KR20190106140A - Dna 단편 혼합물이 고농도로 함유된 유동성을 갖는 액제 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DNA 단편 혼합물이 고농도로 함유된 액제 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 유동성을 갖는 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유되어 있는 액제 조성물을 제조하였고, 이러한 유동성을 갖는 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유된 액제 조성물이 약제학적 활성을 유지하고, 장기 보관시에도 높은 안정성을 가지며, 인체 내로 효과적으로 주사할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명의 유동성을 갖는 고농도의 DNA 단편 혼합물을 이용해 주사제, 액상제, 크림제 등 다양한 제형 개발에 적용 가능할 것으로 기대된다.

Description

DNA 단편 혼합물이 고농도로 함유된 유동성을 갖는 액제 조성물 및 이의 제조방법{Fluid composition containing higher concentrations of fragmented DNA mixtures and a method for manufacturing the same}
본 발명은 DNA 단편 혼합물이 고농도로 함유된 액제 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 고농도의 DNA 단편 혼합물이 실온조건에서 유동성이 유지되며, 안정화된 상태로 포함되어 있는 액제 조성물에 관한 것이다.
핵산(nucleic acid)은 세포 내의 핵에 존재하는 DNA와 RNA로, 퓨린(purine) 염기(아데닌, A; 구아닌, G)나 피리미딘(pyrimidine) 염기(시토신, C; 티민, T; 우랄실, U), 오탄당 및 인산으로 구성된 뉴클레오티드(nucleotide)의 중합체이다. 이러한 핵산은 유전 정보의 저장과 전달을 위한 물질로 인식되어 왔으나, 최근에는 핵산이 세포 외부에서 작은 조각으로 분해되어 세포 표면의 수용체와 선택적 결합하여 세포 내부로 신호를 활성화하는 역할과 핵산의 작은 조각들이 세포내로 이동하여 적은 에너지로 신속하게 DNA 합성을 유도하는 역할을 하는 것으로 알려지면서 새로운 기능 및 이를 활용한 기술 개발이 이루어지고 있다.
폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide)는 동물 또는 식물에서 추출된 특정한 규격을 가진 DNA 단편 혼합물로, 아데노신 A2 수용체(adenosine A2 receptors)를 자극하여 항염증(anti-inflammation), 세포 증식(cell proliferation), 조직 재생(tissue regeneration) 효과를 갖는다고 알려져 있다(Kim, Y.H., et al., 2010). 유럽과 한국에서는 연어나 송어와 같은 연어과 어류의 정액에서 추출하여 얻는 DNA 단편 혼합물을 PDRN®으로 명명하고, 이를 이용한 세포 증식과 조직 재생을 위한 의약품 원료로 사용되고 있다(Yun, J.K., et al., 2015).
폴리뉴클레오티드(polynucleotide, 이하 PN)도 PDRN®과 마찬가지로 연어나 송어와 같은 연어과 어류의 정액에서 추출하여 얻는 DNA 단편 혼합물이나, PDRN®보다 핵산의 사슬 길이가 길고 분자량이 크다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 물리적인 지지체 역할로 세포 고착과 윤활 및 완충 효과로 의료기기 원료로 사용되고 있다.
의약품 및 의료기기 개발에 있어서, 원료 물질의 농도, 용해도, 물리학적 성질 및 형태는 의약품 또는 의료기기의 적용 방법 및 원료 물질의 인체 내 흡수에 영향을 준다. 또한, 의약품 및 의료기기 개발에 있어서, 원료 물질에 부형제 또는 담체 등의 다양한 추가 성분을 추가하는 경우에는 원료 물질 및 추가 성분들이 균일하게 혼합되는 것이 중요하며, 이때, 원료 물질 및 추가 성분들의 용해도가 중요하게 작용한다.
PDRN® 및 PN과 같은 DNA 단편 혼합물의 전달 효과를 높이기 위한 목적으로 동일한 양의 용매에 다량의 DNA 단편 혼합물을 용해시켜 농도를 높이는 방법이 검토되었으나, 일반적인 저분자의 핵산 추출물과 달리 DNA 단편 혼합물은 분자량이 크기 때문에 용해에 어려움이 있다. 특히나, 고농도의 DNA 단편 혼합물이 포함된 액제를 제조하는 경우에, 용해 과정에서 겔화(gelation)가 진행되면서 유동성이 낮아지거나 용해되지 못한 DNA 단편 혼합물의 침전이 일어나면서 산업적으로 사용이 어려운 문제점이 나타난다.
이에, 본 발명자들은 DNA 단편 혼합물을 포함하는 액제 조성물을 연구하는 과정에서, 유동성을 갖는 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유되어 있는 액제 조성물을 제조하였고, 이러한 액제 조성물이 약제학적 활성을 유지하고, 인체 내로 효과적으로 주사할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 장기 보관에도 제조된 조성물의 상태 변화 없이 유동성이 지속적으로 유지되어 높은 안정성을 갖는다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
또한, 다량의 DNA 단편 혼합물을 주입하는 경우, 수차례 반복 주입해야 했던 기존과는 달리, 이 발명의 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유되어 있는 액제 조성물을 통해 주입 횟수를 줄일 수 있게 되었고, 다른 유효 성분과의 혼합도 고농도 상태에서 가능하게 됨으로써 산업적인 활용도를 증가시킬 수 있었다.
종래 선행기술로서 한국등록특허 제1459185호에는 스페르민 공중합체에 핵산이 결합된 핵산 전달 복합체가 기재되어 있으나, 본 발명의 양이온성 첨가제를 이용하여 고농도의 DNA 단편 혼합물을 용해시키는 효과는 전혀 기재 및 암시되어 있지 않다. 또한, 한국공개특허 제2011-0129969호에는 폴리아민 유도체 및 핵산을 포함하는 제형물이 기재되어 있으나, 본 발명의 고농도의 단편 혼합물을 용해시키는 효과는 전혀 기재 및 암시되어 있지 않다.
비특허문헌으로서 Sung, B.K.은 스페르민을 이용한 DNA 응축에 대해서 기재되어 있으나, 본 발명의 고농도의 DNA 단편 혼합물의 겔화 및 이를 방지하여 고농도의 DNA 단편 혼합물을 용해하는 효과는 기재되어 있지 않다.
한국등록특허 제1459185호, 스페르민 공중합체 및 이를 핵산 전달체로 이용하는 유전자 치료, 2014. 10. 31. 등록. 한국공개특허 제2011-0129969호, 폴리아민 유도체, 2011. 12. 02. 공개.
Kim, Y.H., et al., The wound healing effect of PDRN(polydeoxyribonucleotide) material on full thickness skin defect in the mouse, J. Korean Soc. Plast. Reconstr. Surg., 37(3), 220-226, 2010. Sung, B.K., Condensation of DNA by spermine in bulk and in the bacteriophage capside : a cryo-electron microscopy study, HAL, ID: tel-00725394, 2012. Yun, J.K., et al., Wound healing effect of low molecular PDRN on experimental surgical excision rat model, J. Soc. Cosmet. Sci. Korea, 41)4), 401-411, 2015.
본 발명의 목적은 DNA 단편 혼합물이 고농도로 함유된 액제 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것으로, 실온에서도 유동성 및 안정성을 갖는 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유되어 있는 액제 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명은 DNA 단편 혼합물이 고농도로 함유된 20℃에서 점도가 1~1,000mPa·s인 유동성을 갖는 액제 조성물에 관한 것이다.
상기 액제 조성물은 양이온성 첨가제를 포함할 수 있다.
상기 액제 조성물은 DNA 단편 혼합물 및 양이온성 첨가제가 1:1~5중량비율로 혼합될 수 있다.
상기 액제 조성물은 DNA 단편 혼합물이 액제 조성물 총 중량을 기준으로 2~20중량%가 포함될 수 있다.
상기 DNA 단편 혼합물은 분자량이 50~10,000kDa일 수 있다.
상기 DNA 단편 혼합물은 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide) 및 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 DNA 단편 혼합물은 어류의 정소 또는 정액에서 분리할 수 있다.
상기 어류는 연어과일 수 있다.
상기 양이온성 첨가제는 양이온성 펩타이드, 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 양이온성 펩타이드는 폴리라이신(polylysine), 프로타민(protamine) 및 KALA 펩타이드(cationic fusogenic peptide)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드(N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride), 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판(1,2-dioleoyloxy-3-(trimethylammonio)propane), 1,2-디올레오일-3-(4'-트리메틸암모니오)부탄오일-sn-글리세롤(1,2-dioleoyl-3-(4'-trimethylammonio)butanoyl-sn-glycerol), 1,2-디아실-3-디메틸암모니움-프로판(1,2-diacyl-3-dimethylammonium-propane), 1,2-디아실-3-트리메틸암모니움-프로판(1,2-diacyl-3-trimethylammonium-propane), 1,2-디아실-sn-글리세롤-3-에틸포스포콜린(1,2-diacyl-sn-glycerol-3-ethylphosphocholine), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤(3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol, 디메틸디옥타데실암모니움 브로마이드(dimethyloctadexylammonium bromide) 및 그 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 양이온성 고분자는 키토산(chitosan), 스페르민(spermine), 프트레신(putrescine), 카타베린(cadaverine) 및 스페르미딘(spermidine)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 액제 조성물은 히알루론산(hyaluronic acid), 카르복시메틸셀룰로오스(carboxylmethyl cellulose), 콜라겐(collagen), 알지네이트(alginate), 폴록사머(poloxamer), 항체(antibody), 단백질(protein), 펩타이드(peptide), miRNA(microRNA), siRNA(small interfering RNA), 압타머(aptamer), 합성약물(chemical drug) 및 골 이식재(bone graft materials)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 추가로 혼합될 수 있다.
상기 액제 조성물은 주사용제, 액상제, 크림제, 연고제, 겔제, 로션제, 내용액제, 외용액제, 경피흡수제로 사용될 수 있다.
상기 액제 조성물은, DNA 단편 혼합물을 완충용액에 넣고 열교반기를 이용하여 80℃ 이상의 고온에서 용해시켜 DNA 단편 혼합물 저장용액을 제조하는 제1단계; 양이온성 첨가제를 완충용액에 넣고 용해시켜 양이온성 첨가제 저장용액을 제조하는 제2단계; 및 80℃ 이상의 열교반기에서 상기 제1단계의 DNA 단편 혼합물 저장용액과 제2단계의 양이온성 첨가제 저장용액을 혼합하고, 교반하면서 온도를 실온으로 낮추는 제3단계;로 이루어진 과정을 통해 제조될 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 DNA 단편 혼합물이 고농도로 함유된 20℃에서 점도가 1~1,000mPa·s인 유동성을 갖는 액제 조성물에 관한 것이다.
상기 유동성(fluidity)은 액체와 같이 흘러 움직이는 성질을 말하는 것으로, 점도와 관련이 있으며, 제제 개발 시 제제 균일성 및 함량에 영향을 미칠 수 있으며, 주사제형의 경우에는 주입 가능 여부를 결정하는 주요한 성질로 설명된다. 일반적으로 물의 점도는 20℃에서 약 1mPa·s이며, 꿀의 점도는 약 10,000mPa·s로 알려져 있으며, 물과 유사한 점도가 주사제형 뿐 아니라 다른 제형으로의 적용에도 효용성이 높다.
본 발명의 유동성을 갖는 액제 조성물은 20℃에서 1~1,000mPa·s의 점도를 나타내는 것일 수 있다. 바람직하게는 1~100mPa·s의 점도를 나타내는 것이며, 상기 점도는 혼합되는 제형의 선택에 따라 조절될 수 있으나 유동성이 유지되는 것이 바람직하다.
상기 유동성을 갖는 액제 조성물은 실온에서 장기간 보관하더라도 물성 변화 없이 지속적으로 유동성이 유지되어 높은 안정성을 갖는다.
상기 DNA 단편 혼합물이란, 인산, 4종류의 염기, 데옥시리보스(deoxyribose)로 이루어진 생체 고분자에 해당하는 DNA가 추출된 형태로서, 다양한 분자량을 갖는 DNA 단편 형태로 혼합되어 존재하는 것을 지칭하는 것이다.
상기 DNA 단편 혼합물은 고농도로 용해시키는 과정에서 겔화(gelation) 되어 유동성이 낮아지거나, 용해되지 못한 DNA 단편 혼합물의 침전이 일어나 산업적으로 이용이 어려울 수 있다. 따라서, DNA 단편 혼합물을 고농도로 함유하는 유동성을 갖는 액제 조성물을 제조하기 위해 양이온성 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 DNA 단편 혼합물의 겔화는 DNA 단편 혼합물이 액제 조성물 총 중량을 기준으로 2중량% 이상일 경우에 나타날 수 있다.
상기 양이온성 첨가제를 첨가한 액제 조성물은 DNA 단편 혼합물 및 양이온성 첨가제가 1:1~10 중량비율로 혼합된 것일 수 있다. 바람직하게는 1:1~5 중량비율이고, 더 바람직하게는 1:3~5 중량비율이다.
상기 DNA 단편 혼합물이 고농도로 함유된 액제 조성물은 DNA 단편 혼합물이 액제 조성물 총 중량을 기준으로 2중량% 이상 포함된 것일 수 있다. 바람직하게는 2~20중량%이고, 더욱 바람직하게는 2~10중량% 이다.
상기 DNA 단편 혼합물이 고농도로 함유된 액제 조성물은 다량의 DNA 단편 혼합물 주입이 필요한 경우, 주입 횟수를 줄일 수 있고, 다른 유효 성분과의 혼합에 있어서도 고농도 상태에서 가능하게 됨으로써 산업적인 활용도를 증가시킬 수 있다.
상기 DNA 단편 혼합물은 분자량이 50~10,000kDa 일 수 있다. DNA 단편 혼합물의 분자량이 50kDa 미만일 경우에는 양이온성 첨가제 사용 없이 충분히 고농도로 녹일 수 있고, 유동성이 유지될 수 있으며, 10,000kDa 초과일 경우에는 물에 대한 용해도가 낮고, 유동성이 감소되어 산업적으로 사용하기 어렵다.
상기 DNA 단편 혼합물은 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide) 및 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 DNA 단편 혼합물은 어류의 정소 또는 정액에서 분리한 것일 수 있다.
상기 어류는 연어과일 수 있고, 바람직하게는 연어 또는 송어이며, 가장 바람직하게는 연어이다.
상기 양이온성 첨가제는 양이온성 펩타이드, 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 양이온성 펩타이드는 폴리라이신(polylysine), 프로타민(protamine) 및 KALA 펩타이드(cationic fusogenic peptide)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 그러나, 이에 한정되지 않는다.
상기 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드(N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride), 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판(1,2-dioleoyloxy-3-(trimethylammonio)propane), 1,2-디올레오일-3-(4'-트리메틸암모니오)부탄오일-sn-글리세롤(1,2-dioleoyl-3-(4'-trimethylammonio)butanoyl-sn-glycerol), 1,2-디아실-3-디메틸암모니움-프로판(1,2-diacyl-3-dimethylammonium-propane), 1,2-디아실-3-트리메틸암모니움-프로판(1,2-diacyl-3-trimethylammonium-propane), 1,2-디아실-sn-글리세롤-3-에틸포스포콜린(1,2-diacyl-sn-glycerol-3-ethylphosphocholine), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤(3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol, 디메틸디옥타데실암모니움 브로마이드(dimethyloctadexylammonium bromide) 및 그 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 그러나, 이에 한정되지 않는다.
상기 양이온성 고분자는 키토산(chitosan), 스페르민(spermine), 프트레신(putrescine), 카타베린(cadaverine) 및 스페르미딘(spermidine)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 그러나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 스페르민, 스페르미딘 및 프트레신으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 가장 바람직하게는 스페르민이다.
상기 액제 조성물은 생리학적 활성 물질 또는 의료 기기 원료 물질을 추가로 첨가할 수 있다.
상기 생리학적 활성 물질은 항체(antibody), 단백질(protein), 펩타이드(peptide), miRNA(microRNA), siRNA(small interfering RNA), 압타머(aptamer), 합성약물(chemical drug) 등 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 의료 기기 원료 물질은 히알루론산(hyaluronic acid), 카르복시메틸셀룰로오스(carboxylmethyl cellulose), 콜라겐(collagen), 알지네이트(alginate), 폴록사머(poloxamer), 골 이식재(bone graft materials) 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 액제 조성물은 주사용제, 액상제, 크림제, 연고제, 겔제, 로션제, 내용액제, 외용액제, 경피흡수제 등으로 사용될 수 있으며, 액제 조성물이 사용될 수 있는 제형이라면 제한하지 않는다.
상기 액제 조성물은, DNA 단편 혼합물을 완충용액에 넣고 열교반기를 이용하여 80℃ 이상의 고온에서 용해시켜 DNA 단편 혼합물 저장용액을 제조하는 제1단계; 양이온성 첨가제를 완충용액에 넣고 용해시켜 양이온성 첨가제 저장용액을 제조하는 제2단계; 및 80℃ 이상의 열교반기에서 상기 제1단계의 DNA 단편 혼합물 저장용액과 제2단계의 양이온성 첨가제 저장용액을 혼합하고, 교반하면서 온도를 실온으로 낮추는 제3단계;로 이루어진 과정을 통해 제조될 수 있다.
상기 제1단계의 DNA 단편 혼합물 저장용액 제조를 위한 완충용액은 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트(sodium phosphate dibasic dodecahydrate), 염화나트륨(sodium chloride), 염화마그네슘(magnesium chloride), 염화칼륨(potassium chloride), 인산 완충 식염수(phosphate buffer sline) 또는 HEPES(N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid) 완충용액 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 제2단계의 양이온성 첨가제 저장용액 제조를 위한 완충용액은 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트, 염화나트륨, 염화마그네슘, 염화칼륨, 인산 완충 식염수, HEPES 완충용액, 아세트산(acetic acid), 염산(hydrochloric acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 젖산(lactic acid), 질산(nitric acid) 등일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 DNA 단편 혼합물이 고농도로 함유된 유동성을 갖는 액제 조성물 및 약학적 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물은, 통상의 방법에 따라 주사제, 액상제, 크림제 및 연고제, 겔제, 로션제, 내용액제, 외용액제 및 경피흡수제 등으로 사용할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 제제화 활 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 질환의 병리상태, 병리상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축 및 인간과 같은 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 피부, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사, 국소 적용에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 DNA 단편 혼합물이 고농도로 함유된 액제 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 실온(1~30℃)에서 유동성 및 안정성을 갖는 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유되어 있는 액제 조성물을 제조하였고, 제조된 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유된 액제 조성물이 약제학적 활성을 유지하고, 인체 내로 효과적으로 주사할 수 있음을 확인하였으며, 실온에서 장기 보관 할 경우에도 조성물의 물성 변화 없이 지속적으로 유동성이 유지되는 높은 안정성을 갖는다는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 DNA 단편 혼합물이 고농도로 함유된 유동성을 갖는 액제 조성물이 주사제, 액상제, 크림제 등 다양한 제형 개발에 적용이 가능할 것으로 기대되며, 액제 상태의 고농도 DNA 단편 혼합물에 다양한 고분자 및 활성인자를 추가 혼합하는 것을 용이하게 함으로써 다양한 물질들과의 조합을 통한 활성이 증가된 조성물 개발에도 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 DNA 단편 혼합물이 고농도로 함유된 액제 조성물의 진동 변형 크기(A) 및 온도 변화(B)에 따른 저장 탄성률(G')과 손실 탄성률(G") 및 복소점도(η*)의 변화를 분석한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 본 발명의 DNA 단편 혼합물이 고농도로 함유된 액제 조성물의 물성 변화를 육안으로 관찰한 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유된 액제 조성물 제조>
본 발명의 DNA 단편 혼합물은 폴리데옥시리보뉴클레오티드(제품명: PDRN®, ㈜파마리서치프로덕트 제조, 대한민국)를, 양이온성 첨가제는 스페르민(spermine)을 이용하였다.
DNA 단편 혼합물로서 PDRN®을 0.4% 염화나트륨(sodium chloride, NaCl) 완충용액에 넣고 열교반기를 이용하여 80℃에서 20분간 용해시켜 PDRN® 저장용액(stock solution)을 제조하였다.
양이온성 첨가제로서 스페르민을 0.4% 염화나트륨(sodium chloride, NaCl) 완충용액에 넣고 상온에서 1시간 이상 용해시켜 스페르민 저장용액을 제조하였다.
상기에서 제조된 PDRN® 저장용액 및 스페르민 저장용액을 하기 표 1에 기재된 농도조건이 되도록 혼합하여 실시예 1-1 내지 실시예 1-12의 조성물을 제조하였다. 이때, PDRN® 저장용액을 80℃에서 교반하면서 상기의 스페르민 저장용액을 천천히 첨가하면서 1시간 이상 교반하여 혼합한 후, 교반기에서 지속적으로 교반하면서 온도를 실온으로 낮추어 본 발명의 액제 조성물을 제조하였다.
조성물 최종 농도(중량%)
PDRN® 스페르민
실시예 1-1 2 2
실시예 1-2 6
실시예 1-3 10
실시예 1-4 4 4
실시예 1-5 12
실시예 1-6 20
실시예 1-7 8 8
실시예 1-8 24
실시예 1-9 40
실시예 1-10 10 10
실시예 1-11 30
실시예 1-12 50
< 비교예 1. 비교 대상 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유된 액제 조성물 제조>
본 발명의 고농도 DNA 단편 혼합물과의 비교를 위하여, 하기 표 2에 기재된 비교예 1-1 내지 비교예 1-10의 조성물을 상기 실시예 1의 제조 방법과 동일한 방법으로 제조하였다.
조성물 최종 농도(중량%)
PDRN® 스페르민
비교예 1-1 1 0
비교예 1-2 5
비교예 1-3 2 0
비교예 1-4 1
비교예 1-5 4 0
비교예 1-6 2
비교예 1-7 8 0
비교예 1-8 4
비교예 1-9 10 0
비교예 1-10 5
< 실시예 2. 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유된 액제 조성물의 물성 확인>
액제 조성물의 안정성 및 물성은 이를 이용한 제형 개발 및 시술 부위에 따른 시술 방법에 큰 영향을 준다. 이에, 본 발명의 고농도의 DNA 단편 혼합물이 포함되어 있는 유동성이 있는 액제 조성물이 외부에서 가해지는 힘 또는 온도에 따라 물성 변화가 있는지를 분석함으로써 안정적으로 유동성을 유지하는지 확인하였다.
실시예 2-1. 레오미터(rheometer)를 이용한 물성 확인
점성(viscosity)은 운동에 대항하는 유체의 내부 저항 또는 유동성(fluidity)과 관련되어 있는 것으로, 온도에 영향을 받는다. 탄성(elasticity)은 외부 힘에 의하여 변형을 일으킨 물질이 힘이 제거되었을 때 원래의 모양으로 되돌아가려는 성질로, 물과 같은 액체는 탄성 변형을 하지 않는다. 따라서 물질의 점성과 탄성의 절대값과 상대적인 비율은 그 물질이 외력에 대해 반응하는 특성을 결정짓는 중요한 재료 함수이다.
이에 따라, 본 발명의 고농도의 DNA 단편 혼합물이 포함되어 있는 유동성이 있는 액제 조성물의 유동성 및 안정성을 점성과 탄성의 변화 분석을 통해 확인하였다.
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 액제 조성물과 대조군으로 물을 이용하여, 진동 변형(oscillation strain) 크기 및 온도 변화에 따른 저장 탄성률(storage modulus, G')과 손실 탄성률(loss modulus, G") 및 복소점도(complex viscosity, η*)를 레오미터를 이용해 측정하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이때, 사용한 측정조건은 PU20, 간격(Gap) 0.5㎜, 0.1Hz, 1% 응력-변형률(stress strain)로 24℃부터 40℃까지 1℃씩 올려주면서 1분간 유지시켜 저장 탄성률(G') 및 손실 탄성률(G")의 변화를 측정하였다.
상기 저장 탄성률은 탄성을, 손실 탄성률은 점성을 측정한 것이고, 복소점도는 점도를 실수부와 허수부의 합으로 나타낸 수학적 표현이다.
도 1(A)의 진동 변형 크기에 따른 영향을 확인한 결과에서 보여주듯이, 비교예 1-5는 진동 변형 크기가 10% 이상 주어질 경우, 저장 탄성률(G'), 손실 탄성률(G") 및 복소점도(η*)가 모두 급격히 감소하는 반면에, 실시예 1-6은 진동 변형의 크기에 따른 저장 탄성률(G'), 손실 탄성률(G") 및 복소점도(η*)의 변화가 거의 없고, 이는 대조군으로 이용한 물과 비슷하다는 것을 확인하였다.
또한, 도 1(B)의 온도에 따른 영향을 확인한 결과에서 보여주듯이, 비교예 1-5는 온도에 따른 저장 탄성률(G'), 손실 탄성률(G") 및 복소점도(η*)의 변화가 크게 나타나는 반면에, 물과 실시예 1-6은 큰 변화가 없는 것을 확인하였다.
본 명세서에서 보여주지 않았지만, 상기 실시예 1-1 내지 실시예 1-5, 실시예 1-7 내지 실시예 1-12의 경우에도 진동 변형 크기 및 온도에 따른 탄성 및 점성의 변화가 거의 없는 것을 확인하였다.
실시예 2-2. 육안 관찰을 통한 물성 확인
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유된 액제 조성물을 실온에서 24시간 보관한 후, 각 액제 조성물의 상(phase)변화를 육안을 통해 관찰하였고, 그 결과를 도 2 및 하기 표 3에 나타내었다. 이때, 상변화 여부는 조성물 제조 직후와 비교하였을 때 실온에서 방치 후 제조한 조성물의 유동성 감소 또는 겔화를 기준으로 판단하였다.
조성물 최종 농도(중량%) 실온에서 24시간 보관 후 상변화
PDRN® 스페르민
실시예 1-1 2 2 ×
실시예 1-2 6 ×
실시예 1-3 10 ×
실시예 1-4 4 4 ×
실시예 1-5 12 ×
실시예 1-6 20 ×
실시예 1-7 8 8 ×
실시예 1-8 24 ×
실시예 1-9 40 ×
실시예 1-10 10 10 ×
실시예 1-11 30 ×
실시예 1-12 50 ×
비교예 1-1 1 0 ×
비교예 1-2 5 ×
비교예 1-3 2 0 O
비교예 1-4 1 O
비교예 1-5 4 0 O
비교예 1-6 2 O
비교예 1-7 8 0 O
비교예 1-8 4 O
비교예 1-9 10 0 O
비교예 1-10 5 O
상기 표 3 및 도 2에서 보여주듯이, PDRN® 1중량%만 포함되어 있는 비교예 1-1 경우에는 실온 보관을 하여도 상변화가 없는 반면에, 2중량% 이상의 PDRN®만이 포함되어 있는 비교예 1-3, 비교예 1-5 비교예 1-7 및 비교예 1-9의 경우에는 실온 보관 시, 상변화가 나타나는 것을 확인하였다.
또한, 2중량% 이상의 PDRN®과 스페르민이 PDRN®의 중량% 대비 1배 미만으로 혼합되어 있는 비교예 1-4, 비교예 1-6, 비교예 1-8 및 비교예 1-10의 경우에는 상변화가 나타나 겔화가 되면서 유동성이 감소되는 것을 확인한 반면에, 스페르민이 PDRN®의 중량% 대비 1배 이상 혼합되어 있는 실시예 1-1 내지 실시예 1-12의 경우에는 PDRN®이 2중량% 이상 포함되어 있음에도 불구하고 상변화가 나타나지 않고 유동성을 유지하고 있는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 실시예 2-1 및 실시예 2-2의 결과를 통해, 본 발명의 고농도의 DNA 단편 혼합물이 포함되어 있는 유동성이 있는 액제 조성물은 물과 같은 유동성을 유지하고 있으며, 외부에서 가해지는 힘 및 온도 변화에 따른 점성 및 탄성 수치 변화가 거의 없이 안정성이 유지되고 있음을 알 수 있었다.
<실시예 3. 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유된 액제 조성물의 장기 안정성 확인>
본 발명의 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유된 액제 조성물의 장기 보관 시 안정성을 확인하기 위해, 상기 실시예 1-1 내지 실시예 1-12의 액제 조성물을 제조 후, 실온에서 8주간 보관하였다. 보관하는 동안 1주, 2주, 4주, 8주차에 각 액제 조성물의 복소점도를 레오미터를 이용해 측정하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
조성물 최종 농도(중량%) 복소점도　η* (Pa.s), 실온
PDRN® 스페르민 1주 2주 4주 8주
실시예 1-1 2 2 0.12 0.13 0.13 0.12
실시예 1-2 6 0.11 0.12 0.11 0.11
실시예 1-3 10 0.14 0.14 0.12 0.13
실시예 1-4 4 4 0.12 0.13 0.13 0.11
실시예 1-5 12 0.15 0.16 0.14 0.15
실시예 1-6 20 0.11 0.10 0.11 0.12
실시예 1-7 8 8 0.13 0.12 0.13 0.12
실시예 1-8 24 0.12 0.13 0.12 0.11
실시예 1-9 40 0.14 0.13 0.13 0.14
실시예 1-10 10 10 0.12 0.11 0.12 0.11
실시예 1-11 30 0.14 0.13 0.13 0.12
실시예 1-12 50 0.13 0.13 0.12 0.12
대조군 (물) - - 0.11 0.12 0.11 0.11
상기 표 4에서 보여주듯이, 실시예 1-1 내지 실시예 1-12의 경우, 실온 보관 기간에 따른 복소점도의 차이가 크게 나타나지 않는 것을 확인하였다. 더욱이, 복소점도의 수치가 대조군으로 이용한 물의 복소점도 수치와 유사한 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유된 액제 조성물이 물과 비슷한 유동성을 가지며, 이러한 유동성은 장기간 보관하더라도 유지되는 것을 확인함으로써, 안정성이 높다는 것을 알 수 있었다.
<제조예 1. 고농도의 DNA 단편 혼합물 및 양이온성 펩타이드가 함유된 액제 조성물 제조>
상기 실시예 1에서 사용한 양이온성 첨가제인 스페르민 대신에 양이온성 펩타이드의 한 종류인 폴리라이신을 이용하여 상기 실시예 1의 제조 방법과 동일한 방법으로 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유된 액제 조성물을 제조하였다.
제조된 액제 조성물의 점도를 확인한 결과 2mPa·s 이하에서 유지되며, 복소점도 또한 0.15η* (Pa.s)로서 유동성이 유지되는 것을 확인하였다.
<제조예 2. 고농도의 DNA 단편 혼합물 및 양이온성 지질이 함유된 액제 조성물 제조>
상기 실시예 1에서 사용한 양이온성 첨가제인 스페르민 대신에 양이온성 지질의 한 종류인 디메틸디옥타데실암모니움 브로마이드를 이용하여 실시예 1의 제조 방법과 동일한 방법으로 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유된 액제 조성물을 제조하였다.
제조된 액제 조성물의 점도를 확인한 결과 2.2mPa·s 이하에서 유지되며, 복소점도 또한 0.14η* (Pa.s)로서 유동성이 유지되는 것을 확인하였다.
<제조예 3. 추가 성분이 포함된 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유된 액제 조성물 제조>
본 발명의 고농도의 DNA 단편 혼합물이 함유된 액제 조성물에 생리학적 활성 물질 또는 의료 기기 원료 물질을 추가하였을 때 유동성에 영향을 주는지 확인하였다.
상기 실시예 1-6의 액제 조성물에 2중량% 히알루론산 용액을 1:1 중량비율로 혼합하고, 점도 및 복소점도를 측정하였다. 그 결과, 히알루론산이 추가로 포함된 액제 조성물의 점도는 1.5mPa·s 이하에서 유지되었으며, 복소점도 또한 0.12η* (Pa.s)로서 유동성이 유지되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 DNA 단편 혼합물이 고농도로 함유된 액제 조성물을 산업적으로 사용 가능함을 알 수 있었다.

Claims (15)

  1. DNA 단편 혼합물이 고농도로 함유된, 20℃에서 점도가 1~1,000mPa·s인 유동성을 갖는 액제 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 액제 조성물은 양이온성 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 유동성을 갖는 액제 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 액제 조성물은 DNA 단편 혼합물 및 양이온성 첨가제가 1:1~5 중량비율로 혼합된 것을 특징으로 하는 유동성을 갖는 액제 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 액제 조성물은 DNA 단편 혼합물이 액제 조성물 총 중량을 기준으로 2~20중량%가 포함된 것을 특징으로 하는 유동성을 갖는 액제 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 단편 혼합물은 분자량이 50~10,000kDa인 것을 특징으로 하는 유동성을 갖는 액제 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 단편 혼합물은 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide) 및 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 유동성을 갖는 액제 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 단편 혼합물은 어류의 정소 또는 정액에서 분리한 것을 특징으로 하는 유동성을 갖는 액제 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 어류는 연어과인 것을 특징으로 하는 유동성을 갖는 액제 조성물.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 양이온성 첨가제는 양이온성 펩타이드, 양이온성 지질 및 양이온성 고분자로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 유동성을 갖는 액제 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 양이온성 펩타이드는 폴리라이신(polylysine), 프로타민(protamine) 및 KALA 펩타이드(cationic fusogenic peptide)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 유동성을 갖는 액제 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모니움 클로라이드(N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride), 1,2-디올레오일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판(1,2-dioleoyloxy-3-(trimethylammonio)propane), 1,2-디올레오일-3-(4'-트리메틸암모니오)부탄오일-sn-글리세롤(1,2-dioleoyl-3-(4'-trimethylammonio)butanoyl-sn-glycerol), 1,2-디아실-3-디메틸암모니움-프로판(1,2-diacyl-3-dimethylammonium-propane), 1,2-디아실-3-트리메틸암모니움-프로판(1,2-diacyl-3-trimethylammonium-propane), 1,2-디아실-sn-글리세롤-3-에틸포스포콜린(1,2-diacyl-sn-glycerol-3-ethylphosphocholine), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤(3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol, 디메틸디옥타데실암모니움 브로마이드(dimethyloctadexylammonium bromide) 및 그 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 유동성을 갖는 액제 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 양이온성 고분자는 키토산(chitosan), 스페르민(spermine), 프트레신(putrescine), 카타베린(cadaverine) 및 스페르미딘(spermidine)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 유동성을 갖는 액제 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액제 조성물은 히알루론산(hyaluronic acid), 카르복시메틸셀룰로오스(carboxylmethyl cellulose), 콜라겐(collagen), 알지네이트(alginate), 폴록사머(poloxamer), 항체(antibody), 단백질(protein), 펩타이드(peptide), miRNA(microRNA), siRNA(small interfering RNA), 압타머(aptamer), 합성약물(chemical drug) 및 골 이식재(bone graft materials)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 추가로 혼합된 것을 특징으로 하는 유동성을 갖는 액제 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액제 조성물은 주사용제, 액상제, 크림제, 연고제, 겔제, 로션제, 내용액제, 외용액제 및 경피흡수제로 사용되는 것을 특징으로 하는 유동성을 갖는 액제 조성물.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 액제 조성물은,
    DNA 단편 혼합물을 완충용액에 넣고 열교반기를 이용하여 80℃ 이상의 고온에서 용해시켜 DNA 단편 혼합물 저장용액을 제조하는 제1단계;
    양이온성 첨가제를 완충용액에 넣고 용해시켜 양이온성 첨가제 저장용액을 제조하는 제2단계; 및,
    80℃ 이상의 열교반기에서 상기 제1단계의 DNA 단편 혼합물 저장용액과 제2단계의 양이온성 첨가제 저장용액을 혼합하고, 교반하면서 온도를 실온으로 낮추는 제3단계;
    로 이루어진 과정을 통해 제조된 것을 특징으로 하는 유동성을 갖는 액제 조성물.
KR1020180027186A 2018-03-08 2018-03-08 Dna 단편 혼합물이 고농도로 함유된 유동성을 갖는 액제 조성물 및 이의 제조방법 KR102056144B1 (ko)

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