이트(Glycerol dimethacrylate, GDM)"는 최근 바이오디젤 생산시 부수적으로 생산되는 글리세롤 유도체의 일종으로, 특히, 습윤성이 높아 콘택트 렌즈 소재로도 많이 쓰이는 인체 친화성 물질이다. 본 발명의 글라이세롤 디메타크릴레이트는 하기 화학식 4의 구조를 가질 수 있다.
[화학식 4]
Figure 112014071310113-pat00004
본 발명에서 폴리에틸렌이민과 글라이세롤 디메타크릴레이트는 마이클 부가반응을 통하여, 폴리에스터아민(poly(ester-amine), PEA)을 형성한다. 폴리에스터아민은 그 자체가 핵산 전달체로 사용될 수 있음이 알려져 있다. 이는 양이온성을 갖는 폴리에틸렌이민을 그 일부분으로 포함함으로써, 음이온성을 갖는 핵산의 응집을 유도할 수 있는 능력에 기인한다. 한편, 해당 폴리에스터아민보다 세포독성이 더 낮고, 형질전환 효율이 더 높은 핵산 전달체에 대한 요구가 계속되고 있으며, 특히 특정 세포(예를 들어, 암세포) 특이적으로 형질전환 효율이 높은 핵산 전달체에 대한 요구가 계속되고 있는 상태이다.
본 발명에서 "비타민 B6"는 피리독신(pyridoxine, PN), 피리독살(pyridoxal, PL), 피리독사민(pyridoxamine, PM) 또는 각각의 인산화 형태(PNP, PLP, PMP)등으로 존재하며, 많은 생활성 효소들의 조효소로 사용된다. 특히, 조효소로 사용되는데 있어서는, 주로 PLP 및 PMP의 형태로 사용되며, PLP는 생물학적 활성이 매우 큰 형태로 알려져 있다. 본 발명의 활성형 비타민 B6(피리독살 5'인산, pyridoxal 5'phosphate, PLP)는 하기 화학식 5의 구조를 가질 수 있다.
[화학식 5]
Figure 112014071310113-pat00005
본 발명에서는 피리독살 5'인산(pyridoxal 5'phosphate, PLP)와 상기 제조된 폴리에스터아민을 반응시켜 일시적 시프 염기(transient Schiff base)를 형성하도록 하였다. 이후 NaCNBH4를 이용하여 환원하여 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)를 수득하였다.
본 발명에서 용어, "비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)"는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 지칭한다. 특히 본 발명에서는 저분자량 폴리에틸렌이민(LW PEI)과 글리세롤 디메타크릴레이트(GDM) 간의 마이클 부가반응에 의하여, 폴리에스터아민(PEA)을 제조하고, 폴리에스터아민에 활성형 비타민 B6인 피리독살 5'인산을 반응시켜 형성된 화합물일 수 있다.
본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)는 비타민 B6 구성에 의하여 세포막에 존재하는 비타민 B6 수송체에 결합함에 따라 전달체의 세포막 부착을 유도하고, 이렇게 세포막에 부착된 뒤에는 폴리에스터아민(PEA) 골격에 의한 양성자 스폰지 효과로 세포내 핵산 유입이 효율적으로 유도되어 현저히 향상된 형질전환 효율을 나타낼 수 있다. 또한, 세포독성이 매우 낮아 유전자 전달체로서 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 비타민 B6에 대한 높은 요구성을 가지고 있는 암세포에 정상세포에 비하여 높은 형질전환 효율을 보일 수 있다.
본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)는 효과적인 유전자 전달을 위해　1,000 내지 100,000 Da 범위의 분자량(중량 평균 분자량 기준)을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)에 핵산을 결합한 핵산 전달 복합체는 1 내지 100 mV 범위의 제타 전위(zeta potential)를 갖는 것이 효과적인 유전자 전달을 위해 바람직하며, 특히 25 내지 50 mV의 제타 전위를 가질 수 있다. 상기 범위의 물리화학적 특성을 나타낼 때, 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)는 유전자 전달체로서 세포의 엔도좀(endosome) 내에 효과적으로 유입될 수 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 저분자량 폴리에틸렌이민과 글라이세롤 디메타크릴레이트 사이의 마이클 부가반응에 의해 폴리에스터아민을 형성하는 단계, 및 이를 활성형 비타민 B6와 반응시키는 단계를 포함하는, 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA) 제조방법은,
a) 저분자량 폴리에틸렌이민(PEI) 용액을 글라이세롤 디메타크릴레이트 용액에 첨가하여 마이클 부가반응을 수행하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계의 반응물로부터 형성된 폴리에스터아민(PEA,poly-(ester amine))을 분리하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 분리된 폴리에스터아민과 활성형 비타민 B6 (피리독살 5'인산, Pyridoxal 5'phosphate, PLP)를 반응시키는 단계; 및
d) NaCNBH4에 의하여 환원시켜 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 a)는 글라이세롤 디메타크릴레이트 용액에 을 교반하면서 폴리에틸렌이민 용액을 첨가하여 폴리에틸렌이민과 글라이세롤 디메타크릴레이트 사이의 마이클 부가반응을 수행하는 단계이다. 본 발명에 적합한 마이클 부가반응은 40 내지 100℃에서 1 내지 72시간 동안 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 마이클 부가반응에서 폴리에틸렌이민과 글라이세롤 디메타크릴레이트의 화학량비는 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.5이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 상기 제조한 글라이세롤 디메타크릴레이트 용액에 폴리에틸렌이민 용액을 서서히 적하 첨가한 후, 60℃에서 24시간 동안 반응시켜 마이클 부가반응을 수행하였다.
본 발명에 적합한 저분자량 폴리에틸렌이민은 50 내지 10,000 Da의 분자량(중량 평균 분자량 기준)을 갖는 선형 또는 분지형인 것이 사용될 수 있으며, 특히 분지형일 수 있다. 상기 폴리에틸렌이민과 글라이세롤 디메타크릴레이트 용액을 제조하는데 사용가능한 용매는 폴리에틸렌이민과 글라이세롤 디메타크릴레이트와 반응하거나 이들을 분해하지 않으면서 이들을 용해시킬 수 있는 것이라면 임의의 용매를 적절히 선택하여 채용할 수 있다. 이러한 용매의 예로는 다이메틸설폭사이드, 무수 메틸알코올, 에틸알코올, 다이메틸포름아마이드, 다이옥산 등을 들 수 있으며, 특히 무수 메탄올일 수 있다.
상기 단계 b)는 단계 a)의 마이클 부가반응에 의해 형성된 폴리에스터아민을 분리하는 단계로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 수득된 반응물을 4℃에서 24시간 동안 증류수에 대해 투석(투석막: Spectra/Por, MW 제한 3.5k; Spectrum Medical Industries, Inc., 로스엔젤레스, CA, USA)을 수행하여 폴리에스터아민(poly(ester-amine), PEA)를 분리하였다. 이렇게 분리된 폴리에스터아민은 동결-건조하여 0℃에 보관할 수 있는데, 동결-건조는 통상적으로 사용되는 동결-건조 방법 또는 동결-건조기를 사용하여 수행될 수 있고, 그 결과 부생성물이 제거된 점성을 갖는 폴리에스터아민(PEA)을 얻을 수 있었다.
단계 c)는 단계 b)의 분리된 폴리에스터아민과 활성형 비타민 B6 (피리독살 5'인산, Pyridoxal 5'phosphate, PLP)를 반응시키는 단계로, PEA 용액을 강하게 교반시키면서, 피리독살 5'인산 용액을 실온에서 24시간 동안 적하 첨가하여 반응시켰다. 이렇게 되면, PEA의 일차 아민이 피리독살 5'인산과 결합하여 일시적 시프 염기를 형성하게 되는데, 단계 d)에서는 이에 NaCNBH4를 첨가하여 환원을 유도해 이차 아민으로 전환시켰다. 이를 통해 최종 산물인 상기 화학식 1의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)를 제조하여 수득하였다. 이렇게 제조된 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체는 HPLC, 투석 등의 해당 분야에서 사용되는 임의의 방법을 통해 분리될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 비타민 B6 결합 핵산 전달체를 젤 투과 크로마토그래피/다각 레이저 빛 산란법(gel permeation chromatography coypled with multiangle laser light scattering, GPC-MALLS)으로 분석한 결과, VBPEA의 분자량(중량 평균 분자량 기준)은 대략 5000 내지 6000 Da 갖는 것으로 확인되었고, 1H NMR로 분석한 결과, 상기 VBPEA에서의 비타민 B6의 구성은 NMR 실험을 통해 예측한 결과 9.77 mol-% 정도인 것으로 나타났다(도 9 참고). 또한, 본 발명에 따른 VBPEA 내 비타민 B6의 피리독살 링(pyridoxal ring)의 양성자에 대한 피크는 δ= 8.0 ppm에서, PEA 백본의 양성자에 대한 피크는 δ= 1.1 ppm 및 2.4 ppm에서 검출되었다(도 9 참고). 상기 결과는 본 발명에 따른 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)가 효과적으로 합성되었음을 나타내는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 상기 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)에 치료 핵산이 결합된 유전자 전달 복합체를 제공한다.
본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)에 결합될 수 있는 치료 핵산의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 본 발명의 목적에 따라 원하는 표적에 전달되어 원하는 치료 효과를 발휘할 수 있는 어떠한 핵산도 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)와의 복합체 형태로 전달이 가능한 유전자로는 질병과 관련된 치료 핵산의 정상 유전자, 표적 단백질의 발현 억제 유전자, 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 크고 작은 폴리뉴클레오티드, 리보자임이나 siRNA를 포함하는 임의의 RNA 형태의 유전자가 포함될 수 있다. 즉, 본 발명의 치료 핵산은 siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), esiRNA(endoribonuclease-prepared siRNAs), 안티센스 올리고뉴클레오티드, DNA, 단일가닥 RNA, 이중가닥 RNA, DNA-RNA 혼성체(hybrid) 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태일 수 있다. 본 발명의 치료 핵산은 특히 특정 질환에 원인이 되는 유전자에 대하여, 이를 과발현시키거나 저해하기 위한 핵산일 수 있으며, 특히 암 발생 및 진행에 작용하는 유전자(oncogene)의 발현을 저해하는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), esiRNA(endoribonuclease-prepared siRNAs), 안티센스 올리고뉴클레오티드에 해당하는 핵산이나 암 발생이나 진행을 막는데 작용하는 유전자(tumor suppressor gene)의 발현을 유도하는 핵산일 수 있다. 특히, 본 발명에서 치료 핵산은 암세포 증식에 중요한 역할을 하는 비타민 B6 의존성 효소인 세린 하이드록시메틸전이효소(Serine hydroxymethyltransferase, SHMT)에 대한 siRNA 또는 이의 complex mixture인 esiRNA일 수 있으며, 이는 esiRNA Human SHMT1 (esiRNA1, Sigma, Cat No : EHU159081-50UG)일 수 있다.
본 발명의 용어, "세린 하이드록시메틸전이효소(Serine hydroxymethyltransferase, SHMT)"는 티미딜산(thymidylate) 합성을 위한 탄소 공급 반응을 촉매하는 티미딜산 생합성 대사경로(thymidylate biosynthesis pathway)에 관여하는 다효소 복합체를 구성하는 효소이다. SHMT에는 두 종류가 있는데 하나는 세포질의 SHMT1 이고 다른 하나는 미토콘드리아에 있는 SHMT2α이다. 이하 본 발명에서의 SHMT는 세포질의 SHMT1일 수 있다.
세포 분열과정에서 DNA 생합성에 관여하는 SHMT가 고농도로 존재하는 것이 알려져 있다. SHMT는 DNA 합성 과정에 두 가지 측면에서 기능하는데, 첫 번째로는 세린의 탄소를 테트라히드로엽산(tetrahydrofolate, THF)에 이동시켜 메틸렌-테트라히드로엽산을 생산하는 것을 통해 세린을 글리신으로 전환하는 반응을 촉진하고, 두 번째로는 다효소 복합체 형성에 필수적인 스캐폴드 단백질로 기능한다. 티미딜산 생합성에서 중추적인 역할을 함에 따라 SHMT의 발현은 속도 제한 인자(rate limiting factor)가 되었으며, 빠른 DNA 생합성을 필요로 하는 빠른 분열을 특징으로 하는 종양 세포에서 SHMT의 활성이 중요하다는 것이 알려져 있다. 이에 따라, 종양의 분열 과정에서 SHMT의 활성이 증진되는 것이 알려져 있으며, 또한 비정상적으로 SHMT가 과발현될 경우 종양의 생성과 발달 모두에 영향을 미칠 수 있다고 알려져 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 SHMT1에 대한 esiRNA를 VBPEA를 통하여 암세포(A549)에 도입하여 다른 핵산 전달체에 비하여 암세포 사멸 유도, 및 증식 억제 효과를 가지는 것을 확인하였다(실시예 8).
본 발명에 따른 유전자 전달 복합체의 효과적인 형성을 위해 치료 핵산과 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)를 1:0.5 내지 1:100, 바람직하게는 1:5 내지 1:40의 몰비로 반응시키는 것이 바람직하다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 치료 핵산에 대한 응축능(condensation capability)을 조사하기 위해 다양한 몰비로 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)와 DNA를 반응시킨 결과, 이들의 몰비가 1:5 이상인 경우에 상기 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)와 DNA의 유전자 전달 복합체(VBPEA/DNA)가 가장 효과적으로 형성되고(도 2a의 A 참고), DNA 가수분해 효소에 의한 공격으로부터 유전자 전달 복합체 내 DNA가 효과적으로 보호되며(도 2a의 B), 형성된 유전자 전달 복합체가 구형 모양의 압축된 구조를 가짐을 확인하였다(도 2b). 또한, 본 발명에 따른 핵산 전달 복합체는 평균 150 내지 300 nm의 상대적으로 균일한 입자 크기 분포를 나타내어(도 2c 및 2d) 유전자 전달체로 사용되기에 적합한 입자 크기를 가질 뿐만 아니라, 표면 전하가 30 내지 41 mV의 양성 제타 전위(zeta potential)를 나타내어(도 2e) 음이온 세포 표면에 효과적으로 결합할 수 있음을 확인하였다.
본 발명자들은 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 세포독성을 조사하기 위해, 무혈청 조건하에 DNA와 VBPEA의 다양한 몰비(5, 10, 20, 30, 40 및 50 N/P)로 제조된 핵산 전달 복합체를 다양한 세포(A549 세포, HeLa 세포 및 HepG2 세포, 도 3a 내지 도 3c)에 처리한 후 MTT 분석을 수행하여 세포 생존능을 조사하였다. 이를 PEA 및 PEI25k를 사용한 경우와 비교하였다. 상기 MTT 분석 결과, 본 발명의 VBPEA/DNA 복합체는 PEA/DNA 복합체 또는 PEI25k/DNA에 비하여 세포 독성이 현저히 적은 것을 확인하였다(도 3a 내지 3c). 구체적으로는, 본 발명의 VBPEA/DNA 복합체는 A549 세포, HeLa 세포 및 HepG2 세포주에서 98% 이상의 생존율을 확인하였다. 이에 비하여, PEA/DNA 복합체는 85 내지 90%의 생존율을 보였으며, PEI25k/DNA 복합체는 70%의 생존율을 가졌다.
또한, 본 발명자들은 본 발명에 따른 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 형질전환 효율을 조사하기 위해 다양한 세포주(A549 세포, HeLa 세포, HepG2 세포, 도 4a 내지 4c)에서 다양한 몰비로 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)와 DNA를 반응시켜 유전자 전달 복합체(VBPEA/DNA)를 형성한 후 이들의 형질전환 효율을 루시퍼라제(luciferase) 활성 분석을 통해 조사하였다(실시예 5-1). 그 결과, DNA와 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 몰비를 다양하게 처리하였을때, 1:10 내지 1:40까지의 모든 몰비에서 비슷한 수준의 높은 형질전환 효율을 나타내었다. 특히, 비교군으로 사용된 PEI 25K 처리군은 몰비가 증가함에 따라 유전자 전달 효율이 급격히 감소하는데 비해, 본 발명의 유전자 전달 복합체는 몰비와 상관없이 일정하게 높은 형질전환 효율을 유지하였고, 혈청의 존재 하에서도 형질전환 효율이 급격히 감소한 PEI 25K 처리군에 비해 안정적으로 높은 형질전환 효율을 유지함을 확인하였다(도 4d 참고).
아울러, 본 발명자들은 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 시험관 내 형질도입 효율을 조사하기 위해, A549 세포에서 VBPEA의 GFP 발현을 유세포 측정(flow cytometry)으로 분석하였다(실시예 5-2). 그 결과, PEA/DNA 복합체는 30 내지 35%, PEI25k/DNA 복합체는 10 내지 13%의 형질전환 효율을 가지는 반면, VBPEA/DNA 복합체는 40 내지 45%의 형질전환 효율을 가지는 것을 확인하였다(도 4e 및 도 5a).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 생체 내 형질도입 분포 및 효율을 조사하기 위해, VBPEA/pGL3 복합체를 정맥 내 주사를 통하여 Balb/c 마우스(그룹당 4마리)에 투여하여, 생체 내 분포를 분석하였다. 그 결과, 가장 높은 루시퍼라제 활성을 보이는 것은 췌장(spleen)이었으며, 폐, 뇌, 간 및 신장 순으로 루시퍼라제 활성을 보이는 것을 확인하였으며, 가장 낮은 활성을 보이는 것은 심장이었다(도 4f).
상기 결과는 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)가 DNA에 대한 결합능이 우수하여 효과적으로 나노 크기의 유전자 전달 복합체를 형성하고, 그로 인해 높은 형질전환 효율을 나타낼 뿐만 아니라, 이러한 형질전환 효율이 혈청의 존재 하에서도 안정적으로 높게 유지되어 생체 내 적용에 유리하게 사용될 수 있음을 의미하는 것이다. 본 발명에 따른 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 이렇게 높은 형질전환 효율은 공중합체의 완충능(buffering capacity)에 기인한 것이다.
이에 본 발명자들은 상기에 확인한 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 높은 효율의 형질전환 기작을 설명하기 위해, 실험을 진행하였다.
먼저, 본 발명의 VBPEA의 형질전환에 비타민 B6의 역할을 확인하기 위해서, 비타민 B6의 구조적 유사체인 4'-Deoxypyridoxine을 이용하여 경쟁 저해 실험을 수행하였다. 그 결과, 4'-Deoxypyridoxine 처리시(1 mM), PEA/DNA 복합체에 비하여 VBPEA/DNA 복합체의 형질전환 효율이 급격히 감소하는 것을 확인하였다. 이는 VBPEA/DNA 복합체의 높은 형질전환 효율은 VTC(VB6 transporting membrane carrier)에 비타민 B6가 결합함으로써 일어나는 현상이라는 것을 시사한다(도 6의 A).
또한, VBPEA/DNA 복합체의 세포 내 흡수 경로를 확인하기 위하여, 다양한 엔도사이토시스를 저해하고 이후 형질전환 효율을 비교하였다. 클라트린-매개 엔도사이토시스(clathrin-mediated endocytosis)는 이의 저해제인 클로르프로마진(Chlorpromazine)을, 카베올라-매개 흡수(caveolae-mediated uptake)는 이의 저해제인 β-메틸 사이클로덱스트린(β-methyl cyclodextrin) 또는 제니스테인(genistein)을 이용하여 세포에서의 해당 엔도사이토시스를 저해하였다. 그 결과, 카베올라의 저해제인 β-메틸 사이클로덱스트린 및 제니스테인을 처리한 경우에 VBPEA-매개 또는 PEA-매개 형질전환 효율이 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 이는 양 핵산 전달체가 카베올라 유입 경로를 이용한다는 것을 시사한다.
또한, VBPEA를 구성하고 있는 PEI에 의한 양자 스폰지 효과를 확인하기 위해, 엔도좀 양자 펌프 저해제(endosome proton pump inhibitor)인 바필로마이신 A1(bafilomycin A1, vacuolar type H+ ATPase 특이적 저해제, 200 nM)을 처리하고 이후 형질전환 효율을 비교하였다. 상기와 같이 바필로마이신 A1(bafilomycin A1)을 이용하여 액포형(vacuolar-type) 양자 펌프를 억제한 결과, VBPEA에 의한 형질전환이 1000배 가량 감소하는 것을 확인하였다. 이는 VBPEA의 형질전환은 양자 스폰지 효과를 통해 촉진된다는 것을 시사한다(도 12).
따라서, 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)는 DNA에 높은 결합능을 나타내고 DNA 분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 구형의 균일한 입자 크기의 유전자 전달 복합체를 형성할 수 있을 뿐만 아니라, 비타민 B6 수용체를 통한 세포막 부착을 유도함으로써, 세포내 섭취 경로를 촉진시키고, 세포질 내 지속기간이 증가되어 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 물리화학적 특성을 나타낼 뿐만 아니라, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내고 형질전환 효율이 매우 높아 유전자 치료를 위한 유전자 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 상기 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)에 치료 핵산이 결합된 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 함유하는 유전자 치료용 약학제제를 제공한다. 본 발명의 약학제제는 이를 구성하는 치료 핵산의 종류에 따라 유전자 치료가 가능한 질환의 치료 또는 예방 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학제제는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여 시에는 상기 유효성분 이외에 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 추가로 포함할 수 있다. 주사제의 경우에, 본 발명의 약학제제는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한, 국소 투여 시에 본 발명의 약학제제는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 약학제제의 제형은 상술한 바와 같이 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있으며, 특히 흡입 투여용 제형 또는 주사 투여용으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약앰플 또는 다중 투약형태로 제조할 수 있다. 기타 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다. 흡입(inhalation)을 통한 약물 전달은 비침습적(non-invasive) 방법 중 하나로, 특히 폐 질환의 광범위한 치료에 흡입 투여용 제형(예를 들어, 에어로졸)을 통한 치료 핵산 전달이 유리하게 이용될 수 있다. 이는 폐의 해부학적 구조 및 위치가 즉각적이고 비침습적인 접근을 가능케 하고, 다른 기관에는 영향을 미치지 않으면서 유전자 전달 시스템의 국소 적용을 받을 수 있기 때문이다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학제제는 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약학제제의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약학제제는 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 유효성분은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 약학제제의 유효 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 당해 기술 분야의 통상의 전문가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학제제는 이를 구성하는 치료 핵산이 세린 하이드록시메틸전이효소(Serine hydroxymethyltransferase, SHMT)의 발현 억제를 표적하는 것일 수 있으며, 이는 esiRNA Human SHMT1 (esiRNA1, Cat No : EHU159081-50UG)일 수 있다. 본 발명의 약학제제는 이를 구성하는 치료 핵산의 종류에 따라 암 치료 또는 예방 효과를 가지는 것일 수 있으며, 상기 암은 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 제 1 중추신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 아데노마로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 상기에서 설명한 본 발명의 VBPEA 핵산 전달체, 이를 포함하는 핵산 전달 복합체, 또는 이를 포함하는 약학제제를 이용한 유전자 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)는 기존에 존재하는 핵산 전달체들보다 현저히 높은 핵산 전달율을 가지며, DNA와 결합시 결합체의 세포 독성은 거의 없고, 생체 내 형질전환 효율 또한 매우 높은 것을 확인하였다. 또한, siRNA를 통한 유전자 사일런싱 효율도 높으며, 이를 이용하여 암세포에 높은 세포사멸 및 세포 증식 억제를 일으킬 수 있는 것을 확인함으로써, 항암 용도로 사용될 수 있음을 확인하였다 이에 따라, 본 발명의 핵산 전달체는 실험적인 유전자 전달체의 용도 뿐 아니라, 이를 구성하는 치료 핵산에 따라 다양한 질환에 대하여 유전자 치료 분야에서 폭넓게 사용될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(Vitamin B6 PEA, VBPEA)를 합성하는 과정을 보여주는 도면이다.
도 1b는 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체-매개 세린 하이드록시메틸전이효소(Serine hydroxymethyltransferase, SHMT1) 사일런싱 과정을 보여주는 도면이다.
도 1c는 세린 하이드록시메틸전이효소를 통한 티미딜산 합성 사이클과 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체-매개 세린 하이드록시메틸전이효소 사일런싱이 작용하는 기작을 보여주는 도면이다.
도 2a는 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 치료 핵산에 대한 응축능(condensation capability)을 조사하기 위해 다양한 몰비로 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)와 DNA를 반응시킨 결과를 확인한 도면이다. 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)과 치료 핵산을 반응시킨 핵산 전달 복합체의 DNA 보호효과를, DNAse Ⅰ을 처리하였을 때 DNA를 보호하는지 여부를 아가로스 겔 전기영동으로 확인한 도면이다.
도 2b는 본 발명의 핵산 전달 복합체(VBPEA/DNA)의 입자를 EF-TEM으로 확인한 도면이다.
도 2c 및 도 2d는 무혈청 조건에서 다양한 N/P 비율(5, 10, 20 및 30)로 제조된 본 발명의 핵산 전달 복합체의 입자 크기(도 2c)와, 다양한 농도의 혈청 존재 하(0%, 10%, 20%, 및 30%)에서 제조된 본 발명의 핵산 전달 복합체의 입자 크기(도 2d)를 측정한 결과를 확인한 도면이다.
도 2e는 다양한 N/P 비율(5, 10, 20 및 30)로 제조된 본 발명의 핵산 전달 복합체의 제타 전위를 측정한 결과를 확인한 도면이다.
도 2f는 다양한 N/P 비율(0.5, 1, 2, 3 및 5)로 제조된 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)과 siRNA를 반응시킨 핵산 전달 복합체의 응축능을 아가로스 겔 전기영동으로 확인한 도면이다.
도 2g는 다양한 N/P 비율(5, 10, 20 및 30)로 제조된 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)과 siRNA를 반응시킨 핵산 전달 복합체의 RNA 보호효과를, RNase를 처리하였을 때 RNA를 보호하는지 여부를 아가로스 겔 전기영동으로 확인한 도면이다. VBPEA/siRNA 복합체에 대하여 RNase 미처리군(레인 1), RNase 처리군(레인 2)과 free siRNA에 대하여 RNase 미처리군(레인 3), RNase 처리군(레인 4)을 확인하였다.
도 2h는 다양한 N/P 비율(5, 10, 20 및 30)로 제조된 본 발명의 핵산 전달 복합의 제타 전위(mV, 청색) 및 입자 크기(nm, 검은색)를 측정한 결과를 확인한 도면이다.
도 2i는 본 발명의 핵산 전달 복합체(VBPEA/siRNA)의 입자를 EF-TEM으로 확인한 도면이다.
도 3a 내지 도 3c는 무혈청 조건하에 다양한 N/P 비율(5, 10, 20, 30, 40 및 50 N/P)로 제조된 핵산 전달 복합체를 다양한 세포에 처리하여 세포 생존능을 확인한 결과이다. 구체적으로 3a는 A549 세포에서, 3b는 HeLa 세포에서, 3c는 HepG2 세포에서 확인한 결과이다.
도 4a 내지 도 4c는 무혈청 조건하에 다양한 N/P 비율(5, 10, 20, 30, 40 및 50 N/P)로 제조된 핵산 전달 복합체를 다양한 세포에 처리하여 루시퍼라제 분석을 통해 형질전환 효율을 확인한 결과이다. 구체적으로 4a는 A549 세포에서, 4b는 HeLa 세포에서, 4c는 HepG2 세포에서 확인한 결과이다.
도 4d는 본 발명의 복합체의 안정성에 혈청이 미치는 영향을 확인하기 위하여, A549 세포주에 N/P 20의 비율로 제작한 복합체를 0, 10, 20, 또는 30% 혈청 농도상에서 루시퍼라제 분석을 통해 형질전환 효율을 확인한 결과이다.
도 4e는 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 시험관 내 형질도입 효율을 조사하기 위해, A549 세포에서 VBPEA의 GFP 발현을 유세포 측정(flow cytometry)으로 분석한 도면이다.
도 4f는 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 에어로졸에 의한 생체 내 핵산전달 분포를 확인한 도면이다.
도 5a는 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 시험관 내 형질도입 효율을 조사하기 위해, A549 세포에서 VBPEA의 GFP 발현을 유세포 측정(flow cytometry)으로 분석한 도면이다.
도 5b는 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 siRNA에 대한 시험관 내 형질도입 효율을 조사하기 위해, A549 세포에서 VBPEA의 GFP 발현을 유세포 측정(flow cytometry)으로 분석한 도면이다.
도 6a는 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 형질전환 기작 분석하기 위해서 비타민 B6의 구조적 유사체인 4'-Deoxypyridoxine 처리하여 형질전환 효율을 분석한 도면이다.
도 6b는 본 발명의 VBPEA/siSHMT1가 VTC를 통해 세포 흡수를 촉진한다는 것을 확인하기 위하여, 4'-deoxypyridoxine 경쟁적 저해제의 존재 또는 비존재 하에 A549 세포에 VBPEA/siRNA 복합체로 형질전환한 후 120분 뒤에 TRITC(적색)로 표지한 VBPEA(청색)와 DAPI로 표지된 핵DNA를 촬영한 공초점 현미경 이미지이다.
도 6c는 본 발명의 VBPEA/siSHMT1가 VTC를 통해 세포 흡수를 촉진한다는 것을 확인하기 위하여, 4'-deoxypyridoxine 경쟁적 저해제의 존재 또는 비존재 하에 A549 세포에 VBPEA/siSHMT1 및 PEA/siSHMT1 복합체(N/P 20)를 처리하고, SHMT1 발현량을 웨스턴 블랏으로 측정한 결과이다. PEA를 핵산 전달체로 이용한 경우에는 4'-deoxypyridoxine에 의한 저해 효과를 보이지 않은 반면, VBPEA를 이용한 경우에만 저해 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
도 7은 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 형질전환 기작 분석하기 위해 실험한 결과를 나타낸 도면이다. 구체적으로 도 7의 A는 비타민 B6를 별도로 처리한 경우와 VBPEA 핵산 전달체 형태로 처리한 경우에 형질전환을 촉진하는데 있어 미치는 영향을 분석한 도면이다. 도 7의 B는 인간 또는 마우스 일차 폐 세포 또는 폐암세포에서의 VBPEA/DNA 복합체의 형질전환 효율을 비교한 도면이다. 도 7의 C는 VBPEA 핵산 전달체를 이용하여 유전자 사일런싱(gene silencing)이 가능한지 확인한 도면이다.
도 8a는 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 형질전환에 비타민이 작용하는 기작을 모식화한 도면이다.
도 8b는 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 형질전환 기작을 모식화한 도면이다.
도 8c는 A549 세포에서 VBPEA/siRNA 복합체의 흡수 및 분해를 확인하였다. 공초점 현미경을 통하여 VBPEA/siRNA 처리 후 0일(3h), 2일, 3일, 5일, 6일 및 7일에 걸쳐서 TRITC 표지된 VBPEA(적색)의 흡수 및 분해 과정을 확인한 도면이다. 핵은 DAPI(청색)으로 염색하였다.
도 8d는 A549 세포에서 VBPEA/siRNA 복합체의 독성을 확인하기 위해서 복합체를 처리한 후 3h, 2일, 5일 및 7일에 걸쳐서 세포의 생존율(% cell viability)를 측정한 결과이다.
도 9는 동결-건조된 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 구성을 1H-핵자기 공명(1H-nuclear magnetic resonance, 1H-NMR)(Avance 600, Bruker, Germany, 600 mHz)으로 분석한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 인간과 마우스 정상 폐세포(16HBE-인간, LA4-마우스)에 대한 세포독성을 확인한 도면이다(n = 3, error bar = SD).
도 11a 내지 도 11c는 VBPEA 흡수 경로를 확인하기 위하여, 다양한 엔도사이토시스를 저해하고 이후 형질전환 효율을 비교한 도면이다. 구체적으로는 카베올라-매개 흡수(caveolae-mediated uptake)는 이의 저해제인 β-메틸 사이클로덱스트린(β-methyl cyclodextrin)(도 11a) 또는 제니스테인(genistein)(도 11b)을 처리하여 확인하였고, 클라트린-매개 엔도사이토시스(clathrin-mediated endocytosis)는 이의 저해제인 클로르프로마진(Chlorpromazine)(도 11c)을 처리하여 확인한 도면이다(n = 3, error bar = SD) (*p < 0.05; **p < 0.01, ***p < 0.001, one-way ANOVA).
도 12는 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 양성자 스폰지 효과에 따른 형질전환 기작을 갖는지 규명하기 위해, 엔도좀 양자 펌프 저해제(endosome proton pump inhibitor)인 바필로마이신 A1(bafilomycin A1, vacuolar type H+ ATPase 특이적 저해제, 200 nM)을 처리하여 확인한 도면이다(n = 3, error bar = SD) (***p < 0.001, one-way ANOVA).
도 13a는 다양한 siRNA 농도(0, 50, 100 및 150 pM)로 제조된 핵산 전달 복합체의 세포 독성을 확인한 도면이다(n = 3, error bar = SD) (*p < 0.05, one-way ANOVA).
도 13b는 다양한 siRNA 농도(0, 50, 100 및 150 pM)로 제조된 핵산 전달 복합체를 A549 세포에 처리하여 세포 독성을 확인한 도면이다(n=3, error bar = 표준편차)(*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001, one-way ANOVA).
도 14a 내지 도 14d는 siRNA와 결합한 본 발명의 핵산 전달 복합체를 이용하여 유전자 사일런싱이 효율적으로 일어나는지를 확인한 도면이다.
도 14e는 siRNA와 결합한 본 발명의 핵산 전달 복합체를 이용하여 유전자 사일런싱이 효율적으로 일어나는지를 확인한 도면이다. 구체적으로 미처리, VBPEA/siScr 처리, naked siSHMT1 처리, PEA/siSHMT1 처리 및 VBPEA/siSHMT1 처리(N/P 20)한 후 24시간, 48시간 및 72시간 지난 후 SHMT의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 15a는 siRNA와 결합한 본 발명의 핵산 전달 복합체를 이용하여 유전자 사일런싱이 효율적으로 일어나는지를 현미경으로 확인한 도면이다.
도 15b는 siRNA와 결합한 본 발명의 핵산 전달 복합체를 처리한 경우 SHMT1 유전자 사일런싱으로 인한 세포 사멸 유도 효과를 Annexin V 염색으로 확인한 도면이다.
도 16a는 암세포에 본 발명의 핵산 전달 복합체를 이용한 siSHMT1 전달을 통하여 암세포의 증식 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 16b는 암세포에 본 발명의 핵산 전달 복합체를 이용한 siSHMT1 전달을 통하여 암세포의 증식 억제 효과를 광학 현미경으로 확인한 도면이다.
도 17은 암발생 동물 모델에서 생체 내 실험을 통하여, VBPEA를 이용한 siSHMT1 전달을 통한 SHMT1 유전자 사일런싱 효과를 확인한 도면이다(그룹별 n =4).
도 18은 암발생 동물 모델에서 생체 내 실험을 통하여, VBPEA를 이용한 siSHMT1 전달에 따른 종양 크기의 변화를 IVIS imaging system 100을 이용하여 2주에 한 번씩 측정한 bioluminescence 이미지이다(그룹별 n =4).
도 19는 암발생 동물 모델에서 생체 내 실험을 통하여, VBPEA를 이용한 siSHMT1 전달에 따른 종양 크기의 변화를 IVIS imaging system 100을 이용하여 1주에 한 번씩 측정한 결과이다.
도 20a는 A549 세포에서 SHMT1 넉다운(knockdown)이 미치는 영향을 확인한 도면이다. (A)는 분열 중인 세포를 EdU를 통해 확인한 도면이며, (B)는 이를 형광측정한 도면이다. 그 결과 VBPEA/siSHMT1를 처리한 4일차까지도 분열 중인 세포가 적은 것을 확인할 수 있었다.
도 20b는 A549 세포에서 SHMT1 넉다운(knockdown)이 미치는 영향을 확인한 도면이다. 구체적으로 세포 사멸(apoptosis)이 일어나는 세포를 Tunel assay를 통해 확인한 결과, 다른 핵산 전달체인 PEA나 naked siSHMT1를 처리한 경우보다 세포 사멸 중인 세포 수가 현저히 많은 것을 확인할 수 있었다.
도 21a는 SHMT1 넉다운(knockdown)이 DNA 합성 및 세포 주기 억제(cell cycle arrest)에 미치는 영향을 확인한 도면이다. 구체적으로, S 주기에 싱크로시킨 A549 세포를 바탕으로 미처리군, VBPEA/siScr 처리군 또는 VBPEA/siSHMT1 처리군에서 SHMT1(적색)와 핵라미나(nuclear lamina, 녹색)의 공-위치(co-localization)하는지 여부를 확인한 도면이다. 음성 대조군(VBPEA/siScr 처리군)에서 분열중인 세포는 화살표로 표시하였다.
도 21b 및 도 21c는 A549 세포를 바탕으로 미처리군, VBPEA/siScr 처리군, naked siSHMT1 처리군, PEA/siSHMT1 처리군 및 VBPEA/siSHMT1 처리군에서 genomic DNA 양 및 형광 세기(형광 염색 : Hoechst 33258)를 확인한 도면이다.
도 21d는 A549 세포에 미처리, VBPEA/siScr 처리, naked siSHMT1 처리, PEA/siSHMT1 처리 및 VBPEA/siSHMT1 처리(N/P 20)한 후 12시간, 24시간 및 72시간 지난 후 세포들의 세포주기 프로파일(profile)을 FACS를 통해 측정한 도면이다.
도 21e는 세포주기 단계 및 각 단계별 세포 내 현상을 도식화한 도표이다.
도 22는 암발생 동물 모델에서 생체 내 실험을 통하여, VBPEA를 이용한 siSHMT1 전달에 따른 종양 조직의 면역화학염색을 통해 SHMT1 단백질의 발현을 확인한 도면이다.
도 23은 암발생 동물 모델에서 생체 내 실험을 통하여, VBPEA를 이용한 siSHMT1 전달에 따른 종양 조직의 세포 사멸 양상을 확인하기 위해 Tunel assay를 수행한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1: 사용 시약 및 물질
본 발명에서는 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(Vitamin B6 PEA, VBPEA)를 제조하고 이하 실시예 및 실험예를 확인하기 위하여 하기의 물질 및 시약을 사용하였다. bPEI(branched Poly(ester imine), Mn: 1.2k 및 25k), DMSO(dimethyl sulfoxide), PLP(Pyridoxal 5'phosphate), NaCNBH4(sodium cyanoborohydride), 제니스테인(genistein), 클로르프로마진(Chlorpromazine), 메틸-β-사이클로덱스트린(methyl--cyclodextrin), 바필로마이신 A1(bafilomycin A1), MTT(3-(4,5-dimethyl thioazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetra-zolium bromide) 시약 및 4'-디옥시피리독신 염산염(4'-deoxylpyridoxine hydrochloride)는 시그마(St.Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 또한, 반딧불 루시퍼라제(firefly, Photonus pyralis)를 암호화하는 루시퍼라제 리포터(Luciferase reporter), pGL3- 벡터 및 인핸서는 프로메가(Promega, Madison, WI, USA)로부터 얻었다. GFP(Green fluorescent protein) 유전자는 클론텍(Clontech, Palo Alto, CA, USA)로부터 얻었다. 공초점 현미경 분석에는 TRITC(Tetramethylrhodamine isothiocyanate)와 YOYO-1 iodide(Molecular Probes, 인비트로젠, Oregon, USA) 염료를 사용하였다. 또한, 웨스턴블랏 및 면역화학염색 분석에는 항-SHMT 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA), 항-β actin 항체(Abfrontier, 서울, 대한민국), 핵라미나 특이적 LAP2 항체(Millipore, CA, USA) 및 HRP 결합 2차 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였다.
표 1에 개시한 비특이적 스크램블 siRNA(Nonspecific scrambled siRNA, siScr)과 루시퍼라제 siRNA는 제놀루션 제약회사(Genolution Pharmaceuticals, Inc., 서울, 대한민국)에서 구입하여 사용하였다. 본 실시예 또는 실험예에서 사용한 모든 화합물들은 분석 시약 등급(analytical reagent grade)이었다.
siRNA 서열
siRNA 센스(5'->3') 안티센스(5'->3')
siRNA scrambled
(siScr)
 CGUACGCGGAAUACUUCGAUU
(서열번호 1)		 UCGAAGUAUUCCGCGUACGUU
(서열번호 2)
siRNA Luciferase
(siLuc)		 CUUACGCUGAGUACUUCGAUU
(서열번호 3)		 UCGAAGUACUCAGCGUAAGUU
(서열번호 4)
siRNA GFP GUUCAGCGUGUCCGGCGAGUU
(서열번호 5)		 CUCGCCGGACACGCUGAACUU
(서열번호 6)
siRNA Serine hydroxymethyltransferase
(siSHMT1)		 esiRNA Human SHMT1
(esiRNA1, Cat No : EHU159081-50UG)
(Complex mixture로 특정 서열 없음)
실시예 2: 비타민 B6 결합 핵산 전달체의 제조
본 발명에 따른 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)는 문헌(Arote RB, et al., Bioconjug. Chem. 2009, 20(12): 2231-41)에 보고된 방법을 약간 변형한 마이클 부가반응에 따라 합성하였다(도 1).
간략히 정리하면, 저분자량 bPEI와 글라이세롤 디메타크릴레이트(Glycerol dimethacrylate, GDM)을 교차 연결하여 PEA(poly(ester amine))을 제조한 후, 이에 활성형 비타민 B6(Pyridoxal 5'phosphate, PLP)와 결합하는, 두 단계 반응을 통해 VBPEA 핵산 전달체를 제조하였다. 자세한 과정은 하기에 설명한다.
2-1: PEA의 제조 단계
PEA는 저분자량 bPEI(1.2k)와 GDM 간에 마이클 부가 반응을 통하여 제조하였다. 먼저, GDM과 저분자량 bPEI를 무수 메탄올에 각각 용해시킨 후, 60℃에서 일정한 교반속도를 유지하면서 GDM 용액에 저분자량 bPEI 용액을 화학량비가 1:2가 되도록 24시간동안 천천히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 Spectra/Por 멤브레인(MW 제한 3.5k; Spectrum Medical Industries, Inc., 로스엔젤레스, CA, USA)을 이용하여, 4℃에서 24시간 동안 증류수에서 투석하였다. 이렇게 제조한 합성물을 동결건조하여 0℃에 보관하였다.
2-2: VBPEA 제조 단계
상기 실시예 2-1에서 제조한 PEA의 존재하에서 10 mol%의 일차 아민을 피리독살 5'인산(pyridoxal 5'phosphate, PLP)과 반응시켜 일시적 시프 염기(transient Schiff base)를 형성하도록 하였다. 이후 NaCNBH4에 의해서 환원되어 VBPEA를 수득하였다. 구체적으로는, PLP 용액(25 mg/mL) 10 mL을 PEA 1g과 NaHCO3 100mg을 포함하는 50 mL 수용액에 적하 첨가하였다. 상기 적하 첨가는 실온에서, 24시간 동안 강하게 교반시키며 수행하였다.
이후, 상기 생성된 시프 염기를 이차 아민으로 환원하기 위하여 NaCNBH4 50 mg을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 Spectra/Por 멤브레인(MW 제한 3.5k; Spectrum Medical Industries, Inc., 로스엔젤레스, CA, USA)을 이용하여, 4℃에서 24시간 동안 증류수에서 투석하였다. 이렇게 제조한 합성물을 동결건조하여 0℃에 보관하였다.
그 결과, PEA의 말단 아민이 비타민 B6(pyridoxal 5'phosphate)의 알데하이드 기와 반응하여, 불안정한 일시적 시프 염기를 형성하였고, 이는 NaCNBH4을 이용하여 환원하였다. 이렇게 생성된 VBPEA에 대하여 그 구성, DNA 응축 및 보호능, 크기, 제타 전위 및 DNA 복합체 형태를 분석하였다.
2-3. 비타민 B6 결합 핵산 전달체의 특성 분석
동결-건조된 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA) 및 PEA의 구성을 1H-핵자기 공명(1H-nuclear magnetic resonance, 1H-NMR)(Advanced 600, Bruker, Germany, 600 mHz)으로 분석하였다. VBPEA의 절대 분자량은 Sodex OHpack SB-803 HQ(Phenomenex, Torrells, CA, USA) 컬럼을 이용한 젤 투과 크로마토그래피/다각 레이저 빛 산란법(gel permeation chromatography coypled with multiangle laser light scattering, GPC-MALLS)을 통해 측정하였다. 상기 컬럼 분석은 유속 0.5 ml/min으로 분석하였으며, 25℃로 유지했다.
먼저, 상기 VBPEA의 구성을 1H-핵자기 공명으로 분석한 결과, 8.0 ppm에서 강한 피크를 보였으며, 이는 비타민 B6의 피리독살 링(pyridoxal ring)에 존재하는 양자를 보여주었다. PEA 백본은 1.1 ppm 및 2.4 ppm에서의 메틸 피크로 확인하였다. 비타민 B6와 PEA, VBPEA의 NMR 데이터를 비교한 결과는 도 9에서 확인할 수 있었다. VBPEA에서의 비타민 B6의 구성은 NMR 실험을 통해 예측한 결과 9.77 mol-% 정도에 해당하였다.(도 10)
아울러, 상기 GPC-MALLS를 통하여 측정한 VBPEA의 분자량은 대략 5000 내지 6000 Da 였다. 상기 결과를 정리하면 하기 표 2와 같다.
VBPEA 구조적 특성
샘플 반응물 분자량(Da) PEA
(mol-%)		 VB6
(mol-%)		 분자량
(Da)		 다분산지수
(PDI)
PEA VB6
VBPEA 5000-
5200		 247 90.23 9.77 5000-
6150		 1.12
실시예 3: 비타민 B6 결합 핵산 전달체/핵산 복합체의 특성 분석
3-1. VBPEA 의 DNA 및 RNA 응축능
유전자 전달체의 가장 중요한 특징 중 하나는 핵산과 상호작용하여 이를 응축시킬 수 있는 능력이다. 이에 상기 실시예 2에서 제조된 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 DNA 및 RNA의 응축능을 아가로스 젤 전기영동으로 젤 이동 지체 분석(gel retardation assay) 확인하였다.
먼저, VBPEA와 pGL3 플라스미드(5.3 kb, Promega)를 0.5, 1, 3, 5, 및 10의 다양한 몰비(N/P ratio)로 혼합한 후 고온멸균한 물로 총량 20 ul를 맞춰주었다. 이를 가볍게 볼텍싱(vortexing)해주고 실온에서 30분간 인큐베이션한 후, 1 x 로딩 염료(Biosesang, 대한민국)을 첨가한 각 반응용액을 0.8 % 아가로스 겔에 전기영동(100 V)을 수행하고 자외선 하에서 DNA 이동성을 관찰하였다. 이때, 대조군으로는 본 발명의 VBPEA와 반응시키지 않은 pGL3 플라스미드 단독을 사용하였다.
그 결과 도 2a에서 확인할 수 있듯이, N/P 비율 5의 경우에 젤 이동이 완전이 지연되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 VBPEA가 높은 DNA 결합능을 가지고 있으며 플라스미드 DNA를 효과적으로 응축시켜 핵산 전달 복합체(VBPEA/DNA)를 형성하였음을 나타내는 것이다. 대조군인 비반응 플라스미드 DNA는 아무런 지연 없이 겔을 통과하여 이동하였다. 상기 결과로부터 핵산 전달 복합체의 효과적인 형성을 위해서는 플라스미드 DNA와 본 발명의 VBPEA를 N/P 5 이상의 비로 혼합하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
또한, VBPEA와 siRNA(1 ㎍)를 0.5, 1, 3, 및 5의 다양한 몰비(N/P ratio)로 혼합하였으며, 대조군으로 동량의 free siRNA를 사용하였다. 상기 샘플에 1 x 로딩 염료(Biosesang, 대한민국)을 첨가한 각 반응용액을 2 % 아가로스 겔(0.1 ㎍/㎖ EtBr)에 전기영동(100 V)을 수행하고 자외선 하에서 DNA 이동성을 관찰하였다.
그 결과, 도 2f에서 확인할 수 있듯이, N/P 비율 5의 경우에 젤 이동이 완전이 지연되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 VBPEA가 높은 RNA 결합능을 가지고 있으며 siRNA를 효과적으로 응축시켜 핵산 전달 복합체(VBPEA/DNA)를 형성하였음을 나타내는 것이다.
3-2. VBPEA 의 핵산 보호효과
효과적인 유전자 발현을 위해서는 핵산분해효소와 같은 효소 공격으로부터 핵산 전달 복합체 내의 핵산(DNA 및 RNA)이 보호되어야 한다. 이러한 핵산 보호효과를 확인하기 위해, 상기 실시예 2에서 제조한 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)와 pGL3 플라스미드 DNA를 10:1의 몰비(N/P 비율)로 실온에서 30분간 반응시켜 핵산 전달 복합체(VBPEA/DNA)를 제조하였다. 상기 핵산 전달 복합체 용액 4 ㎕ 또는 비반응 플라스미드 DNA를 포함하는 DNase/Mg2+ 분해 완충액(50 mM TrisCl, pH 7.6 및 10 mM MgCl2)에 DNase I 1 ㎕(50 유닛)를 첨가하고 37℃에서 30분간 배양 교반기에서 인큐베이션하였다. 이후, 효소 반응을 중지시키기 위해, 모든 반응용액에 4 ㎕의 EDTA(250 mM, 1N NaOH)를 실온에서 30분간 처리한 후, VBPEA와 DNA의 이온결합을 분리하기 위하여 1% 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, pH 7.2)를 5 ㎕를 첨가하여 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 분리된 DNA를 포함하는 용액을 트리스-아세테이트-EDTA 완충액(1xTAE running buffer)을 이용해 0.8% 아가로스 겔에서 40분 동안 100 V로 전기영동을 수행하였다.
그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 대조군인 비반응 플라스미드 DNA는 DNase I에 의해 완전히 분해된 반면(레인 2), 본 발명의 핵산 전달 복합체(VBPEA/DNA) 내의 DNA는 DNase I의 분해로부터 효과적으로 보호되었음을 알 수 있다(레인 4). 이러한 결과는 본 발명의 핵산 전달 복합체가 핵산분해효소의 공격으로부터 DNA를 보호하면서 효과적으로 세포 내로 전달할 수 있음을 나타내는 것이다.
아울러, VBPEA가 RNase로부터의 RNA를 보호하는 능력을 확인하였다. 30분간 RNase를 처리한 후 RNase 반응을 불활성화하기 위해 5 ㎕ EDTA(100 mM)를 첨가하여 70 ℃에서 10분간 처리하였다. 이후, 실온에서 30분간 정치하였다. 최종적으로 보호된 siRNA는 1% 소디움 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 5 ㎕를 추가하여 두 시간 처리하는 것을 통해 복합체로부터 release시켜 2% 아가로스 겔(0.1 ㎍/㎖ EtBr)에 전기영동(100 V)을 수행하고 DNA 이동성을 관찰하였다.
그 결과, 도 2g에서 확인할 수 있듯이, 대조군인 free siRNA는 RNase에 의해 완전히 분해된 반면(레인 4), 본 발명의 핵산 전달 복합체(VBPEA/siRNA) 내의 RNA는 RNase를 처리하지 않은 정도와 거의 차이가 없을 정도로 효과적으로 보호되는 것을 알 수 있다(레인 2). 이러한 결과는 본 발명의 핵산 전달 복합체가 핵산분해효소의 공격으로부터 RNA를 보호하면서 효과적으로 세포 내로 전달할 수 있음을 나타내는 것이다.
3-3. VBPEA 핵산 전달체/DNA 복합체의 형태학적 분석
상기 실시예 3-1에서 비타민 B6 결합 핵산 전달체와 pGL3 플라스미드 DNA를 20:1의 몰비(N/P 비율)로 반응시켜 제조한 핵산 전달 복합체(VBPEA/DNA)의 형태를 투과 전자현미경(LIBRA 120, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였다. 구체적으로는, VBPEA/DNA 복합체(N/P 20)와 대조군으로 PEI25k/DNA 복합체(N/P 10)를 제조하여, 탄소 격자(carbon grid)에 로딩하여 1% 우라닐 아세테이트로 10 초간 염색한 후, 증류수로 세척하였다. 이후 샘플을 10분간 건조한 후, 전자 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 2d에 나타난 바와 같이, 본 발명의 VBPEA/DNA 복합체는 나노스케일의 입자 크기를 가져 세포 흡수에 적합한 것을 보여준다.
3-4. VBPEA 핵산 전달체/핵산 복합체의 표면 전하 측정
유전자 전달 복합체의 양성 표면 전하는 음이온 세포 표면에 결합하는데 필수적이고, 이는 복합체의 세포 내 유입을 용이하게 한다.
먼저, 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체와 플라스미드 DNA를 다양한 몰비로 반응시켜 형성된 핵산 전달 복합체(VBPEA/DNA)와 비교군으로 PEA/DNA 복합체 및 PEI25k/DNA 복합체의 제타 전위(zeta potential)를 동적 광 산란 분광 광도계(DLS-8000, Otsuka Electronics, Osaka, 일본)를 이용하여 측정하였다. 25 ℃ 각각 90˚ 및 20˚의 산란각에서 측정하였다. 시료는 총 부피 1mL에 최종 DNA 농도가 40 ㎍/mL이 되도록 N/P 비율 5, 10, 20 및 30으로 30 분간 인큐베이션하였다. PEA/DNA 복합체(N/P 20)와 PEI25k/DNA 복합체(N/P 10)과 비교하여, VBPEA/DNA 복합체(N/P 20)의 안정성에 혈청 단백질이 미치는 영향을 확인하기 위해서, 다양한 농도의 혈청 존재 하(0%, 10%, 20%, 및 30%)에서 제조된 핵산 전달 복합체의 입자 크기를 측정하였다.
상기 동적 광 산란 분광 광도계(Dynamic light scattering spectrometer, DLS)를 통하여 N/P 비율 또는 혈청의 비율이 증가함에 따라, VBPEA/DNA 복합체의 크기가 줄어드는 경향을 가진다는 것을 확인하였다. 다만, 본 발명의 VBPEA/DNA 복합체는 N/P 비율이 증가함에 따른 제타 전위가 다른 PEA/DNA 복합체나 PEI25k/DNA 복합체에 비하여 그 증가량이 크지 않으나, 35 mV에서 41 mV로 증가하는 것을 확인하였다(도 2f). 본 발명의 VBPEA와 플라스미드 DNA를 20:1의 몰비로 반응시켜 제조한 핵산 전달 복합체가 가장 높은 양성의 제타 전위를 나타내었고, 그 값은 모두 양성값을 나타내었다. 이처럼 표면 전하가 양전하를 띤다는 것은 음전하를 띠는 DNA가 핵산 전달 복합체 내부에 완전히 둘러싸여 있음을 의미하고, 양성의 표면 전하는 핵산 전달 복합체의 세포 내로의 유입을 용이하게 할 뿐만 아니라, 입자들 사이에 정전기적 반발력을 일으켜 입자들끼리의 응집현상을 감소시키는 장점이 있다.
일정한 응집 한계(~110 nm, N/P 20)에 도달하고 나서는 복합체의 크기는 다시 증가하기 시작하였으며, 이는 복합체 내 정전기적 반발력 때문일 것으로 사료된다. 한편, PEA/DNA 복합체에 비하여 제타 전위의 증가량이 강하지 않은 것은 비타민 B6와의 결합 때문인 것으로 사료된다. 또한, 혈청 단백질과의 응집에 의한혈청 비율의 증가에 의한 PEI25k/DNA 복합체의 지속적인 크기 증가는 해당 복합체가 세포 흡수에 적합하지 않음을 시사한다. 반면, VBPEA/DNA 복합체는 혈청 비율에 의하여 크기 변화가 거의 없는 것을 확인하였다. 이는 PEA 백본의 히드록실기에 비타민 B6가 결합함에 따라, PEA 백본의 양전하와 혈청 단백질과의 결합이 방해받는 것 때문인 것으로 사료된다.
또한, EF-TEM 이미지를 통하여 VBPEA/DNA 복합체가 동일한 크기 분포(120 nm 이하)를 가지는 것을 확인하였다(도 2c). 특히, PEI25k/DNA 복합체에 비하여 비교적 잘 구별되는 구형을 가지고 응집(aggregation)이 일어나지 않아, 세포 내로의 흡수를 용이하게 할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체와 siRNA를 다양한 몰비로 반응시켜 형성된 핵산 전달 복합체(VBPEA/siRNA)에 대하여 동적 광 산란 분광 광도계(DLS-8000, Otsuka Electronics, Osaka, 일본)를 이용하여 제타 전위(zeta potential)를 측정하였으며, 입자 크기를 측정하였다.
그 결과, 도 2h에서 확인할 수 있듯이, N/P 10 내지 N/P 20인 경우에 제타 전위가 현저히 낮아지는 것을 확인할 수 있으며, 이와 비례해서 입자의 크기가 감소하였다.
또한, EF-TEM 이미지를 통하여 VBPEA/siRNA 복합체가 동일한 크기 분포(120 nm 이하)를 가지는 것을 확인하였다(도 2i).
실시예 4: 비타민 B6 결합 핵산 전달체의 시험관 내 형질전환 효율 분석
4-1. 마우스 일차 폐세포 분리 및 배양
인간 폐 선암종 상피세포주(A549)와 마우스 폐 선종 세포주(LA-4)는 RPMI-1640 배지로 배양하였다. 인간 경부 상피 암종 세포주(HeLa) 및 인간 간암 세포주(HepG2)는 DMEM(저-포도당, low glucose) 배지로 배양하였다. 인간 기관지 상피 세포(16HBE)는 10% 열처리 불활성화 우태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/Ham's F12 배지(FBS, HyClone, Logan, UT, USA)에 배양하였다. 모든 세포는 37℃, 5% CO2의 표준 배양 환경에서 배양하였다.
폐 세포 단세포 부유액(Lung single cell suspension)을 얻기 위해서, 마우스(6주령)으로부터 폐를 수득하여, 0.5 mg/mL 콜라게네이즈 D(Collagenase D, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) 및 100 ㎍/mL DNase I(Sigma-Aldrich)를 포함하는 DMEM/F-12 배지에 각각 보관하였다. 조직을 가위로 분쇄한 후, 1시간동안 37℃에서 배양한 다음, 70㎛ 세포 Falcon cell strainer(BD Labware)를 통과시켰다. 적혈구 용해(RBC lysis)는 ACK 용해 완충액(ACK llysis buffer, Gibco)를 이용하여 원심분리(800 rpm, 10 min)를 통해 수행하였다. 세포 응집체를 DMEM/Ham's F-12 배지(10% FBS 및 1% 항생제 포함)에 재현탁시켜, 세포 수를 계수하여 24-웰 플레이트에 접종하였다.
4-2. 비타민 B6 결합 핵산 전달체의 세포독성
본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 세포독성을 조사하기 위해, 무혈청 조건하에 DNA와 VBPEA의 다양한 몰비(5, 10, 20, 30, 40 및 50 N/P)로 제조된 핵산 전달 복합체를 다양한 세포에 처리한 후 MTT 분석을 수행하여 세포 생존능을 조사하였다. 또한 VBPEA와 siRNA의 다양한 농도(0, 50, 100 및 150 pM)로 제조된 핵산 전달 복합체를 세포에 처리한 후 MTT 분석을 수행하여 세포 생존능을 조사하였다. 이를 PEA 및 PEI25k를 사용한 경우와 비교하였다.
먼저, 상기 VBPEA/DNA 복합체들을 처리하기 전에 A549 세포, HeLa 세포 및 HepG2 세포를 1×105 개/mL의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 80% 밀도로 키웠다. 본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA) 또는 PEI와 DNA를 서로 다른 N/P 비율로 혼합하여 핵산 전달 복합체를 제조하여, 상기 배양한 세포 배지를 복합체를 함유하는 무혈청 배지로 교체한 후 3시간 동안 배양하였다. 이후 혈정 포함 배지로 갈아주었다. 36시간 배양한 후, 1xPBS에 0.5 mg/mL의 농도로 제조한 MTT 시약 500㎕를 각 웰에 처리한 후 3 시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 DMSO로 각 웰의 포르마잔을 녹여내어, 색이 나는 용액은 96-웰 플레이트로 옮겨 VERSAmax tunable microplate reader(Sunnyvale, USA)로 광학 밀도(540 nm)를 측정하였다. 모든 실험은 3번 반복하였다.
상기 MTT 분석 결과, 본 발명의 VBPEA/DNA 복합체는 PEA/DNA 복합체 또는 PEI25k/DNA에 비하여 세포 독성이 현저히 적은 것을 확인하였다(도 3). 구체적으로는, 본 발명의 VBPEA/DNA 복합체는 A549 세포, HeLa 세포 및 HepG2 세포주에서 98% 이상의 생존율을 확인하였다. 이에 비하여, PEA/DNA 복합체는 85 내지 90%의 생존율을 보였으며, PEI25k/DNA 복합체는 70%의 생존율을 가졌다.
실시예 5: 비타민 B6 결합 핵산 전달체의 시험관 내 및 생체 내 형질전환 효율 분석
5-1. 루시퍼라제 분석에 의한 시험관 내 형질전환 분석
본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 혈청 유무에 따른 시험관 내 형질도입 효율을 조사하기 위해, 다양한 세포주에서 형질전환 실험을 진행하였다.
구체적으로는, A549 세포, HeLa 세포, HepG2 세포를 1×105 개/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종하였다. 80% 밀도로 키운 후, 무혈청 조건하에 다양한 몰비(5, 10, 20, 30, 40 및 50 N/P)로 제조된 VBPEA/pGL3 플라스미드, PEA/ pGL3 플라스미드, 또는 PEI25k/pGL3 플라스미드 복합체들을 처리하였다. 3시간 후에 배지를 교환해주고, 24시간 동안 표준 배양 조건에서 배양하였다. 이 후, 제조사의 프로토콜에 따른 루시퍼라제 분석을 수행하였다. Chemiluminometer(Autolumat, LB953; EG&G Berthold, 독일)을 이용하여 상대 광 단위(relative light units, RLU)를 측정하여, BCA 단백질 분석 키트(Perice Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 이용한 단백질 농도로 정상화(normalization)시켰다.
한편, 복합체의 안정성에 혈청이 미치는 영향을 확인하기 위하여, 24-웰 배양접시에 A549 세포주에 N/P 20의 비율로 제작한 복합체를 0, 10, 20, 또는 30% 혈청 농도상에서 형질전환하였다. 이 후, 상기와 동일한 방법을 통하여 루시퍼라제 분석을 수행하였다. 형질전환 효율은 RLU/mg(단백질)로 측정하였으며, 실험은 3번 반복하였다.
그 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이, 본원발명의 VBPEA/DNA 복합체는 PEA/DNA 복합체에 비하여 5 내지 20 배의 형질전환 효율(루시퍼라제 발현)을 보였으며 PEI25k/DNA 복합체에 비하여는 12 내지 30 배의 형질전환 효율을 가지는 것을 확인하였다.
5-2. 유세포 측정에 의한 시험관 내 형질전환 분석
본 발명의 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA)의 시험관 내 형질도입 효율을 조사하기 위해, A549 세포에서 VBPEA의 GFP 발현을 유세포 측정(flow cytometry)으로 분석하였다.
먼저, 본 발명의 VBPEA와 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)을 발현하는 플라스미드 pcDNA3.1/CT-GFP(6.1 kb, Invitrogen)를 몰비 10으로 혼합하여 핵산 전달 복합체(VBPEA/tGFP)를 제조하였다. A549 세포를 상기 제조한 VBPEA/tGFP 복합체로 형질감염시킨 후 PBS로 세척하고 트립신을 처리하였다. FACS 캘리버 시스템(Calibur System)(Becton-Dickinson, San Joes, CA, USA)을 이용하여 10,000개의 세포를 분석하여 GFP 발현하는 세포의 비율(%)을 기록하여 형질도입 효율을 평가하였다.
그 결과, 도 4e 및 도 5에서 나타낸 바와 같이, PEA/DNA 복합체는 30 내지 35%, PEI25k/DNA 복합체는 10 내지 13%의 형질전환 효율을 가지는 반면, VBPEA/DNA 복합체는 40 내지 45%의 형질전환 효율을 가지는 것을 확인하였다.
또한, 이미 GFP를 형질전환한 A549 세포에 VBPEA/siGFP 복합체로 형질감염하여 siGFP 효과를 비교하였다. 구체적으로, GFP 형질전환 세포에 control, naked siGFP, VBPEA/siScr, VBPEA/siGFP, PEA/siGFP 또는 PEI25k/siGFP를 처리하여 GFP 형광 발현 세포를 유세포 측정으로 분석하였다.
그 결과, 도 5b 내지 도 5c 에서 나타난 바와 같이, VBPEA/siGFP는 PEA/siGFP 또는 PEI25k/siGFP보다 현저히 우수한 siGFP 형질전환 효율을 가지는 것을 확인하였다. 도 5d는 형광 현미경으로 GFP 형광 발현 양상을 측정한 도면이다.
5-3. 생체 내 분포 분석(In vivo biodistribution)
VBPEA/pGL3 복합체를 정맥 내 주사를 통하여 Balb/c 마우스(그룹당 4마리)에 투여하여, 생체 내 분포를 분석하였다. 상기 동물은 Orient Bio Inc.(대한민국)에서 구입하여, 온도 23±2℃ 및 상대습도 50 ± 20%에서 12시간 밤/낮 주기를 유지하여 실험실 동물시설에 보관하였다. 본 연구의 모든 실험 절차는 서울국립대학교의 동물보호 및 사용위원회(Animal Care and Use Committee at Seoul National University, SNU-120409-3)에 의해 승인되었다.
구체적으로, VBPEA 및 PEA는 pGL3 플라스미드 30 ㎍과 N/P 20 비율로 결합시켰으며, 식염수(normal saline)로 최종 부피 100㎕가 되도록 조절하였다. 대조군으로는 식염수에 DNA만 넣은 것을 사용하였다. 6주령의 Balb/c 마우스에 상기 복합체 및 대조군을 꼬리 혈관에 40U 인슐린 시린지(0.3 x 8 mm 바늘, 1 mL)를 이용하여 정맥 내 주사하였다. 상기 핵산 전달 4일 후, 각 군의 마우스를 경추 탈골법을 통하여 희생시키고, 모든 기관을 적출하였다. 기관들은 차가운 식염수로 세척한 후, 무게를 측정하고, 분쇄하여, 2.5 x 세포 용해 완충액(Promega, USA)에 25% 밀도로 현탁시켜 균질화하였다. 이후, 4℃에서, 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 세포 용출액을 수득하였다. 각 시료로부터 수득한 세포 용출액(100 ㎕)에 대하여 Chemiluminometer를 이용한 루시퍼라제 분석을 수행하였다.
그 결과, 가장 높은 루시퍼라제 활성을 보이는 것은 췌장(spleen)이었으며, 폐, 뇌, 간 및 신장 순으로 루시퍼라제 활성을 보이는 것을 확인하였으며, 가장 낮은 활성을 보이는 것은 심장이었다(도 4f). 세포 흡수는 특히 일반적으로 의약의 출입이 제한되어 형질전환된 유전자의 발현 수준이 낮은 간, 폐 및 뇌에서 비타민 B6에 의하여 촉진되는 것을 확인하였다. 정맥 내 주사 직후에, 복합체는 혈액 세포 및 혈청 성분들과 응집하는 경향을 보였으며 이에 따라 폐의 모세혈관에 복합체들이 축적되는 것을 확인하였다. 이는 혈관 누출의 크기가 60 nm 이상임에 따라, 복합체들이 폐 조직으로 흘러나오기 때문인 것으로 사료된다. 좀 더 큰 복합체들은 순환하여, 간세포에서 높은 농도로 발견하였다. 이는 간에서 비타민 B6를 대사하기 때문인 것으로 사료된다. 따라서, PEA에 의한 핵산 전달과는 달리 VBPEA를 이용하였을 때, 마우스의 간에서 루시퍼라제의 활성을 확인하였다.
실시예 6: VBPEA의 형질전환 기작 연구
상기 실시예 5에서 확인한 본 발명의 VBPEA의 높은 형질전환 효율이 어떠한 기작에 의하여 이루어지는 것인지 확인하기 위하여 실험을 진행하였다.
6-1. 4'-Deoxypyridoxine 경쟁 실험
본 발명의 VBPEA의 형질전환에 비타민 B6의 역할을 확인하기 위해서, 비타민 B6의 구조적 유사체인 4'-Deoxypyridoxine을 이용하여 경쟁 저해 실험을 수행하였다. 구체적으로는, 80%의 세포 밀도로 배양된 A549 세포에 4'-Deoxypyridoxine를 0, 1, 2, 5, 10 또는 20 mM의 농도로 청리하고, VBPEA/DNA 또는 PEA/DNA 복합체로 10분간 처리하였다. 24시간 후에, 상기 세포를 수득하여 시험관 내 루시퍼라제 분석을 수행하였다.
도 6의 A에서 나타낸 바와 같이, 비타민 B6의 구조적 유사체인 4'-Deoxypyridoxine 처리시(1 mM), PEA/DNA 복합체에 비하여 VBPEA/DNA 복합체의 형질전환 효율이 급격히 감소하는 것을 확인하였다. 이는 VBPEA/DNA 복합체의 높은 형질전환 효율은 VTC(VB6 transporting membrane carrier)에 비타민 B6가 결합함으로써 일어나는 현상이라는 것을 시사한다. 곧, VBPEA를 구성하는 비타민 B6가 VBPEA/DNA 복합체의 VTC를 통한 세포막 접근성을 높여서, 높은 형질전환 효율을 가진다는 것을 시사한다.
6-2. 공초점 현미경을 이용한 VBPEA 저해 실험
공초점 현미경(inverted laser scanning confocal microscope, Zeiss LSM 710, Carl Zeiss)으로 A549 세포 내 이동(intracellular trafficking)에서 TRITC-표지 VBPEA와 YOYO-1-표지 DNA 신호를 관찰하였다. 이는 4'-Deoxypyridoxine 존재 또는 비존재하에서 수행하였다.
구체적으로는, TRITC(25㎕, 1mg/100㎕ DMF)를 VBPEA(1 ml, 10mg/mL H2O)에 첨가하여(총 아민의 1% 가량을 블락킹), 하룻밤 동안 교반시켰다. 반응하지 않은 TRITC는 에틸 아세테이드(2mL로 3번) 세척하여 제거하고, 동결건조 후 물에 재현탁하였다. pDNA(1㎍)에는 YOYO-1 iodide(2 ㎕, DMSO 1mM 용액)로, 어둠 속에서 25 ± 1℃에서 2시간 동안 교반하여 표지하였다. 이는 -20℃에 보관하였다. A549 세포를 6웰 배양접시에 2x105 세포/웰의 농도로 접종하고 4'-Deoxypyridoxine 존재 또는 비존재하에 이중 표지된 VBPEA/DNA로 형질전환시켰다. 120 분간 처리한 후, 세포를 1xPBS로 3번 세척한 후, 4% 파라포름알데하이드로 4℃에서 10분간 고정하였다. DAPI는 핵 DNA를 대조 염색하기 위하여 이용하였으며, 이미지는 공초점 현미경을 통하여 수득하였다.
그 결과, 상기 실시예 6-1에서 확인했듯이, 본 발명의 VBPEA/DNA 복합체는 4'-Deoxypyridoxine 존재 하에서 VBPEA의 VTC 접근성을 감소시켜, 세포 흡수가 현저히 줄어드는 것을 공초점 현미경 이미지로 확인하였다(도 6의 B).
6-3. 자유 또는 결합 비타민 B6가 유전자 형질전환에 미치는 영향 분석
비타민 B6를 별도로 처리한 경우와 VBPEA 핵산 전달체 형태로 처리한 경우에 형질전환을 촉진하는데 있어 미치는 영향을 분석하였다. 이를 위하여, A549 세포주를 PEA/pGL3 플라스미드 복합체(N/P 20)와 함께 비타민 B6를 0, 5, 20, 50 또는 100 μM 농도로 처리하였으며, 이를 VBPEA/pGL3 플라스미드 복합체(N/P 20)의 형질전환 효율과 비교하였다.
그 결과, 도 7의 A에서 확인할 수 있듯이, VBPEA/DNA 복합체는 자유 비타민 B6와 PEA/DNA를 같이 처리한 경우보다 높은 형질전환을 가지고 있으며, 자유 비타민 B6의 농도의 증가에 불구하고 PEA/DNA는 형질전환 효율이 별다른 차이를 보이지 않는 것을 확인하였다. 이는, PEA의 형질전환 효율은 자유 비타민 B6와는 별개의 기작에 의해서 이루어진다는 것을 보여준다.
6-4. 암세포 및 정상 세포에 대한 VBPEA 결합력 비교
마우스 일차 폐 세포를 24-웰 배양접시에 1x105 세포/웰의 농도로 접종한 후, PBS로 세척하고 무혈청 조건 하에 VBPEA/DNA 복합체(N/P 20)으로 형질전환하였다. 3시간 후에 배지를 DMEM/F-12 완전 배지로 교환하였다. 유사하게, 마우스 폐 선종 세포주 LA-4 세포, 인간 폐 선암종 상피세포주 A549 세포 및 인간 기관지 상피세포 16HBE 세포에도 형질전환하였다. 24시간 후에, 루시퍼라제 발현 정도를 분석하여 정상 세포와 암세포 간에 비교하였다. 이와 함께, VBPEA/DNA 복합체가 정상 세포에서도 독성이 없다는 것을 확인하기 위하여 상기 설명한 바와 동일한 방법을 이용한 MTT 분석을 동시에 수행하였다.
그 결과, 도 7의 B에서 나타낸 바와 같이, 인간 또는 마우스 일차 폐 세포 또는 폐암세포에서의 VBPEA/DNA 복합체의 형질전환 효율을 비교한 결과, 일차 세포에 비하여 암세포에서 형질전환 효율이 현저히 높은 것을 확인하였다(A549 세포 및 LA-4 세포). 이는 VBPEA/DNA는 정상 세포보다는 암세포에 높은 효율로 흡수되는 것을 의미하며, 이는 세포의 성장 및 증식이 활발하게 일어나는 암세포에서 비타민 B6에 대한 요구가 높음에 따라 일어나는 현상임을 시사한다. 한편, 본 발명의 VBPEA/DNA 복합체가 정상세포에서도 독성을 보이지 않는다는 것을 확인하였다(도 10).
6-5. PEA와 VBPEA 간에 엔도사이토시스(endocytosis) 기작 비교
VBPEA 흡수 경로를 확인하기 위하여, 다양한 엔도사이토시스를 저해하고 이후 형질전환 효율을 비교하였다. 클라트린-매개 엔도사이토시스(clathrin-mediated endocytosis)를 연구하기 위하여, A549 세포에 클로르프로마진(Chlorpromazine)을 1, 2 및 3 ㎍/mL 농도로 1시간 가량 처리한 후에, VBPEA/DNA 복합체(N/P 20)을첨가하였다. 유사하게, 카베올라-매개 흡수(caveolae-mediated uptake)는 이의 저해제인 β-메틸 사이클로덱스트린(β-methyl cyclodextrin)을 2.5, 6.5 또는 10 mg/mL을 처리하거나, 제니스테인(genistein)을 100, 200 또는 300 μM을 처리하였다. 상기 저해제들을 1시간 동안 처리한 후, A549 세포에 형질전환시킨 다음 24시간 후에 루시퍼라제 발현을 측정하였다.
카베올라의 저해제인 β-메틸 사이클로덱스트린 및 제니스테인을 처리한 경우에 VBPEA-매개 또는 PEA-매개 형질전환 효율이 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 이는 양 핵산 전달체가 카베올라 유입 경로를 이용한다는 것을 시사한다. 반면, 클로르프로마진을 이용한 클라트린-매개 엔도사이토시스 저해는 VBPEA/DNA 복합체의 형질전환 효율은 저해하지만, PEA/DNA 복합체의 형질전환 효율은 변하지 않았다(도 11). PEA에 의한 형질전환에는 수송체가 관여하지 않아, 클라트린 매개 엔도사이토시스를 일으키지 않는데 반해, VBPEA에 의한 형질전환에는 비타민 B6 수송체의 관여로 인하여 VBPEA에 의해 클라트린 매개 기작이 일어나는 것을 시사한다.
6-6. VBPEA에서의 PEI에 의한 양자 스폰지 효과 확인
PEI의 비교적 높은 형질전환 효과는 양자 스폰지 효과에 의해 엔도좀을 탈출하는 내재적 능력 때문이라고 알려져 있다. 이러한 효과는 엔도좀의 양자 및 Cl- 유입에 의한 산성화, 그에 따른 엔도좀의 팽윤 및 용혈작용에 이르는 동안 PEI가 완충작용을 하기 때문으로 알려져 있다. 본 발명에 따른 비타민 B6 결합 핵산 전달체(VBPEA) 또한 동일한 양성자 스폰지 효과에 따른 형질전환 기작을 갖는지 규명하기 위해, 상기 VBPEA의 완충능을 조사하였다.
24-웰 플레이트에 1.0×105 개/well로 접종하여 80%의 밀도로 A549 세포를 배양한 후, DMSO에 희석된 엔도좀 양자 펌프 저해제(endosome proton pump inhibitor)인 바필로마이신 A1(bafilomycin A1, vacuolar type H+ ATPase 특이적 저해제, 200 nM)을 혈청없는 배지에 첨가하여 10분간 배양하였다. 이후, 본 발명에 따른 VBPEA/DNA 복합체(N/P 20) 및 비교군으로 PEI25K/DNA(N/P 10)를 처리하고, 24시간 후에 상기 설명한 바와 같은 방법으로 루시퍼라제 발현을 측정하였다.
상기와 같이 바필로마이신 A1(bafilomycin A1)을 이용하여 액포형(vacuolar-type) 양자 펌프를 억제한 결과, VBPEA에 의한 형질전환이 1000배 가량 감소하는 것을 확인하였다. 이는 VBPEA의 형질전환은 엔도좀(endosome)의 산성화를 통하여 촉진된다는 것을 시사한다(도 12). 상기 저해제는 엔도좀 산성화를 방지하고, 전달체의 방출을 위한 파열(bursting)을 막았다.
실시예 7: VBPEA를 이용한 사일런싱
7-1. VBPEA를 이용한 siRNA 효율
본 발명의 VBPEA 핵산 전달체를 이용하여 유전자 사일런싱(gene silencing)이 가능한지 확인하기 위하여, siRNA 형질전환 실험을 수행하였다.
구체적으로는, A549 세포에 무혈청 조건하에서 리포펙타민TM/pGL3 플라스미드 복합체를 이용하여 형질전환을 한 후, 3시간 후에 배지를 교체하고 VBPEA/siLuc(si Luciferase) 또는 siScr(si Scrambled) 복합체나 PEA/siLuc 또는 siScr 복합체(N/P 20)을 처리하였다. 상기 si RNA들은 50, 75, 100 또는 150 pM 농도를 처리하였다. 상기 세포는 추가로 3시간 동안 배양한 후, 배지를 10% 혈청을 포함하는 완전 배지로 교체하였다. 마지막으로, 24시간 후에 루시퍼라제 발현을 상기 설명한 바 있는 루시퍼라제 실험을 통해 측정하였으며, 이는 단백질 농도로 정상화(normalization)하였다. 루시퍼라제 사일런싱 효율은 루시퍼라제 특이적 siRNA를 처리하지 않은 대조군 세포에 비교하여 상대적 비율로 계산하였다.
그 결과, VBPEA/siLuc 복합체를 이용한 사일런싱 효율은 PEA/siLuc 복합체를 이용한 경우에 비교하여 94%에 이르는 효율 증가를 보였다. 사일런싱 활성은 siRNA가 100pM 이상일 때 안정화되었다. 핵산 전달체/비특이적 스크램블 siRNA(siScr, 대조군) 복합체를 이용한 경우나 siLuc 플라스미드 단독을 이용한 경우에는 사일런싱 효과가 미비하였다(도 7c).
7-2. VBPEA를 이용한 siRNA의 세포 독성 측정
VBPEA/siLuc 복합체가 독성이 없다는 것을 MTT 분석을 통하여 확인하였다. 구체적으로는, A549 세포에서 다양한 농도의 siRNA(50, 100, 150 pM)을 포함하는 VBPEA/siRNA 및 PEA/siRNA 복합체(N/P 20)의 세포 독성을 측정하였다. 36시간 후에, 상기 설명한 바와 동일한 방법으로, MTT 분석을 수행하였다.
그 결과, VBPEA-매개 유전자 사일런싱은 비교군(PEA/siRNA)에 비하여 세포 독성이 낮아, 개선되었음을 확인하였다(도 13a). 이러한 결과는 VBPEA가 암세포 증식에 관여하는 비타민 B6 의존성 효소의 사일런싱에 효과적으로 사용되어, 항암제로 사용될 수 있음을 시사한다.
아울러, VBPEA/siRNA와 관련해서 A549 세포주에서 상기 VBPEA/DNA 복합체 처리 실험 과정과 유사하게 진행하였다.
그 결과, 도 13b에서 확인할 수 있듯이 VBPEA/siRNA는 기존 핵산 전달체인 PEA나 PEI25k보다 세포 독성이 현저히 적었다.
실시예 8. VBPEA 를 이용한 유전자 사일런싱을 통한 암세포 증식 억제 효과
상기 실시예 7에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 VBPEA를 이용하여 유전자 사일런싱이 효율적으로 일어나는 것을 확인하였다. 이에 따라, 비타민 B6 의존성 효소의 사일런싱에 특히 효율적일 것으로 사료되었으며, 비타민 B6가 암세포 증식에 중요한 조효소로 작용할 수 있는 점을 이용하여, VBPEA를 이용한 유전자 사일런싱을 통한 암세포 증식 억제 효과를 확인하였다.
8-1. 세린 하이드록시메틸전이효소 사일런싱 효율 측정
먼저, 암세포 증식에 중요한 역할을 하는 비타민 B6 의존성 효소인 세린 하이드록시메틸전이효소(Serine hydroxymethyltransferase, SHMT)에 대한 esiRNA(esiRNA Human SHMT1, Sigma, Cat No : EHU159081-50UG))를 이용하여 VBPEA의 유전자 사일런싱 효율을 Real time-qPCR(실시간 정량 PCR) 및 Reverse transcriptase(RT)-PCR(역전사 PCR)(도 14b)로 확인하였다. 이에 사용한 프라이머는 하기 표 3에 정리하였다.
프라이머 정방향(5' -> 3') 역방향(5' -> 3')
hGAPDH RT-PCR primer GCCCAATACGACCAAATCC
(서열번호 7)		 AGTCAGCCGCATCTTCTT
(서열번호 8)
hSHMT RT-PCR primer GCTGGGCTACAAAATAGTCA
(서열번호 9)		 AGGCAATAGAACAGGCTTC
(서열번호 10)
그 결과, 도 14a 및 도 14b에서 확인할 수 있듯이, VBPEA를 이용하였을 때 다른 비교군들과 비교하여 사일런싱 효율이 현저히 높은 것을 확인하였다. SHMT의 유전자 발현이 음성 대조군에 비하여 naked siSHMT1는 15% 감소, VBPEA/siScr는 10% 감소, PEA/siSHMT1는 42% 감소, PEI25k/siSHMT1는 31% 감소한 데에 비하여, VBPEA를 이용하였을 때 90%가 감소하는 것을 확인하였다.
8-2. 암세포 사멸 유도 측정
암세포에서 VBPEA를 이용한 SHMT1 유전자의 사일런싱이 세포 사멸을 유도하는지 여부를 확인하였다. SHMT1 유전자를 사일런싱하기 위한 siSHMT1는 esiRNA Human SHMT1 (sigma aldrich, Cat No : EHU159081-50UG)를 사용하였다.
구체적으로, A549 세포에 VBPEA/siSHMT1, PEA/siSHMT1, VBPEA/siScr을 처리하고, 양성 또는 음성 대조군을 준비하였다. 세포 사멸의 특징인 DNA 절단을 녹색 형광을 통하여 확인하였고(fluorescene-dUTP), 또한 터널 어세이(tunel assay)를 통하여 세포 사멸 수를 확인하였다(도 15a).
그 결과, 도 15a에서 확인할 수 있듯이, VBPEA/siSHMT1를 처리한 세포에서 사멸 세포의 빈도수가 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
또한, A549 세포에 VBPEA/siSHMT1, PEA/siSHMT1, VBPEA/siScr을 처리하고, 양성 또는 음성 대조군을 준비하였으며, 처리 후 48시간 후에 Annexin V-PI 염색을 통해, 세포 사멸 비율을 확인하였다,
그 결과, 도 15b에서 확인할 수 있듯이, 다른 조건에서는 세포 사멸을 일으킨 세포 비율이 10%에도 못 미치는데 비하여, VBPEA/siSHMT1를 처리한 경우에 세포 사멸을 일으킨 세포 비율이 50% 이상인 것을 확인하였다.
8-3. 암세포 증식 억제효과 측정
암세포에서 VBPEA를 이용한 SHMT 유전자의 사일런싱이 암세포 증식 억제효과를 갖는지 확인하였다. 구체적으로, A549 세포에 VBPEA/siSHMT1, PEA/siSHMT1, VBPEA/siScr을 처리하고, 또는 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군을 준비하여 0 내지 4일에 걸쳐 세포 증식을 측정하였다. 이에 WST assay를 통하여 세포 증식율을 확인하였다(도 16a).
WST assay는 살아있는 세포에서 활성을 가지는 미토콘드리아 디하이드로게네이즈(mitochondrial dehydrogenase)에 의해서 tetrazolium salt WST-1이 프로마잔으로 분해되는 기작을 이용한다. 최종으로 살아있는 세포에서만 생성되는 프로마잔의 농도를 450nm에서 흡광도를 측정하여 살아있는 세포의 수를 측정하는 방법이다.
상기 실험 결과, 도 16a에서 확인할 수 있듯이, VBPEA/siSHMT1를 처리한 경우에 세포 증식이 PEA/siSHMT1, VBPEA/siScr 등을 처리한 경우보다 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 첫째 날 및 둘째 날에는 암세포는 증식하지 못하고 세포 사멸 효과에 의하여 원래 존재하던 세포 수보다 적은 세포 수를 보였다.
또한, A549 세포에 VBPEA/siSHMT1(N/P 20) 또는 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군을 준비하여 0 내지 4일에 걸쳐(3h, 48h 및 96h) 세포 증식을 광학 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 16b에서 확인할 수 있듯이, VBPEA/siSHMT1를 처리한 경우에 세포 증식이 음성 대조군보다 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
8-4. 유세포 측정에 의한 SHMT 사일런싱에 의한 세포 분포 분석
A549 세포에 naked siSHMT1, VBPEA/siSHMT1, PEA/siSHMT1, VBPEA/siScr을 처리하거나 또는 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군을 준비하여, 처리한 후 12시간, 24시간 및 72시간째에 유세포 측정을 통해 세포 주기 분포를 profiling하였다.
그 결과, 도 16c에서 확인할 수 있듯이, 다른 조건들에서는 세포 주기 분포에서 큰 변화를 보이지 않는데 비하여, VBPEA/siSHMT1의 경우에는 죽은 세포가 현저히 많고(sub G1), S phase에 많은 세포들이 정지(arrest)해 있으며, 전체적인 세포 분포가 현저히 달라지는 것을 확인하였다.
8-5. SHMT 사일런싱의 기타 영향
상기의 SHMT1 사일런싱에 의한 현상에 더하여, A549 세포에 VBPEA/siSHMT1를 처리하여 DNA 합성이나 세포 사멸에 미치는 영향에 대해서 추가적으로 확인하였다.
먼저, DNA 합성 중인 세포를 EdU를 통해 확인한 결과, 도 20a의 (A) 및 (B)에서 확인할 수 있듯이 VBPEA/siSHMT1를 처리한 경우 분열 중인 세포가 적은 것을 확인하였다.
아울러, 세포 사멸이 일어나는 세포를 Tunel assay를 통해 측정한 결과, 도 20b의 (A) 및 (B)에서 확인할 수 있듯이, VBPEA/siSHMT1를 처리한 경우 다른 핵산 전달체인 PEA나 naked siSHMT1를 처리한 경우보다 세포 사멸 중인 세포 수가 현저히 많은 것을 확인하였다.
또한, S 주기에 싱크로시킨 A549 세포를 바탕으로 미처리군, VBPEA/siScr 처리군 또는 VBPEA/siSHMT1 처리군을 준비하였다. 상기 시료들에서 SHMT1(적색)와 핵라미나(nuclear lamina, 녹색)의 공-위치(co-localization)하는지 여부를 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 21a에서 확인할 수 있듯이, SHMT1를 사일런싱하기 전에는 SHMT1와 핵라미나가 공-위치하는 비율이 89 내지 91%에 이르는데 비해 VBPEA/siSHMT1를 처리한 경우 7%에 불과해지는 것을 확인할 수 있다. 곧, SHMT1와 핵라미나가 공-위치하여 기능함을 확인하였다.
A549 세포를 바탕으로 한 미처리군, VBPEA/siScr 처리군, naked siSHMT1 처리군, PEA/siSHMT1 처리군 및 VBPEA/siSHMT1 처리군에 대하여, 세포 genomic DNA의 양을 측정(형광 염색 : Hoechst 33258)하였다.
그 결과, 도 21b 및 도 21c에서 확인할 수 있듯이, VBPEA/siSHMT1 처리군에서 DNA 양이 현저히 적어지는 것을 확인할 수 있다.
A549 세포를 바탕으로 한 미처리군, VBPEA/siScr 처리군, naked siSHMT1 처리군, PEA/siSHMT1 처리군 및 VBPEA/siSHMT1 처리군에 대하여, 처리(N/P 20)한 후 12시간, 24시간 및 72시간 지난 후 세포들의 세포주기 프로파일(profile)을 FACS를 통해 측정한 도면이다.
그 결과, 도 21d에서 확인할 수 있듯이, 다른 조건들에서는 세포 주기 분포에서 큰 변화를 보이지 않는데 비하여, VBPEA/siSHMT1의 경우에는 죽은 세포가 현저히 많고(sub G1), S phase에 많은 세포들이 정지(arrest)해 있으며, 전체적인 세포 분포가 현저히 달라지는 것을 확인하였다.
실시예 9. 동물 모델에서 VBPEA 를 이용한 유전자 사일런싱을 통한 암세포 증식 억제 효과 확인
상기 실시예 8에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 VBPEA를 이용하여 암관련 유전자(세린 하이드록시메틸전이효소, SHMT)에 대한 유전자 사일런싱이 효율적으로 일어나고 실험관 내 실험에서 암세포 증식 억제 효과를 확인하였다. 이에 따라, 마우스를 이용한 암발생 동물 모델에서 생체 내 실험을 통하여, VBPEA를 이용한 유전자 사일런싱을 통한 암세포 증식 억제 효과를 확인하였다.
9-1. 암발생 동물 모델 구축 및 치료 방법
5주령의 수컷 누드 마우스(Balb/c, 그룹당 4마리)의 피하에 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 인간 폐 선암종 상피세포주 A549를 3 x 106 (100㎕)투여하여, 암발생 동물 모델을 구축하였다. 상기 동물은 Orient Bio Inc.(대한민국)에서 구입하여, 온도 23±2℃ 및 상대습도 50 ± 20%에서 12시간 밤/낮 주기를 유지하여 실험실 동물시설에 보관하였다. 본 연구의 모든 실험 절차는 서울국립대학교의 동물보호 및 사용위원회(Animal Care and Use Committee at Seoul National University, SNU-120409-3)에 의해 승인되었다.
상기 A549 세포주 주입하고 한달 후, 암세포의 크기가 약 800 내지 1000 mm3에 이른 뒤, siSHMT1를 이용한 암치료를 시작하였다.
구체적으로, 각 그룹별로 VBPEA/siSHMT1(30 ㎍) 복합체 (N/P 20), PEA/siSHMT1 복합체 (N/P 20) 또는 PEI25k/siSHMT1 복합체 (N/P 10)를 식염수에 녹여 각각 48 시간마다 투여하였으며, 치료는 한 달 동안 진행하였다. 한편, 음성 대조군으로는 공벡터, siSHMT1 핵산(naked siSHMT1) 또는 VBPEA/siScr를 투여하였다.
상기 치료 한 달 동안, IVIS Imaging system 100 (Xenogen)을 이용하여 종양 크기를 측정하였으며, 한 달이 지난 후 희생시켜 종양 조직에서 SHMT 단백질의 발현 수준을 측정하였다.
9-2. 종양 조직의 SHMT 발현량 측정
상기 9-1에서 희생시킨 마우스에서 적출한 종양 조직에서 SHMT의 발현량을 웨스턴 블랏팅(western blotting) 및 면역화학염색을 통해 측정하였다.
먼저, 각 군의 마우스를 경추 탈골법을 통하여 희생시키고, 종양 조직을 적출하였다.
기관들은 차가운 식염수로 세척한 후, 무게를 측정하고, 분쇄하고, 2.5 x 세포 용해 완충액(Promega, USA)에 25% 밀도로 현탁시켜 균질화하였다. 이후, 4℃에서, 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 세포 용출액을 수득하였다. 수득한 세포 용출액의 단백질 농도를 측정하여, 25 ㎍의 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고, 니트로셀룰로즈 멤브레인(Nitrocellulose membrane)에 옮겨 면역블랏팅을 진행하였다(도 17).
그 결과, 도 17에서 확인할 수 있듯이, VBPEA/siSHMT1 복합체를 처리한 경우에 PEA/siSHMT1 또는 PEI25k/siSHMT1 복합체를 처리한 경우보다 SHMT 발현 억제 효과가 월등한 것을 확인할 수 있다(도 17).
또한, 상기 적출한 종양 조직에 대하여 면역화학염색을 통해 SHMT의 발현량을 확인하였다.
그 결과, 도 22에서 확인할 수 있듯이, VBPEA/siSHMT1 복합체를 처리한 경우에 PEA/siSHMT1 또는 PEI25k/siSHMT1 복합체를 처리한 경우보다 SHMT 발현 억제 효과가 월등한 것을 확인할 수 있다(도 22).
9-3. 종양 조직의 세포 사멸 양상 확인
상기 9-1에서 희생시킨 마우스에서 적출한 종양 조직에서 세포 사멸 양상을 Tunel assay를 통해 수행하였다.
그 결과, 도 23에서 확인할 수 있듯이, VBPEA/siSHMT1 복합체를 처리한 경우 PEA/siSHMT1 또는 PEI25k/siSHMT1 복합체를 처리한 경우보다 세포 사멸 효과가 월등한 것을 확인할 수 있다.
9-4. 종양 크기( Tumor volume ) 측정
상기 9-1에서 진행하는 한 달 동안의 치료과정 동안 1주일에 한번씩 IVIS Imaging system 100 (Xenogen)을 이용하여 종양 크기의 변화를 측정하였다. 종양 크기는 다음과 같이 측정하였다.
종양 크기(m) = 0.5 × a × b2
a : 가장 작은 지름
b : 가장 긴 지름
IVIS imaging system 100을 이용하여 측정한 결과는 하기 표 4 및 도 19와 같으며, 2주에 한 번씩 측정한 bioluminescence 이미지는 도 18과 같다.
치료기간 동안 vernier caliper 이용한 종양 크기 측정 결과(1주 간격)
치료 기간 비치료군
(mm3)		 naked siSHMT1
(mm3)		 VBPEA/
siScr
(mm3)		 VBPEA/
siSHMT1
(mm3)		 PEA/
siSHMT1
(mm3)		 PEI/
siSHMT1
(mm3)
치료전 961.4 ± 24.7 889.4± 38.4 1000.5± 31.8 1066.6± 31.1 1138.4± 40.5 1166.4± 40.5
1주 2016.5 ± 66.4 1608.2± 69.5 1846.0± 85.6 956.3 ± 52.9 1241. 9 ± 93.9 1203.6 ± 76.9
2주 2740.8 ± 49.2 2282.8± 68.6 2794.8± 20.7 802.1 ± 79.0 1283.5 ± 56.5 1405.9 ± 56.1
3주 3662.0 ± 49.2 3187.1± 60.9 3593.7± 51.6 590.5± 45.6 1488.4± 64.9 1583.5± 45.0
4주 4428.9 ± 66.6 4397.7± 53.2 4763.0± 173.2 471.5± 25.0 1504.6± 14.1 1884.9± 77.1
상기 표 4, 도 18 및 도 19에서 확인할 수 있듯이, 오직 VBPEA/siSHMT1 복합체를 투여한 군만이 종양 크기를 실질적으로 감소시켰으며, 그 효과는 50% 이하로 매우 우수한 것으로 확인된다.
그에 비하여, 다른 유전자 전달체인 PEA 또는 PEI를 이용하여 siSHMT1를 전달한 경우에는 종양 크기 증가율이 현저히 낮아지긴 했으나, 종양의 성장을 막지는 못하는 수준에 불과한 것을 확인하였으며, 유전자 전달체 없이 siSHMT1 핵산 자체를 투여한 naked siSHMT1 처리군이나 VBPEA와 스크램블 siRNA(siScr) 복합체 처리군은 비치료군과 동일한 수준으로 종양이 성장하는 것을 확인하였다.
즉, 암유발 동물 모델을 통해 VBPEA를 이용한 생체 내 항암용 유전자 치료가 다른 유전자 전달체를 이용하는 경우보다 훨씬 효율적으로 이루어지는 것을 확인하였으며, 그 치료 효과가 종양 성장 속도 감소의 방어적인 수준이 아닌 종양 제거 수준의 적극적인 치료 수준에 해당하는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 종합하면, VBPEA는 기존에 존재하는 핵산 전달체들보다 현저히 높은 핵산 전달율을 가지며, DNA와의 결합체 자체의 세포 독성은 거의 없고, 생체 내 형질전환 효율 또한 매우 높은 것을 확인하였다. 또한, siRNA를 통한 유전자 사일런싱 효율도 높으며, 이를 이용하여 암세포 및 암발생 동물 모델에서 높은 세포사멸 및 세포 증식 억제를 일으킬 수 있는 것을 확인함으로써, 항암 목적 유전자 치료용도로 사용될 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Vitamin B6 coupled gene transporter and cancer gene therapy using the same as a gene carrier <130> PA130274-KR-P1 <150> KR10-2013-0089145 <151> 2013-07-26 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA scrambled sense <400> 1 cguacgcgga auacuucgau u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA scrambled antisense <400> 2 ucgaaguauu ccgcguacgu u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA Luciferase sense <400> 3 cuuacgcuga guacuucgau u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA Luciferase antisense <400> 4 ucgaaguacu cagcguaagu u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense GFP <400> 5 guucagcgug uccggcgagu u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA anti-sense GFP <400> 6 cucgccggac acgcugaacu u 21 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAPDH RT-PCR primer sense <400> 7 gcccaatacg accaaatcc 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAPDH RT-PCR primer anti-sense <400> 8 agtcagccgc atcttctt 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSHMT RT-PCR primer sense <400> 9 gctgggctac aaaatagtca 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSHMT RT-PCR primer anti-sense <400> 10 aggcaataga acaggcttc 19

Claims (20)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 비타민 B6 결합 암세포 표적용 핵산 전달체:
    <화학식 1>
    Figure 112016117127965-pat00071

    상기 식에서, n은 1 내지 500 사이의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 전달체가 1,000 내지 100,000 Da 범위의 중량 평균 분자량을 갖는 것인, 비타민 B6 결합 암세포 표적용 핵산 전달체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 전달체는 비타민 B6 수송체(Vitamin B6 transporter)와 결합하는 것인, 비타민 B6 결합 암세포 표적용 핵산 전달체.
  4. a) 저분자량 폴리에틸렌이민(PEI) 용액을 글라이세롤 디메타크릴레이트 용액에 첨가하여 마이클 부가반응을 수행하는 단계; 및
    b) 상기 a) 단계의 반응물로부터 형성된 폴리에스터아민(PEA,poly-(ester amine))을 분리하는 단계;
    c) 상기 b) 단계에서 분리된 폴리에스터아민과 활성형 비타민 B6 (피리독살 5'인산, Pyridoxal 5'phosphate, PLP)를 반응시키는 단계; 및
    d) NaCNBH4에 의하여 환원시켜 비타민 B6 결합 핵산 전달체를 수득하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 비타민 B6 결합 핵산 전달체를 제조하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 저분자량 폴리에틸렌이민(PEI)은 50 내지 10,000 Da 범위의 중량 평균 분자량을 갖는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 저분자량 폴리에틸렌이민(PEI)은 분지형(branched-type)인 것인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 단계 a)에서 마이클 부가반응이 40 내지 100℃에서 1 내지 72시간 동안 수행되는 것인 방법.
  8. 제4항에 있어서, 단계 a)에서 저분자량 폴리에틸렌이민(PEI)과 글라이세롤 디메타크릴레이트의 화학량비가 1:0.1 내지 1:10인 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 비타민 B6 결합 핵산 전달체에 치료 핵산이 결합된 암세포 표적용 핵산 전달 복합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 치료 핵산과 비타민 B6 결합 핵산 전달체가 1:0.5 내지 1:100의 몰비로 결합되는 것인, 암세포 표적용 핵산 전달 복합체.
  11. 제9항에 있어서, 상기 핵산 전달 복합체가 100 내지 250 nm의 평균 입자 크기를 갖는 것인, 암세포 표적용 핵산 전달 복합체.
  12. 제9항에 있어서, 상기 핵산 전달 복합체가 25 내지 50 mV 범위의 제타 전위를 나타내는 것인, 암세포 표적용 핵산 전달 복합체.
  13. 제9항에 있어서, 상기 치료 핵산이 siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), esiRNA(endoribonuclease-prepared siRNAs), 안티센스 올리고뉴클레오티드, DNA, 단일가닥 RNA, 이중가닥 RNA, DNA-RNA 혼성체(hybrid) 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태인, 암세포 표적용 핵산 전달 복합체.
  14. 제9항에 있어서, 상기 치료 핵산이 세린 하이드록시메틸전이효소(Serine hydroxymethyltransferase, SHMT)의 발현 억제를 표적하는 것인, 암세포 표적용 핵산 전달 복합체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 치료 핵산이 세린 하이드록시메틸전이효소의 발현을 억제하는, esiRNA Human SHMT1 (sigma aldrich)로 카탈로그 번호 EHU159081-50UG에 해당하는 esiRNA인 것인 핵산 전달 복합체.
  16. 제9항의 핵산 전달 복합체를 유효성분으로 포함하는 암세포 표적용 약학제제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 핵산 전달 복합체가 흡입 투여용 제형 또는 주사 투여용으로 제형화된, 암세포 표적용 약학제제.
  18. 제16항에 있어서, 상기 핵산 전달 복합체에 포함된 치료 핵산이 세린 하이드록시메틸전이효소(Serine hydroxymethyltransferase, SHMT)의 발현 억제를 표적하는 것인, 암세포 표적용 약학제제.
  19. 삭제
  20. 제16항에 있어서, 상기 암은 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 제 1 중추신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 아데노마로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 암세포 표적용 약학제제.
KR1020140095959A 2013-07-26 2014-07-28 비타민 b6 결합 핵산 전달체 및 이를 이용한 유전자 암치료 KR101734018B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20130089145 2013-07-26
KR1020130089145 2013-07-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150014399A KR20150014399A (ko) 2015-02-06
KR101734018B1 true KR101734018B1 (ko) 2017-05-11

Family

ID=52390757

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140095959A KR101734018B1 (ko) 2013-07-26 2014-07-28 비타민 b6 결합 핵산 전달체 및 이를 이용한 유전자 암치료

Country Status (2)

Country Link
US (1) US9872925B2 (ko)
KR (1) KR101734018B1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106397765B (zh) * 2016-09-04 2019-01-15 北京大学 维生素e修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其合成方法和应用
US20230098307A1 (en) * 2020-03-13 2023-03-30 Elbio Inc Vitamin b6-coupled polyol-based polydixylitol gene transporter comprising peptide binding specifically to cancer stem cell and cancer stem cell-targeted therapy technique
CN113105625B (zh) * 2021-04-14 2022-07-12 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种琥珀酸维生素e修饰的聚乙烯亚胺衍生物、制备方法及其应用
CN113563418B (zh) * 2021-06-22 2023-03-03 中国科学院化学研究所 一种原位响应ros的人工酶及其制备方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070092558A1 (en) * 2005-10-20 2007-04-26 George Heavner Methods of Preparing Targeted Immunoliposomes

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100980395B1 (ko) * 2008-06-27 2010-09-07 재단법인서울대학교산학협력재단 비-바이러스성 유전자 전달체용 중합체/유전자 복합체

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070092558A1 (en) * 2005-10-20 2007-04-26 George Heavner Methods of Preparing Targeted Immunoliposomes

Also Published As

Publication number Publication date
US9872925B2 (en) 2018-01-23
US20150030854A1 (en) 2015-01-29
KR20150014399A (ko) 2015-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhu et al. Dual-responsive polyplexes with enhanced disassembly and endosomal escape for efficient delivery of siRNA
Jere et al. Chitosan-graft-polyethylenimine for Akt1 siRNA delivery to lung cancer cells
CN107075515B (zh) C/EBPα组合物和使用方法
Nikkhoo et al. Codelivery of STAT3 siRNA and BV6 by carboxymethyl dextran trimethyl chitosan nanoparticles suppresses cancer cell progression
Tang et al. pH/ATP cascade-responsive nano-courier with efficient tumor targeting and siRNA unloading for photothermal-immunotherapy
Younis et al. A multifunctional lipid-based nanodevice for the highly specific codelivery of sorafenib and midkine siRNA to hepatic cancer cells
Li et al. Ionizable lipid-assisted efficient hepatic delivery of gene editing elements for oncotherapy
Ye et al. An integrated therapeutic delivery system for enhanced treatment of hepatocellular carcinoma
Zhang et al. Co-delivery of EGFR and BRD4 siRNA by cell-penetrating peptides-modified redox-responsive complex in triple negative breast cancer cells
US20240131170A1 (en) Cationic amphiphilic polymers for codelivery of hydrophobic agents and nucleic acids
US20190292549A1 (en) Poly(ethylene glycol) brushes for efficient rna delivery
JP7512207B2 (ja) 核酸治療薬のための調節可能な共カップリングポリペプチドナノ粒子送達系の組成物および方法
Xu et al. Creatine based polymer for codelivery of bioengineered MicroRNA and chemodrugs against breast cancer lung metastasis
US9617544B2 (en) Nanoparticle mediated delivery of siRNA
Han et al. Enhanced antitumor efficacies of multifunctional nanocomplexes through knocking down the barriers for siRNA delivery
KR101734018B1 (ko) 비타민 b6 결합 핵산 전달체 및 이를 이용한 유전자 암치료
KR20150006743A (ko) 간암 연관 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
Xie et al. Efficient inhibition of uveal melanoma via ternary siRNA complexes
Yang et al. “Star” miR-34a and CXCR4 antagonist based nanoplex for binary cooperative migration treatment against metastatic breast cancer
KR102003239B1 (ko) 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체 및 이의 제조방법
KR101809795B1 (ko) 폴리올계 삼투압적 폴리디자일리톨 폴리머 유전자 전달체 및 이의 용도
Ye et al. Preliminary preclinical study of Chol-DsiRNA polyplexes formed with PLL [30]-PEG [5K] for the RNAi-based therapy of breast cancer
Wu et al. Multivalent methionine‐functionalized biocompatible block copolymers for targeted small interfering RNA delivery and subsequent reversal effect on adriamycin resistance in human breast cancer cell line MCF‐7/ADR
CN114732907B (zh) Ddx11蛋白作为dna损伤标志蛋白或放化疗治疗肿瘤靶点的应用
KR101459185B1 (ko) 스페르민 공중합체 및 이를 핵산 전달체로 이용하는 유전자 치료

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant