JP5881711B2 - 無細胞血管製品 - Google Patents
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Description
従来技術として、ブタα−galエピトープが欠如し、α1,3gt遺伝子が欠損したα1,3gtノックアウトブタをつくることにより、この免疫学的障壁が部分的に解消され、これにより超急性拒絶反応が一部克服されることが知られているが、移植用のブタの生産にはコストと時間がかかる。さらに、少ないとはいえ潜在的には相当量のgalα(1,3)galがα1,3gtノックアウト動物の組織で発現しており、これは、このエピトープの合成には別のグリコシルトランスフェラーゼも関与していることを示している(Milland et al Immunol. Cell Biol 2005, 83, 687-693)。また、従来技術として、コーヒー生豆のα−ガラクトシダーゼおよび組み換えヒトα−ガラクトシダーゼにより、ブタの大動脈弁や心膜組織などの組織の細胞表面からα−galエピトープを除去することができることも知られている。しかし、酵素処理には費用対効果の面で限界があるだけでなく、組織の構築に悪影響を及ぼし、望ましくない酵素の残基が残存しうるという問題がある。超急性拒絶反応を克服するために、(C3を枯渇させる)コブラ毒因子、可溶性補体受容体タイプ1、抗C5抗体、またはC1インヒビター(C1−INH)を用いて被移植体の補体経路を阻害することも知られている。この手法には、コブラ毒因子の毒性に加え、最も重要な点としてこれらの処理が個体の機能補体系を奪ってしまうといった欠点がある。急性血管性拒絶に関していえば、この種の拒絶反応は、超急性拒絶が防止されても、不適合異種移植片において2〜3日以内に発生する。このプロセスは超急性拒絶反応よりも格段に複雑であり、現在完全には理解されていないが、超急性拒絶反応および急性血管性拒絶を防止すれば、血中にXNAsが存在していても異種移植片が生着し、免疫学的に順応させることが可能となる。補体経路が阻害されるか、血中抗体が除去されるかもしくは機能が変更されるか、または移植片の表面抗原の発現に変化があった場合、液性拒絶により移植片が破断される。これにより異種移植片の受容体の発現が増加し、ひいては保護遺伝子の発現が可能となる。
(i)EDTAでのインキュベーション、
(ii)第1の殺菌洗浄、
(iii)少なくとも2サイクルの、低張緩衝液および陰イオン洗浄剤を用いたインキュベーション、
(iv)ヌクレアーゼ処理、
(v)高張液洗浄、および
(vi)最終殺菌処理
の方法工程を交換用血管に施すことにより天然型無細胞異種血管組織を調製する方法が提供される。
長さ最大200mmの凍結保存したEIAおよびICA血管を、200mLの各溶液を用いて図1に示すとおり調製した。各溶液は、使用前に適切な温度に予め温めておく。血管は個別に無菌の250mL容器に入れ、80rpmで行うヌクレアーゼ工程を除き、すべてのインキュベーションを240rpmの攪拌とともに行う。最初の工程として、EIAおよびICAが凍結されている場合、組織を37℃で20分間解凍し、その後バンコマイシン、硫酸ゲンタマイシン、およびポリミキシンBを含む殺菌溶液を用いて37℃で30分間洗浄する。インキュベーションの第1の工程は、200mMのEDTAを用いた24時間4℃の洗浄であり、続いて低張緩衝液(10mM TRIS, 2.7mMEDTA, 10KIU/m アプロチニン)を用いた24時間4℃の洗浄と、低張緩衝液内の0.1%(w/v)のSDSを用いた24時間37℃の洗浄を行う。低張緩衝液を用いた24時間4℃での洗浄をさらに行った後、アプロチニンを含むDPBSa EDTAを用いた4℃48〜56時間の洗浄、および0.1%(w/v)SDSの低張緩衝液を用いた24時間37℃での洗浄を行う。その後、組織に対しそれぞれDPBSaを用いた30分間37℃の洗浄を3回行い、ヌクレアーゼ溶液(5mM TRIS, 50μg/mL BSA, 50U/mL DNAse, 1U/mL RNAse)を用いた3時間37℃での洗浄を行う。次に、組織に対し、それぞれアプロチニンを含むDPBSa EDTAを用いた30分間37℃での洗浄を3回行い、さらに高張溶液を用いた24時間37℃でのインキュベーション洗浄およびそれぞれアプロチニンを含むDPBSa EDTAを用いた30分間37℃での洗浄をさらに3回行う。続いて、組織を0.1%(v/v)の過酢酸溶液を用いて4時間27℃で殺菌する。続いて、(i)それぞれアプロチニンを含むDPBSa EDTAを用いた30分間37℃の洗浄を3回および(ii)DPBSaを用いた24時間4℃での洗浄の2工程をクラスIIの安全キャビネット内で無菌状態にて行う。その後組織は必要となるまでDPBS内に4℃で保存しておく。
組織試験片を10%(v/v)の中性緩衝ホルマリン内に固定した後、乾燥してパラフィンワックスに包埋した。連続切片を採取し、標準的なヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)(Bios Europe Ltd., Skelmersdale, UK)染色を用いて組織の組織構造を評価し、ミラー(Miller)のエラスチン染色によりエラスチン含有量を評価した。核酸をDAPI染色(シグマ−アルドリッチ)およびヘキスト33258(シグマ−アルドリッチ)を用いて染色した。α−galエピトープに対するIgMモノクローナル抗体をAlexis Biochemicals(米国サンディエゴ)から入手し、使用前に精製した。
ELISAを用いて組織試料のインキュベーション後の非結合α−gal抗体レベルを定量した。試料は、5%(w/v)BSAを含む500μLのDPBSで一晩4℃でインキュベーションし、その後BSAを処分してそれぞれの管に対し500μLのDPBSを用いて2分間の洗浄を3回行った。厳密に100mgの組織を計量し、よく膨潤させ、抗α−galモノクローナル抗体希釈液(0.37mg・mL−1)1mLを、ブロッキングされたマイクロチューブに入れ、スピナーにセットして4℃で一晩放置した。組織を入れたマイクロチューブを600×g、15分間遠心分離(または13000rpmでマイクロ遠心分離)し、750μLの上澄みを取り除いてブロッキングされたマイクロチューブをリフレッシュし、そこにさらに750μLのTBSアジドBSAを加えた。その後撹拌し、600×g、15分間遠心分離した。さらに750μLの上澄み液を取り出し、この上澄み液のα−galに対する抗体を、Maxisorbマイクロタイタープレートのウェルに10μg/mL−1のα−gal BSAを含む50μLのDPBSを添加し、4℃で一晩反応させるELISA法で分析した。これらに対し、300μLのDPBS Tweenを用いて振とうしながら10分間の洗浄を3回行い、コーティングされたMaxisorbマイクロタイタープレートの各ウェルを、250μLの5%(w/v)BSAのDPBSにより4℃で一晩ブロッキングした。次に、各ウェルに対し300μLのDPBS Tweenを用いて、振とうしながら30分間の洗浄を3回行い、100μLの試料を、コーティング及びブロックされた、マイクロタイタープレートの対応するウェルに継代した。その後、これを常温で3時間インキュベーションし、洗浄した後、50μLのホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗マウス二次抗体(1:1000希釈)を添加した。これを常温で1時間インキュベーションした後、洗浄し、100μLのOPD溶液を添加し、暗所で10分間常温でインキュベーションした。50μLの3M硫酸を各ウェルに添加し、マイクロプレート分光光度計を用いて630nmのリファレンスフィルタで492nmにおける光学密度を測定した。各試料の値を平均値、信頼限界±95%でプロットしたが、有意差は見られなかった。
ヒドロキシプロリン測定の実行に先立ち、試料を前もって恒量となるまで凍結乾燥し、6M塩酸(HCl)を用いた4時間120℃のインキュベーションにより加水分解し、水酸化ナトリウム(NaOH)を用いて中和した。採用した一連の手順は、EdwardsおよびO’Brien [29]により説明された方法に基づいている。trans−4−ヒドロキシ−L−プロリン(シグマ)を用いて標準的な標準物質溶液を調製した。100μLの酸化性溶液(クロラミンT・水和物、シグマ)を添加した平底の96ウェルプレートのウェルに試験溶液(50μL)を加え、緩やかに振とうしながら5分間放置した。その後、エールリッヒ試薬(100μL)を各ウェルに添加した。続いて、このプレートに覆いをかけ、570nmにおける吸光度を測定する前に、水槽内で45分間60℃でインキュベーションした。ヒドロキシプロリンの標準曲線から補間することによりヒドロキシプロリンの濃度を求めた。
硫酸化糖(GAGs)の量をジメチルメチレンブルー結合により測定した(Enobakhare et al, Anal.Biochem. 243, 189, 1996、Farndale et al, Biochim. Biophys. Acta., 883, 173, 1986)。簡潔に述べると、試液をジメチルメチレンブルー溶液でインキュベーションし、525nmにおける吸光度を測定した。GAGsの量は、ある濃度範囲にわたるコンドロイチン硫酸およびリン酸塩分析緩衝液(オルトリン酸二水素ナトリウム 0.1M, オルトリン酸水素二ナトリウム 0.1M, pH6.8)を用いて得られた標準曲線から補間することにより求めた。
Claims (15)
- 生体外で、適切なドナー血管に下記工程(i)〜(vi)の処理を施すことにより、天然型無細胞異種血管組織を調製する方法:
(i)200mMのエチレンジアミン四酢酸を用いた前処理のインキュベーション、(ii)第1の殺菌洗浄、
(iii)少なくとも2サイクルの低張緩衝液および陰イオン洗浄剤を用いたインキュベーション、
(iv)ヌクレアーゼ処理、
(v)高張液洗浄、および
(vi)最終殺菌処理工程。 - EDTAを用いた前記インキュベーション工程が高張緩衝溶液内で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記陰イオン洗浄剤がドデシル硫酸ナトリウムである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記最終殺菌処理によりウイルスを排除し、生物汚染度を低減する、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記天然型無細胞異種血管組織の内面および外面のいずれか一方または両方を、抗凝固剤、合成五糖阻害剤、直接トロンビン阻害剤、ビタミンK拮抗薬、第Xa因子阻害薬、銀、コラーゲンIV、エラスチン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、および合成または天然のペプチドからなる群、またはこれらの混合物からから選択される材料で覆う工程をさらに含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記天然型無細胞異種血管組織に、上皮細胞、平滑筋細胞、多能性・多分化能の幹細胞、および線維芽細胞からなる群から選択された単一細胞集団または混合細胞集団を播種する工程をさらに含む、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の方法により得られる血管組織マトリックスの未処理対照と比較し、DNA含有量が少なくとも80%低減された天然型無細胞異種血管組織マトリックスを含み、前もって形成されたヒト抗体と反応しうるエピトープを内腔表面上に含まず、補体を活性化する能力をもたない製品。
- α−galエピトープを内腔表面上に含まない、請求項7に記載の製品。
- (i)ブタ外腸骨動脈(EIA)およびブタ内頸動脈(ICA)のいずれか一方であるか;
(ii)ウシ由来の製品であって、頸動脈、内乳動脈、内胸動脈、腸間膜静脈、および頸静脈からなる群から選択される、請求項7または8に記載の製品。 - 前記ブタドナー血管の長さが最長30cmであり、前記ウシドナー血管の長さが最長80cmである、請求項7〜9のいずれかに記載の製品。
- 生細胞の、または未処理の組織と比較して、コラーゲン含有量、グリコサミノグリカン含有量、エラスチン含有量、破裂圧力、縫合保持強度、最大抗張力、および低ひずみ速度破壊靭性値からなる群から選択される生化学的または生物力学的特性が同等または有意に異ならない、請求項7〜10のいずれかに記載の製品。
- 被膜をさらに含み、該被膜が適切な材料で内面(内腔)および外面のいずれか一方または両方を覆って設けられ、前記被膜の材料が抗凝固剤、合成五糖阻害剤、直接トロンビン阻害剤、ビタミンK拮抗薬、第Xa因子阻害薬、銀、コラーゲンIV、エラスチン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、および合成または天然のペプチドからなる群から選択されるか、またはこれらの混合物である、請求項7〜11のいずれか一に記載の製品。
- 上または中に単一細胞集団または混合細胞集団が播種され、前記細胞集団が移植箇所に応じて選択され、上皮細胞、平滑筋細胞、多能性・多分化能の幹細胞、および線維芽細胞からなる群から選択された、請求項7〜12のいずれかに記載の製品。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の方法により得られる天然型無細胞異種血管組織マトリックス組織製品を、移植組織として用いる製品。
- バイパス手術または血管アクセスに用いられる請求項14に記載の製品。
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