KR101459185B1 - 스페르민 공중합체 및 이를 핵산 전달체로 이용하는 유전자 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스페르민(spermine) 공중합체 및 이를 핵산 전달체로 이용하는 유전자 치료에 관한 것이다. 본 발명의 스페르민 공중합체는 2개 이상의 히드록실기를 포함하는 링커 화합물을 이용하여 스페르민(spermine, SPE)을 공중합시킴으로써, DNA 등 치료 핵산에 높은 결합능을 나타내고, 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며, 핵산 전달체로 사용하기에 적합한 물리화학적 특성을 나타낼 뿐만 아니라, 링커의 히드록실기가 다른 혈액 단백질의 접근 및 그로 인한 응집을 방지하여 핵산 전달체의 혈액 내 안정성을 향상시킴으로써, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내고, 형질도입 효율이 매우 높아 유전자 치료를 위한 핵산 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

스페르민 공중합체 및 이를 핵산 전달체로 이용하는 유전자 치료{Spermine copolymer and gene therapy using the same as a gene carrier}

본 발명은 스페르민(spermine) 공중합체 및 이를 핵산 전달체로 이용하는 유전자 치료에 관한 것이다.

유전자 치료(gene therapy)는 치료 핵산을 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포 내에서 새로운 단백질이 발현되도록 하여 질병을 치료하는 것으로, 질병의 증상을 치료하는 것이 아니고 질병의 원인을 치료하여 제거하는 방식이다. 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료에 비해서 우수한 선택성을 가질 수 있고 다른 치료법으로는 조절하기 힘든 질병의 치료율 및 치료 속도를 개선하여 오랜 기간 동안 적용할 수 있다. 다만, DNA 등 치료 핵산은 생체 내 효소에 의한 가수분해에 취약하고 세포 내로 유입되는 효율이 낮기 때문에, 효과적인 유전자 치료를 위해서는 치료 핵산을 원하는 표적세포로 안전하게 전달하여 높은 발현효율의 달성을 가능케 하는 핵산 전달체(gene carrier)를 개발하는 것이 필수적이다.

핵산 전달체는 독성이 낮거나 없어야 하며, 핵산을 선택적이고 효과적으로 원하는 세포에 전달할 수 있어야 한다. 이러한 핵산 전달체는 크게 바이러스성과 비바이러스성으로 나눌 수 있다. 최근까지 임상 실험에는 핵산 전달체로 형질도입 효율이 높은 바이러스성 벡터(viral vector)가 사용되었다. 그러나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노바이러스와의 복합체(adeno-associated virus)와 같은 바이러스성 벡터는 제조과정이 복잡할 뿐만 아니라, 면역원성, 감염 가능성, 염증 유발, 비특이적 DNA의 삽입 등의 안전성 문제와 수용할 수 있는 DNA의 크기가 한정되어 있다는 문제로 인해 인체에 적용하기엔 한계가 많다. 이에 현재는 비바이러스성 벡터(non-viral vector)가 바이러스성 벡터의 대용으로 각광을 받고 있다.

비바이러스성 벡터는 최소한의 면역반응으로 반복 투여할 수 있고, 특정 세포로의 특이적 전달이 가능하며, 안전성 및 저장 안정성이 우수하고, 대량 생산이 용이하다는 장점을 가지고 있다. 이러한 비바이러스성 벡터의 예로는 양이온성 리포좀(liposome) 계열로서 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 알킬암모늄(alkylammonium), 양이온성 콜레스테롤 유도체(cationic cholesterol derivatives), 그라미시딘(gramicidin) 등이 있다. 그러나, 종래의 리포좀 계열 핵산 전달체는 혈액 안정성이 낮고, 가격 경쟁력이 낮은 단점이 있다.

최근 비바이러스성 벡터 중 양이온성 고분자가 음전하를 띠는 DNA와 이온결합을 통한 복합체를 형성할 수 있기 때문에 많은 관심을 불러일으키고 있다. 이러한 양이온성 고분자에는 폴리-L-라이신(PLL), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산], 폴리아미도아민 덴드리머, 폴리[N,N'-(다이메틸아미노)에틸]메타크릴레이트(PDMAEMA) 등이 포함되며, 이들은 DNA 등 치료 핵산을 압축하여 나노입자를 형성함으로써 효소분해로부터 DNA를 보호하고, 빠르게 세포 안으로 침투하여 엔도좀(endosome)에서 빠져나올 수 있도록 도와준다. 대부분의 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 비해 생분해성, 낮은 독성, 비면역원성, 사용상의 간편함 등의 장점을 가지나, 상대적으로 낮은 형질도입 효율, 제한적인 입자 크기 등의 문제점을 가지고 있다.

특히, 비바이러스성 벡터로 사용되는 대부분의 양이온성 고분자는 혈청 농도가 낮은 환경인 시험관 내에서는 높은 형질도입 효율을 나타내지만, 생체 내 환경에서는 혈청에 존재하는 각종 인자에 의하여 양이온성 고분자/핵산 복합체의 형질도입 효율이 심각하게 저해되어 핵산의 세포 내 유입이 원활하지 않다는 문제점이 있다. 이는 생체 내에서는 양이온성 고분자/핵산 복합체의 표면에 과도한 양전하가 발생하여 혈장 단백질 및 혈액 구성성분과의 비특이적 상호작용이 유발되기 때문이다. 따라서, 시험관 내의 무혈청 배지 또는 혈청이 매우 낮은 농도로 존재하는 환경이 아닌, 다량의 혈청이 존재하는 생체 내에서는 양이온성 고분자의 형질도입 효율이 현저히 저하되며, 이를 생체 내에 그대로 적용하는 경우에는 폐, 간 및 비장에서의 응집, 축적과, 나아가 망상내피계에 의한 옵소닌화(opsonization) 및 제거를 유발할 수 있기 때문에, 상기 양이온성 고분자의 치료적 적용은 크게 제한되지 않을 수 없다. 비바이러스성 벡터로서 가장 광범위하게 연구되고 있는 폴리에틸렌이민(PEI) 역시 생체 내 형질도입 효율이 현저히 떨어지며, 높은 세포독성 및 낮은 혈액 적합성으로 인한 핵산의 낮은 발현 효과 등의 문제점이 있다.

따라서, 기존의 비바이러스성 벡터의 장점은 그대로 유지하면서 형질도입 효율을 증강시킨 핵산 전달체의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 세포독성은 낮으면서 높은 형질도입 효율을 나타내는 핵산 전달체를 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 종래에 친수성 핵산 전달체는 형질도입 효율이 낮고 세포 유입(uptake) 효율이 낮다고 알려진 바와 달리, 2개 이상의 히드록실기를 포함하는 링커 화합물을 이용하여 2 이상의 스페르민(spermine, SPE)을 공중합시킨 스페르민 공중합체는 DNA 등 치료 핵산에 높은 결합능을 나타내고 핵산분해효소로부터 치료 핵산을 효과적으로 보호하며 핵산 전달체로 사용하기에 적합한 물리화학적 특성을 나타낼 뿐만 아니라, 링커의 히드록실기가 다른 혈액 단백질의 접근 및 그로 인한 응집을 방지하여 핵산 전달체의 혈액 내 안정성을 향상시킴으로써, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성 및 현저히 향상된 형질도입 효율을 나타냄을 발견하고, 상기 스페르민 공중합체가 유전자 치료를 위한 핵산 전달체로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 핵산 전달체로서 세포독성을 나타내지 않으면서 형질도입 효율이 현저히 향상된 스페르민 공중합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 스페르민 공중합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 스페르민 공중합체에 치료 핵산을 결합시킨 핵산 전달 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 전달 복합체를 유효성분으로 함유하는 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 링커의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 두 개의 아크릴레이트 말단에 스페르민의 1차 아민 또는 2차 아민이 부가반응에 의해 결합된 스페르민 공중합체를 제공한다.

본 발명의 링커는 2개 이상의 히드록실기와 2개 이상의 아크릴레이트기를 포함한다. 본 발명의 링커는, 상기 히드록실기에 의하여 친수성을 나타내고, 혈액 내에서 혈액 단백질의 접근 및 그로 인한 응집을 방지하여 핵산 전달체의 혈액 내 안정성을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 링커는, 상기 아크릴레이트기(마이클 수용체(Micheal acceptor)로 작용)에 스페르민의 1차 아민 또는 2차 아민, 바람직하게는 NH₂(마이클 공여체(Micheal donor)로 작용)와 마이클 부가반응을 할 수 있다. 링커와의 마이클 부가반응의 결과, 간단한 공정을 통하여 스페르민을 고분자화할 수 있다. 본 발명의 링커는 화학식 1로 표시될 수 있으나, 2개 이상의 히드록실기와 2개 이상의 아크릴레이트기를 포함하는 한, 본 발명의 범주에 속한다. 상기 화학식 1에서, 아크릴레이트기와 히드록실기 사이의 탄소수 조절이 가능하며, 바람직하게는, 핵산 압축능을 더욱 향상시키기 위하여 아크릴레이트기 및 히드록실기가 3개일 수 있고, 더욱 바람직하게는 하기 화학식 2로 표시되는 글리세롤 프로폭실레이트 트라이아크릴레이트(glycerol propoxylate triacrylate, GPT, C₂₁H₃₂O₉, 428 Da)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 글리세롤 프로폭실레이트 트라이아크릴레이트는 스페르민과 반응하여 마이클 부가반응에 의해 3개의 아크릴레이트 말단에 스페르민을 중합시킬 수 있다.

본 발명에서 용어, "스페르민(spermine)"은 하기 화학식 3으로 표시되고 2개의 일차 및 이차 아미노기를 갖는 생물기원 테트라-아민(biogenic tetra-amine)이다.

스페르민은 모든 진핵세포에 자연적으로 존재하며, 특히 단백질 및 핵산 합성이 왕성한 조직에 다량으로 포함되고, 세포대사에 관여하며, DNA 또는 RNA 구조의 안정화, 리보솜과 rRNA 결합의 안정화, 히스톤의 아세틸화 촉진, 비히스톤 단백질의 인산화촉진 등의 생리작용을 나타낸다. 핵산 전달체로서의 스페르민은, 기존에 핵산 전달체로 사용되던 폴리에틸렌이민(25kDa)에 비하여 분자량이 작아 세포독성이 적고 안전성이 우수한 장점이 있다. 단량체 스페르민은 길이가 짧기 때문에 핵산을 효과적으로 압축하여 세포 내로 효과적으로 유입시키기 위해서 스페르민을 고분자화하는 것이 필요하다.

본 발명의 스페르민 공중합체는 스페르민을 복수 개 연결함으로써 핵산 압축능이 우수하고, 세포 내로 도입된 후로는 링커와 스페르민 간의 결합이 가수분해되므로 핵산 방출능 또한 우수하며, 고분자 핵산 전달체가 단량체로 가수분해되어 안전성이 우수한 효과가 있다. 또한, 링커 화합물의 히드록실기에 의하여, 혈액 내에서 혈액 단백질의 접근 및 그로 인한 응집을 방지하여 핵산 전달체의 혈액 내 안정성을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 스페르민 공중합체는, 스페르민 중 링커에 연결되지 않은 1차 아민 또는 2차 아민이 또다른 화학식 1로 표시되는 링커의 아크릴레이트 말단에 부가반응에 의해 추가로 결합되어, 바람직하게는 화학식 1로 표시되는 링커를 통하여 덴드리머(dendrimer)를 형성하는 스페르민 공중합체일 수 있다. 덴드리머는 반복적으로 분지된 구조로서 예를 들어 하기의 구조일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 스페르민 공중합체는 하기 화학식 4로 표시될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 스페르민 공중합체는 1분자의 글리세롤 프로폭실레이트 트라이아크릴레이트를 기준으로 3분자의 스페르민이 결합된 형태를 갖는다. 본 발명의 일실시예에서, 스페르민 공중합체는 효과적인 핵산 전달을 위해 3 내지 15 kDa 범위의 분자량을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 일실시예에서, 스페르민 공중합체는 5 내지 30 mV 범위의 제타 전위(zeta potential)를 갖는 것이 효과적인 핵산 전달을 위해 바람직하다. 상기 범위의 물리화학적 특성을 나타낼 때, 본 발명의 스페르민 공중합체는 핵산 전달체로서 세포의 엔도좀(endosome) 내에 효과적으로 유입될 수 있다.

본 발명의 스페르민 공중합체는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 갈락토실화 폴리에틸렌글리콜(gal-PEG), 엽산(folate), 만노스(mannose), 또는 그 조합이 추가로 결합될 수 있다. 상기 결합은 물리적 또는 화학적 결합일 수 있고, 화학적 결합은 공유결합, 이온결합, 분자간 결합 등일 수 있으나, 특별히 한정되지 않는다.

PEG 결합에 의한 개질은 본 발명의 스페르민 공중합체로 하여금 혈장 성분들과의 상호작용을 차단하여 혈액 안정성을 향상시켜 핵산 전달체의 반감기를 연장하는 효과를 기대할 수 있다. 본 발명에서 용어, "폴리에틸렌글리콜(PEG)"은 말단 히드록실기를 갖는 직쇄형 중합체로서, 화학식 HO-CH₂CH₂-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH(식 중, n은 약 8 내지 약 4000임)을 갖는다. 본 발명에 사용하기에 적당한 PEG는 양 말단에 각각 같거나 다른 관능기를 갖는 이관능성(bi-functional) PEG일 수 있고, 바람직하게는 N-말단에 아민기(NH₂)를 갖고 C-말단에 카르복실기(COOH)를 갖는 헤테로-이관능성 PEG일 수 있다. 본 발명에 유용한 PEG의 분자량은 바람직하게는 2 내지 10 kDa, 보다 바람직하게는 5 kDa 일 수 있다.

갈락토실화 폴리에틸렌글리콜은 간세포 표적능을 부여하기 위하여 결합되는 것으로서, 간세포 표적 핵산 전달체로서 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 간세포에만 높은 밀도로 존재하는 아시알로당단백질(ASGPR)과의 수용체-매개 상호작용에 관여하는 갈락토스 잔기를 포함하기 때문에, 수용체-매개 세포 내 이입에 의해 간세포 특이적으로 효과적인 유전자 전달이 가능하다. 갈락토실화 폴리에틸렌글리콜은 갈락토스 함유 당단백질의 활성화된 카르복실기와 이관능성 PEG의 아민기 사이의 아미드 반응에 의해 합성된 결합체를 지칭하는데, 하기 화학식 5로 표시될 수 있다. 상기 갈락토스 함유 당단백질은 말단 당 기로 갈락토스 잔기를 갖는 임의의 모든 당단백질로서, PEG에 수식되어 최종적으로 수득되는 공중합체에 갈락토스 잔기를 부여할 수 있는 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 이관능성 PEG의 말단 카르복실기와 아민기는 작용기로서, 아민기는 갈락토스 함유 당단백질의 카르복실기와 아미드 결합을 형성하고, 카르복실기는 스페르민 공중합체의 아민기와 아미드 결합을 형성할 수 있다.

만노스를 스페르민 중합체에 도입하면, 만노스 수용체를 갖는 세포와 특이적으로 결합할 수 있어, 유전자 전달 효율을 높이고, 수용체 매개 세포 내 이입을 유도할 수 있다. 만노스 수용체를 갖는 세포로서 알려진 것은 대식세포 (macrophage cell)와 수지상세포 (dendritic cell)가 있다.

엽산은 비타민의 일종으로, 비타민 B9 또는 비타민 M 이라고도 불린다. 엽산은 엽산 수용체와 특이적 결합을 이룬다. "엽산 수용체"는 종양 관련된 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커 단백질로서, 결합된 엽산 또는 엽산 결합된 물질이 수용체-매개 엔도사이토시스를 통하여 섭취되도록 한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 용매에 용해된 상기 화학식 1로 표시되는 링커 화합물을, 용매에 용해된 스페르민과 혼합하여 마이클 부가반응을 수행하는 단계; 및 상기 반응물로부터 형성된 스페르민 공중합체를 분리하는 단계를 포함하는, 스페르민 공중합체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따른 스페르민 공중합체는 도 1에 나타난 바와 같이,

1) 스페르민과 글리세롤 프로폭실레이트 트라이아크릴레이트 각각을 용매에 용해시키는 단계;

2) 교반 하에 글리세롤 프로폭실레이트 트라이아크릴레이트 용액을 스페르민 용액에 첨가하여 마이클 부가반응을 수행하는 단계; 및

3) 반응물로부터 형성된 공중합체를 분리하여 스페르민 공중합체를 수득하는 단계를 통하여 제조될 수 있다.

구체적으로, 단계 1)은 마이클 공여체로서의 스페르민과 마이클 수용체로서의 링커의 아크릴레이트기 사이의 마이클 부가반응을 위해, 스페르민과 링커 화합물 각각을 용매에 용해시켜 반응용액을 제조하는 단계이다. 본 발명에 사용가능한 반응용매는 스페르민과 링커 화합물(예, 글리세롤 프로폭실레이트 트라이아크릴레이트)과 반응하거나 이들을 분해하지 않으면서 이들을 용해시킬 수 있는 것이라면 임의의 용매를 적절히 선택하여 채용할 수 있다. 이러한 용매의 예로는 무수 메틸알코올, 에틸알코올 등을 들 수 있다.

단계 2)는 단계 1)에서 제조된 스페르민 반응용액을 교반하면서 링커 화합물 반응용액을 첨가하여 마이클 부가반응을 수행하는 단계이다. 본 발명에 적합한 마이클 부가반응은 3 내지 5℃에서 1 내지 3시간 동안에 이어서 20 내지 25℃에서 12 내지 24시간 동안, 바람직하게는 4℃에서 2시간 동안에 이어서 25℃에서 12시간 동안 수행한다. 본 발명에 적합한 마이클 부가반응에서 스페르민과 링커 화합물(예, 글리세롤 프로폭실레이트 트라이아크릴레이트)의 반응 몰비는 4:3 내지 8:3, 바람직하게는 5:3이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 4℃에서 2시간 동안 교반 하에 2.5 M의 스페르민 반응용액에 1.5 M의 글리세롤 프로폭실레이트 트라이아크릴레이트 반응용액을 서서히 첨가한 후 실온에서 밤새 반응시켜 마이클 부가반응을 수행한다.

단계 3)은 단계 2)의 마이클 부가반응에 의해 형성된 공중합체를 분리하여 스페르민 공중합체를 수득하는 단계로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 수득된 반응물을 24시간 동안 진공-건조하여 4℃에서 증류수에 용해시킨 후 4℃에서 24시간 동안 증류수에 대해 투석(MWCO = 3500)을 수행하여 스페르민 공중합체를 분리한다. 이렇게 분리된 스페르민 공중합체는 동결-건조되어 -25℃에 보관될 수 있는데, 동결-건조는 통상적으로 사용되는 동결-건조 방법 또는 동결-건조기를 사용하여 수행될 수 있고, 그 결과 부생성물이 제거된 점성을 갖는 스페르민 공중합체의 나노입자를 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서 제조된 본 발명의 스페르민 공중합체는 3,000 내지 6,000 Da의 분자량을 가지며, ¹H-NMR 분석에 의해 δ = 3.9-4.0 ppm에서 글리세롤 프로폭실레이트 트라이아크릴레이트의 메틸렌기의 양성자에 대한 피크가, δ = 1.6-1.7 ppm에서 스페르민의 에틸렌기의 양성자에 대한 피크가 검출되어(도 2 참고), 스페르민과 글리세롤 프로폭실레이트 트라이아크릴레이트 사이의 마이클 부가반응에 의해 본 발명에 따른 스페르민 공중합체가 효과적으로 형성되었음을 확인하였다. 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography) 분석 결과, 본 발명의 스페르민 공중합체의 중량-평균 분자량(Mw)은 5170이고, 수-평균 분자량(Mn)은 3870이며, 다분산 지수(polydispersity index, PDI = Mw/Mn)는 1.34인 것으로 확인되었다.

본 발명의 제조방법에 의하는 경우, 간단한 공정을 통하여 본 발명의 스페르민 공중합체를 제조할 수 있으므로, 본 발명의 스페르민 공중합체를 대량생산할 수 있고, 세포 내로 도입된 후로는 링커와 스페르민 간의 에스테르 결합이 가수분해되어 고분자 핵산 전달체가 단량체로 가수분해되므로 핵산 방출능 및 안전성이 우수한 효과가 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 상기 스페르민 공중합체에 치료 핵산이 결합된 핵산 전달 복합체를 제공한다. 본 발명의 스페르민 공중합체에 결합될 수 있는 치료 핵산의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 본 발명의 목적에 따라 원하는 표적에 전달되어 원하는 치료 효과를 발휘할 수 있는 어떠한 핵산도 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 스페르민 공중합체와의 복합체 형태로 전달이 가능한 핵산으로는 질병과 관련된 핵산의 정상 핵산, 표적 단백질의 발현 억제 핵산 등이 siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, DNA, 단일가닥 RNA, 이중가닥 RNA, DNA-RNA 혼성체(hybrid) 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태로 전달될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 전달 복합체의 효과적인 형성을 위해 치료 핵산과 스페르민 공중합체를 1:1 내지 1:50, 바람직하게는 1:1 내지 1:20, 더욱 바람직하게는 1:5 내지 1:10의 중량비로 반응시켜 핵산 전달체의 전하가 적정 전하가 되도록 하는 것이 바람직하다. 핵산 전달체의 양전하가 과도하게 높으면 핵산 압축능은 증가하지만 세포 표면에 손상을 입혀 세포 독성이 높아진다.

본 발명에 따른 스페르민 공중합체의 치료 핵산에 대한 응축능(condensation capability)을 조사하기 위해 다양한 중량비로 스페르민 공중합체와 DNA를 반응시킨 결과, 이들의 중량비가 5:1 이상인 경우에 상기 스페르민 공중합체와 DNA의 핵산 전달 복합체(GTP-SPE/DNA)가 가장 효과적으로 형성되고(도 3a 참고), 핵산분해효소에 의한 공격으로부터 핵산 전달 복합체 내 DNA가 효과적으로 보호되며(도 3b 참고), 형성된 핵산 전달 복합체가 구형 모양의 압축된 구조를 가짐을 확인하였다(도 3c 참고). 또한, 본 발명에 따른 핵산 전달 복합체는 평균 120 내지 200 nm의 상대적으로 균일한 입자 크기 분포(PDI: 1.938e-001)를 나타내어(도 3d 참고) 핵산 전달체로 사용되기에 적합한 입자 크기를 가질 뿐만 아니라, 표면 전하가 양성의 제타 전위(zeta potential)를 나타내어(도 3e 참고) 음이온 세포 표면에 효과적으로 결합할 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명에 따른 스페르민 공중합체의 세포 내 유입을 확인하기 위해, 스페르민 공중합체를 FITC로 표지한 후 DNA와 반응시켜 FITC-표지된 핵산 전달 복합체(GTP-SPE/DNA-FITC)를 제조하였다. 준비된 FITC-표지된 핵산 전달 복합체를 세포에 형질도입한 후 공초점 현미경으로 세포를 관찰한 결과, FITC-표지된 핵산 전달 복합체가 세포 내에서 검출됨을 확인하였다(도 4a 참고).

또한, 본 발명에 따른 스페르민 공중합체의 형질도입 효율을 조사하기 위해 다양한 중량비로 스페르민 공중합체와 DNA를 반응시켜 핵산 전달 복합체(GTP-SPE/DNA)를 형성한 후 이들의 형질도입 효율을 루시퍼라제(luciferase) 활성 분석을 통해 조사하였다. 그 결과, DNA와 스페르민 공중합체의 중량비가 1:5 내지 1:10까지는 중량비의 증가에 따라 핵산 전달 복합체의 형질도입 효율이 증가하고, 1:10 이상의 중량비에서는 비슷한 수준의 높은 형질도입 효율을 나타내며, 특히 본 발명의 핵산 전달 복합체는 DNA 단독 처리군에 비해 1800배 이상 높은 형질도입 효율을 나타냄을 확인하였다(도 4b 참고). 이는 본 발명의 스페르민 공중합체가 DNA에 대한 결합능이 우수하여 효과적으로 나노 크기의 핵산 전달 복합체를 형성하고, 그로 인해 높은 형질도입 효율을 나타냄을 의미하는 것이다. 또한, 혈청 존재 하에 본 발명의 일실시예에 따른 GPT-SPE/pGL3의 형질 도입 효율을 PEI 25K/pGL3 및 리포펙타민/pGL3의 형질도입 효율과 비교한 결과, 10% 혈청 존재 하에서, 본 발명의 일실시예에 따른 GPT-SPE/pGL3의 형질 도입 효율은 약간 감소(12.8-folds)한 것에 반하여, PEI 25K/pGL3 및 리포펙타민/pGL3의 형질도입 효율은 현저히 감소(각각, 192.7-folds 및 3468.4-folds)한 것을 확인할 수 있었다(도 4c 참고).

이에 본 발명에 따른 스페르민 공중합체의 형질도입 기작을 규명하기 위해, 엔도솜 양자 펌프 억제제(endosome proton pump inhibitor)인 바필로마이신 A1(bafilomycin A1)을 이용하여 상기 공중합체의 완충능을 조사한 결과, 본 발명에 따른 스페르민 공중합체의 형질도입 효율은 바필로마이신 A1 처리 후 급격하게 감소하였다(도 4d 참고). 이는 본 발명의 스페르민 공중합체가 양성자 스폰지 효과(proton sponge effect)에 의해 엔도솜으로부터 세포질 내로 효과적으로 방출될 수 있음을 나타내는 것이다.

또한, 본 발명에 따른 스페르민 공중합체의 세포독성을 다양한 세포주를 대상으로 조사한 결과, 비교군으로 사용된 폴리에틸렌이민(PEI, 25kDa)보다 세포독성이 낮고, 대상 세포 모두에서 고농도(100 ㎍/㎖)의 처리에서도 세포 생존율이 높게 나타남을 확인하였다(도 5a 내지 5d 참고).

따라서, 본 발명의 스페르민 공중합체는 DNA에 높은 결합능을 나타내고 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며 핵산 전달체로 사용하기에 적합한 구형의 균일한 입자 크기의 핵산 전달 복합체를 형성할 수 있을 뿐만 아니라, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내고 형질도입 효율이 매우 높아 유전자 치료를 위한 핵산 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.

이에 본 발명은, 하나의 양태로서, 상기 스페르민 공중합체에 치료 핵산이 결합된 핵산 전달 복합체를 유효성분으로 함유하는 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여 시에는 상기 유효성분 이외에 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 추가로 포함할 수 있다. 주사제의 경우에, 본 발명의 약학적 조성물은 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한 국소 투여 시에 본 발명의 조성물은 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같이 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약앰플 또는 다중 투약형태로 제조할 수 있다. 기타 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 설하, 흡입 또는 국소 투여가 가능하다. 이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 유효성분은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 유효 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 당해 기술 분야의 통상의 전문가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 핵산 전달체와 결합되는 치료 핵산의 목적 질환 종류에 따라, 투여 경로를 달리 할 수 있고, 목적 세포에 따라 표적화 인자를 결합하여 다양한 질환 치료에 사용할 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 스페르민 공중합체에 치료 핵산이 결합된 핵산 전달 복합체를 에어로졸 전달을 통해 표적 부위에 전달하도록 제제화된 상기 약학적 조성물의 흡입 투여용 제형(에어로졸 제형)을 제공한다.

흡입(inhalation)을 통한 약물 전달은 기도를 통과하여 폐의 점막을 통하여 직접 폐세포로 약물을 전달하는 비침습적(non-invasive) 방법 중 하나로, 특히 폐 질환의 광범위한 치료에 에어로졸 전달을 통한 핵산 전달이 유리하게 이용될 수 있다. 이는 폐의 해부학적 구조 및 위치가 즉각적이고 비침습적인 접근을 가능케 하고, 다른 기관에는 영향을 미치지 않으면서 핵산 전달 시스템의 국소 적용을 받을 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 스페르민 공중합체에 치료 핵산으로서 폐 질환, 특히 폐암과 관련된 핵산을 결합시킨 핵산 전달 복합체를 에어로졸 방식으로 폐에 전달하면, 상기 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 기대할 수 있다. 흡입 투여용 제형을 위하여, 핵산 전달 복합체가 120 내지 200 nm의 평균 입자 크기를 갖는 것이 바람직하고, 이를 위하여, 핵산을 핵산 전달체와 1:5 이상의 중량비로 혼합하여 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 본 발명에 따른 스페르민 공중합체의 에어로졸에 의한 생체 내 전달효율을 확인하기 위하여, 먼저 스페르민 공중합체와 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 핵산을 10:1의 중량비로 혼합하여 핵산 전달 복합체(GTP-SPE/GFP)를 제조한 후 이를 포함하는 에어로졸에 정상 마우스를 노출시켰다. 그 결과, 비처리 대조군과 GFP 단독 처리군에 비해 본 발명의 핵산 전달 복합체(GTP-SPE/GFP) 처리군에서 현저히 증가된 GFP 신호가 검출되었고, 모든 처리군에서 어떠한 세포독성도 나타나지 않음을 확인하였다(도 6a, 6b 및 7 참고).

하나의 양태로서, 본 발명은 유전자 치료요법이 필요한 개개인의 기도를 통해 스페르민 공중합체와 복합체를 형성한 치료 핵산과 같은 유전적 거대분자의 수성 분산제를 소립자 에어로졸을 통하여 전달하는 단계를 포함하는, 기도를 통해 유전자 치료 요법을 표적화하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 전달 방법에는 경구 흡입 및 비내 흡입 방법, 안면 마스크 또는 경구용 튜브에 의한 방법 및 산소를 투여하기 위해 사용되어 온 어린이용 산소 후드에 의한 방법이 포함될 수 있다. 일반적으로, 소립자 에어로졸은 분무화 공정에 의해서 창출되고, 이러한 분무화 공정은 제트 분무기에 의해 수행된다. 추가로, 치료 핵산이 발현에 필요한 작동적으로 연결된 요소를 포함하는 것이 바람직하고, 대표적인 치료 핵산에는 담낭 섬유증 트랜스멤브레인 컨덕턴스(conductance) 조절인자 핵산, p53 또는 망막아종과 같이 종양 억제인자를 암호화하는 핵산, 또는 유전공학적으로 처리된 이들 핵산의 변이체, 사이토킨 핵산, 예를 들면, 인터루킨-2 또는 인터루킨-12, 및 종양 또는 기타 감염성 제제에 대한 직접 면역 반응을 자극할 DNA 백신으로서 사용하게 될 핵산이 포함된다. 또 다른 대표적인 치료 핵산은 세린/트레오닌 키나아제인 Akt1 핵산 작용제이다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 스페르민 공중합체에 치료 핵산으로서 Akt1 핵산의 발현을 억제하는 작용제가 결합된 핵산 전달 복합체를 에어로졸 전달에 의한 폐암 치료에 사용한다. Akt는 세포의 생존 및 증식에 중요한 조절제로서, 세포증식의 자극 및 아폽토시스(apoptosis)의 억제를 통해 발암에 핵심적인 역할을 담당한다. 많은 종양에서 Akt 이소형(isoforms)인 Akt1, 2 및 3을 코딩하는 핵산의 발현이 증폭되어 있음이 발견되었다. 따라서, Akt 활성 또는 발현 억제는 암세포의 생존 및 증식을 차단하고 암세포의 아폽토시스를 유도함으로써 암의 치료를 위한 합리적인 전략일 수 있다. 본 발명에 적합한 Akt1의 발현 또는 활성을 억제하는 작용제에는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 길항제, 리보자임, 억제제, 펩티드, 소형 분자 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Akt1을 표적으로 하는 shRNA 구조체로서 서열번호 1로 표시되는 19-mer 머리핀형 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드(Meng et al., Cell Signal 2006, 18(12): 2262e71)를 Akt1의 발현 또는 활성을 억제하는 작용제로 사용하였다.

본 발명의 약학적 조성물은 수성 분산제를 개개인 또는 동물의 기도에 에어로졸 전달하도록 제조할 수 있다는 것을 특별히 고려해야 한다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 과도한 실험 없이 에어로졸 제형의 적당한 투여량을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 표적화된 유전자 치료 요법을 위해 생체 내에서 사용된 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 치료학적 유효량, 즉 치료 핵산을 효율적으로 발현시킴으로써 해당 질환을 없애거나 완화시키는 양으로 환자 또는 동물에게 투여된다. 용량 및 투여량 섭생은 질환의 종류, 특정한 스페르민 공중합체/DNA 복합체의 특징, 예를 들면, 이의 치료학적 지수, 환자, 환자의 병력 및 기타 요인들에 좌우될 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 전형적으로 약 0.01 내지 약 0.1 g/체중 kg일 것이다. 당해 조성물 및 제형은 미량의 부가제, 예를 들면, 등장성 및 화학적 안정성을 증진시키는 물질(예: 완충제 및 방부제)을 함유할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 스페르민 공중합체에 치료 핵산이 결합된 핵산 전달 복합체를 정맥 주사를 통해 표적 부위에 전달하도록 제제화된 상기 약학적 조성물의 정맥 주사용 제형을 제공한다. 본 발명의 핵산 전달 복합체는 혈액 내 안정성이 높기 때문에, 효율적으로 전신전달에 이용될 수 있고, 혈액 내 안정성을 더욱 향상시키기 위하여, 스페르민 공중합체에 PEG를 추가로 결합시킬 수 있다.

본 발명의 스페르민 공중합체는 2개 이상의 히드록실기를 포함하는 링커 화합물을 이용하여 2 이상의 스페르민(spermine, SPE)을 공중합시킴으로써, DNA 등 치료 핵산에 높은 결합능을 나타내고, 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며, 핵산 전달체로 사용하기에 적합한 물리화학적 특성을 나타낼 뿐만 아니라, 링커의 히드록실기가 다른 혈액 단백질의 접근 및 그로 인한 응집을 방지하여 핵산 전달체의 혈액 내 안정성을 향상시킴으로써, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내고, 형질도입 효율이 매우 높아 유전자 치료를 위한 핵산 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 스페르민 공중합체(GPT-SPE)의 제조방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 스페르민 공중합체(GPT-SPE)의 조성을 ¹H-NMR로 분석한 결과로, δ = 1.6-1.7 ppm에서 [-CH₂-CH₂-]의 스페르민 양성자에 대한 피크가, δ = 3.9-4.0 ppm에서 [-CH-]의 GPT의 메틸렌기의 양성자에 대한 피크가 검출되어 스페르민 공중합체가 효과적으로 형성되었음을 확인하였다.
도 3a는 본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)와 DNA를 다양한 중량비로 반응시켜 제조한 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/DNA)의 이동성을 아가로스 겔 전기영동으로 분석한 결과이다.
도 3b는 본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)와 DNA를 다양한 중량비로 반응시켜 제조한 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/DNA)가 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호할 수 있음을 나타내는 결과이다.
도 3c는 본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)와 DNA를 다양한 중량비로 반응시켜 제조한 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/DNA)의 형태를 에너지 여과 투과 전자현미경(Energy Filtering Transmision Electron Microscopy, EF-TEM)으로 분석한 결과이다.
도 3d는 본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)와 DNA를 다양한 중량비로 반응시켜 제조한 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/DNA)의 입자 크기 분포를 분석한 결과이다.
도 3e는 본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)와 DNA를 다양한 중량비로 반응시켜 제조한 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/DNA)의 표면 전하(n=3, 오차 막대는 표준 편차를 나타냄)를 측정한 결과이다.
도 4a는 본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)와 DNA를 다양한 중량비로 반응시켜 제조한 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/DNA)의 세포 내 유입을 FITC 표지를 이용하여 조사한 결과이다.
도 4b는 본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)와 DNA를 다양한 중량비로 반응시켜 제조한 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/DNA)의 형질도입 효율을 A549 세포주를 대상으로 조사한 결과이다(평균± SD, n=3). 도면에서 RLU는 'relative light unit'의 약자로 발광 정도를 나타낸다.
도 4c는 유전자 형질도입 효율에 대한 혈청의 영향을 알아보기 위한 실험 결과이다. A549 세포를 10% 혈청 존재/부존재 하에 공중합체/pGL3 복합체와 함께 배양한 결과를 나타낸다(평균 ± SD, n = 3).
도 4d는 본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)와 DNA를 다양한 중량비로 반응시켜 제조한 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/DNA)의 완충능(buffering capacity)을 바필로마이신(bafilomycin) A1의 처리를 통해 조사한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)의 세포독성을 다양한 농도에서 다양한 세포(a: A549 세포주; b: HepG2 세포주; c: MCF7 세포주; d: HeLa 세포주)를 대상으로 조사한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)와 GFP(green fluorescent protein)를 반응시켜 제조한 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/GFP)를 마우스의 폐에 에어로졸 투여한 후 생체 내 GFP 발현을 분석한 결과(배율: 200×, 스케일 바는 50 ㎛를 나타냄)로, a는 형질도입 효율을 나타낸 것이고, b는 폐의 조직병리학적 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)와 GFP를 반응시켜 제조한 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/GFP)가 에어로졸 투여된 마우스의 폐를 비롯한 다양한 기관 조직을 조직병리학적으로 검사한 결과이다(배율: 200×, 스케일 바는 50 ㎛를 나타냄).
도 8은 본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)와 Akt1 shRNA를 반응시켜 제조한 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/shAkt1)를 폐종양 보유 k-ras 마우스의 폐에 에어로졸 투여한 후 치료 효과를 확인한 결과(배율: 200×, 스케일 바는 50 ㎛를 나타냄)로, 도 8a는 에어로졸 투여 후 폐의 병변을 나타내고(붉은색 원이 종양 조직을 나타냄); 도 8b는 에어로졸 투여 후 총 종양 개수를 측정한 결과(n=4, *는 GPT-SPE/Scr 대비 p<0.05이고, **는 Akt1 shRNA 단독 대비 p<0.01, 대조군 대비 p<0.01임), 및 에어로졸 투여 후 직경 1 mm 이상인 종양의 개수를 측정한 결과(n=4, *는 GPT-SPE/Scr 대비 p<0.05이고, ***는 Akt1 shRNA 단독 대비 p<0.001이고, **는 대조군 대비 p<0.01임)이고; 도 8c는 조직병리학적으로 검사한 결과로서, 붉은색 원이 폐 내 발생된 병변을 나타내고(배율: 200×, 스케일 바는 50 ㎛를 나타냄); 도 8d는 에어로졸 투여 후 폐 내 Akt1 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯 분석하고 덴시토미터로 분석한 결과이다(n=4, **p<0.01, ***p<0.001).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다.

실시예 1: 스페르민 공중합체의 제조

본 발명의 일실시예에 따른 스페르민 공중합체는 문헌(Arote RB, et al., Bioconjug. Chem. 2009, 20(12): 2231-41)에 보고된 방법을 약간 변형한 마이클 부가반응에 따라 합성하였다(도 1).

간략히 설명하면, 2.5 M 스페르민(MW: 202.34 Da, Sigma-Aldrich)과 1.5 M 글리세롤 프로폭실레이트 트라이아크릴레이트(GPT)(MW: 428 Da, Sigma-Aldrich)를 각각 4℃에서 무수 에틸알코올에 용해시킨 후 제조된 GPT 용액을 4℃에서 2시간 동안 교반하면서 제조된 스페르민 용액에 서서히 첨가하고 실온에서 밤새 반응시켰다. 이로부터 수득된 공중합체를 24시간 동안 진공-건조시키고 4℃에서 증류수에 용해시켰다. 얻어진 용액을 투석막(Spectra/Por^®, MWCO = 3500)을 사용하여 4℃에서 24시간 동안 증류수에 대해 5회 투석을 수행하여 미반응물을 제거하였고, 분리된 스페르민 공중합체(GPT-SPE)는 -20℃에서 동결-건조하였다.

동결-건조된 스페르민 공중합체(GPT-SPE)의 조성을 ¹H-핵자기 공명(¹H-nuclear magnetic resonance, ¹H-NMR)(Avance 600, Bruker, Germany)으로 분석하였다. ¹H-NMR 분석을 위해 스페르민 공중합체(GPT-SPE)를 증류수에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, δ = 3.9-4.0 ppm에서 글리세롤 프로폭실레이트 트라이아크릴레이트의 메틸렌기의 양성자에 대한 피크가, δ = 1.6-1.7 ppm에서 스페르민의 에틸렌기의 양성자에 대한 피크가 검출되어 스페르민과 글리세롤 프로폭실레이트 트라이아크릴레이트의 공중합체가 효과적으로 형성되었음을 확인하였다.

또한, 겔-투과 크로마토그래피 칼럼(gel-permeation chromatography column, GPC-MALS, Dawn Eos, Wyatt, USA)을 이용해 690 nm 레이저 파장에서 공중합체의 분자량을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

	Mw	Mn	PDI
GPT-SPE	5170	3870	1.34

표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 스페르민 공중합체의 중량-평균 분자량(Mw)은 5170이고, 수-평균 분자량(Mn)은 3870이며, 다분산 지수(polydispersity index, PDI = Mw/Mn)는 1.34인 것으로 확인되었다.

실시예 2: 스페르민 공중합체/DNA 복합체의 특성 분석

<2-1> 스페르민 공중합체의 DNA 응축능

핵산 전달체의 가장 중요한 특징 중 하나는 플라스미드 DNA와 상호작용하여 이를 응축시킬 수 있는 능력이다. 이에 상기 실시예 1에서 제조된 스페르민 공중합체의 DNA 응축능을 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다. 먼저, 스페르민 공중합체(GPT-SPE) 용액에 pGL3 플라스미드(5.3 kb, Promega)를 0.01, 0.5, 1, 5 및 10의 다양한 중량비(weight ratio)로 혼합한 후 가볍게 볼텍싱(vortexing)해주고 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 각 반응용액을 1% 아가로스 겔에 전기영동을 수행하고 자외선 하에서 DNA 이동성을 관찰하였다. 이때, 대조군으로는 본 발명의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)와 반응시키지 않은 pGL3 플라스미드 단독을 사용하였다.

그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, 본 발명의 스페르민 공중합체와 플라스미드 DNA가 1:1 이하의 중량비로 반응한 경우에는 DNA 응축으로 인한 지연(retardation) 현상이 야기되지 않거나 미미한 반면, 이들의 중량비가 5:1 이상인 경우에는 DNA의 이동성이 완전히 지연되었는데, 이는 본 발명의 스페르민 공중합체가 플라스미드 DNA를 효과적으로 응축시켜 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/DNA)를 형성하였음을 나타내는 것이다. 대조군인 비반응 플라스미드 DNA는 아무런 지연 없이 겔을 통과하여 이동하였다. 상기 결과로부터 핵산 전달 복합체의 효과적인 형성을 위해서는 본 발명의 스페르민 공중합체와 플라스미드 DNA를 5:1 이상의 중량비로 혼합하는 것이 바람직함을 알 수 있다.

<2-2> 스페르민 공중합체/DNA 복합체의 DNA 보호효과

효과적인 핵산 발현을 위해서는 핵산분해효소와 같은 효소 공격으로부터 핵산 전달 복합체 내의 DNA가 보호되어야 한다. 이러한 DNA 보호효과를 확인하기 위해, 상기 실시예 <2-1>에서 스페르민 공중합체와 DNA를 5:1의 중량비로 반응시켜 제조한 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/DNA) 용액 4 ㎕ 또는 비반응 플라스미드 DNA 용액 4 ㎕에 DNase I 1 ㎕(2 유닛) 또는 PBS(phosphate-buffered saline) 함유 DNase/Mg²⁺ 분해 완충액(50 mM TrisHCl, pH 7.6 및 10 mM MgCl₂) 1 ㎕를 첨가하고 37℃에서 30분간 100 rpm으로 교반하면서 인큐베이션하였다. 효소 반응을 중지시키기 위해, 모든 반응용액에 4 ㎕의 EDTA(250 mM)를 10분간 처리한 후, 1% 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, pH 7.2)를 혼합하여 최종 부피를 15 ㎕로 맞추고 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 반응용액을 트리스-아세테이트-EDTA 완충액(running buffer)을 이용해 1% 아가로스 겔에서 1시간 동안 50 V로 전기영동을 수행하였다.

그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이, 대조군인 비반응 플라스미드 DNA는 DNase I에 의해 완전히 분해된 반면, 본 발명의 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/DNA) 내의 DNA는 DNase I의 분해로부터 효과적으로 보호되었음을 알 수 있다. 이러한 결과는 본 발명의 핵산 전달 복합체가 핵산분해효소의 공격으로부터 DNA를 보호하면서 효과적으로 세포 내로 전달할 수 있음을 나타내는 것이다.

<2-3> 스페르민 공중합체/DNA 복합체의 형태학적 분석

상기 실시예 <2-1>에서 스페르민 공중합체와 DNA를 5:1의 중량비로 반응시켜 제조한 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/DNA)의 형태를 EF-TEM(LIBRA 120, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/DNA)는 스페르민 공중합체와 플라스미드 DNA가 효과적으로 응축하여 구형의 압축된 구조를 가지고 있음을 확인하였다.

핵산 전달 복합체의 입자 크기는 복합체가 표적 부위에 접근하고 이를 통과하는 데 중요한 요소로 복합체의 세포 내 유입에 필수적이다. 대부분의 핵산 전달 복합체는 세포 내 이입(endocytosis) 또는 포액작용(pinocytosis)에 의해 세포 내로 유입되기 때문에, 최적의 세포 내 유입을 위해서는 복합체의 크기가 일정 수준 이하인 것이 요구된다. 이에 동적 광 산란 분광 광도계(dynamic light scattering spectrophotometer, ELS8000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 다양한 중량비에서 핵산 전달 복합체의 입자 크기 및 분포도를 측정하였다. 이때, 산란각도(scattering angle)는 90° 및 20°로 설정하였다.

그 결과, 도 3d에 나타난 바와 같이, 중량비 5:1에서 본 발명의 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/DNA)는 평균 120 내지 200 nm의 상대적으로 균일한 입자 크기 분포(PDI: 1.938e-001)를 나타내어, 핵산 전달체로 사용되기에 적합한 입자 크기를 가짐을 확인하였다.

<2-4> 스페르민 공중합체/DNA 복합체의 표면 전하 측정

또한, 핵산 전달 복합체의 양성 표면 전하는 음이온 세포 표면에 결합하는데 필수적이고, 이는 복합체의 세포 내 유입을 용이하게 한다. 이에 본 발명의 스페르민 공중합체와 플라스미드 DNA를 다양한 중량비로 반응시켜 형성된 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/DNA)의 제타 전위(zeta potential)를 동적 광 산란 분광 광도계(ELS8000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 3e에 나타난 바와 같이, 본 발명의 스페르민 공중합체와 플라스미드 DNA가 0.1:1의 중량비로 반응한 경우에는 이들 사이의 복합체가 완벽하게 형성되지 않아 음성의 제타 전위를 나타낸 반면, 중량비가 5:1 이상으로 증가함에 따라 복합체는 양성의 제타 전위를 나타내었고(제타 전위: +9.14 Mv; 이동도: 6.922e-005 ㎠/Vs), 그 값은 급격하게 증가하였다. 이처럼 표면 전하가 양전하를 띤다는 것은 음전하를 띠는 DNA가 핵산 전달 복합체 내부에 완전히 둘러싸여 있음을 의미하고, 양성의 표면 전하는 핵산 전달 복합체의 세포 내로의 유입을 용이하게 할 뿐만 아니라, 입자들 사이에 정전기적 반발력을 일으켜 입자들끼리의 응집현상을 감소시키는 장점이 있다.

실시예 3: 스페르민 공중합체의 형질도입 효율

<3-1> 시험관 내 세포 내 유입 분석

본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)의 시험관 내 세포 내 유입(in vitro cellular uptake)을 확인하기 위하여, 플라스미드 DNA를 FITC로 표지한 후 스페르민 공중합체와 반응시켜 FITC-표지된 핵산 전달 복합체(GTP-SPE/DNA-FITC)를 제조하였다. 준비된 FITC-표지된 핵산 전달 복합체를 세포에 형질도입한 후 공초점 현미경으로 세포를 관찰한 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, FITC-표지된 핵산 전달 복합체가 세포 내에서 검출되어, 본 발명의 스페르민 공중합체가 DNA를 세포 내로 효과적으로 유입시킴을 확인하였다.

<3-2> 형질도입 효율 분석

본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)의 형질도입 효율을 조사하기 위하여, 시험관 내 루시퍼라제 활성 분석(in vitro luciferase activity assay)을 수행하였다.

먼저, 24-웰 플레이트에 10% FBS(HyClone), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 페니실린이 함유된 RPMI 1640(Gibco BRL) 배지를 첨가하고 A549 세포를 1.5×10⁵ 개/웰의 밀도로 접종하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 18시간 동안 배양하였다. 아울러, 본 발명의 스페르민 공중합체 용액에 SV40 프로모터 및 인핸서에 의해 발현이 유도되는 루시퍼라제 핵산을 포함하는 pGL3 발현벡터(5.3 kb, Promega)를 1, 5 및 10의 중량비로 혼합한 후 가볍게 볼텍싱 해주고 실온에서 30분간 인큐베이션하여 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/GL3)를 제조하였다. 상기 웰 플레이트의 배지를 무혈청 배지 또는 제조된 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/GL3) 1 ㎍를 함유하는 배지로 교체하고 4시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 이때, PEI(polyethylene imine) 25K(25 kDa, Sigma-Aldrich) 및 리포펙타민(lipofectamine)을 동일한 농도로 처리한 세포 배양액을 비교군으로 사용하였다. 그 후, 웰 플레이트의 배지를 신선한 10% FBS 함유 DMEM 배지로 교체하고 다시 48시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 이어서, 배지를 제거한 후, 각 웰에 세포 용해 완충액(cell lysis buffer)을 100 ㎕씩 첨가하고 -20℃에서 24시간 동안 방치한 후 배양액을 이-튜브(e-tube)로 옮겨 담고 10,000 rpm에서 15분간 원심분리를 수행하여 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액의 루시퍼라제 활성을 루시퍼라제 분석 키트(luciferase assay kit, Promega)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, DNA와 스페르민 공중합체의 중량비가 1:5 내지 1:10까지는 중량비의 증가에 따라 핵산 전달 복합체의 형질도입 효율이 증가하고, 1:10 이상의 중량비에서는 비슷한 수준의 높은 형질도입 효율을 나타내며, 특히 본 발명의 핵산 전달 복합체는 DNA 단독 처리군에 비해 1800배 이상 높은 형질도입 효율을 나타냄을 확인하였다. 이는 본 발명의 스페르민 공중합체가 DNA에 대한 결합능이 우수하여 효과적으로 나노 크기의 핵산 전달 복합체를 형성하고, 그로 인해 높은 형질도입 효율을 나타냄을 의미하는 것이다.

또한, 혈청 존재 하에 본 발명의 일실시예에 따른 GPT-SPE/pGL3의 형질 도입 효율을 PEI 25K/pGL3 및 리포펙타민/pGL3의 형질도입 효율과 비교한 결과, 10% 혈청 존재 하에서, 본 발명의 일실시예에 따른 GPT-SPE/pGL3의 형질 도입 효율은 약간 감소(12.8-folds)한 것에 반하여, PEI 25K/pGL3 및 리포펙타민/pGL3의 형질도입 효율은 현저히 감소(각각, 192.7-folds 및 3468.4-folds)한 것을 확인할 수 있었다(도 4c).

<3-3> 완충능 분석

본 발명에 따른 스페르민 공중합체의 이렇게 높은 형질도입 효율은 공중합체의 완충능(buffering capacity)에 기인한 것이다. 이에 본 발명의 일실시예에 따른 스페르민 공중합체(GPT-SPE)의 형질도입 기작을 규명하기 위해, 상기 공중합체의 완충능(buffering capacity)을 조사하였다. 상기와 같이 웰 플레이트에서 배양된 A549 세포에 DMSO에 희석된 바필로마이신 A1(bafilomycin A1, specific inhibitor of vacuolar type H+ ATPase, 200 nM)을 첨가하여 10분간 배양한 후, 상기와 동일한 방법으로 형질도입 효율을 측정하였다. 그 결과, 도 4d에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 스페르민 공중합체(GPT-SPE)의 형질도입 효율은 바필로마이신 A1 처리 후 급격하게 감소하였는데, 이는 본 발명의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)가 높은 완충능을 가지고 있으며, 따라서 양성자 스폰지 효과(proton sponge effect)에 의해 엔도솜으로부터 신속하게 방출되어 세포질 내로 유입될 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 4: 스페르민 공중합체의 세포독성

본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)의 세포독성을 조사하기 위해, 상기 공중합체의 농도를 달리하면서 세포 증식 분석(Cell Titer 96^® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay)을 수행하여 세포 생존능을 조사하였다.

먼저, A549(human lung adenocarcinoma cell, ATCC) 세포와 MCF7(human breast cancer cell, ATCC) 세포는 RPMI 1640(Gibco BRL, Paris, France) 배지에, HepG2(human hepatoblastoma cells, 한국세포주은행) 세포와 HeLa(human cervical carcinoma cell, ATCC) 세포는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium, Gibco BRL) 배지에 접종하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 이때, 모든 배지에는 10%의 우태아혈청(FBS, HyClone, Logan, UT, USA), 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 100 U/㎖의 페니실린을 첨가하였다. 배양된 A549, HepG2, MCF7 및 HeLa 세포를 1×10⁴ 개/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하고 18시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 상기 웰 플레이트의 배지를 본 발명의 스페르민 공중합체를 각각 5, 10, 20, 50 및 100 ㎍/㎖의 농도로 함유하는 무혈청 배지로 교체한 후 다시 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 이때, 무처리 세포 배양액을 대조군으로 사용하고, 스페르민(202.34 Da, Sigma-Aldrich) 및 PEI 25K(25 kDa, Sigma-Aldrich)를 동일한 농도로 처리한 세포 배양액을 비교군으로 사용하였다. 그 후, 웰 플레이트의 배지를 20 ㎕의 세포 역가 측정 시약(Cell Titer 96^® Aqueous One Solution Reagent)을 포함하는 성장 배지(growth medium)로 교체하였다. 3시간 동안 배양 후, ELISA 플레이트 판독기(GLR 1000, Genelabs Diagnostics, Singapore)를 사용하여 590 nm에서 웰 플레이트의 흡광도를 측정하여 세포의 대사 활성도(metabolic activity)를 조사하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)를 처리한 세포에서는 모두 100 ㎍/㎖의 고농도에서도 세포 생존율이 높게 나타난 반면(A549 세포에서 62.48%; HepG2 세포에서 76.33%; MCF7 세포에서 85.05%; 및 HeLa 세포에서 79.00%), PEI 25K를 처리한 세포의 세포 생존율은 농도가 증가함에 따라 급격하게 감소하였다(100 ㎍/㎖ 처리 시, A549 세포에서 12.32%; HepG2 세포에서 18.92%; MCF7 세포에서 29.58%; 및 HeLa 세포에서 19.71%). 상기 결과로부터 본 발명의 스페르민 공중합체는 세포독성이 매우 낮아 생체적합성이 우수함을 확인하였다.

실시예 5: 스페르민 공중합체의 생체 내 에어로졸 전달

본 발명에 따른 스페르민 공중합체의 에어로졸에 의한 생체 내 전달효율을 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

먼저, 상기 실시예 2에 기재된 방법에 따라 스페르민 공중합체와 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)을 발현하는 플라스미드 pcDNA3.1/CT-GFP(6.1 kb, Invitrogen)를 10:1의 중량비로 혼합하여 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/GFP)를 제조하였다.

6주령의 수컷 BALB/c 마우스(Breeding and Research Center)를 온도 23± 2℃ 및 상대습도 50± 20%에서 12시간 밤/낮 주기를 유지하여 실험실 동물시설에 보관하였다. 본 연구의 모든 실험 절차는 서울대학교의 동물보호 및 사용위원회(Animal Care and Use Committee at Seoul National University, SNU-101211-2)에 의해 승인되었다. 에어로졸을 통한 핵산 전달 효율성을 확인하기 위해 마우스의 코 부위만 노출시키는 챔버(NOEC; Dusturbo, Seoul, Korea)를 사용하였고, 12마리의 마우스를 다음과 같이 무작위로 3개 군(각 군당 4마리)으로 나누었다: 비처리 대조군; GFP 단독 처리군; 및 스페르민 공중합체와 GFP 복합체(GPT-SPE/GFP) 처리군. 상기 각 군의 마우스에 1 mg의 DNA가 전달되도록 문헌에 사용된 방법에 근거하여 에어로졸에 노출시켰다(H.L. Jiang, 등 Biomaterials 30: 5844-5852, 2009).

에어로졸 노출 2일 후, 각 군의 마우스를 희생시키고 폐를 적출하였다. 적출된 폐를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 담가 12시간 동안 고정시킨 후 30% 수크로스 용액에 담가 4℃에서 48시간 동안 보관하였다. 고정된 폐를 -20℃ 이하의 온도에서 OCT 화합물(Tissue-Tek OCT, Sakura)로 포매(embedding)한 후 마이크로톰(microtome)으로 절단하여 10 ㎛ 두께의 폐 조직 절편을 제조하였다. 조직병리학적 분석을 위해, 준비된 폐 조직 절편을 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색한 후 공초점 현미경(confocal microscope, Zeiss LSM510, Carl Zeiss)으로 GFP 신호를 관찰하였다. 아울러, 독성 검사를 위하여, 각 군의 마우스로부터 적출된 폐, 심장, 간, 비장, 뇌 및 신장 조직을 10% 중성 포르말린(neutral formalin)으로 고정시키고 3 ㎛ 두께의 파라핀 절편을 제조한 후 H&E 염색하여 공초점 현미경(Zeiss LSM510, Carl Zeiss)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 6의 a에 나타난 바와 같이, 비처리 대조군과 GPT 단독 처리군(스페르민 공중합체 부재)에서는 GFP 신호가 검출되지 않거나 매우 미약한 반면, 본 발명의 스페르민 공중합체와 GFP의 복합체(GPT-SPE/GFP) 처리군에서는 강한 GFP 신호가 검출되어 에어로졸 전달 효율이 매우 우수함을 알 수 있다.

폐의 조직병리학적 검사 결과, 도 6의 b에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 스페르민 공중합체를 이용한 에어로졸 전달 시 폐에 어떠한 병리학적 이상도 발생하지 않음을 확인하였다. 또한, 도 7에 나타난 바와 같이, 폐를 비롯한 심장, 간, 비장, 뇌, 신장 등의 주요 기관에서 아무런 병리학적 이상이 발견되지 않아, 본 발명에 따른 스페르민 공중합체를 이용한 에어로졸 전달에 의해서 독성이 유발되지 않음을 확인하였다.

실시예 6: 스페르민 공중합체를 이용한 폐암의 유전자 치료

본 발명에 따른 스페르민 공중합체를 이용한 폐암의 유전자 치료효과를 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

Akt1을 표적으로 하는 shRNA 구조체의 19-mer 머리핀형 서열을 인코딩하는 올리고뉴클레오티드를 문헌(Meng et al., Cell Signal 2006, 18(12): 2262e71)에 개시된 방법에 따라 합성하였고, 이의 대조군으로 스크램블(scramble) shRNA를 제조하였다. 상기 실시예 2에 기재된 방법에 따라 스페르민 공중합체 4 ㎎과 Akt1 shRNA 또는 스크램블 shRNA 0.4 ㎎을 증류수 내에서 혼합하여 핵산 전달 복합체(GPT-SPE/shAkt1 또는 GPT-SPE/Scr)를 제조하였다.

폐암을 가지는 6주령의 암컷 k-ras 마우스(Breeding and Research Center)를 온도 23± 2℃ 및 상대습도 50± 20%에서 12시간 밤/낮 주기를 유지하여 실험실 동물시설에 보관하였다. 본 연구의 모든 실험 절차는 서울대학교의 동물보호 및 사용위원회(Animal Care and Use Committee at Seoul National University, SNU-101211-2)에 의해 승인되었다. 에어로졸을 통한 핵산 전달 효율성을 확인하기 위해 마우스의 코 부위만 노출시키는 챔버(NOEC; Dusturbo, Seoul, Korea)를 사용하였고, 16마리의 마우스를 다음과 같이 무작위로 4개 군(각 군당 4마리)으로 나누었다: 비처리 대조군; Akt1 shRNA 처리군; 스페르민 공중합체와 Akt1 shRNA 복합체(GPT-SPE/shAkt1) 처리군; 및 스페르민 공중합체와 스크램블 shRNA 복합체(GPT-SPE/Scr) 처리군. 상기 각 군의 마우스에 1 mg의 DNA가 전달되도록 문헌에 사용된 방법에 근거하여 에어로졸에 노출시켰다(H.L. Jiang, 등 Biomaterials 30: 5844-5852, 2009).

마우스를 4주간 주 2회씩 에어로졸에 노출시킨 후, 각 군의 마우스를 희생시켰다. 부검 시, 문헌(Singh RP et al., J. Natl. Cancer Inst. 2006, 98(12): 846-55)에 기재된 방법에 따라 현미경으로 폐 표면의 종양 병소를 계수하였다. 이와 동시에, 폐를 PBS로 관류하고 좌측 폐의 엽(lobe)을 회수한 후 10% 중성 완충 포르말린으로 고정하여 조직병리학적 검사를 수행하였다.

그 결과, 도 8a, 8b 및 8c에 나타난 바와 같이, 비처리 대조군, Akt1 shRNA 처리군 및 스페르민 공중합체와 스크램블 shRNA 복합체(GPT-SPE/Scr) 처리군에 비하여 본 발명의 스페르민 공중합체와 Akt1 shRNA 복합체(GPT-SPE/shAkt1) 처리군에서 종양 개수, 특히 크기가 1mm 이상인 종양 개수가 현저히 감소한 것을 확인하였다. 또한, 도 8d에 나타난 바와 같이, 비처리 대조군, Akt1 shRNA 처리군 및 스페르민 공중합체와 스크램블 shRNA 복합체(GPT-SPE/Scr) 처리군에 비하여 본 발명의 스페르민 공중합체와 Akt1 shRNA 복합체(GPT-SPE/shAkt1) 처리군에서 폐 내 Akt1 단백질 발현이 현저히 감소한 것을 확인하였다. 또한, 하기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 혈액 내 독성이 거의 검출되지 않았다. 이는 본 발명의 일실시예의 스페르민 공중합체(GPT-SPE)가 생체 내에서 Akt1 shRNA 전달 운반체로서 효과적으로 작용하여 폐암의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

CBC: 전혈 계수(complete blood count), WBC: 백혈구, RBC: 적혈구, HGB: 헤모글로빈, HCT: 헤마토크릿(hematocrit), MCV: 평균 세포 용적(mean cell volume), MCH: 평균 혈구 헤모글로빈(mean Corpuscular Hemoglobin), MCHC: 평균 혈구 헤모글로빈 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration), CHCM: 평균 세포 헤모글로빈 농도(mean cell hemoglobin concentration), RDW: 적혈구 분포 폭(red cell distribution width), PLT: 혈소판, MPV: 평균 혈소판 용적(Mean platelet volume), PDW: 혈소판 분포 폭(platelet distribution width), PCT: 혈소판용적비(plateletcrit), MPC: 평균 혈소판 성분(mean platelet component), MPM: 평균 혈소판 질량(mean platelet mass), Large Pit: 대 혈소판(large platelets)

<110> SNU R&DB Foundation <120> Spermine copolymer and gene therapy using the same as a gene carrier <130> PA120288/KR <150> KR10-2011-0027191 <151> 2011-03-25 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Akt1 shRNA <400> 1 gaaggaaguc aucguggcca a 21

Claims (19)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 링커의 적어도 하나의 아크릴레이트 말단에 스페르민의 1차 아민 또는 2차 아민이 부가반응에 의해 결합되며, 상기 스페르민에 폴리에틸렌글리콜(PEG), 갈락토실화 폴리에틸렌글리콜(gal-PEG), 엽산(folate) 또는 만노스(mannose)가 추가로 결합된 것인 스페르민 공중합체.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 제1항에 있어서, 상기 링커는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 스페르민 공중합체.
   [화학식 2]
   

   

   
   
3. 제1항에 있어서, 상기 스페르민 중 링커에 연결되지 않은 1차 아민 또는 2차 아민이 또다른 화학식 1로 표시되는 링커의 아크릴레이트 말단에 부가반응에 의해 결합된 스페르민 공중합체.
   
4. 제3항에 있어서, 화학식 1로 표시되는 링커를 통하여 스페르민이 덴드리머(dendrimer)를 형성하는 것인 스페르민 공중합체.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 공중합체의 중량평균분자량이 3 내지 15 kDa 범위인 것인 스페르민 공중합체.
   
6. 삭제
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 스페르민 공중합체에 핵산이 결합된 핵산 전달 복합체.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 핵산과 스페르민 공중합체가 1:5 내지 1:50의 중량비로 결합되는 것인 핵산 전달 복합체.
   
9. 하기 화학식 1로 표시되는 링커의 적어도 하나의 아크릴레이트 말단에 스페르민의 1차 아민 또는 2차 아민이 부가반응에 의해 결합되며, 스페르민에 폴리에틸렌글리콜(PEG), 갈락토실화 폴리에틸렌글리콜(gal-PEG), 엽산(folate) 또는 만노스(mannose)가 추가로 결합된 핵산 전달 복합체가 120 내지 200 nm의 평균 입자 크기를 갖는 것인 핵산 전달 복합체.
   [화학식 1]
   

   

   
   
10. 제7항에 있어서, 상기 핵산 전달 복합체가 5 내지 30 mV 범위의 제타 전위를 나타내는 것인 핵산 전달 복합체.
    
11. 제7항에 있어서, 상기 핵산이 siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, DNA, 단일가닥 RNA, 이중가닥 RNA, DNA-RNA 혼성체(hybrid) 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태인 핵산 전달 복합체.
    
12. 제7항에 있어서, 상기 핵산이 Akt1의 발현 억제를 표적하는 것인 핵산 전달 복합체.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 핵산이 Akt1의 발현을 억제하는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 shRNA인 것인 핵산 전달 복합체.
    
14. 제12항의 핵산 전달 복합체를 포함하는 유전자 치료용 약학적 조성물.
    
15. 제14항에 있어서, 상기 핵산 전달 복합체가 흡입 투여용 제형 또는 정맥 주사 투여용으로 제형화된 약학적 조성물.
    
16. 용매에 용해된 하기 화학식 1로 표시되는 링커 화합물을, 용매에 용해된 스페르민과 혼합하여 마이클 부가반응을 수행하는 단계; 및
    상기 반응물로부터 형성된 스페르민 공중합체를 분리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 스페르민 공중합체를 제조하는 방법.
    [화학식 1]
    

    

    
    
17. 제16항에 있어서, 상기 용매가 무수 에틸알코올 또는 무수 메틸알코올인 것인 방법.
    
18. 제16항에 있어서, 마이클 부가반응이 3 내지 5℃에서 1 내지 3시간 동안에 이어서 20 내지 25℃에서 12 내지 24시간 동안 수행되는 것인 방법.
    
19. 제16항에 있어서, 스페르민과 링커 화합물의 반응 몰비가 4:3 내지 8:3인 것인 방법.

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