KR101710615B1 - 생착률을 증가시킨 이식용 진피층 및 이의 제조 방법 - Google Patents

생착률을 증가시킨 이식용 진피층 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생착률을 증가시킨 이식용 진피층 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 세포가 제거된 무세포성 진피 이식편에 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액을 충전시켜 제조할 수 있다. 이렇게 제조된 이식용 진피층이 내부에 충전되어 있는 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액으로 인해, 이식된 주변 조직으로부터 세포들 유입과 고착을 빠르게 함으로써 초기 염증 반응을 완화하고 주변 조직과의 융합이 촉진되는 것을 확인하였다.

Description

생착률을 증가시킨 이식용 진피층 및 이의 제조 방법 {Dermal matrix for transplantation having improved survival rate and method for preparing thereof}
본 발명은 생착률을 증가시킨 이식용 진피층 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 생물학적으로 비활성화 된 진피층에 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액을 충전시켜 이식 시 생착률을 증가시킨 이식용 진피층에 관한 것이다.
피부는 인체 표면 전체를 덮고 있는 가장 큰 장기로서, 체액의 유실을 막아주고, 외부로부터 유해물질과 미생물의 유입을 막고, 물리적 자극, 방사선과 자외선 등으로부터 우리 몸을 보호하는 기능을 수행하고 있다. 피부는 모낭, 털, 땀샘, 피지선 등 여러 부속기관을 보유하고 있어 보호막 기능 외에도 다양한 기능을 수행하고 있는 중요한 복합 기관이다(김천호, et al., 2002). 피부는 크게 표피층(epidermis), 진피층(dermis) 및 피하조직(subcutaneous tissue, hypodermis)으로 나뉜다.
표피층은 피부 외부의 얇은 층으로서, 새로 분화하는 세포들로 구성되어 있으며, 이들은 외부 환경으로부터 피부를 보호하는 세포들을 계속 새로운 세포로 교체해 준다. 제일 하단부로부터 기저층(stratum basalis, basal cell layer), 유극층(stratum spinosum, spinous cell layer), 과립층(stratum granulosum, granular cell layer), 각질층(stratum corneum)으로 계층화 되어 있어 피부 표면에는 최종 분화된 죽은 세포가 여러 겹으로 쌓여 보호막 기능을 수행하게 된다.
진피층은 표피의 아래에 있는 층으로 혈관, 신경 등의 다양한 구조물들을 지지해 주는 기질을 공급하는 층으로 콜라겐, 탄성 섬유 및 세포외 기질(extracellular matrix)들로 이루어져 있다. 진피층은 크게 상층부의 섬유아세포(fibroblast)가 풍부하고 미세 혈관이 분포하는 유두층(papillary layer)과 두꺼운 콜라겐 섬유가 풍부한 세망 결합 조직(reticular connective tissue)으로 구성되어 있다.
피하조직은 진피와 근육, 골격 사이에 있는 부분으로 지방조직(adipose tissue)과 결합조직으로 구성되어 있고, 혈관과 림프관 및 신경말단부를 포함한다. 피하조직 내의 지방 조직은 외부의 압력으로부터 보호해주며, 마찰력에 대한 패딩 효과를 제공하여 뼈와 근육과 같은 심부구조 위에서 피부의 이동을 쉽게 하도록 한다. 또한, 지방 조직이 많아서 열을 생산하고 생산한 열을 보유할 뿐만 아니라 충격을 흡수함으로써 신체를 보호하며 여분의 영양소를 축적한다.
피부조직은 화상, 외상 및 피부 질환 등으로 인해 조직의 일부가 손상될 수 있는데, 이 경우 손상된 조직의 치유를 목적으로 하거나 재건성형을 목적으로 본인 피부조직을 이식하는 자가이식(autograft), 다른 사람의 피부를 이식하는 동종이식(homograft, allograft), 동물의 피부를 이식하는 이종이식(heterograft, xenograft) 방법을 사용한다. 이들 방법 중 자가이식이 가장 이상적이지만 치료부위가 광범위한 경우 조직을 확보할 수 있는 부위에 제한이 따르며, 채취 부위가 새로운 상처부위로 남게 되는 어려움이 있다. 동족이식은 영구적인 생착보다는 상처 주변부의 세포의 이동과 치유를 돕는 역할을 한다.
피부의 손실이 심각한 상태의 환자를 위해서는 상처를 덮을 수 있는 지지체(scaffold)가 필요하며, 이를 위해 인공피부(artificial skin)가 개발되고 있다. 인공피부는 손실 부위의 감염 및 체액의 손실을 막아주는 보호막의 역할과, 환자의 상처 부위에 흉터가 남지 않고, 치유과정에 발생될 수 있는 심각한 수축을 원칙적으로 막아 줄 수 있어야 한다(Yannas I.V., 1995).
인공피부는 크게 창상피복제(wound dressing)라고 하는 일시적 피복형(temporary skin equivalent)과 배양 피부 또는 체내이식용인 영구생착형(permanent skin equivalent)이라고 하는 두 가지로 크게 나뉠 수 있다. 일시적 피복형인 창상피복제는 화상이나 외상 등에 의해 손상을 입은 피부가 회복할 때까지 일시적으로 환부를 보호하는 것으로, 체내로부터의 수분 노출을 방지하고 삼출액을 흡수하며, 외부로부터 미생물의 침입 및 감염을 방지하는 역할을 한다. 반면, 영구생착형 인공피부는 합성 고분자와 천연 고분자로 이루어지며, 창상피복제 역할은 물론 인체의 세포가 쉽게 침투할 수 있는 통로를 제공하며 본래의 피부 조직으로 재생되는 것을 적극적으로 돕고, 그 자체는 인체 내에서 분해, 흡수된다. 영구생착형 인공피부 중 하나인 생인공피부(bioartifical skin)는 보호막 기능은 물론 손상 조직의 재생에 필요한 성장인자와 세포외 기질을 제공하여 신속한 상처 치유와 상흔의 감소 등 그 탁월한 효과가 입증되고 있다. 현재 생인공피부는 화상, 욕창, 외상, 성형, 난치성 궤양, 당뇨성 피부괴사, 압력 미란 등에 임상 적용되고 있다.
피부 이식은 이식하는 외식편(explant)의 두께와 이식 부위 관리에 따라 성공 여부가 다양하다(Gallico G.G. 3rd., 1990; Kunert P., 1991). 성공적인 피부 이식을 위해 피부 이식의 기전에 대한 연구, 기술적 발달과 수술 후 공여부 관리, 수술 부위 관리 등에 대한 연구도 활발히 이루어져 왔다(Johnson C.S., et al., 2001; McDowell F., 1977). 일반적으로 알려진 피부 이식의 기전은 이식 피부가 착상 배지로부터 혈류를 공급 받아 살게 되며 이식 성공 여부는 24~48시간에 발생하는 영양 및 산소의 확산 효과인 혈장 흡수(plasmatic imbibition)와 신생혈관형성(revascularization)에 의해 결정된다(Johnson C.S., et al., 2001). 피부 이식의 실패 원인으로 가장 흔한 것은 이식 피부하 혈종이나 체액의 저류로 보고되고 있다. 두 번째로 흔한 원인은 감염으로 알려져 있다(Barret J.P., et al., 2002; McGergor A.D., et al., 2000). 그 외 피부 이식의 성공에 영향을 미치는 다양한 인자들이나 연관 인자들이 있을 것으로 생각되나 이에 대한 연구 결과는 부족하며, 조절 가능한 적절한 피부 이식의 전제조건이나 기준은 제시된 바가 없다(안기찬, et al., 2012).
키토산(chitosan)(poly β-(1→4)-2-amino-2-deoxy-D-glucan)은 D-글루코사민이 β-(1→4) 결합한 선형 고분자로, 키틴(chitin)(poly β-(1→4)-2-acetamined-2-deoxy-D-glucan)의 C2 위치에 있는 아세트아미드기 중에서 아세틸기를 제거시킴으로써 얻어지는 천연 다당류이다. 키토산은 키틴에 비해 결정성이 낮기 때문에 염산(hydrochloric acid), 황산(sulfuric acid) 등의 무기산, 포름산(formic acid), 아세트산(acetic acid), 프로피온산(propionic acid), 옥살산(oxalic acid), 숙신산(succinic acid) 등의 유기산, 글루콘산(gluconic acid), 락트산(lactic acid), 말산(malic acid) 등의 옥시산(oxy acid), 글루타민산(glutamic acid) 등의 산성 아미노산의 묽은 수용액에서 산염을 형성하여 녹는다(Mussarelli R.A.A., 1997; Brine C.J., et al., 1992).
키토산 용액은 점도가 높은 특징을 가지고 있으며, 탈아세틸화도, 이온강도, pH, 온도 등에 따라 차이가 있다. 예를 들면, 용매의 pH가 낮으면 키토산 용액의 점도는 감소하고 pH가 높아지면 점도는 증가하며, 온도의 경우에는 온도가 높아지면 키토산 용액의 점도가 감소하고 다시 원래의 온도가 되면 처음과 같은 점도가 된다.
키토산은 사람을 포함한 동물, 식물에 대한 생리활성을 가지기 때문에 넓은 분야에서 응용 및 이용되고 있다. 키토산의 생리작용을 활용하여 가장 넓게 응용되고 있는 것은 항균 작용이다. 키토산의 항균작용은 양이온화 된 아미노기에 의해 발현되는 것으로 알려져 있다. 양이온화 된 키토산의 아미노기와 세균의 세포벽을 구성하는 시알산(sialic acid), 인지질(phospholipid) 등의 산성기(acidic group) 간에 이온결합이 일어나 고분자 전해질 복합체를 형성한 결과, 세포막 중 인지질의 극성화로 접촉면 반대 측의 세포막 조직이 파괴되고 그로 인해 세포내의 원형질이 누출되어 세균이 죽게 된다. 또한, 생체의료공학분야에서 우수한 인체 적합성과 거부반응이 최소인 고분자 소재로서 키토산을 이용하려는 연구들이 지속되어 왔으며, 창상 보호재, 창상 연고, 치과용재, 정형외과재료, 수술용 봉합사 등의 인체 적합성 생체고분자 소재로서 각광받고 있다(고병열, et al., 2002).
이에, 본 발명자들은 피부 이식용 조성물을 연구하는 과정에서, 생물학적으로 비활성화 된 진피층에 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액으로 충전시켜 제조한 이식용 진피층이 이식한 부위에서 생착률이 증가된 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
종래 선행기술로서 한국등록특허 제0469661호 및 제1362402호에는 이식용 무세포 진피층이 기재되어 본 발명의 구성과 유사하나, DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액을 충전시키는 방법은 기재되어 있지 않아 본 발명의 구성과 차이가 있다. 또한, 미국공개특허 제2004-0031067호에는 피부 이식시 신생혈관형성 유도인자를 암호화하고 있는 핵산을 투여하는 방법을 기재하고 있으나, 본 발명의 키토산은 전혀 언급되어 있지 않고, 약물이 충전된 진피 조성물이 기재되어 있지 않아 본 발명의 구성과 상이하다. 한국등록특허 제1534276호에는 지방이식 수술 후 지방세포의 생착률 증진을 위한 폴리디옥시리보뉴클리오티드를 성분으로 하는 조성물이 기재되어 있어 본 발명의 구성과 유사하나, 키토산은 전혀 언급되어 있지 않고, 약물이 충전된 진피 조성물이 기재되어 있지 않아 본 발명의 구성과 차이가 있다.
한국등록특허 제0469661호, 이식용 무세포 진피층 및 이의 제조방법, 2005. 01. 24. 등록. 한국등록특허 제1362402호, 기저막층이 제거된 무세포 진피조직 이식체, 2014. 02. 06. 등록. 미국공개특허 제2004-003167호, Regulation of human skin healing, 2004. 02. 12. 공개. 한국등록특허 제1534276호, 지방 이식 수술 후 지방세포 정상 및 생착 증진을 위한 조성물, 2015. 06. 30. 등록.
고병열, et al., 키토산, 심층정보분석보고서, 한국과학기술정보연구원, 2002. 김천호, et al., 인공피부의 현황 및 전망, Polymer Science and Technology, 13(1), 48-55, 2002. 안기찬, et al., 피부 이식의 성공에 영향을 미치는 요인들의 분석, J. Korean Orthop., Assoc., 47, 119-124, 2012. Barret J.P., et al., Use of previously burned skin as random cutaneous local flaps in pediatric burn reconstruction, Burns, 28, 500-502, 2002. Brine C.J., et al., Advances in chitin and chitosan, Elsevier Applied Science, 30, 1992. Gallico G.G. 3rd., Biologic skin substitutes, Clin. Plast. Surg., 17, 519-526, 1990. Johnson C.S., et al., Plastic surgery, In: Sabiston DC, ed. Sabiston Textbook of surgery: the biologic basis of modern surgical practice, Philadelphia: Saunders, 1553-1554, 2001. Kunert P., Structure and construction: the system of skin flaps., Ann. Plast. Surg., 27, 509-516, 1991. McDowell F., The source book of plastic surgery, Baltimore: Williams and Wilkins, 1-52, 1977. McGregor A.D., Free skin graft, In: McGregor AD, McGergor I, ed. Fundamental techniques of plastic surgery, 10th ed., Philadelphia: Churchill Livingstone, 35-59, 2000. Muzzarelli R.A.A., Chitin, Pergamon Press, 1997. Yannas I.V., Artificial skin and dermal equivalents, In: The Biomedical Engineering Handbook, ed., by J. D. Bronzino: CRC Press, USA, 2025-2038, 1995.
본 발명의 목적은 생착률을 증가시킨 이식용 진피층 및 이의 제조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 이식용 진피층 제조 방법에 관한 것으로, DNA 단편 혼합물 저장 용액(stock solution)을 제조하는 제1단계; 키토산 저장 용액을 제조하는 제2단계; 상기 DNA 단편 혼합물 저장 용액 및 상기 키토산 저장 용액을 혼합하여 교반한 후 멸균하여 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액을 제조하는 제3단계; 및 상기 충전액을 무세포성 진피 이식편에 충전하는 제4단계; 를 포함하는 이식용 진피층의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 제조방법은 DNA 단편 혼합물을 완충 용액에 넣고 50℃ 내지 70℃에서 교반하면서 1시간 내지 3시간 동안 용해시켜 DNA 단편 혼합물 저장용액을 제조하는 제1단계; 키토산을 산성 완충용액에 용해시켜 키토산 저장용액을 제조하는 제2단계; 상기 DNA 단편 혼합물 저장 용액 및 상기 키토산 저장 용액을 DNA 단편 혼합물 및 키토산의 중량비율이 20:1~10,000:1이 되도록 혼합하여 65℃ 내지 75℃에서 1시간 내지 2시간 동안 교반 한 후 멸균하여 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액을 제조하는 제3단계; 및 상기 충전액을 진공 약물 충전 장치를 이용하여 무세포성 진피 이식편에 충전하는 제4단계;를 포함할 수 있다.
상기 DNA 단편 혼합물은 어류의 정소 또는 정액에서 분리할 수 있다.
상기 어류는 연어과일 수 있다.
상기 DNA 단편 혼합물은 분자량이 50kDa 내지 10,000kDa일 수 있다.
상기 DNA 단편 혼합물은 충전액 총 중량을 기준으로 0.01중량% 내지 3중량%일 수 있다.
상기 키토산은 분자량이 3kDa 내지 1,000kDa일 수 있다.
상기 키토산은 충전액 총 중량을 기준으로 1×10- 6중량% 내지 0.15중량%일 수 있다.
상기 제4단계의 무세포성 진피 이식편은 진피로부터 세포 및 불순물이 제거되고, 바이러스 불활화 처리 후 동결 건조 처리하여 생물학적으로 비활성화 된 콜라겐 사용 조직 보충재일 수 있다.
상기 진피는 자가, 동종 또는 이종에서 분리한 것일 수 있다.
상기 제4단계의 충전은 압력을 이용해 무세포성 진피 이식편 내부로 점성이 있는 충전액을 유입시켜 콜라겐 사이의 빈 공간을 채우는 것일 수 있다.
상기 제4단계의 진공 약물 충전 장치는 충전액을 일방향에 연결하고, 양압 또는 음압을 발생시켜 연결된 충전액이 무세포 진피 이식편 내부의 콜라겐 사이의 공간을 채워 충전 되도록 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 이식용 진피층에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 이식용 진피층을 포함하는 피부 손상 치료제에 관한 것이다.
상기 피부 손상은 찰과상(abrasion), 절개(incision), 열상(laceration), 피부결출(skin avulsion), 피부타박(skin bruise), 천자부상(puncture wound) 및 수술에 의한 피부절제 군에서 선택되는 1종 이상이 원인될 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 DNA 단편 혼합물 저장 용액(stock solution)을 제조하는 제1단계; 키토산 저장 용액을 제조하는 제2단계; 상기 DNA 단편 혼합물 저장 용액 및 상기 키토산 저장 용액을 혼합하여 교반한 후 멸균하여 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액을 제조하는 제3단계; 및 상기 충전액을 무세포성 진피 이식편에 충전하는 제4단계;를 포함하는 이식용 진피층의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 이식용 진피층의 제조방법은 DNA 단편 혼합물을 완충 용액에 넣고 50℃ 내지 70℃에서 교반하면서 1시간 내지 3시간 동안 용해시켜 DNA 단편 혼합물 저장용액을 제조하는 제1단계; 키토산을 산성 완충용액에 용해시켜 키토산 저장용액을 제조하는 제2단계; 상기 DNA 단편 혼합물 저장 용액 및 상기 키토산 저장 용액을 DNA 단편 혼합물 및 키토산의 중량비율이 20:1~10,000:1이 되도록 혼합하여 65℃ 내지 75℃에서 1시간 내지 2시간 동안 교반한 후 멸균하여 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액을 제조하는 제3단계; 및 상기 충전액을 진공 약물 충전 장치를 이용하여 무세포성 진피 이식편에 충전하는 제4단계;를 포함할 수 있다.
상기 제1단계에서 DNA 단편 혼합물 저장 용액 제조시 이용할 수 있는 완충용액으로는 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트(sodium phosphate dibasic dodecahydrate), 염화나트륨(sodium chloride), 염화마그네슘(magnesium chloride), 염화칼륨(potassium chloride), 인산 완충 식염수(phosphate buffer sline), HEPES(N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid) 또는 글리세롤-3-인산(glycerol-3-phosphate) 완충용액이 있으며, 바람직하게는 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트(sodium phosphate dibasic dodecahydrate)를 이용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 DNA 단편 혼합물은 어류의 정소 또는 정액으로부터 분리한 것일 수 있다.
상기 어류는 연어과일 수 있고, 바람직하게는 연어 또는 송어 일 수 있고, 가랑 바람직하게는 연어일 수 있다.
상기 DNA 단편 혼합물이란, 인산, 4종류의 염기, 데옥시리보오스(deoxyribose)로 이루어진 생체고분자에 해당하는 DNA로, 분자량이 저감된 단편 형태로 혼합되어 존재하는 것을 지칭한다.
상기 DNA 단편 혼합물은 분자량이 50kDa 내지 10,000kDa 일 수 있다. 바람직하게는 50kDa 내지 5,000kDa이고, 가장 바람직하게는 50kDa 내지 3,500kDa이다.
상기 제2단계에서 키토산 저장용액 제조 시 이용할 수 있는 산성 완충용액으로는 아세트산(acetic acid), 염산(hydrochloric acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 젖산(lactic acid), 질산(nitric acid)이 있으며, 바람직하게는 아세트산(acetic acid)을 이용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 키토산은 분자량이 3kDa 내지 1,000kDa 일 수 있다.
상기 제3단계에서 DNA 단편 혼합물 및 키토산의 중량비율이 20:1~10,000:1일 수 있으며, 바람직하게는 20:1~1,000:1이고, 더욱 바람직하게는 50:1~200:1이다.
상기 DNA 단편 혼합물은 충전액 총 중량을 기준으로 0.01중량% 내지 3중량%일 수 있고, 바람직하게는 0.1중량% 내지 2중량%이며, 가장 바람직하게는 1중량% 내지 1.5중량%이다. DNA 단편 혼합물이 0.01중량% 미만일 경우에는 생착률 증진 효과를 기대하기 어렵고, 3중량% 초과인 경우에는 충전액 제조 공정상의 문제점이 발생할 수 있어 바람직하지 못하다.
상기 키토산은 충전액 총 중량을 기준으로 1×10- 6중량% 내지 0.15중량%일 수 있고, 바람직하게는 1×10-5중량% 내지 0.15중량%이며, 가장 바람직하게는 1×10- 4중량% 내지 0.075중량%이다. 키토산이 1×10- 6중량% 미만 또는 0.15중량% 초과인 경우에는 충전액의 점성에 의해 무세포 진피 이식편 충전시 충전율이 낮아져 바람직하지 못하다.
상기 키토산은 DNA 단편 혼합물과 혼합됨으로써 충전액의 점성을 증가시킬 수 있다. 이러한 점성의 증가는 충전액의 충전시 무세포성 진피 이식층 내부의 콜라겐 사이의 빈 공간을 채우는 충전 효율을 증가시킬 수 있다.
상기 키토산은 무세포 진피 이식편의 주성분인 음전하를 띄는 콜라겐과 이온결합을 통해 충전 시 충전액의 충전 효율을 증가시킬 수 있다.
상기 제3단계에서 멸균은 고온고압증기멸균, 건열멸균, EO(ethylene oxide)가스멸균 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 고온고압증기멸균을 이용하지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 제4단계에서 무세포 진피 이식편(Acellular dermal matrix)은 진피로부터 세포 및 불순물이 제거되고, 바이러스 불활화 처리 후 동결 건조 처리하여 생물학적으로 비활성화 된 콜라겐사용 조직 보충재 및 지지체(scaffold)일 수 있다.
상기 보충재는 상처를 덮을 수 있는 것으로, 인공피부(artificial skin)일 수 있다.
상기 무세포 진피 이식편은 진피로부터 일련의 과정을 통해 제조할 수 있으며 또한, 상용화 되어 판매되는 것을 이용할 수 있다.
상기 진피는 자가, 동종 또는 이종에서 분리한 진피일 수 있다.
상기 제4단계의 충전은 압력을 이용해 무세포성 진피 이식편 내부로 충전액을 유입시켜 콜라겐 사이의 빈 공간을 충전액으로 채우도록 하는 것일 수 있다. 특히, 충전액이 점성을 띠어 무세포성 진피 이식편 내부로 유입이 어려운 경우, 음압 또는 양압을 가함으로써 무세포성 진피 이식편 내부로 충전액 유입을 증가시켜 콜라겐 사이의 빈 공간을 채우는 충전 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 충전액의 이식편 내부로의 유입을 증가시켜 충전액에 포함되어 있는 물질과 무세포성 진피 이식편의 주요성분인 콜라겐과의 접촉 면적을 증가시킴으로써, 충전액에 포함되어 있는 물질과 콜라겐과의 이온결합 기회를 높여 두 물질 간의 결합을 촉진시킴으로써 충전 효율이 증가 될 수 있다.
상기 충전은 진공 약물 충전 장치를 이용하여 이루어질 수 있다.
상기 진공 약물 충전 장치는 무세포성 진피 이식편에 양압(positive pressure) 또는 음압(negative pressure)을 가함으로써 충전액이 무세포성 진피 이식편 내부로 유입되도록 하는 장치일 수 있다. 바람직하게는 음압을 이용한다.
상기 진공 약물 충전 장치는 무세포성 진피 이식편을 고정하는 부위와 충전액이 유입되는 부위, 양압 또는 음압을 위한 진공 펌프가 연결된 부위로 이루어질 수 있다.
상기 고정하는 부위는 약물 충전 시 압력에 의해 약물이 새어나가지 못하도록 패킹(packing) 되어야 한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 이식용 진피층에 관한 것이다.
상기 이식용 진피층은 충전되어 있는 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액으로 인해, 이식된 주변 조직으로부터 세포들이 빠르게 이동하도록 함으로써 주변 조직과의 융합을 촉진시켜 생착률을 증가시킬 수 있으며, 초기 염증을 완화시켜 이식 후 회복을 빠르게 할 수 있다.
또한, 본 발명은 이식용 진피층을 포함하는 피부 손상 치료제에 관한 것이다.
상기 피부 손상은 찰과상(abrasion), 절개(incision), 열상(laceration), 피부결출(skin avulsion), 피부타박(skin bruise), 천자부상(puncture wound) 및 수술에 의한 피부절제 군에서 선택되는 1종 이상이 원인이 되어 나타나는 것 일 수 있다.
상기 피부 손상 치료는 피부의 손상이 심각한 부위에 보충재 또는 지지체(scaffold)를 이식하여 상처 부위를 덮어 손상 부위의 체액 손실을 막아주고, 상처 부위에 흉터가 남지 않도록 하는 것이다.
본 발명은 생착률을 증가시킨 이식용 진피층 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 생물학적으로 비활성화 된 진피 이식편에 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액을 충전시켜 제조할 수 있다. 이렇게 제조된 이식용 진피층이 내부에 충전되어 있는 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액으로 인해, 이식된 주변 조직으로부터 세포들 유입과 고착을 빠르게 함으로써 초기 염증 반응을 줄이고 주변 조직과의 융합을 촉진하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 이식용 진피층을 피부가 손상된 부위에 이식함으로써 생착률이 높고, 빠른 피부 손상 치료 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액의 충전 여부를 확인한 결과를 보여주고 있다. 대조군 1인 충전액을 충전하지 않은 무세포성 진피 이식편(A) 및 대조군 2인 충전액에 담지 시킨 무세포성 진피 이식편(B)의 경우에는 헤마톡실린에 의해 자색으로 염색된 부분이 없으나, 본 발명의 이식용 진피층(C)의 경우에는 붉은 색으로 염색된 콜라겐 사이사이에 자색으로 염색된 부분이 다수 존재하는 것으로 관찰되었다. 검은색 화살표는 헤마톡실린에 의해 자색으로 염색된, 충전액이 충전된 부위를 나타낸다.
도 2는 이식용 진피층 이식 후 시간에 따른 진피층의 크기 변화를 나타내고 있다. 대조군 1(A) 및 대조군 2(B)를 이식한 경우에는 시간이 지나도 이식한 무세포성 진피 이식편의 크기 변화가 크게 나타나지 않는 반면에, 본 발명의 이식용 진피층을 이식한 경우(C)에는 3주까지는 대조군과 비슷하였지만 4주가 지난 후에는 이식한 진피층의 테두리가 분해되어 진피층의 크기가 작아지는 것을 알 수 있다.
도 3은 본 발명의 이식용 진피층의 이식에 의한 염증 유발 정도를 보여주고 있다. 염증에 의해 나타나는 섬유 조직 캡슐의 두께를 관찰한 결과 대조군 1을 이식한 경우(A)에 비해, 본 발명의 이식용 진피층을 이식한 경우(B)가 초기 염증 반응을 완화시킨다는 것을 알 수 있다.
도 4는 본 발명의 이식용 진피층의 이식에 따른 세포생착률을 보여주고 있다. 본 발명의 이식용 진피층(B)을 이식한 경우가 대조군 1(A)을 이식한 경우보다 이식용 진피층 내의 세포수가 더 많이 증가하였다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 생착률을 증가시킨 이식용 진피층 제조>
실시예 1-1. DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액 제조
본 발명의 생착률을 증가시킨 이식용 진피층을 제조하기 위해 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액을 제조하였다.
DNA 단편 혼합물을 190mM 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트(sodium phosphate dibasic dodecahydrate) 완충용액에 넣고 60℃의 열교반기를 이용하여 2시간 이상 용해시켜 DNA 단편 혼합물 저장용액(stock solution)을 제조하였다. 키토산은 90mM 아세트산(acetic acid)에 넣고 상온에서 3시간 동안 교반시켜 용해하여 키토산 저장용액을 제조하였다.
상기에서 제조한 DNA 단편 혼합물 저장용액 및 키토산 저장용액을 혼합하여 70℃의 열교반기에서 2시간 동안 교반하였다. 이때, DNA 단편 혼합물 및 키토산의 농도 및 혼합비율이 하기 표 1의 조건이 되도록 혼합하였다. 제조된 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액을 고온고압증기멸균기로 멸균 처리하였다.
구성 최종 농도(중량%) 혼합비율(중량비율)
DNA 단편 혼합물 키토산 DNA 단편 혼합물 키토산
충전액 1-1 0.5 0.005 100 1
충전액 1-2 0.01 0.0005 20 1
충전액 1-3 0.01 0.000001 10000 1
충전액 1-4 3 0.15 20 1
충전액 1-5 3 0.0003 10000 1
실시예 1-2. 생착률을 증가시킨 이식용 진피층 제조
본 발명의 생착률을 증가시킨 이식용 진피층을 제조하기 위해 한스바이오메드사(서울, Korea)로부터 무세포성 진피 이식편(Acellular dermal matrix)(상품명: Nature-Derma)을 구입하여 사용하였다. 이 제품은 화학처리 공정에 의한 돼지 진피로부터 세포 및 불순물을 제거하고, 바이러스 불활화 처리 후 동결건조 처리된 콜라겐 사용 조직 보충재로 내외과적 처리 및 수술 시 결손 또는 손상된 뼈, 연골 등을 보충하기 위하여 사용하는 콜라겐 함유 제품이다.
상기 한스바이오메드사로부터 구입한 무세포성 진피 이식편을 진공 약물 충전 장치에 고정시킨 후 상기 실시예 1-1에서 제조한 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액 중에서 발명자의 육안 검사와 충전 테스트를 통해 사용감이 우수한 충전액 1-1을 무세포성 진피 이식편에 충전시켜 본 발명의 이식용 진피층을 제조하였다.
<실시예 2. DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액의 충전 확인>
무세포성 진피 이식편에 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액이 충전되었는지 확인하기 위해 H&E(haematoxylin and eosin) 염색을 진행하였다. H&E 염색 과정에서 헤마톡실린(haematoxylin)이 음전하를 갖는 핵산과 결합하여 자색을 나타내고, 에오신(eosin)이 양전하를 갖는 세포질 내 단백질과 결합하여 붉은 색을 나타내는데, 무세포성 진피 이식편의 주성분인 콜라겐이 에오신과 결합하여 붉은 색으로 염색된다.
상기 실시예 1-2에서 제조한 이식용 진피층 중 표 1의 충전액 1-1을 충전시킨 이식용 진피층을 이용해 H&E 염색을 진행하였다. 이때, 대조군으로 충전액을 충전하지 않은 무세포성 진피 이식편(대조군 1) 및 무세포성 진피 이식편을 충전액에 담가 1시간 정도 담지 시킨 이식편(대조군 2)을 가지고 H&E 염색을 진행하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보여주듯이, DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액을 충전하지 않은 무세포성 진피 이식편(대조군 1)(A) 및 충전액에 담지 시킨 무세포성 진피 이식편(B)의 경우에는 에오신에 의해 콜라겐 부분이 붉은 색으로 염색되었으나, 헤마톡실린에 의해 자색으로 염색된 부분이 없는 것을 알 수 있다. 반면, 상기 실시예 1-2에서 제조한 이식용 진피층(C)의 경우에는 붉은 색으로 염색된 콜라겐 사이사이에 자색으로 염색된 부분(검은색 화살표)이 나타나는 것을 알 수 있다.
이를 통해, 충전액에 담지하는 방법은 무세포성 진피 이식편 내부로의 충전액이 유입되지 않는다는 것을 알 수 있으며, 무세포성 진피 이식편에 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액을 충전하는 방법으로 진공 약물 충전 장치를 이용한 방법이 가장 효율적이라는 것을 알 수 있었다.
<실험예 1. 실험 동물의 준비>
동물 실험은 7주령의 무게가 230~280g인 Sprague-Dawley계 수컷 쥐(Rat)를 영바이오(성남시, 대한민국)로부터 구입하여 사용하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(Harlan laboratories, Inc., USA)를 사용하였고 급이기에 고형사료를 넣어 자유섭취 시켰다. 음수는 수돗물을 필터유수살균기로 여과한 후 자외선을 조사하였고, 자동급수장치로 자유섭취 시켰다. 실험동물 사육실의 환경은 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 조명시간 12시간 및 조도 150~300Lux로 유지하였다.
<실험예 2. 생착률을 증가시킨 이식용 진피층의 생착률 확인>
실험예 2-1. 이식용 진피층의 이식
상기 실시예 1-2에서 제조한 이식용 진피층을 동일한 농도의 충전액이 담긴 용액에 30분 정도 추가 담지하여 사용하였다. 이때, 대조군으로 충전액을 충전시키지 않은 무세포성 진피 이식편을 PBS(phosphate buffer saline) 용액에 담지 시킨 것(대조군 1)과 충전액 1-1에 30분 정도 담지 시킨 것(대조군 2)을 이용하였다.
상기 실험예 1의 쥐를 이소플루란(isofluran)으로 호흡 마취시킨 후, 이식하고자 하는 부위를 포비돈과 에탄올로 소독하였다. 소독 후 쥐의 척추를 따라 등 부위를 절개하여 핀셋을 이용하여 외피를 들어 이식 공간을 확보하였다. 확보된 이식 공간에 상기에서 준비한 본 발명의 이식용 진피층 또는 대조군을 넣은 후 절개부위를 봉합하였다. 이때, 척추를 중심으로 쥐의 왼쪽 등 피하에는 대조군을, 오른쪽 등 피하에는 본 발명의 이식용 진피층을 이식하였다. 수술한 쥐를 케이지에 1마리씩 넣고 안정한 환경 속에서 사육하였다.
실험예 2-2. 육안 관찰을 통한 생착률 확인
상기 실험예 2-1의 이식 수술 후 1주마다 쥐를 1마리씩 희생시킨 후 이식 부위의 조직을 분리하여 이식용 진피층의 변화 여부를 육안으로 관찰하였고, 그 결과를 표 2 및 도 2에 나타내었다. 표 2의 경우에는 이식 후 4주가 지난 쥐의 이식용 진피층의 크기 변화를 확인한 결과로, 이식 시 이용한 이식용 진피층 크기 대비 이식 후 크기를 백분율(%)로 나타내었다.
구성 이식용 진피층 크기(%)
대조군 1 100
대조군 2 98
충전액 1-1 64
상기 표 2 및 도 2에서 보여주듯이, 대조군 1(PBS 용액에 담지한 무세포성 진피 이식편)(A) 및 대조군 2(충전액 1-1에 담지한 무세포성 진피 이식편)(B)를 이식한 경우에는 시간이 지나도 이식한 진피 이식편의 크기가 변화가 거의 없는 반면에, 본 발명의 이식용 진피층을 이식한 경우(B)에는 3주까지는 크기 변화가 거의 없었으나, 4주가 지난 후에는 이식한 진피층의 테두리가 분해되어 진피층의 크기가 작아지는 것을 알 수 있다.
이를 통해, 대조군 2와 같이 무세포성 진피 이식편을 충전액에 담지하여 외부 표면에만 흡착시킨 경우에는 생착률이 증가되지 않으며, DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액을 충전시켜 제조한 본 발명의 이식용 진피층에서 생착률이 증가한 것을 알 수 있었다.
실험예 2-3. 조직 염색을 통한 세포생착률 및 생체적합성 확인
상기 실험예 2-1에서 충전액 1-1을 충전시킨 본 발명의 이식용 진피층 및 PBS 용액에 담지한 무세포성 진피 이식편(대조군 1)을 이식한 후 1주차와 4주차의 조직을 수거하여 H&E 염색한 후 생체적합성 및 생착률을 확인하였다.
1주차와 4주차의 이식 부위의 조직을 수거하여 포르말린으로 고정하였고, 일련의 탈수 작업을 거쳐 파라핀에 심어 파라핀 블록을 제작하였다. 제작한 파라핀 블록을 5㎛ 두께로 조직 절편하고, 조직 절편을 Mayer's hematoxyline(Sigma, USA) 용액에 1초간 반응시킨 후, 흐르는 물에서 10분간 세척하였다. 이후 eosin(Sigma, USA) 용액에 3초간 반응시켰다. 염색이 완료된 조직은 탈수과정을 거쳐 Permount®(Fischer scientific, USA)로 봉입하였다. H&E 염색한 조직 절편을 현미경을 이용하여 조직병리학적 변화를 관찰하였고, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 도 3은 염증에 의해 나타나는 섬유 조직 캡슐(fibrous tissue capsule)을 관찰함으로써 생체적합성을 확인한 결과를 보여주고 있으며, 도 4는 이식한 진피층 내의 세포 수의 변화를 관찰함으로써 세포생착률을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3에서 보여주듯이, 이식 후 1주차에는 염증에 의해 나타나는 섬유 조직 캡슐의 두께가 대조군 1(A)에 비해 본 발명의 이식용 진피층(B)을 이식한 경우에 얇은 것을 알 수 있고, 4주차에는 대조군 1(A) 및 본 발명의 이식용 진피층(B)을 이식한 경우에 모두 섬유 조직 캡슐의 두께가 얇아졌다.
또한, 세포생착률의 경우에는, 도 4에서 보여주듯이, 이식 후 1주차에는 대조군 1(A) 및 본 발명의 이식용 진피층(B)의 콜라겐 사이의 빈공간이 다수 관찰된 반면, 4주차에는 콜라겐 사이의 빈공간들이 세포들로 채워진 것을 관찰하였다. 특히나 본 발명의 이식용 진피층(B)을 이식한 경우가 대조군 1(A)을 이식한 경우보다 세포수가 더 많이 증가한 것을 알 수 있다.
이를 통해, 본 발명의 이식용 진피층에 충전된 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액에 의해 초기 염증이 완화되었음을 알 수 있었으며, 주변 조직으로부터 세포들이 빠르게 이동하도록 하여 주변조직과의 융합이 촉진되어 세포생착률이 증가되었음을 알 수 있었다.

Claims (15)

  1. DNA 단편 혼합물 저장 용액(stock solution)을 제조하는 제1단계;
    키토산 저장 용액을 제조하는 제2단계;
    상기 DNA 단편 혼합물 저장 용액 및 상기 키토산 저장 용액을 혼합하여 교반한 후 멸균하여 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액을 제조하는 제3단계; 및
    상기 충전액을 무세포성 진피 이식편에 충전하는 제4단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 생착률을 증가시킨 이식용 진피층의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제조 방법은,
    DNA 단편 혼합물을 완충 용액에 넣고 50℃ 내지 70℃에서 교반하면서 1시간 내지 3시간 동안 용해시켜 DNA 단편 혼합물 저장용액을 제조하는 제1단계;
    키토산을 산성 완충용액에 용해시켜 키토산 저장용액을 제조하는 제2단계;
    상기 DNA 단편 혼합물 저장 용액 및 상기 키토산 저장 용액을 DNA 단편 혼합물 및 키토산의 중량비율이 20:1~10,000:1이 되도록 혼합하여 65℃ 내지 75℃에서 1시간 내지 2시간 동안 교반 한 후 멸균하여 DNA 단편 혼합물 및 키토산을 포함하는 충전액을 제조하는 제3단계; 및
    상기 충전액을 진공 약물 충전 장치를 이용하여 무세포성 진피 이식편에 충전하는 제4단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 생착률을 증가시킨 이식용 진피층의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 DNA 단편 혼합물은 어류의 정소 또는 정액에서 분리한 것임을 특징으로 하는 생착률을 증가시킨 이식용 진피층의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 어류는 연어과인 것을 특징으로 하는 생착률을 증가시킨 이식용 진피층의 제조 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 DNA 단편 혼합물은 분자량이 50kDa 내지 10,000kDa인 것을 특징으로 하는 생착률을 증가시킨 이식용 진피층의 제조 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 DNA 단편 혼합물은 충전액 총 중량을 기준으로 0.01중량% 내지 3중량%인 것을 특징으로 하는 생착률을 증가시킨 이식용 진피층의 제조 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 키토산은 분자량이 3kDa 내지 1,000kDa인 것을 특징으로 하는 생착률을 증가시킨 이식용 진피층의 제조 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 키토산은 충전액 총 중량을 기준으로 1×10-6중량% 내지 0.15중량%인 것을 특징으로 하는 생착률을 증가시킨 이식용 진피층의 제조 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제4단계의 무세포성 진피 이식편은 진피로부터 세포 및 불순물이 제거되고, 바이러스 불활화 처리 후 동결 건조 처리하여 생물학적으로 비활성화 된 콜라겐 사용 조직 보충재인 것을 특징으로 하는 생착률을 증가시킨 이식용 진피층의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 진피는 자가, 동종 또는 이종에서 분리한 진피인 것을 특징으로 하는 생착률을 증가시킨 이식용 진피층의 제조 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제4단계의 충전은 압력을 이용해 무세포성 진피 이식편 내부로 점성이 있는 충전액을 유입시켜 콜라겐 사이의 빈 공간을 채우도록 하는 것을 특징으로 하는 생착률을 증가시킨 이식용 진피층의 제조 방법.
  12. 제2항에 있어서,
    상기 제4단계의 진공 약물 충전 장치는 충전액을 일방향에 연결하고, 양압 또는 음압을 발생시켜 연결된 충전액이 무세포 진피 이식편 내부의 콜라겐 사이의 공간을 채워 충전 되도록 하는 것을 특징으로 하는 생착률을 증가시킨 이식용 진피층의 제조 방법.
  13. 제1항 또는 제2항의 방법으로 제조된 생착률을 증가시킨 이식용 진피층.
  14. 제13항의 이식용 진피층을 포함하는 피부 손상 치료제.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 피부 손상은 찰과상(abrasion), 절개(incision), 열상(laceration), 피부결출(skin avulsion), 피부타박(skin bruise), 천자부상(puncture wound) 및 수술에 의한 피부절제 군에서 선택되는 1종 이상이 원인이 되는 것을 특징으로 하는 피부 손상 치료제.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018048047A1 (ko) * 2016-09-07 2018-03-15 주식회사 파마리서치프로덕트 생착률을 증가시킨 이식용 진피층 및 이의 제조방법
KR101959523B1 (ko) 2018-01-30 2019-03-18 주식회사 파마리서치프로덕트 핵산, 골 이식재 및 양이온성 고분자를 포함하는 골 이식용 조성물 및 이를 제조하기 위한 골 이식용 키트
WO2019151611A1 (ko) 2018-01-31 2019-08-08 주식회사 로킷헬스케어 진피 재생 시트용 바이오 잉크 조성물, 이를 이용한 맞춤형 진피 재생 시트의 제조방법, 및 상기 제조방법을 이용하여 제조된 맞춤형 진피 재생 시트
KR102056144B1 (ko) 2018-03-08 2019-12-16 주식회사 파마리서치프로덕트 Dna 단편 혼합물이 고농도로 함유된 유동성을 갖는 액제 조성물 및 이의 제조방법
KR20220092441A (ko) 2020-12-24 2022-07-01 주식회사 로킷헬스케어 조직 재생 패치의 제조방법

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040003167A (ko) 2002-06-29 2004-01-13 동부전자 주식회사 웨이퍼 현상 장치
KR100469661B1 (ko) 2000-03-28 2005-02-02 한스바이오메드 주식회사 이식용 무세포 진피층 및 이의 제조방법
US20100266559A1 (en) * 2006-03-17 2010-10-21 Synovis Orthopedic And Woundcare, Inc. Stabilized, sterilized collagen scaffolds with active adjuncts attached
JP2013530729A (ja) * 2010-03-25 2013-08-01 ライフセル コーポレーション 再生組織足場の製造
KR101362402B1 (ko) 2012-03-15 2014-02-14 김준용 기저막층이 제거된 무세포 진피조직 이식체
KR101534276B1 (ko) 2014-07-18 2015-07-07 주식회사 에스씨301테라피 지방 이식 수술 후 지방세포 성장 및 생착 증진을 위한 조성물

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040031067A1 (en) 2001-10-11 2004-02-12 Meenhard Herlyn Regulation of human skin healing
JP4674288B2 (ja) * 2004-03-31 2011-04-20 恵雄 岡畑 歯科用材料。
AU2006244873A1 (en) * 2005-05-13 2006-11-16 Netech Inc. Medical composition for promotion of skin regeneration
US9072816B2 (en) * 2006-01-18 2015-07-07 Cormatrix Cardiovascular, Inc. Composition for modulating inflammation of cardiovascular tissue
CN102056619A (zh) * 2008-04-18 2011-05-11 科尔普兰特有限公司 产生和使用原胶原的方法
EP2310507A4 (en) * 2008-07-08 2013-03-20 David Gladstone Inst METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING ANGIOGENESIS
CN101956000A (zh) * 2010-07-19 2011-01-26 博奥生物有限公司 可控释放生物分子的方法及可控释放生物分子的生物芯片
RU2519326C2 (ru) 2011-12-29 2014-06-10 Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения
US9532866B2 (en) * 2012-03-15 2017-01-03 L&C Bio Co., Ltd. Acellular dermal graft
US9173969B2 (en) * 2012-04-11 2015-11-03 Kaohsiung Medical University Biomaterial for wound healing
WO2015125117A1 (en) * 2014-02-20 2015-08-27 Mastelli S.R.L. Dermocosmetic filler and uses thereof for aesthetic purposes
KR101710615B1 (ko) * 2016-09-07 2017-02-27 주식회사 파마리서치프로덕트 생착률을 증가시킨 이식용 진피층 및 이의 제조 방법

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100469661B1 (ko) 2000-03-28 2005-02-02 한스바이오메드 주식회사 이식용 무세포 진피층 및 이의 제조방법
KR20040003167A (ko) 2002-06-29 2004-01-13 동부전자 주식회사 웨이퍼 현상 장치
US20100266559A1 (en) * 2006-03-17 2010-10-21 Synovis Orthopedic And Woundcare, Inc. Stabilized, sterilized collagen scaffolds with active adjuncts attached
JP2013530729A (ja) * 2010-03-25 2013-08-01 ライフセル コーポレーション 再生組織足場の製造
KR101362402B1 (ko) 2012-03-15 2014-02-14 김준용 기저막층이 제거된 무세포 진피조직 이식체
KR101534276B1 (ko) 2014-07-18 2015-07-07 주식회사 에스씨301테라피 지방 이식 수술 후 지방세포 성장 및 생착 증진을 위한 조성물

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Barret J.P., et al., Use of previously burned skin as random cutaneous local flaps in pediatric burn reconstruction, Burns, 28, 500-502, 2002.
Brine C.J., et al., Advances in chitin and chitosan, Elsevier Applied Science, 30, 1992.
Gallico G.G. 3rd., Biologic skin substitutes, Clin. Plast. Surg., 17, 519-526, 1990.
Johnson C.S., et al., Plastic surgery, In: Sabiston DC, ed. Sabiston Textbook of surgery: the biologic basis of modern surgical practice, Philadelphia: Saunders, 1553-1554, 2001.
Kunert P., Structure and construction: the system of skin flaps., Ann. Plast. Surg., 27, 509-516, 1991.
McDowell F., The source book of plastic surgery, Baltimore: Williams and Wilkins, 1-52, 1977.
McGregor A.D., Free skin graft, In: McGregor AD, McGergor I, ed. Fundamental techniques of plastic surgery, 10th ed., Philadelphia: Churchill Livingstone, 35-59, 2000.
Muzzarelli R.A.A., Chitin, Pergamon Press, 1997.
Yannas I.V., Artificial skin and dermal equivalents, In: The Biomedical Engineering Handbook, ed., by J. D. Bronzino: CRC Press, USA, 2025-2038, 1995.
고병열, et al., 키토산, 심층정보분석보고서, 한국과학기술정보연구원, 2002.
김천호, et al., 인공피부의 현황 및 전망, Polymer Science and Technology, 13(1), 48-55, 2002.
안기찬, et al., 피부 이식의 성공에 영향을 미치는 요인들의 분석, J. Korean Orthop., Assoc., 47, 119-124, 2012.

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018048047A1 (ko) * 2016-09-07 2018-03-15 주식회사 파마리서치프로덕트 생착률을 증가시킨 이식용 진피층 및 이의 제조방법
US11109955B2 (en) 2016-09-07 2021-09-07 Pharmaresearch Co., Ltd. Dermal layer for grafting having improved graft survival rate and method for producing same
KR101959523B1 (ko) 2018-01-30 2019-03-18 주식회사 파마리서치프로덕트 핵산, 골 이식재 및 양이온성 고분자를 포함하는 골 이식용 조성물 및 이를 제조하기 위한 골 이식용 키트
WO2019151736A1 (ko) 2018-01-30 2019-08-08 주식회사 파마리서치프로덕트 핵산, 골 이식재 및 양이온성 고분자를 포함하는 골 이식용 조성물 및 이를 제조하기 위한 골 이식용 키트
WO2019151611A1 (ko) 2018-01-31 2019-08-08 주식회사 로킷헬스케어 진피 재생 시트용 바이오 잉크 조성물, 이를 이용한 맞춤형 진피 재생 시트의 제조방법, 및 상기 제조방법을 이용하여 제조된 맞춤형 진피 재생 시트
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KR102056144B1 (ko) 2018-03-08 2019-12-16 주식회사 파마리서치프로덕트 Dna 단편 혼합물이 고농도로 함유된 유동성을 갖는 액제 조성물 및 이의 제조방법
CN111836617A (zh) * 2018-03-08 2020-10-27 医药研究产品有限公司 以高浓度含有dna片段混合物且具有流动性的液剂组合物及其制备方法
EP3763357A4 (en) * 2018-03-08 2021-12-22 Pharmaresearch Products Co., Ltd. LIQUID COMPOSITION WITH HIGH CONCENTRATION OF DNA FRAGMENT MIXTURE AND WITH FLOWABILITY AND MANUFACTURING METHOD FOR IT
CN111836617B (zh) * 2018-03-08 2022-07-01 医药研究有限公司 以高浓度含有dna片段混合物且具有流动性的液剂组合物及其制备方法
KR20220092441A (ko) 2020-12-24 2022-07-01 주식회사 로킷헬스케어 조직 재생 패치의 제조방법

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