JP2010533042A - 組織修復用無細胞組織基質構成体 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明の構成体は、酸性溶液中でATM断片を膨張させ、次に、得られた膨張ATM断片懸濁液を、好ましくはメッシュ基材の一面又は両面上において、乾燥させることによって作成される。異物反応を軽減させるための、ここに提供する構成体を有する移植可能な医療器具のコーティングもまた意図される。好適な器具の例には、限定するものではないが、人工関節、代用血管、人工弁、心臓ペースメーカー、細動除去器、筋刺激装置、神経学的刺激器、人工内耳、モニタリング装置、薬ポンプ、及び、左心補助循環装置が含まれる。
ここで使用されているように、「無細胞組織基質」(「ATM」)は、コラーゲンを含有する任意の広範な組織から、すべて若しくは実質的にすべての生存細胞、さらに、好ましくは、検出可能なすべての死細胞、細胞内成分、及び/又は、死細胞若しくは瀕死細胞により生じる残骸を除去することによってできる組織由来の構造である。ここで使用されているように、「無細胞基質」は:(a)様々なコラーゲンを基礎とする組織から作られ;(b)無細胞性であり;さらに、(c)由来した天然の組織又は器官が有する生物学的及び構造的機能を維持する基質である。基質によって維持される生物学的機能には、細胞伸展、細胞増殖、及び、細胞分化をサポートする能力のみならず、細胞認識及び細胞結合が含まれる。そのような機能は、非変性コラーゲンタンパク(例えば、タイプIコラーゲン)、及び、種々の非コラーゲン分子(例えば、インテグリン受容体の等の分子、グルコサミノグリカン(例えば、ヒアルロン酸)若しくはプロテオグリカンのような高電荷密度を有する分子、又は、その他の付着因子、のためのリガンドとして機能するタンパク)により提供される。有用な無細胞基質により維持される構造的機能には、組織学的構造の維持、組織成分の三次元的配列並びに強度、弾性、耐性及び規定された空隙率のような物理的特性の維持、並びに、巨大分子の保持が含まれる。無細胞基質の生物学的機能の効率は、例えば、細胞増殖をサポートする能力により測定可能であり、その無細胞基質が作られる元となった天然の組織又は器官の少なくとも50%(「少なくとも」は、例えば、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.5%、100%、又は100%超である。)である。さらに、無生物基質中の基底膜の完全性は、電子顕微鏡及び/又は免疫組織化学により測定され、細胞基質が作成された元の天然の組織又は器官の少なくとも70%である。ここで使用されているように、「実質的にすべての生存細胞」を欠損しているATMは、生存細胞の濃度がATMが作成される元となった組織又は器官の1%未満(例えば、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%、0.000001%又は0.0%)のATMである。本発明に有用なATMは、好ましくは、又は実質的に、細胞を殺した後にもATM中に存在しうる死細胞及び/又は細胞残骸がない。「死細胞及び/又は細胞残骸が実質的にない」ATMとは、細胞除去工程を後に予定しているATM中に存在する死細胞及び/又は細胞残骸の10%未満(すなわち、8%、5%、1%、0.1%、0.001%、0.0001%、又は、それ未満)を含むATMである。
ある実施形態において、生体適合性組織修復構成体はメッシュ基材を具えていてもよい。例えば、外科用メッシュ基材などの、任意の生体適合性メッシュ基材を使用してもよい。外科用メッシュ基材は、多くの形態で利用可能であり、種々の合成及び天然材料から作成された多繊維織物材料である。メッシュは、繊維構造、孔径及び重量によって大まかに分類されうる。繊維構造は、単繊維、多繊維、又は、単繊維材料から形成された多繊維であってもよい。メッシュ孔径は、約200μから約5000μまで変動してもよい。小さい孔径(例えば1000μ以下)は、重量メッシュに特有であり、その一方で、大きい孔径(例えば1000μ超)は、軽量メッシュに特有である。重量メッシュが約80−100g/m2の密度を有し、軽量メッシュが約25−45g/m2の範囲内の密度を有するように、メッシュ重量はg/m2として表される。
ここにおいて提供される生体適合性組織修復構成体は、酸性溶液中でATM断片を膨張させて膨張ATM粒子の均質な懸濁液を作成し、当該懸濁液を乾燥させてコラーゲンフィルム又はスポンジ状構造を作成することによって提供される。通常、膨張ATM断片によって占められる体積は、同じ質量の膨張していないATM断片によって占められる体積に比例して増加する。ある実施形態において、膨張は、やや高い温度でおこなわれてもよい。ATMは、断片、すなわち、粒子、繊維又は糸の形態であってもよい。膨張させる前にすべての抗凍結剤を除去するためにATMを洗浄してもよい。洗浄用溶液は、生理的に影響を及ぼさない任意の溶液であってもよく;特に好適な洗浄用溶液は、例えば、脱イオン化された水若しくは蒸留された水、又は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)である。
ここに記載される生体適合性組織構成体は、組織の改善又は修復が必要とされる広範な任意の疾患を処置するために使用できる。組織欠損は、例えば、先天性奇形、外傷、感染、及び、腫瘍切除を含む種々の病状から起こりうる。したがって、生体適合性組織構成体は、任意の軟組織(例えば、体の他の構造及び器官を接続し、サポートし又は囲む組織)における欠損を修復するために使用できる。また、生体適合性組織構成体は、例えば、骨修復のサポート(例えば、骨をサポートするための骨膜移植、又は、軟骨修復を促進するための関節移植として)において使用できる。軟組織は任意の非骨組織であってもよい。また、軟組織は、体の外側を覆い、体内において器官及び腔を並べる上皮組織であってもよい。限定するものではないが、上皮組織の例には、単層扁平上皮、重層扁平上皮、立方上皮、又は、円柱上皮が含まれる。
組織再生を助ける治療薬剤が生体適合性組織修復構成体の中に含まれていてもよい。これらの薬剤には、細胞、成長因子又は小分子治療薬が含まれていてもよい。これらの薬剤は、生体適合性組織構成体が対象物に置かれる前に生体適合性組織構成体の中に組み込まれてもよい。あるいはまた、対象において既に適所に置かれた生体適合性組織構成体の中にそれらを注入できる。これらの薬剤は、単独で又は組み合わされて投与されてもよい。例えば、生体適合性組織構成体は、細胞、成長因子及び小分子治療薬を同時に届けるため、又は、成長因子に加えて細胞を届けるか、又は、小分子治療薬に加えて細胞を届けるか、又は、小分子治療薬に加えて成長因子を届けるために使用されてもよい。
ここにおいて提供される生体適合性組織構成体は、製品又はキットとして含まれていてもよい。ある実施形態において、キットは、生体適合性組織構成体、包装材料、又は、治療方法のための指示が含まれる添付文書を具えていてもよい。包装材料には、生体適合性組織構成体の長期の安定及び滅菌を促進する成分が含まれていてもよい。
無細胞組織基質(ATM)の調製
ユカタンミニブタから得られたブタ真皮組織からATMを調製した。ブタ真皮組織を以下の標準Lifecellプロトコルに従って処理した。該組織を20mM EDTAを含むRPMI1640培地中において4℃で24時間にわたって定温放置した。組織サンプルを脱表皮化溶液(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、10mM EDTA、0.5%トリトン X−100、リンコマイシン、バンコマイシン、ポリミキシンB及びセフォキシチン)の中で穏やかに攪拌しながら22.5時間にわたって室温で定温放置することによって真皮表皮を除去した。次に、真皮から表皮層を物理的に除去した。表皮を破棄し、真皮を更なる処理に供した。該真皮を脱細胞化溶液(10mM HEPES、pH8.0、10mM EDTA、2%デオキシコール酸ナトリウム)中で15分間洗浄し、その後に、多量の未使用の脱細胞化溶液中において室温で18時間にわたって穏やかに攪拌することによって細胞成分及び残骸を除去した。該真皮を、DNAse溶液(20mM HEPES、pH7.2、20mM 塩化カルシウム、20mM塩化マグネシウム、及び、1U/ml DNAse(Pulmozyme(登録商標)、Genentech社製、南サンフランシスコ、カリフォルニア))中で定温放置し、その後に、PBS、10mM EDTA、pH7.2の中で洗浄した。続いて、DNAse処理された真皮を予備冷凍溶液中で定温放置し、凍結乾燥することによってシート形態のATM(XenoDerm(商標))を得た。Spex−Certiprep Freeze Millを用いてXenoDerm(商標)を微粉化した。微粉化されたXenoDerm(商標)のおおよその粒径は、約100から200μの間である。微粉化された材料を実施例において下記されるように、コーティングされたメッシュ及び真皮フィルムの調製のための出発材料として使用した。
溶解性抗凍結剤を除去するために、100mgの微粉化された組織を水で3回洗浄した。その後、洗浄された材料を凍結乾燥して重量測定をおこなった。微粉化されたブタ真皮は、約50%の抗凍結剤と、約50%の無細胞組織基質(ATM)とからなることがわかった。
再生組織基質(ATM)の膨張に有用な酢酸濃度を実験的に決定した。26mgのATMを含む、50mgの微粉化されたブタ真皮を水で3回洗浄し、その後、表1に示される濃度の酢酸5mL中において懸濁させた。ATMサンプルを時々攪拌しながら室温に置いて3時間定温放置した。膨張したATM微粒子は静置され、膨張したATMによって占められる体積を記録し;その後、サンプルを低速遠心分離し、ATMペレットの固まった体積を記録した。重力又は遠心分離で評価したように(表1)、100mM酢酸(約pH2.6)がATMのほぼ最大限度の膨張、すなわち、膨張体積と密集体積との違いの大きさを示した。酢酸濃度が低いとき、ATMの膨張は均質ではなく、巨大な粒子を含む不均質な懸濁液が得られた。ATM濃度を0.5%ATM(w/v)より高める試みは、塩(10mM塩化ナトリウム)又はpHを高める(>3.0)ことのいずれによっても消散しない多数の粒子を含む不均質な懸濁液を形成する結果となった。
フィルムコーティングされたメッシュ及びスポンジコーティングされたメッシュの調製における第一のステップは同じであった。要約すると、ATMは、酸の中で膨張させられ、ポリプロピレンメッシュ表面に注がれた。コーティングされたメッシュを窒素/空気雰囲気中で乾燥することにより、均質にコーティングされた、厚さ約0.5mmのメッシュであって、セロハンに似たものが得られた。この材料は、「フィルムコーティングされたメッシュ」と称される。その一方、コーティングされたメッシュを凍結乾燥すると、粗い均質性を有する厚さ約2−3mmの材料であって、綿ボールに似たものが結果的に得られた。この材料は、「スポンジコーティングされたメッシュ」と称される。
ATM(ポリプロピレンメッシュ単位cm2当たり2.5mgのATM)を、残存する抗凍結剤及び塩を取り除くために水中で3回洗浄し、次に、最終濃度が0.5%ATMである100mM酢酸中において室温で3時間膨張させた。ポリプロピレンメッシュ(PROLENE mesh、Ethicon Inc社製)を、約7.5cm×2.5cmの切片に切り、各切片を、それぞれ、4穴(4−well)のポリスチレン皿(Nunc、カタログ番号267061)の1つの穴(8cm×3cm)に置いた。酸膨張したATMを、メッシュ上に約5mmの深さまで注ぎ、該皿を一夜にわたって窒素雰囲気中で定温放置した。乾燥されたフィルムコーティングメッシュを皿から持ち上げ、100mM酢酸中において15分間水和し、反転し、清潔なポリスチレン容器に移動した。新たに調製された酸膨張ATMをフィルムコーティングされたメッシュの上に再び注ぎ、そして、メッシュを一夜にわたって窒素雰囲気下で乾燥させた。その後、乾燥された二重コーティングメッシュをポリスチレン容器から取り除いた。
残存する抗凍結剤及び塩を取り除くために、ATM(ポリプロピレンメッシュ単位cm2当たり2.5mgのATM)を水で3回洗浄し、次に、最終濃度が5%ATMである100mM酢酸中において室温で3時間膨張させた。ポリプロピレンメッシュ(PROLENE mesh、Ethicon Inc社製)を、約7.5cm×2.5cmの切片に切り、各切片を、それぞれ、4穴(4−well)のポリスチレン皿(Nunc、カタログ番号267061)の1つの穴(8cm×3cm)に置いた。酸膨張したATMを、メッシュ上に(メッシュ単位cm2当たり2.5mgのATM)約5mmの深さまで注いだ。酸膨張したATMをメッシュ上に注ぎ、メッシュを凍結乾燥した。その後、乾燥されたスポンジコーティングポリプロピレンメッシュをポリスチレン容器から取り除いた。いくつかの例において、ATMスポンジコーティングされたメッシュを架橋処理した。乾燥されたコーティングメッシュを、100mM 4−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、pH5.4,20mM 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDAC)、10mM N−ヒドロキシスルホサクシンイミド(NHS)、及び、0.5μMリジンの中で室温で3時間定温放置した。架橋されたメッシュを、生理食塩水中で洗浄し、インビトロ分析又はインビボ分析前に水和された状態で保った。
ポリプロピレンメッシュをサンプルから省略したのを除き、上述の方法とまったく同様にフィルム及びスポンジを調製した。フィルム及びスポンジを再水和し、それらの引張強度を、製造社の仕様書に従ってInstron5865試験機(Instron社、ノーウッド、マサチューセッツ)を用いて評価した。この試験の結果は、表2下部に示されている。これらの値は、2の独立したサンプルの平均最大応力を表す。架橋されたフィルムは、最も大きい全体強度を有し、通常の凍結乾燥されたATM(Xenoderm(商標))によって許容された最大応力よりも約20−25%多く許容した。
酸膨張したATMが生理的条件下で安定した状態を維持する能力を、例えば細胞外基質の変性温度及び酸膨張したATMのコラゲナーゼ感受性を測定することを含むインビトロ的方法によって評価した。細胞外基質の変性温度を示差走査熱量測定(DSC)により評価した。水和されたサンプルを大体積DSC受け皿に置いて密封し、2.5℃/分から95℃の傾斜を有し、2℃の均衡温度を有するDSC Q100(TA Instruments)の中にいれた。ポリプロピレンメッシュをサンプルから省略したことを除き、フィルム及びスポンジを上述の方法とまったく同様に調製した。表3に示されるように、架橋によってコラーゲン基質を変性させるために必要とされる温度が上昇するようであった。その一方で、非架橋フィルム及びスポンジの変性温度がそれらの由来する微粉化されたブタ真皮よりもわずかに低かったことは、フィルム及びスポンジ中のコラーゲンの全体構造的機構が天然コラーゲンのものと類似していたことを示している。さらに、フィルム及びスポンジの変性温度が一般哺乳類の体温である37℃より高かったことは、フィルム及びスポンジが生理的温度において安定であろうことを示している。
フィルムコーティングされたポリプロピレンメッシュサンプル、及び、スポンジコーティングされたポリプロピレンメッシュサンプルを上述されたように調製し、次に、切断し、ヘモトキシリン及びエオシン(H&E)によって染色した。フィルムコーティングされたメッシュサンプルにおいては、濃い好酸性材料が該ポリプロピレンメッシュを包囲していたが、対照的に、スポンジコーティングされたメッシュサンプルにおいては、好酸性物質の緩いネットワークが該ポリプロピレンメッシュを包囲していた。メッシュのパラフィン埋め込みに起因する組織学的人工物が存在していたが、真皮基質において一般にみられるコラーゲン束が、フィルムコーティングされたポリプロピレンメッシュサンプル又はスポンジコーティングされたポリプロピレンメッシュサンプルのいずれにおいても観察されなかったことは、切断前にプラスチックに埋め込む必要があることを示している。
フィルムコーティングされたポリプロピレンメッシュ、及び、スポンジコーティングされたポリプロピレンメッシュの生体適合性を、免疫適格性ラットモデルを用いたインビボにおける経時的実験によって評価した。実施例2に記載されているように、架橋を有するか又は有しないように調製された、フィルムコーティングされたメッシュ及びスポンジコーティングされたメッシュを皮下に移植し、移植後1、3及び5週において分析のために除去した。対照試料には、コーティングされていないポリプロピレンメッシュ及びシート状Xenoderm(商標)が含まれる。各試験片の3つの複製物をそれぞれの時点において移植した。移植片を動物の背面に作成された小さい皮下ポケット(ラット1個体当たり4つ)に挿入した。試験片の挿入に続いて、外科用ステープルを用いて外傷を閉じた。
実施例7、10及び11で用いられるフィルムコーティングされたポリプロピレンメッシュ、及び、実施例5、6、7、8及び9で用いられる真皮フィルムを下記のように調製した。
フィルムコーティングされたポリプロピレンメッシュの調製
凍結乾燥されたシート状XenoDerm(商標)を上述の方法に従って微粉化した。ATMを、残存する抗凍結剤及び塩を取り除くために水中で洗浄し、次に、最終濃度が0.5%ATMである100mM酢酸中において3時間膨張させた。膨張温度を以下の具体例において詳細に説明されるように32−40℃で変化させた。酸膨張したATMをポリスチレン皿に注入し、該ポリプロピレンメッシュ(7.5cm×2.5cmの断片)を約1cmの深さまでATM溶液中に沈め;ポリプロピレンメッシュ単位cm2当たり0.75mgの酸膨張したATMを使用した。ポリプロピレンメッシュを一度だけコーティングした。サンプルを、実施例7、10及び11において以下に示されるように乾燥した。
ポリプロピレンメッシュが含まれない真皮フィルムを以下のように調製した。凍結乾燥されたシート状XenoDerm(商標)を上述の方法に従って微粉化した。残存する抗凍結剤及び塩を取り除くためにATMを水中で洗浄し、その後、最終濃度が0.5%ATMである100mM酢酸中においてATMを3時間膨張させた。以下の具体例で詳しく述べられるように膨張温度を32−40℃で変化させた。ポリスチレン皿に約0.5cmの深さまで酸膨張したATM溶液を注ぎ;ポリスチレン皿の単位cm2当たり0.75mgの酸膨張ATMを使用した。実施例5、6、8及び9で以下に示されるようにサンプルを乾燥した。
上記実施例4で説明されるように周辺温度で膨張させたATMを用いて真皮フィルムを調製し;該フィルムを窒素雰囲気中で、室温又は33℃、37℃若しくは43℃において加熱ブロック上で乾燥した。実施例3で上述の架橋方法を用いて調製されたフィルムを陽性対照として加えた。得られた材料の細胞外基質の変性特性を示差走査熱量測定(DSC)で評価した。表5に示されるように、33℃及び37℃で乾燥されたフィルムの変性温度は、室温で乾燥された対照フィルムと同様であったが、その一方で、43℃で乾燥されたフィルムの変性温度は、対照フィルムに比例して低かった。架橋により、コラーゲン基質を変性させるために必要とされる温度が上昇するようであった。これらのデータは、フィルムの変性温度が標準哺乳類の体温である37℃より高かったことから、フィルムが生理的温度において安定であろうことを示唆した。
真皮フィルムのコラゲナーゼ感受性を測定することによって、ATMコーティングが生理的条件下で持続する能力を評価した。ATMコーティングは、好ましくは、正常なコラーゲンの代謝回転を許容するのに充分な天然コラーゲン構造を維持しながら、基質の細胞再生を可能にするほど充分に長く持続すべきである。真皮フィルムを、実施例4で上述されるように窒素雰囲気中において室温又は33℃、37℃若しくは43℃で加熱ブロック上で乾燥されたATMを用いて調製した。実施例3で上述された架橋方法を用いて調製したフィルムを陽性対照として加えた。サンプルをコラゲナーゼによって消化し、消化されてないサンプルに対する各サンプル中に残存するコラーゲンの百分率をコラゲナーゼ処理後1、2、4、6及び24時間において分析した。コラゲナーゼ消化のために、15−20mgの乾燥フィルムをエッペンドルフチューブの中に置いた。各サンプルを、1mlの10mM Tris、pH7.4,5mM CaCl2中において水和し、その後に、0.25mgのコラゲナーゼ(10mg/ml溶液の25μl)を添加し、37℃において定温放置した。サンプルを、表示された時点で氷の中において冷却し、非溶解性(消化されていない)材料を遠心分離によって回収した。その後、残存する組織の百分率を決定するために、ペレットを乾燥し、重量測定した。表6に示されるように、架橋フィルムはコラゲナーゼ消化に対してほぼ完全な抵抗性を有していた。高い温度で乾燥されたフィルムは、室温で乾燥されたものよりもコラゲナーゼに対してわずかに影響されやすいようであった。あるサンプルにける、後ろのいくつかの時点における材料の見かけの増加は、小さいサンプル量の残存水分含量における変動性を反映している。これらのデータは、真皮フィルム中のコラーゲンがコラゲナーゼに対して接近可能であり、不可逆的に変性されなかったことを示しており、ATMコーティングされたメッシュの中でコラーゲン原線維が通常の生理的なコラーゲン回転代謝を受けるであろうことを示唆している。
コーティングされたメッシュサンプルの生体適合性に対する調製温度の影響を、皮下免疫適格性ラットモデルにおいて評価した。要約すると、ATMの膨張温度及びコーティングされたメッシュの乾燥温度を下の表7に示される条件に従って体系的に変化させた。コーティングされたメッシュサンプルを移植し、そして、移植片を移植後1、3及び5週の間隔で除去し、組織学的に評価した。
真皮フィルムの生化学的組成に対する調製温度の影響を評価した。要約すると、実施例5で説明されるように、0.1M酢酸中において室温、32℃、37℃又は40℃のいずれかでATMを膨張させ;フィルムを室温で乾燥して真皮フィルムを調製した。結果物である真皮フィルムの生化学的組成を微粉化されたATMの生化学的組成と比較した。
真皮フィルムのコラーゲン含有量を、ヒドロキシプロリン分析により量的に、また、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により質的に分析した。ヒドロキシプロリン分析において、真皮フィルムを、塩、0.5M酢酸及びペプシン消化で連続して処理し、そして、それぞれの溶解性画分についてヒドロキシプロリン含有量を分析した。6N塩酸中の110℃における24時間の加水分解に続き、塩、酸及びペプシン画分のヒドロキシプロリン含有量を決定した。加水分解されたサンプルを最終濃度が0.1N HClとなるように蒸留水で希釈した。その後、試験緩衝液(45.6g/l酢酸ナトリウム三水和物、30g/lクエン酸3ナトリウム2水和物、4.4g/lクエン酸、308.4ml/lイソプロパノール及び1.4%のクロラミンT)を、追加イソプロパノール及びエールリッヒ試薬(60%(v/v)過塩素酸中の2gパラジメチルアミンベンズアルデヒド、イソプロパノール、3:13)と共に加えた。サンプルを60℃で25分間加熱し、冷却し、そして、540nmにおける吸光度が決定した。試験サンプルの吸収度と、ヒドロキシプロリンの既知濃度を用いた標準曲線の吸収度とを比べることによって、ヒドロキシプロリンを定量した。抽出された画分のヒドロキシプロリン含有量を表8に示す。回収された全ヒドロキシプロリンの百分率としてヒドロキシプロリンを表す。
プロテオグリカンを、出発材料である微粉化されたATMから、及び、0.1M酢酸中で室温、32℃又は37℃のいずれかにおいて膨張したATMを用いて調製された真皮フィルムから抽出した。プロテオグリカンを、SDS−PAGEによって分離し、免疫ブロット法のために膜に移した。標準方法に従って免疫ブロット法を実行した。デコリン特有のポリクローナル抗体を用いて膜を調べた。すべてのサンプルにおいて同程度のデコリンが検出可能であった。分解又は架橋の証拠は全くみられなかった。
グルコサミノグリカンを、出発物質である微粉化されたATMから、及び、0.1M酢酸中で室温、32℃、37℃又は40℃のいずれかにおいて膨張しATMを用いて調製された真皮フィルムから抽出した。標準方法に従ったセルロースアセテート膜電気泳動によりグルコサミノグリカンを分離した。ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸グルコサミノグリカンは、すべてのサンプルにおいて検出可能であり、また、グルコサミノグリカン特性のいかなる質的な差異も認められなかった。
真皮フィルムの生体力学特性に対する調製温度の影響を評価した。要約すると、真皮フィルムを、室温、32℃、37℃又は40℃のいずれかにおいて0.1M酢酸中で膨張したATMを用いて調製し、実施例5において説明されたように窒素雰囲気中で乾燥し、そして、該真皮フィルムの1cmの切片をInstron5865試験機(Instron社、ノーウッド、マサチューセッツ)を用いた引張試験に供した。表9に示されるデータは、高温において膨張したATMを用いて調製されたフィルムが室温において膨張したATMを用いて調製されたフィルムに比べてより強い引張強度を有していたことを示す。生体力学特性の最大値のために最適な温度は約37℃であった。したがって、例えば、室温において膨張したメッシュを用いて調製されたフィルムに対する最大応力は0.017±0.007MPaであった。37℃において膨張したメッシュを用いて調製されたフィルムについての対応値は、0.123±0.009MPaであった。室温において膨張したメッシュを用いて調製されたフィルムのヤング率は9.25±.096MPaであった。37℃において膨張したメッシュを用いて調製されたフィルムについての対応値は46.0±3.00MPaであった。室温において膨張したメッシュを用いて調製されたフィルムに対する最大負荷は0.056±0.002Nであった。37℃において膨張したメッシュを用いて調製されたフィルムについての対応値は0.0.337±0.024Nであった。室温において膨張したメッシュを用いて調製されたフィルムの歪み率は21.1±1.0%であった。37℃において膨張したメッシュを用いて調製されたフィルムについての対応値は49.3±3.5%であった。
コーティングされたメッシュの生物体適合性は臨床的に意義のあるラットヘルニアモデル系においても評価した。全層切除欠損部(約1.5cm×2.5cm)をラットの腹側壁の筋膜に作成した。欠損部は、5cm×3cmの楕円形の試験片(ポリプロピレン又は混合物)メッシュを下層部位に置き、傷の端において縫合でメッシュを固定することにより修復された。実施例5に記載された方法に実質的に従って、フィルムコーティングされたメッシュを調製した。ATMを、37℃において膨張させ、ポリスチレン皿に注入した。メッシュを0.5cmの深さまでATM溶液中に沈め;ポリプロピレンメッシュ単位cm2当たり0.75mgのATMを使用した。これらの実験において、大きいメッシュ(約11cm×18cm)を上述されるようにコーティングし、周辺温度で乾燥し、移植前に小さい(3cm×5cm)楕円形に切断した。サンプルは架橋されなかった。
真皮組織がヨークシャーブタから得られたことを除き、実施例1で記載された方法に従ってATMを調製した。ATMを微粉化し、その後、可溶性抗凍結剤を除去するために水で洗浄した。100mM酢酸に代えて40mM HCl(pH1.4)の中でおこなわれたことを除き、実施例1の方法に従って、微粉化されたATMを37℃で3時間膨張させた。実施例2に記載されるようにポリプロピレンメッシュをコーティングし、室温で乾燥した。
Claims (49)
- 生体適合性メッシュ構成体を生産する方法において、当該方法は:
a)多数の無細胞組織基質(ATM)の断片を酸性溶液中で定温放置して膨張させたATM断片の均質な懸濁液を作成するステップであって、前記酸性溶液がpH3.0未満であり、ATM中のコラーゲン原線維の不可逆的変性が実質的に生じないステップと;
b)前記均質な懸濁液を生体適合性メッシュ基材に塗布してコーティングされたメッシュ基材を作成するステップと;及び、
c)前記コーティングされた基材を乾燥してメッシュ構成体を形成するステップと;
を具えることを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法において、ステップ(a)と(b)とが同時におこなわれることを特徴とする方法。
- 請求項1又は請求項2に記載の方法において、前記ATMは、すべて又は実質的にすべての生存細胞が除去された真皮を具えることを特徴とする方法。
- 請求項1−3のいずれかに記載の方法において、
前記無細胞組織基質(ATM)は、すべて又は実質的にすべての生存細胞が除去された組織を具え、
当該組織は、筋膜、心嚢組織、硬膜、臍帯組織、胎盤組織、心臓の弁組織、靭帯組織、腱組織、動脈組織、静脈組織、神経結合組織、膀胱組織、尿管組織、及び、腸組織からなる群より選択されることを特徴とする方法。 - 請求項1−4のいずれかに記載の方法において、前記無細胞組織基質(ATM)がヒト組織から作成されることを特徴とする方法。
- 請求項1−4のいずれかに記載の方法において、前記無細胞組織基質(ATM)が非ヒト哺乳類の組織から作成されることを特徴とする方法。
- 請求項6に記載の方法において、前記非ヒト哺乳類がブタであることを特徴とする方法。
- 請求項6又は請求項7に記載の方法において、前記非ヒト哺乳類が、α−1,3−ガラクトシル残基が発現しないように遺伝子操作されていることを特徴とする方法。
- 請求項6−8のいずれかに記載の方法において、前記非ヒト哺乳類が機能性α−1,3−ガラクトシル転移酵素の遺伝子を欠損することを特徴とする方法。
- 請求項1−9のいずれかに記載の方法において、前記ATMの断片がATMの微粒子であることを特徴とする方法。
- 請求項1−10のいずれかに記載の方法において、前記pHが約3.0より低いことを特徴とする方法。
- 請求項1−11のいずれかに記載の方法において、前記pHが約1.0〜約3.0であることを特徴とする方法。
- 請求項1−12のいずれかに記載の方法において、前記pHが約2.0〜約3.0であることを特徴とする方法。
- 請求項1−12のいずれかに記載の方法において、前記pHが約1.5〜約2.5であることを特徴とする方法。
- 請求項1−12のいずれかに記載の方法において、前記pHが約1.4であることを特徴とする方法。
- 請求項1−15のいずれかに記載の方法において、前記酸性溶液が酢酸、アスコルビン酸、ホウ酸、炭酸、クエン酸、塩酸、乳酸、タンニン酸、リン酸、及び、硫酸からなる群より選択される酸を含む溶液であることを特徴とする方法。
- 請求項1−16のいずれかに記載の方法において、前記酸性溶液が0.1M酢酸を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1−16のいずれかに記載の方法において、前記酸性溶液が0.04M酢酸を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1−18のいずれかに記載の方法において、前記定温放置ステップが約0.5時間〜約12時間であることを特徴とする方法。
- 請求項1−19のいずれかに記載の方法において、前記定温放置ステップが約1.0時間〜約10.0時間であることを特徴とする方法。
- 請求項1−20のいずれかに記載の方法において、前記定温放置ステップが約2.0時間〜約6時間であることを特徴とする方法。
- 請求項1−21のいずれかに記載の方法において、前記定温放置ステップが約2.5時間〜約5時間であることを特徴とする方法。
- 請求項1−22のいずれかに記載の方法において、前記定温放置ステップが約3時間であることを特徴とする方法。
- 請求項1−23のいずれかに記載の方法において、前記定温放置ステップ、前記乾燥ステップ、又は、前記定温放置及び乾燥ステップは、約20℃〜約42℃の温度でおこなわれることを特徴とする方法。
- 請求項1−24のいずれかに記載の方法において、前記定温放置ステップ、前記乾燥ステップ、又は、前記定温放置及び乾燥ステップは、約20℃〜約30℃の温度でおこなわれることを特徴とする方法。
- 請求項1−24のいずれかに記載の方法において、前記定温放置ステップ、前記乾燥ステップ、又は、前記定温放置及び乾燥ステップは、約25℃〜約35℃の温度でおこなわれることを特徴とする方法。
- 請求項1−24のいずれかに記載の方法において、前記定温放置ステップ、前記乾燥ステップ、又は、前記定温放置及び乾燥ステップは、約30℃〜約40℃の温度でおこなわれることを特徴とする方法。
- 請求項1−24又は27のいずれかに記載の方法において、前記定温放置ステップ、前記乾燥ステップ、又は、前記定温放置及び乾燥ステップは、約35℃〜約38℃の温度でおこなわれることを特徴とする方法。
- 請求項1−24のいずれかに記載の方法において、前記定温放置ステップ、前記乾燥ステップ、又は、前記定温放置及び乾燥ステップは、約37℃〜約42℃の温度でおこなわれることを特徴とする方法。
- 請求項1−24又は27−29のいずれかに記載の方法において、前記定温放置ステップ、前記乾燥ステップ、又は、前記定温放置及び乾燥ステップは、約37℃の温度でおこなわれることを特徴とする方法。
- 請求項1−24又は26のいずれかに記載の方法において、前記定温放置ステップ、前記乾燥ステップ、又は、前記定温放置及び乾燥ステップは、約25℃の温度でおこなわれることを特徴とする方法。
- 請求項1−31のいずれかに記載の方法において、前記メッシュ基材が実質的に非吸収性であることを特徴とする方法。
- 請求項1−31のいずれかに記載の方法において、前記メッシュ基材が吸収性であることを特徴とする方法。
- 請求項33に記載の方法において、前記メッシュ基材が重合体であることを特徴とする方法。
- 請求項33に記載の方法において、前記非吸収性のメッシュ基材がポリヒドロキシアルカノエート、ポリグリコール酸、ポリ−1−乳酸、ポリ乳酸/ポリグリコール酸(PLGA)、ポリグラクチン 910、及び、カルボキシメチルセルロースからなる群より選択される重合体であることを特徴とする方法。
- 請求項34に記載の方法において、前記重合体がポリ−4−ヒドロキシブチレートを含むことを特徴とする方法。
- 請求項1−36のいずれかに記載の方法において、前記メッシュ基材が合成基材であることを特徴とする方法。
- 請求項1−32又は37のいずれかに記載の方法において、前記合成基材がポリプロピレンを含むことを特徴とする方法。
- 請求項1−38のいずれかに記載の方法において、前記乾燥ステップが窒素雰囲気中における乾燥ステップを具えることを特徴とする方法。
- 請求項1−38のいずれかに記載の方法において、前記乾燥ステップが凍結乾燥ステップを具えることを特徴とする方法。
- 請求項1−40のいずれかに記載の方法で生産されることを特徴とする生体適合性メッシュ構成体。
- 生体適合性メッシュ構成体が:
コーティングされたメッシュ基材であって、当該メッシュ基材上のコーティングが乾燥されたATM懸濁液を含むメッシュ基材を具えることを特徴とする生体適合性メッシュ構成体。 - 請求項42に記載の構成体において、前記ATM懸濁液は酸性溶液中で膨張した多数の無細胞組織基質(ATM)断片を具え、前記酸性溶液は、pH3.0未満であり、ATM中のコラーゲン原線維の不可逆的変性が実質的に生じず、前記ATM断片は約30℃〜約42℃の温度で定温放置されることを特徴とする生体適合性メッシュ構成体。
- 器官又は組織を改善又は修復する方法であって、当該方法は:
a)対象哺乳類が改善又は修復を必要とする器官又は組織を有していると認識するステップ;及び、
b)請求項42又は請求項43に記載の構成体を前記器官又は組織の内部又は表面に設置するステップ;
を具えることを特徴とする方法。 - 請求項44に記載の方法において、前記対象哺乳類がヒトであることを特徴とする方法。
- 請求項44又は請求項45に記載の方法において、レシピエント器官又はレシピエント組織が腹壁組織、腹筋、及び、平滑筋組織からなる群より選択されることを特徴とする方法。
- 請求項44−46のいずれかに記載の方法において、前記対象は、鼡径ヘルニア、大腿ヘルニア、腹壁ヘルニア、腹部ヘルニア、切開創ヘルニア、裂孔ヘルニア、横隔膜ヘルニア、臍ヘルニア、胸部における筋膜衰弱、腹壁における筋膜衰弱、及び、骨盤内器官脱出症からなる群より選択される要修復欠損を有することを特徴とする方法。
- 製品であって、当該製品は:
a)請求項42又は請求項43に記載の生体適合性メッシュ構成体;及び、
b)包装材料、又は、器官若しくは組織を改善若しくは修復する方法のための使用説明書を含む添付文書、を具え、
当該方法が:
i)対象哺乳類が改善又は修復を必要とする器官又は組織を有していると認識するステップ;及び、
ii)前記生体適合性メッシュ構成体を前記器官又は組織の内部又は表面に設置するステップ;を具える、
ことを特徴とする製品。 - 生体適合性真皮フィルム構成体を生産する方法であって、当該方法は:
a)多数の無細胞組織基質(ATM)の断片を酸性溶液中において膨張させて均質な懸濁液を得るステップであって、前記酸性溶液がpH3.0未満であり、ATM中のコラーゲン線維の不可逆的変性が実質的に生じないステップと;
b)前記ATMの均質な懸濁液を約20℃〜約42℃で定温放置するステップと;及び、
c)前記均質な懸濁液を乾燥させて真皮フィルム構成体を形成するステップと;
を具えることを特徴とする方法。
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