JP2013530729A - 再生組織足場の製造 - Google Patents

Abstract

組織または器官の欠損または損傷を治療または修復するための器具および方法を提供する。器具は、細胞組織マトリックスとポリマーから製造され、安定な三次元形状を有し、免疫反応または炎症反応をあまり惹起しない組織足場を含む。
【選択図】図１

Description

本願は、２０１０年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／３１７，４４３号明細書の優先権を主張する。

本開示は、組織欠損を治療するための組織足場を含む、組織または器官の欠損または損傷を治療するための器具および方法に関する。

組織を補強するまたは組織欠損を修復もしくは治療するための医療処置および外科処置には、現在、ヒトおよび動物由来材料ならびに合成材料が使用されている。特定の目的には、予め形成された安定な形状を有する材料が必要とされる。例えば、特定の骨欠損および軟組織欠損には、欠損部に適合し、所望の構造を有する組織の再生を可能にする安定な三次元構造の器具が必要とされる。しかし、組織または器官を修復または治療するための様々な器具および方法には、ある一定の欠点があった。

従って、安定性が向上し改善された医療用器具が必要とされている。

特定の実施形態では、組織足場の製造方法を提供する。本方法は、ポリマーを溶媒に溶解して溶液を調製するステップ；溶液を粒子状無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）と混合して混合物を調製するステップ；混合物を成形型に入れるステップ；混合物を乾燥させて安定な三次元形状を有する組織足場を形成するステップを含み、組織足場は、人体内に移植されたとき、ポリマー単独のものよりも免疫反応または炎症反応が少ない。

特定の実施形態では、組織足場を提供する。本組織足場は粒子状ＡＴＭとポリマーを含み、ＡＴＭはポリマーに被覆されて組織再生用の安定な三次元組織足場を形成しており、本組織足場は、人体内に移植されたとき、ポリマー単独のものよりも免疫反応または炎症反応が少ない。

特定の実施形態では、組織欠損の治療方法を提供する。本方法は、安定な三次元形状を有する組織足場を選択するステップであって、足場が粒子状ＡＴＭとポリマーを含み、ＡＴＭがポリマーに被覆されて組織再生用の安定な三次元組織足場を形成しているステップ；組織または器官の欠損を確認するステップ；および組織足場材料を欠損部に移植するステップを含む。

図１は、特定の実施形態による、欠損部への組織足場の移植を示す図である。 図２は、特定の実施形態による、組織足場の製造方法を示す流れ図である。 図３は、実施例２による、有機溶媒で処理したブタ無細胞真皮マトリックス（ｐＡＤＭ）の示差走査熱量計（ＤＳＣ）データのグラフである。 図４は、実施例２による、ポリマーの存在下におけるｐＡＤＭのＤＳＣデータのグラフである。 図５Ａは、実施例２に記載の方法による、ポリ−４−ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）を含む４週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。 図５Ｂは、実施例２に記載の方法による、ｐＡＤＭとＰ４ＨＢを含む４週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。 図５Ｃは、実施例２に記載の方法による、Ｐ４ＨＢを含む４週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。 図５Ｄは、実施例２に記載の方法による、ｐＡＤＭとＰ４ＨＢを含む４週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。 図６Ａは、実施例２に記載の方法による、Ｐ４ＨＢを含む１２週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。 図６Ｂは、実施例２に記載の方法による、ｐＡＤＭとＰ４ＨＢを含む１２週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。 図６Ｃは、実施例２に記載の方法による、Ｐ４ＨＢを含む１２週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。 図６Ｄは、実施例２に記載の方法による、ｐＡＤＭとＰ４ＨＢを含む１２週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。 図７Ａは、実施例２に記載の方法による、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を含む４週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。 図７Ｂは、実施例２に記載の方法による、ｐＡＤＭとＰＣＬを含む４週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。 図７Ｃは、実施例２に記載の方法による、ＰＣＬを含む４週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。 図７Ｄは、実施例２に記載の方法による、ｐＡＤＭとＰＣＬを含む４週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。 図８Ａは、実施例２に記載の方法による、ＰＣＬを含む１２週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。 図８Ｂは、実施例２に記載の方法による、ｐＡＤＭとＰＣＬを含む１２週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。 図８Ｃは、実施例２に記載の方法による、ＰＣＬを含む１２週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。 図８Ｄは、実施例２に記載の方法による、ｐＡＤＭとＰＣＬを含む１２週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。 図９Ａは、実施例２に記載の方法による、ヒアルロン酸ベンジルエステル（ＢＨＡ）を含む４週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。 図９Ｂは、実施例２に記載の方法による、ｐＡＤＭとＢＨＡを含む４週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。 図９Ｃは、実施例２に記載の方法による、ＢＨＡを含む４週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。 図９Ｄは、実施例２に記載の方法による、ｐＡＤＭとＢＨＡを含む４週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。 図１０Ａは、実施例２に記載の方法による、ＢＨＡを含む１２週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。 図１０Ｂは、実施例２に記載の方法による、ｐＡＤＭとＢＨＡを含む１２週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。 図１０Ｃは、実施例２に記載の方法による、ＢＨＡを含む１２週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。 図１０Ｄは、実施例２に記載の方法による、ｐＡＤＭとＢＨＡを含む１２週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。 図１１Ａは、実施例２に記載の方法による、キトサンとｐＡＤＭを含む４週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。 図１１Ｂは、実施例２に記載の方法による、キトサンとｐＡＤＭを含む８週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。 図１１Ｃは、実施例２に記載の方法による、キトサンとｐＡＤＭを含む４週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。 図１１Ｃは、実施例２に記載の方法による、キトサンとｐＡＤＭを含む８週の皮下外植片をヘマトキシリン・エオジン染色した顕微鏡写真（倍率４００倍）である。

本願では、単数の使用は、特記しない限り、複数を含むものとする。本願では、「ｏｒ」の使用は、特記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定的な意味を有するものではない。

本明細書で使用するセクションの見出しは、構成の目的で使用しているに過ぎず、記載の対象を限定するものと解釈すべきではない。特許、特許出願、記事、書籍、および論文を含む、本願に引用される文献または文献の一部は全て、参照によりあらゆる目的でその内容全体が本明細書に明示的に援用されるものとする。

前述の便益および利点は、一実施形態に関するものである場合もあれば、幾つかの実施形態に関するものである場合もあることを理解されたい。さらに、「１つ」のものに言及する場合、そのようなものの１つ以上に言及しているものと理解されたい。

本明細書に記載の方法のステップは、適宜、任意の適切な順番で行われても、または同時に行われてもよい。

前述の実施例のいずれかの態様を、適宜、記載されている他の実施例のいずれかの態様と組み合わせて、同等のまたは異なる特性を有し、同じまたは異なる問題に対処するさらに他の実施例を形成してもよい。

好ましい実施形態の前述の説明は単に例として記載されているに過ぎず、当業者により様々な変更が可能であることを理解されたい。上記の詳細な説明、実施例およびデータにより、本発明の例示的実施形態の構造および使用を完全に説明する。本発明の様々な実施形態をある程度詳細に、または１つ以上の個々の実施形態を参照して説明したが、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、開示される実施形態に多くの変更を行うことが可能である。

「無細胞組織マトリックス」という用語は、本明細書で使用する場合、一般に、細胞および／または細胞成分を実質的に含まない任意の組織マトリックスを指す。皮膚、皮膚の一部（例えば、真皮）、および他の組織（血管、心臓弁、筋膜、軟骨、骨、および神経結合組織など）を使用して、本開示の範囲に入る無細胞マトリックスを製造することができる。無細胞組織マトリックスが細胞および／または細胞成分を実質的に含まないかどうかを判定するために、無細胞組織マトリックスの試験または評価を行うことができる。例えば、処理された組織を光学顕微鏡で検査して、細胞（生細胞もしくは死細胞）および／または細胞成分が残存するかどうか判定することができる。さらに、特定のアッセイを使用して細胞または細胞成分の有無を確認することができる。例えば、ＤＮＡまたは他の核酸のアッセイを使用して、組織マトリックス内に残存する核物質を定量化することができる。一般に、残存するＤＮＡまたは他の核酸が存在しない場合、完全に脱細胞化されている（即ち、細胞および／または細胞成分が除去されている）ことを示していることになる。最後に、細胞特有の成分（例えば、表面抗原）を同定する他のアッセイを使用して、組織マトリックスが無細胞であるかどうかを判定することができる。

本開示は、組織または器官の欠損を治療する三次元組織足場を提供する。本組織足場は、組織再生を支援する生物学的能力を有するＡＴＭを含むことができる。幾つかの実施形態では、組織足場は細胞の侵入（ｉｎｇｒｏｗｔｈ）と分化を支援することができる。例えば、足場は、後述するように、組織の侵入、整形外科、歯周組織への用途、組織再構築、組織再建、形成外科、美容外科、および失われた組織の置換術に、例えば、腫瘤摘出術、耳下腺摘出術、または腫瘍切除に使用することができる。一実施形態では、組織足場は、線維芽細胞様細胞および血管の存在により実証されるように、再生組織反応を生じさせる。

さらに、組織足場は、後述するように、１種類以上のポリマー材料を含むことができる。特定の実施形態では、本開示の組織足場は、免疫反応または炎症反応を減弱または低減することによりポリマー成分の許容性を向上させることができる。本明細書で使用する場合、ポリマー成分は合成ポリマーおよび／または天然ポリマーを含むことができる。特定の実施形態では、組織足場中のポリマー材料は、ＡＴＭに安定な三次元構造を提供することができ、それによりインプラントの癒合性や生体適合性が向上する。本明細書で使用する場合、安定な三次元構造とは、静止状態のとき、所定の形状（例えば、移植部位に適合するように形成された形状）を維持する傾向がある材料を指すものと理解されたい。

様々な実施形態では、本開示の組織足場は、多くの異なる解剖学的部位の治療に使用することができる。様々な実施形態によれば、組織足場を幅広い用途に使用することができる。特定の例示的用途としては、吸収性ドレッシング材、皮膚再生（例えば、あらゆる種類の潰瘍および熱傷の治療のため）、神経再生、軟骨再生、結合組織再生または修復（例えば、腱／靭帯スリーブ）、骨再生、歯周組織への用途、創傷／フォームライニング、一体型の包帯ドレッシング材、植皮用支持体／基材、脈管再生、美容外科、金属および／またはポリマーインプラントコーティング（例えば、インプラントの癒合および生体適合性を向上させるため）、ならびに失われた組織の置換術（例えば、外傷、乳房減量術、乳房切除術、腫瘤摘出術、耳下腺摘出術、または腫瘍切除の後など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、吸収性ドレッシング材、皮膚再生、神経再生、軟骨再生、結合組織再生または修復、骨再生、歯周組織への用途、創傷／フォームライニング、一体型の包帯ドレッシング材、植皮用支持体／基材、脈管再生、美容外科、金属および／またはポリマーインプラントコーティング、ならびに失われた組織の置換術の少なくとも１つに使用される、粒子状無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）とポリマーを含む組織足場（ＡＴＭはポリマーに被覆されて組織再生用の安定な三次元組織足場を形成しており、組織足場は、人体内に移植されたとき、ポリマー単独のものよりも免疫反応または炎症反応が少ない）の使用。

本組織足場は、人体内に移植されたとき、１種類または複数種類のポリマーだけを使用して足場を製造した場合と比較して、惹起される免疫反応または炎症反応が少ない。幾つかの実施形態では、多くの方法を使用して宿主内での組織足場の効果を試験することができる。幾つかの実施形態では、移植された足場に対する免疫反応または炎症反応を測定することにより、宿主内での組織足場の効果を試験することができる。幾つかの実施形態では、多くの方法で、組織足場に対する免疫反応または炎症反応を測定することができる。幾つかの実施形態では、組織学的方法を使用して、免疫反応または炎症反応を測定することができる。例えば、後述するように、組織学的評価を行うために、外植された足場を染色して顕微鏡下で観察してもよい。幾つかの実施形態では、炎症細胞（例えば、白血球）の数を測定することにより、足場に対する免疫反応または炎症反応を実証することができる。幾つかの実施形態では、後述するように、炎症細胞の数の減少により、足場に対する免疫反応または炎症反応の減弱化を実証することができる。例えば、白血球、マクロファージ、および好中球を識別するように設計された免疫組織学的染色方法により炎症細胞を測定することができる。また、免疫組織学的染色方法を使用して、インターロイキン−１、ＴＮＦ−α、およびＴＧＦ−βを含む、炎症性サイトカインの有無を判定してもよい。一実施形態では、体内に移植されたときのポリマー材料の免疫反応を低減するためのＡＴＭの使用を提供する。ポリマー組織は、合成または天然ポリマーを含むことができる。

一実施形態では、再生組織反応を生じさせる組織足場を提供する。足場は、粒子状無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）とポリマーを含むことができ；ＡＴＭはポリマーに被覆されて組織再生用の安定な三次元組織足場を形成しており、組織足場は、人体内に移植されたとき、ポリマー単独のものよりも免疫反応または炎症反応が少ない。再生組織反応は、線維芽細胞様細胞および血管の存在により実証される。

様々な実施形態では、本開示の組織足場を使用して、広範囲の障害のいずれかを治療することができる。組織欠損は、例えば、先天性奇形、外傷、感染、および腫瘍切除を含む様々な医学的症状から生じることがある。従って、組織足場は、任意の軟組織の、例えば、身体の他の構造および器官を結合、支持または包囲する組織の欠損の修復に使用することができる。また、組織足場は、骨欠損の治療に、例えば、軟骨再生を支援する関節用移植片として使用することができる。軟組織は骨以外の任意の組織であってもよい。

組織足場は、多くの異なる器官系の軟組織の治療に使用することができる。これらの器官系としては、筋肉系、尿生殖器系、消化器系、外皮系、循環器系、および呼吸器系が挙げられるが、これらに限定されるものではない。組織足場は、また、胸壁および腹壁の結合組織（筋膜、即ち、筋肉、骨および関節を取り囲む特殊な層を含む）の治療に、ならびに泌尿器科、婦人科および消化器科の解剖学的構造の組織脆弱部の修復および補強にも使用される。

別の実施形態では、組織または器官の欠損は、皮膚、骨、軟骨、半月板、真皮、心筋、骨膜、動脈、静脈、胃、小腸、大腸、横隔膜、腱、靭帯、神経組織、横紋筋、平滑筋、膀胱、尿道、尿管、および歯肉からなる群から選択される。一実施形態では、皮膚、骨、軟骨、半月板、真皮、心筋、骨膜、動脈、静脈、胃、小腸、大腸、横隔膜、腱、靭帯、神経組織、横紋筋、平滑筋、膀胱、尿道、尿管、および歯肉の少なくとも１つの欠損の再生、修復、および／または置換術に使用される、粒子状無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）とポリマーを含む組織足場（ＡＴＭはポリマーに被覆されて組織再生用の安定な三次元組織足場を形成しており、組織足場は、人体内に移植されたとき、ポリマー単独のものよりも免疫反応または炎症反応が少ない）の使用。

例えば、図１は、特定の実施形態による、軟骨欠損部への組織足場の移植を示す。図示するように、組織足場１８０は、長骨５００（例えば、大腿骨または上腕骨）の軟骨欠損の治療に使用することができる。様々な実施形態では、足場１８０は、関節表面または任意の関節の軟骨５１０の治療に使用することができる。様々な実施形態では、組織足場１８０は、関節表面または軟骨５１０の欠損または切除領域に配置することができる。

前述のように、組織足場１８０はＡＴＭとポリマーを含む。幾つかの実施形態では、ＡＴＭは、２つの異なる組織供給源、例えば、軟骨１９０と脱灰骨２００からの組織を含む。幾つかの実施形態では、組織足場１８０は、他の組織または器官の欠損の修復に使用することができる。幾つかの実施形態では、組織足場１８０は真皮と軟骨を含んでもよい。幾つかの実施形態では、組織足場は軟骨１９０を含むが、脱灰骨２００は含まない。幾つかの実施形態では、組織足場材料１８０は脱灰骨２００を含むが、軟骨１９０は含まないものであってもよい。幾つかの実施形態では、組織足場１８０は、真皮を含んでもよい。

特定の実施形態では、組織足場の製造方法は、ポリマーを溶液に溶解するステップ；溶液を粒子状ＡＴＭと混合し、混合物を形成するステップ；ならびに、溶媒を除去することにより、組織足場を安定な三次元構造に成形および造形するステップを含む。

図２は、三次元組織足場の製造を示す。足場はＡＴＭを含むことができる（ステップ１００）。幾つかの実施形態では、ＡＴＭは、例えば、真皮、軟骨、骨、脱灰骨、血管、心臓弁、筋膜、または神経結合組織に由来するものであってもよい。幾つかの実施形態では、粒子状ＡＴＭはサイズの均質な粒子を含む。幾つかの実施形態では、粒子状ＡＴＭは真皮ＡＴＭを含む。幾つかの実施形態では、真皮ＡＴＭはヒト組織マトリックスである。幾つかの実施形態では、真皮ＡＴＭはブタ組織マトリックスである。幾つかの実施形態では、粒子状ＡＴＭは軟骨組織マトリックスであり、これはヒト軟骨に由来するものであってもよい。幾つかの実施形態では、軟骨組織マトリックスはブタ軟骨に由来する。幾つかの実施形態では、粒子状ＡＴＭは骨組織マトリックスを含む。幾つかの実施形態では、骨組織マトリックスはヒトの骨に由来する。幾つかの実施形態では、骨組織マトリックスはブタの骨に由来する。

様々な異なる生物学的および力学的特性が付与されるようにＡＴＭを選択することができる。例えば、マトリックスが移植される部位に通常見られる組織の再生が可能となるように組織の侵入および再構築を可能にするようにＡＴＭを選択することができる。例えば、軟骨上または軟骨の中に移植する場合、過剰な線維化または瘢痕形成が起こることなく軟骨の再生が可能になるようにＡＴＭを選択することができる。さらに、ＡＴＭは、過剰な炎症反応を惹起してはならず、最終的に元の宿主組織と類似の組織が形成されるように再構築されなければならない。幾つかの実施形態では、ＡＴＭはコラーゲン、エラスチン、および脈管チャネルを含む。特定の実施形態では、ＡＴＭはＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）またはＳｔｒａｔｔｉｃｅ（商標）（これらはそれぞれヒトおよびブタの無細胞真皮マトリックスである）を含んでもよい。このような材料の例は、米国特許第６，９３３，３２６号明細書および米国特許第７，３５８，２８４号明細書に記載されている。あるいは、後述するように、他の適した無細胞組織マトリックスを使用してもよい。

ＡＴＭを凍結粉砕することにより、粒子状ＡＴＭを製造することができる（ステップ１１０）。粒子状ＡＴＭは多くの異なる組織供給源に由来するものであってもよい。組織供給源は、例えば、真皮、軟骨、骨血管、心臓弁、筋膜、または神経結合組織に由来するものであってもよい。それらについては以下に詳述する。幾つかの実施形態では、２種類以上の異なる組織を使用して粒子状ＡＴＭを製造することができる。

さらに、組織足場は１種類以上のポリマー材料を含むことができる。幾つかの実施形態では、ポリマー材料は多くのポリマーから選択することができる。特定の実施形態では、ポリマーは、例えば、キトサン、ヒアルロン酸のベンジルエステル（ＢＨＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、またはポリ−４−ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）から選択することができる。幾つかの実施形態では、多くの溶媒から選択される、適した溶媒にポリマーを溶解してもよい（ステップ１２０）。幾つかの実施形態では、溶媒は、例えば、ジオキサン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ＤＭＳＯ、または酢酸から選択することができる。一実施形態では、ＰＣＬをジオキサンに溶解する。別の実施形態では、組織足場の製造に使用されるジオキサン溶媒またはＮＭＰ溶媒中のＰＣＬは、約５〜３０％（ｗ／ｖ）であってもよい。別の実施形態では、組織足場の製造に使用されるジオキサン溶媒またはＮＭＰ溶媒中のＰＣＬは、５％、８％、１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％、または３０％（ｗ／ｖ）、５％〜３０％（ｗ／ｖ）、１０％〜３０％（ｗ／ｖ）、およびその間の任意の値であってもよい。別の実施形態では、Ｐ４ＨＢをジオキサンまたはＮＭＰに溶解する。さらに別の実施形態では、組織足場の製造に使用されるジオキサン溶媒またはＮＭＰ溶媒中のＰ４ＨＢは、約５〜４０％（ｗ／ｖ）であってもよい。別の実施形態では、組織足場の製造に使用されるジオキサン溶媒またはＮＭＰ溶媒中のＰ４ＨＢは、５％、８％、１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％または４０％（ｗ／ｖ）、または５％〜４０％（ｗ／ｖ）、１０％〜３０％（ｗ／ｖ）、およびその間の任意の値であってもよい。別の実施形態では、ＢＨＡをＤＭＳＯに溶解する。さらに別の実施形態では、組織足場の製造に使用されるＤＭＳＯ中のＢＨＡは、約５〜５０％（ｗ／ｖ）であってもよい。別の実施形態では、組織足場の製造に使用されるＤＭＳＯ中のＢＨＡは、５％、８％、１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、４０％、または５０％（ｗ／ｖ）、５％〜５０％（ｗ／ｖ）、または１０％〜４０％（ｗ／ｖ）、およびその間の任意の値であってもよい。さらに別の実施形態では、キトサンを酢酸に溶解する。さらに別の実施形態では、酢酸濃度は、０．１〜０．５Ｍ（ｐＨ範囲２．５３〜２．８８）である。さらに別の実施形態では、キトサンと酢酸の混合物のｐＨは４．０〜５．５であってもよい。さらに別の実施形態では、組織足場の製造に使用される酢酸中のキトサンは、１％、２％、３％、４％、または５％（ｗ／ｖ）、およびその間の任意の値であってもよい。これらの足場材料はそれぞれ最終製品に異なる特性を付与することができ、ｉｎ ｖｉｖｏ代謝回転／維持、生体力学的特性、および全体的な生物学的反応の調節を可能にする。

ポリマー溶液を粒子状ＡＴＭと混合してもよい（ステップ１３０）。次いで、ＡＴＭとポリマー／溶媒の混合物を成形型または他の容器に入れまたは充填し、所望の三次元形状を形成する（ステップ１４０）。幾つかの実施形態では、成形型は多くの成形型から選択することができる。幾つかの実施形態では、成形型は、エッペンドルフ管、金属管、注入管、または、組織足場が修復のために設計される組織もしくは器官の欠損部の形態の成形型から選択することができる。

乾燥法により溶媒を除去することができる（ステップ１５０）。幾つかの実施形態では、多くの乾燥法により溶媒を除去することができる。幾つかの実施形態では、乾燥法は、凍結乾燥、空気乾燥、加熱乾燥、アルゴンもしくは窒素雰囲気中での乾燥、または真空補助乾燥から選択することができる。得られる組織足場は、ポリマー／合成支持体足場に被覆された再生組織粒子からなり、機械的応力がかかっても安定である。さらに、乾燥法は、溶媒が標準大気中に蒸発する受動的乾燥を含むことができる。

特定の実施形態では、組織足場の形状および安定性が重要である。幾つかの実施形態では、得られる組織足場の所望のまたは実施される形状およびサイズは、足場の製造に使用される成形型の形状とサイズによって決まる。幾つかの実施形態では、組織足場の所望のまたは実施される形状は、安定な三次元形状である。幾つかの実施形態では、安定な三次元組織足場の製造に使用される成形型は、エッペンドルフ管、金属管、注入管、または、組織足場が移植される組織もしくは器官の欠損部の形態の成形型であってもよい。幾つかの実施形態では、組織足場は円筒状の形状である。幾つかの実施形態では、組織足場は管状の形状である。幾つかの実施形態では、組織足場の形状は組織または器官の欠損または損傷の形状に対応する。幾つかの実施形態では、機械的強度、空隙率、水和、および流体コンダクタンスは、凍結速度、凍結温度、および成形容器の構成を調整することにより調整される。

幾つかの実施形態では、組織足場は、組織または器官の欠損の形状に対応できるようなサイズまたは形状に作られる。幾つかの実施形態では、組織足場は、２種類以上の異なる組織を使用して製造されてもよい。例えば、組織足場中の組織の１つは軟骨であってもよく、第２の組織は脱灰骨であってもよい。幾つかの実施形態では、軟骨／脱灰骨足場を骨軟骨欠損の修復に使用してもよい（図１）。

無細胞組織マトリックス
「無細胞組織マトリックス」という用語は、本明細書で使用する場合、一般に、細胞および／または細胞成分を実質的に含まない任意の組織マトリックスを指す。皮膚、皮膚の一部（例えば、真皮）、および他の組織（血管、心臓弁、筋膜、軟骨、骨、および神経結合組織など）を使用して、本開示の範囲に入る無細胞マトリックスを製造してもよい。無細胞組織マトリックスが細胞および／または細胞成分を実質的に含まないかどうかを判定するために、多くの方法で無細胞組織マトリックスの試験または評価を行うことができる。例えば、処理された組織を光学顕微鏡で検査し、細胞（生細胞もしくは死細胞）および／または細胞成分が残存するかどうか判定することができる。さらに、特定のアッセイを使用して細胞または細胞成分の有無を確認することができる。例えば、ＤＮＡまたは他の核酸のアッセイを使用して、組織マトリックス内に残存する核物質を定量化することができる。一般に、残存するＤＮＡまたは他の核酸が存在しない場合、完全に脱細胞化されている（即ち、細胞および／または細胞成分が除去されている）ことを示していることになる。最後に、細胞特有の成分（例えば、表面抗原）を同定する他のアッセイを使用して、組織マトリックスが無細胞であるかどうかを判定することができる。皮膚、皮膚の一部（例えば、真皮）および他の組織（血管、心臓弁、筋膜、軟骨、骨、および神経結合組織など）を使用して、本開示の範囲に入る無細胞マトリックスを製造してもよい。

一般に、ＡＴＭの製造に必要なステップには、ドナー（例えば、ヒトの死体または動物源）から組織を採取するステップと、生物学的および構造的機能が維持される条件下で細胞を除去するステップが含まれる。例えば、所望の生物学的および構造的機能としては、細胞侵入および組織再生を支援する能力、（例えば、手術部位または欠損部を）機械的に支持する能力、過剰な免疫反応、炎症、線維化および／または瘢痕化を防止する能力が挙げられる。特定の実施形態では、本方法には、組織を安定化させ、細胞除去と共にまたは細胞除去の前に生化学的および構造的分解が起こることを回避するための化学処理が含まれる。様々な実施形態において、安定化溶液は、浸透圧性、低酸素性、自己分解性およびタンパク質分解性の分解を抑制および防止し、微生物汚染から保護し、例えば、平滑筋成分（例えば、血管）を含有する組織で起こり得る機械的損傷を低減する。安定化溶液は、適切な緩衝液、１種類以上の酸化防止剤、１種類以上の膠質浸透圧剤（ｏｎｃｏｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）、１種類以上の抗生物質、１種類以上のプロテアーゼ阻害剤、および／または１種類以上の平滑筋弛緩剤を含有してもよい。

次いで、組織を脱細胞化溶液に入れ、コラーゲンマトリックスの生物学的および構造的完全性を損なわないように、構造的マトリックスから生細胞（例えば、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞）を除去する。コラーゲンマトリックスの完全性は、多くの方法で試験することができる。例えば、示差走査熱量計を使用して、架橋（転移温度の上昇）またはコラーゲン分解（転移温度の低下）を示す熱的転移温度の変化を確認することができる。さらに、電子顕微鏡で正常なコラーゲンパターンの変化を実証することができ、酵素消化アッセイでコラーゲンの損傷を実証することができる。さらに、様々なグリコサミノグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸およびヒアルロン酸）の損失は、組織マトリックスの望ましくない変化を示している可能性がある。

脱細胞化溶液は、適切な緩衝液、塩、抗生物質、１種類以上の界面活性剤（例えば、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（商標）、デオキシコール酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、架橋を防止する１種類以上の薬剤、１種類以上のプロテアーゼ阻害剤、および／または１種類以上の酵素を含有してもよい。適したＡＴＭ製造方法は、例えば、Ｈ．Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｐｏｒｃｉｎｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｒｍａｌ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｔｈａｔ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ Ｓｏｆｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｇａｌａｃｔｏｓｅ−α−（１，３）−Ｇａｌａｃｔｏｓｅ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．Ｐａｒｔ Ａ １５：１８０７（２００９）に記載されている。

脱細胞化工程の後、組織サンプルを生理食塩水で十分に洗浄する。幾つかの例示的実施形態では、例えば、異種間材料を使用する場合、脱細胞化した組織を終夜、室温にてデオキシリノヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）溶液で処理する。幾つかの実施形態では、組織サンプルをＤＮアーゼ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、２０ｍＭ ＣａＣｌ_２および２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中で調製されたＤＮアーゼ溶液で処理する。任意選択により、抗生物質溶液（例えば、ゲンタマイシン）をＤＮアーゼ溶液に添加してもよい。緩衝液が適切なＤＮアーゼ活性を付与する限り、任意の適した緩衝液を使用してもよい。

ＡＴＭは組織足場のレシピエントと同種の１つ以上の個体から製造されてもよいが、必ずしもこのように製造されるわけではない。従って、例えば、組織足場中のＡＴＭは、ブタ組織から製造されてもよい。ＡＴＭのレシピエント、およびＡＴＭを製造するための組織または器官のドナーの役割を果たすことができる種としては、ヒト、ヒト以外の霊長類（例えば、サル、ヒヒ、またはチンパンジー）、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ラット、またはマウスなどの哺乳類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

コラーゲン含有材料からα−ｇａｌエピトープを除去すると、コラーゲン含有材料に対する免疫反応を低下させることができる。α−ｇａｌエピトープは、霊長類以外の哺乳類および新世界ザル（南米のサル）の細胞外成分である糖タンパク質などの高分子に発現する。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１７７５５（１９８８）。しかし、このエピトープは、旧世界霊長類（アジアやアフリカのサル、および類人猿）およびヒトには存在しない。抗ｇａｌ抗体は、ヒトおよび霊長類では、腸内細菌のα−ｇａｌエピトープ糖鎖構造に対する免疫反応の結果として産生される。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５６：１７３０（１９８８）；Ｒ．Ｍ．Ｈａｍａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１２２３（１９９２）。

霊長類以外の哺乳類（例えば、ブタ）は、α−ｇａｌエピトープを産生するため、コラーゲン含有材料をこれらの哺乳類から霊長類に異種移植すると、コラーゲン含有材料上のこれらのエピトープに霊長類の抗α−Ｇａｌが結合するため、拒絶が起こることが多い。結合の結果、補体結合により、および抗体依存性細胞障害によりコラーゲン含有材料が破壊される。Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １４：４８０（１９９３）；Ｍ．Ｓａｎｄｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１３９１（１９９３）；Ｈ．Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２４：５５９（１９９２）；Ｂ．Ｈ．Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５００（１９９５）。さらに、異種移植の結果、免疫系の著しい活性化が起こり、多量の高親和性抗ｇａｌ抗体が産生される。従って、幾つかの実施形態では、α−ｇａｌエピトープを産生する動物を組織源として使用する場合、細胞から、およびコラーゲン含有材料の細胞外成分からα−ｇａｌエピトープを実質的に除去すること、ならびに細胞α−ｇａｌエピトープの再発現を防止することにより、α−ｇａｌエピトープへの抗ｇａｌ抗体の結合に伴うコラーゲン含有材料に対する免疫反応を低下させることができる。

α−ｇａｌエピトープを除去するため、組織を生理食塩水で十分に洗浄してＤＮアーゼ溶液を除去した後、組織サンプル中に特定の免疫原性抗原が存在する場合、それを除去するために、組織サンプルに１つ以上の酵素処理を施してもよい。一実施形態では、組織サンプル中にα−ｇａｌエピトープが存在する場合、それを除去するために、組織サンプルをα−ガラクトシダーゼ酵素で処理してもよい。幾つかの実施形態では、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で調製された３００Ｕ／Ｌの濃度のα−ガラクトシダーゼで組織サンプルを処理する。他の実施形態では、採取した組織からα−ｇａｌエピトープを十分除去するために、α−ガラクトシダーゼの濃度を４００Ｕ／Ｌまで増加させる。抗原の十分な除去が達成される限り、任意の適した酵素濃度および緩衝液を使用してもよい。

あるいは、組織を酵素で処理するのではなく、１つ以上の抗原性エピトープが欠損するように遺伝子操作された動物を組織源として選択してもよい。例えば、末端α−ガラクトース部分が欠損するように遺伝子操作された動物（例えば、ブタ）を組織源として選択してもよい。適切な動物の説明については、同時係属中の米国特許出願第１０／８９６，５９４号明細書および米国特許第６，１６６，２８８号明細書を参照されたい（これらの開示は、その内容全体が参照により本明細書に援用される）。さらに、α−１，３−ガラクトース部分が減量または欠損しているまたはしていない、無細胞マトリックスを製造するための特定の例示的組織処理方法が、Ｘｕ，Ｈｕｉ．ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｐｏｒｃｉｎｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｒｍａｌ Ｓｃａｆｆｏｌｄ ｔｈａｔ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ Ｓｏｆｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｇａｌａｃｔｏｓｅ−α−（１，３）−Ｇａｌａｃｔｏｓｅ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，”Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１５，１−１３（２００９）に記載されており、この文献は参照により本明細書に援用される。

ＡＴＭを形成した後、任意選択により組織適合性生細胞をＡＴＭ中に播種して移植片を製造してもよく、それはさらに宿主により再構築され得る。幾つかの実施形態では、移植前に標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞共培養法により、または移植後にｉｎ ｖｉｖｏ再増殖により組織適合性生細胞をマトリックスに添加してもよい。ｉｎ ｖｉｖｏ再増殖は、ＡＴＭ中に移動するレシピエント自身の細胞で行っても、またはレシピエントから得られた細胞もしくは別のドナーからの組織適合性細胞をＡＴＭ中にｉｎ ｓｉｔｕで注入もしくは注射することにより行ってもよい。胚性幹細胞、成人幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）、および／または神経細胞を含む様々な種類の細胞を使用することができる。様々な実施形態で、これらの細胞を移植直前または移植後にＡＴＭの内部に直接付着させてもよい。特定の実施形態では、移植前に、移植されるＡＴＭ内に細胞を配置し、培養してもよい。一実施形態では、移植前に生細胞を組織足場に添加する。一実施形態では、組織足場を所望の解剖学的部位に移植した後、生細胞を組織足場に添加する。

粒子状無細胞組織マトリックス
以下の手順を使用し、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）、ＳＴＲＡＴＴＩＣＥ（商標）（ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ））または他の適した無細胞組織マトリックスを使用して、粒子状無細胞組織マトリックスを製造することができる。包装から取り出した後、途切れのない「連続」回転刃（ｃｕｔｔｉｎｇ ｗｈｅｅｌ）を備えたＺｉｍｍｅｒ ｍｅｓｈｅｒを使用して、ＡＴＭを細長く切断する。得られたＡＴＭの細長片を長さ約１ｃｍ〜約２ｃｍの長さに切断する。

ＯＭＮＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｗａｒｒｅｎｔｏｎ，Ｖａ）から入手可能なＬａｂ Ｔｅｃｋ Ｍａｃｒｏ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒなどの、ホモジナイザーと滅菌したホモジナイザープローブを組み立てて、ホモジナイザータワーに注がれる滅菌液体窒素を使用して極低温に冷却する。ホモジナイザーが極低温に達した後、前述のように予め細片に製造したＡＴＭを、滅菌液体窒素が入っているホモジナイジングタワーに加える。次いで、ホモジナイザーを作動させてＡＴＭの細片を凍結破砕する。凍結破砕ステップの回数および持続時間は使用するホモジナーザー、ホモジナイジングチャンバのサイズ、ホモジナーザーの運転速度および回数に依存し、当業者は所望の結果が達成されるようにパラメータを簡単に変化させることによりそれを決定することができるはずである。

凍結破砕された粒子状ＡＴＭ材料は、ホモジナイザーの生成物を液体窒素と共に、同様に液体窒素温度に冷却された一連の金属篩で篩分けすることにより、粒度選別される。前述の種類のホモジナイジングタワー内で篩の組み合わせを使用し、まず過大粒子を排除した後、過小粒子を排除するように粒子を篩分けおよび選別することがとりわけ有用であることが分かった。

単離後、粒子状ＡＴＭを取り出し、滅菌液体窒素が蒸発した後、バイアルに入れて凍結乾燥させる。この最後のステップは、上記手順中に吸収された可能性のある残留水分を確実に除去するために行う。

最終生成物は、粒度約１ミクロン〜約９００ミクロン、または粒度約３０ミクロン〜約７５０ミクロンの粉末であってもよい。粒子は、約１５０〜３００ミクロンを平均値として分布する。材料は、通常生理食塩水または他の類似の適した再水和剤に懸濁することにより容易に再水和される。再水和されたＡＴＭは、通常生理食塩水または他の薬学的に適合性のある任意の適した担体に再懸濁されてもよい。

以下の実施例は、様々な実施形態をさらによく説明するために記載するものであり、決して本開示の範囲を限定するものと解釈すべきではない。

実施例１．再生組織足場の製造
図２は、合成ＡＴＭ再生組織足場の製造方法を示す。三次元再生組織足場は、ポリマー足場材料を使用して粒子状ＡＴＭから製造した。ＡＴＭはブタ真皮組織から製造し、凍結乾燥した。乾燥ＡＴＭを約１ｃｍ^２片に切断し、適切なサイズの凍結粉砕機用バイアルに入れた。次いで、液体窒素で予め冷却したＳＰＥＸ６８００フリーザーミルにバイアルを入れ、凍結破砕プロトコルを実施した。次いで、粒子状ＡＴＭをバイアルから取り出し、乾燥貯蔵条件で維持した。

ヒアルロン酸の１００％ベンジルエステル誘導体を４０％（ｗ／ｖ）の濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に可溶化した。次いで、この溶液１ｍｌを上記で製造した粒子状無細胞真皮マトリックス３００ｍｇと混合し、混合物を小型の２ｍｌエッペンドルフ管に移した。次いで、ＤＭＳＯを凍結乾燥法により除去すると、組織足場（ベンジルエステルヒアルロン酸４０重量％、無細胞真皮マトリックス６０重量％）が残り、これは、それが乾燥時に入っていたエッペンドルフ管（円筒状）の形態を保持した（ステップ１５０）。

実施例２．組織足場の機能試験
組織マトリックスの完全性に対する有機溶媒の影響の熱量測定分析
ｉｎ ｖｉｖｏでの結果から、炎症細胞の数が減少することによって実証されるように、再生組織マトリックスが存在すると足場材料に対する免疫反応または炎症反応が減弱することが示唆された。

実施例１に記載のように製造したｐＡＴＭを、ジオキサン、ＮＭＰ、およびＤＭＳＯを含む過剰の異なる溶媒で２時間処理した。処理した材料を示差走査熱量計（ＤＳＣ）で評価し、組織マトリックスの完全性を評価した。図３は、有機溶媒で処理したブタ無細胞真皮マトリックス（ｐＡＤＭ）のＤＳＣデータのグラフである。

同様に、ｐＡＤＭを異なるポリマー、例えば、ポリ−４−ヒドロキシブチレートのジオキサン溶液またはＮＭＰ溶液、およびポリカプロラクトンのジオキサン溶液またはＮＭＰ溶液で処理し、ＤＳＣで組織マトリックスの完全性を評価した。図４は、実施例２による、ポリマーの存在下におけるｐＡＤＭのＤＳＣデータのグラフである。ＤＳＣ分析（図４）から、ポリマーとｐＡＤＭのサーモグラムは相加的であることが分かった。

組織学的評価
ｐＡＤＭの移植の効果をポリ−４−ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）の存在下にて皮下免疫適格ラットモデルで試験した。免疫適格ラットにｐＡＤＭ／Ｐ４ＨＢ組織足場またはＰ４ＨＢポリマー足場を移植した。このモデルで、移植した試験材料に対する細胞反応および免疫学的反応の測定を行った。試験材料は免疫適格ラット（シチロウネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）；ルイスラット（Ｌｅｗｉｓ Ｒａｔ））の背面の小さい切開を通して皮下部位に移植した。移植の４週後（図５Ａ〜Ｄ）および１２週後（図６Ａ〜Ｄ）に、外植片を回収してＰＢＳで洗浄し、１０％ホルマリンで固定した。固定した組織をパラフィンに包埋し、組織マトリックスサンプルの切片を標準的な手順を使用してヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。Ｄ．Ｃ．Ｓｈｅｅｎ ａｎｄ Ｂ．Ｂ．Ｈｒａｐｃｈａｋ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｎ．，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ，Ｂａｔｔｅｌｌｅ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）。次いで、サンプルを顕微鏡で１００倍の倍率（図５Ａ〜Ｂおよび図６Ａ〜Ｂ）と４００倍の倍率（図５Ｃ〜Ｄおよび図６Ｃ〜Ｄ）で観察した。外植体の組織学的分析（図５Ａ〜Ｄおよび図６Ａ〜Ｄ）から、Ｐ４ＨＢはｐＡＤＭが存在すると、Ｐ４ＨＢ単独の外植体と比較して炎症反応が減弱することが分かった。

図７Ａ〜Ｄおよび図８Ａ〜Ｄは、４週および１２週のポリカプロラクトン外植体の組織学的評価を示す。ｐＡＤＭの移植の効果をポリカプロラクトン（ＰＣＬ）の存在下にて皮下免疫適格ラットモデルで試験した。免疫適格ラットにｐＡＤＭ／ＰＣＬ足場またはＰＣＬポリマー足場を移植した。移植の４週後（図７Ａ〜Ｄ）および１２週後（図８Ａ〜Ｄ）に、外植片を回収し、前述のように組織学的評価を行うための処理を行った。次いで、サンプルを顕微鏡で１００倍の倍率（図７Ａ〜Ｂおよび図８Ａ〜Ｂ）と４００倍の倍率（図７Ｃ〜Ｄおよび図８Ｃ〜Ｄ）で観察した。外植体の組織学的分析（図７Ａ〜Ｄおよび図８Ａ〜Ｄ）から、ＰＣＬはｐＡＤＭが存在すると、ＰＣＬ単独の外植体と比較して炎症反応が減弱することが分かった。

図９Ａ〜Ｄおよび図１０Ａ〜Ｄは、４週および１２週のヒアルロン酸ベンジルエステル（ＢＨＡ）外植体の組織学的評価を示す。ｐＡＤＭの移植の効果をＢＨＡの存在下にて皮下免疫適格ラットモデルで試験した。免疫適格ラットにｐＡＤＭ／ＢＨＡ足場またはＢＨＡポリマー足場を移植した。移植の４週後（図９Ａ〜Ｄ）および１２週後（図１０Ａ〜Ｄ）に、外植片を回収し、前述のように組織学的評価を行うための処理を行った。次いで、サンプルを顕微鏡で１００倍の倍率（図９Ａ〜Ｂおよび図１０Ａ〜Ｂ）と４００倍の倍率（図９Ｃ〜Ｄおよび図１０Ｃ〜Ｄ）で観察した。外植体の組織学的分析（図９Ａ〜Ｄおよび図１０Ａ〜Ｄ）から、ＢＨＡはｐＡＤＭが存在すると、ＢＨＡ単独の外植体と比較して炎症反応が減弱することが分かった。

図１１Ａ〜Ｄは、４週および８週のキトサン／ｐＡＤＭ外植体の組織学的評価を示す。ｐＡＤＭの移植の効果をキトサンの存在下にて皮下免疫適格ラットモデルで試験した。免疫適格ラットにｐＡＤＭ／キトサン足場を移植した。移植の４週後（図１１Ａ、Ｃ）および８週後（図１１Ｂ、Ｄ）に、外植片を回収し、前述のように組織学的評価のための処理を行った。次いで、サンプルを顕微鏡で１００倍の倍率（図１１Ａ〜Ｂ）と４００倍の倍率（図１１Ｃ〜Ｄ）で観察した。その結果から、線維芽細胞様細胞と血管の存在によって実証されるように、再生組織反応が生じることが分かった。

前述のように再生組織マトリックスを安定な三次元構造に成形および造形することができるため、広範囲の再生医療用途に使用できる新規な製品を開発することが可能となる。これらの足場材料はそれぞれ最終製品に異なる特性を付与することができ、ｉｎ ｖｉｖｏ代謝回転／維持、生体力学的特性、および全体的な生物学的反応の調節を可能にする。さらに、上記に示したように、再生組織マトリックス成分は、足場材料に対する全体的な炎症反応を低減／減弱する。

Claims (74)

1. 組織足場の製造方法において、
   ポリマーを溶媒に溶解して溶液を調製するステップ；
   前記溶液を粒子状無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）と混合して混合物を調製するステップ；
   前記混合物を成形型に入れるステップ；および
   前記混合物を乾燥させて安定な三次元形状を有する組織足場を形成するステップ；
   を含み、前記組織足場は、人体内に移植されたとき、前記ポリマー単独のものよりも免疫反応または炎症反応が少ないことを特徴とする方法。
2. 請求項１に記載の方法において、前記ポリマーがポリカプロラクトンを含むことを特徴とする方法。
3. 請求項２に記載の方法において、前記溶媒がジオキサンを含むことを特徴とする方法。
4. 請求項２に記載の方法において、前記溶媒がＮ−メチル−２−ピロリドンを含むことを特徴とする方法。
5. 請求項２に記載の方法において、前記ポリカプロラクトンが溶媒中に約５〜３０％（Ｗ／ｖ）の範囲の量で存在することを特徴とする方法。
6. 請求項２に記載の方法において、前記ポリカプロラクトンが溶媒中に約１０〜３０％（Ｗ／ｖ）の範囲の量で存在することを特徴とする方法。
7. 請求項１に記載の方法において、前記ポリマーがポリ−４−ヒドロキシブチレートであることを特徴とする方法。
8. 請求項７に記載の方法において、前記溶媒がジオキサンを含むことを特徴とする方法。
9. 請求項７に記載の方法において、前記溶媒がＮ−メチル−２−ピロリドンを含むことを特徴とする方法。
10. 請求項７に記載の方法において、前記ポリ−４−ヒドロキシブチレートが溶媒中に約５〜４０％（Ｗ／ｖ）の範囲の量で存在することを特徴とする方法。
11. 請求項７に記載の方法において、前記ポリ−４−ヒドロキシブチレートが溶媒中に約１０〜３０％（Ｗ／ｖ）の範囲の量で存在することを特徴とする方法。
12. 請求項１に記載の方法において、前記ポリマーがヒアルロン酸のベンジルエステル誘導体を含むことを特徴とする方法。
13. 請求項１２に記載の方法において、前記溶媒がＤＭＳＯを含むことを特徴とする方法。
14. 請求項１２に記載の方法において、前記ヒアルロン酸のベンジルエステル誘導体が溶媒中に約５〜５０％（Ｗ／ｖ）の範囲の量で存在することを特徴とする方法。
15. 請求項１２に記載の方法において、前記ヒアルロン酸のベンジルエステル誘導体が溶媒中に約１０〜４０％（Ｗ／ｖ）の範囲の量で存在することを特徴とする方法。
16. 請求項１に記載の方法において、前記ポリマーがキトサンを含むことを特徴とする方法。
17. 請求項１６に記載の方法において、前記溶媒が酢酸を含むことを特徴とする方法。
18. 請求項１７に記載の方法において、前記酢酸が０．１〜０．５Ｍであることを特徴とする方法。
19. 請求項１６に記載の方法において、前記キトサンが約１〜５％（ｗ／ｖ）の範囲の量で存在することを特徴とする方法。
20. 請求項１に記載の方法において、前記粒子状ＡＴＭが均一なサイズの粒子を含むことを特徴とする方法。
21. 請求項１に記載の方法において、前記粒子状ＡＴＭが真皮ＡＴＭを含むことを特徴とする方法。
22. 請求項２１に記載の方法において、前記真皮ＡＴＭがヒト組織マトリックスであることを特徴とする方法。
23. 請求項２１に記載の方法において、前記真皮ＡＴＭがブタ組織マトリックスであることを特徴とする方法。
24. 請求項１に記載の方法において、前記粒子状ＡＴＭが軟骨組織マトリックスであることを特徴とする方法。
25. 請求項２４に記載の方法において、前記軟骨組織マトリックスがヒト軟骨マトリックスを含むことを特徴とする方法。
26. 請求項２４に記載の方法において、前記軟骨組織マトリックスがブタ軟骨マトリックスを含むことを特徴とする方法。
27. 請求項１に記載の方法において、前記粒子状ＡＴＭが骨組織マトリックスを含むことを特徴とする方法。
28. 請求項２７に記載の方法において、前記骨組織マトリックスがヒト骨を含むことを特徴とする方法。
29. 請求項２７に記載の方法において、前記骨組織マトリックスがブタ骨を含むことを特徴とする方法。
30. 請求項１に記載の方法において、前記混合物を成形型に入れるステップが、射出成形を含むことを特徴とする方法。
31. 請求項１に記載の方法において、前記粒子状ＡＴＭが２種類以上の異なる組織からのＡＴＭを含むことを特徴とする方法。
32. 請求項３１に記載の方法において、前記２種類以上の異なる組織が真皮と軟骨を含むことを特徴とする方法。
33. 請求項３１に記載の方法において、前記２種類以上の異なる組織が軟骨と骨を含むことを特徴とする方法。
34. 請求項３１に記載の方法において、前記２種類以上の異なる組織がヒト組織マトリックスを含むことを特徴とする方法。
35. 請求項３１に記載の方法において、前記２種類以上の異なる組織がブタ組織マトリックスを含むことを特徴とする方法。
36. 請求項３１に記載の方法において、前記２種類以上の異なる組織がヒト組織マトリックスとブタ組織マトリックスを含むことを特徴とする方法。
37. 粒子状無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）と；
    ポリマーと；
    を含む組織足場において、前記ＡＴＭが前記ポリマーに被覆されて組織再生用の安定な三次元組織足場を形成しており、人体内に移植されたとき、前記ポリマー単独のものよりも免疫反応または炎症反応が少ないことを特徴とする組織足場。
38. 請求項３７に記載の組織足場において、前記ポリマーが合成ポリマーを含むことを特徴とする組織足場。
39. 請求項３７に記載の組織足場において、前記ポリマーがポリカプロラクトンを含むことを特徴とする組織足場。
40. 請求項３７に記載の組織足場において、前記ポリマーがポリ−４−ヒドロキシブチレートであることを特徴とする組織足場。
41. 請求項３７に記載の組織足場おいて、前記ポリマーがヒアルロン酸のベンジルエステル誘導体を含むことを特徴とする組織足場。
42. 請求項３７に記載の組織足場おいて、前記ポリマーがキトサンを含むことを特徴とする組織足場。
43. 請求項３７に記載の組織足場おいて、前記粒子状ＡＴＭが真皮ＡＴＭを含むことを特徴とする組織足場。
44. 請求項４３に記載の組織足場おいて、前記真皮ＡＴＭがヒト組織マトリックスであることを特徴とする組織足場。
45. 請求項４３に記載の組織足場おいて、前記真皮ＡＴＭがブタ組織マトリックスであることを特徴とする組織足場。
46. 請求項３７に記載の組織足場おいて、前記ＡＴＭが軟骨組織マトリックスであることを特徴とする組織足場。
47. 請求項４６に記載の組織足場おいて、前記軟骨組織マトリックスがヒト軟骨を含むことを特徴とする組織足場。
48. 請求項４６に記載の組織足場おいて、前記軟骨組織マトリックスがブタ軟骨を含むことを特徴とする組織足場。
49. 請求項３７に記載の組織足場おいて、前記ＡＴＭが骨組織マトリックスであることを特徴とする組織足場。
50. 請求項４９に記載の組織足場おいて、前記骨組織マトリックスがヒト骨を含むことを特徴とする組織足場。
51. 請求項４９に記載の組織足場おいて、前記骨組織マトリックスがブタ骨を含むことを特徴とする組織足場。
52. （ａ）安定な三次元形状を有する組織足場を選択するステップにおいて、前記組織足場が：
    （ｉ）粒子状無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）と；
    （ｉｉ）ポリマーと；
    を含み、前記ＡＴＭが前記ポリマーに被覆されて組織再生用の安定な三次元組織足場を形成しており、前記組織足場は、人体内に移植されたとき、前記ポリマー単独のものよりも免疫反応または炎症反応が少ないステップ；
    （ｂ）組織または器官の欠損を確認するステップ；および
    （ｃ）前記組織足場を前記欠損部に移植するステップ；
    を含むことを特徴とする治療方法。
53. 請求項５２に記載の方法において、前記欠損が骨の欠損であることを特徴とする方法。
54. 請求項５２に記載の方法において、前記欠損が軟骨組織の欠損であることを特徴とする方法。
55. 請求項５２に記載の方法において、前記欠損が乳房組織の欠損であることを特徴とする方法。
56. 請求項３７に記載の組織足場の使用において、骨、軟骨、および乳房から選択される組織の欠損を治療するためのものであることを特徴とする、使用。
57. 請求項１の方法により製造された再生組織足場。
58. 組織足場の製造方法において、
    ポリマーを溶媒に溶解して溶液を調製するステップ；
    前記溶液を粒子状無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）と混合して混合物を調製するステップ；
    前記混合物を成形型に入れるステップ；および
    前記混合物を乾燥させて安定な三次元形状を有する組織足場を形成するステップ；
    を含み、前記組織足場は、人体内に移植されたとき、前記ポリマー単独のものよりも免疫反応または炎症反応が少ないことを特徴とする方法。
59. 請求項５８に記載の方法において、前記溶媒がジオキサン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ＤＭＳＯまたは酢酸を含むことを特徴とする方法。
60. 請求項５８または５９に記載の方法において、前記溶媒が５〜５０％（ｗ／ｖ）の範囲の量で存在することを特徴とする方法。
61. 請求項５８乃至６０の何れか１項に記載の方法において、前記粒子状ＡＴＭが真皮ＡＴＭ、軟骨組織マトリックスまたは骨組織マトリックス、またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする方法。
62. 請求項５８乃至６１の何れか１項に記載の方法において、前記マトリックスがヒト組織マトリックスおよびブタ組織マトリックス、またはこれらの組み合わせから選択されることを特徴とする方法。
63. 請求項５８乃至６２の何れか１項に記載の方法において、前記混合物を成形型に入れるステップが射出成形を含むことを特徴とする方法。
64. 粒子状無細胞組織マトリックス（ＡＴＭ）と；
    ポリマーと；
    を含む組織足場において、
    前記ＡＴＭが前記ポリマーに被覆されて組織再生用の安定な三次元組織足場を形成しており、人体内に移植されたとき、前記ポリマー単独のものよりも免疫反応または炎症反応が少ないことを特徴とする組織足場。
65. 請求項５８乃至６４の何れか１項に記載の組織足場または方法において、前記ポリマーがポリカプロラクトン、ポリ−４−ヒドロキシブチレート、ヒアルロン酸のベンジルエステル誘導体またはキトサン、またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする組織足場または方法。
66. 請求項５８乃至６５の何れか１項に記載の組織足場または方法において、前記粒子状ＡＴＭが真皮ＡＴＭ、軟骨組織マトリックスまたは骨組織マトリックス、またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする組織足場または方法。
67. 請求項５８乃至６６の何れか１項に記載の組織足場または方法において、前記マトリックスがヒト組織マトリックスおよびブタ組織マトリックスまたはこれらの組み合わせから選択されることを特徴とする組織足場または方法。
68. 請求項５８乃至６７の何れか１項に記載の組織足場または方法において、前記粒子状ＡＴＭが、真皮と軟骨、または軟骨と骨などの２種類以上の異なる組織からのＡＴＭを含むことを特徴とする組織足場または方法。
69. 請求項５８乃至６８の何れか１項に記載の方法において、前記粒子状ＡＴＭが均一なサイズの粒子を含むことを特徴とする方法。
70. 請求項５８乃至６９の何れか１項に記載の組織足場において、骨、軟骨、および乳房から選択される組織の欠損の治療に使用されることを特徴とする組織足場。
71. 請求項６４乃至７０の何れか１項に記載の組織足場において、吸収性ドレッシング材、皮膚再生、神経再生、軟骨再生、結合組織再生または修復、骨再生、歯周組織への用途、創傷／フォームライニング、一体型の包帯ドレッシング材、植皮用支持体／基材、脈管再生、美容外科、金属および／またはポリマーインプラントコーティング、ならびに失われた組織の置換術の１つ以上に使用されることを特徴とする組織足場。
72. 請求項５８乃至６３の何れか１項に記載の方法により得られるまたは得ることができる再生組織足場。
73. 解剖学的部位に移植されたときポリマー材料の免疫反応を低減するのに使用される無細胞組織マトリックス。
74. 請求項７３に記載の無細胞組織マトリックスにおいて、前記マトリックスが真皮組織、骨、軟骨、またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする無細胞組織マトリックス。

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