CN113425912A - 一种脱细胞真皮材料及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物材料领域,具体涉及一种取自基因编辑动物的真皮材料,进一步进行优化的脱细胞处理技术和交联技术处理,由此制备的真皮材料及其用途。本发明的脱细胞真皮材料免疫原性低,且生物活性好,用于临床烧伤、整形、口腔颌面修补、腹壁修补等领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料领域,特别涉及一种脱细胞真皮材料及其制备方法和用途。
背景技术
脱细胞真皮材料因其具有良好的组织相容性,炎症反应轻微,能快速血管化、促进引导组织再生等优点,目前广泛应用于烧伤、整形、口腔颌面修补、腹壁修补等领域。然而,当材料中残留的异种抗原进入人体内时,通常会引发免疫排斥反应,如超急性免疫排斥反应,这种免疫排斥反应的主要靶抗原被认为是由存在于动物组织中的α-Gal抗原引起的,α-Gal抗原存在于除人和高等灵长动物以外的大部分哺乳动物体内。目前虽然可以在脱细胞过程中加入α-1,3Gal酶,降解组织中的α-1,3Gal抗原,从而减轻受体血清对脱细胞真皮材料的免疫反应,但无法完全避免。
针对以上临床问题,我们通过基因编辑技术彻底敲除异种真皮材料中的某些特定抗原(如α-Gal抗原),从材料来源上解决脱细胞真皮材料存在的免疫原性问题(尤其是超急性免疫排斥反应),进一步优化脱细胞和交联化处理,降低其免疫原性,提高其生物活性。
发明内容
本发明提供一种脱细胞真皮材料及其制备方法和用途。本发明的脱细胞真皮材料取自基因编辑动物的真皮材料,进一步进行优化的脱细胞处理技术和交联技术处理,由此制备的真皮材料及其用途。本发明的脱细胞真皮材料免疫原性低,且生物活性好,用于临床烧伤、整形、口腔颌面修补、腹壁修补等领域。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供一种脱细胞真皮材料的制备方法,包括如下步骤:
步骤1、繁育基因编辑动物;
步骤2、采集步骤1所述动物的真皮作为原料;
步骤3、取步骤2制得的所述原料脱细胞;
步骤4、取步骤3制得的材料交联化;
其中,步骤3具体为:
浸没于0.001~1wt.%SDS溶液中6~24h,振荡频率为500~1000rpm,温度为0~40℃;
置于-40~-80℃中1~6h,置于20~40℃中1~3h,置于-20~-40℃中3~6h,置于0~30℃中1~2h;
超声波清洗,40~100KHz处理30min~6h,功率200W~1KW,温度为0~40℃;
浸没于0.01~5wt.%SDS溶液中0.5~12h,振荡频率为300~600rpm,温度为20~40℃;
超声波清洗,40~80KHz处理3~6h,功率200W~800W,温度为10~40℃;
置于-20~-60℃中30min~3h,置于20~40℃中1~2h,置于-40~-80℃中30min~3h,置于20~40℃中1~2h。
在本发明的一些具体实施方案中,所述交联化采用的交联剂包括化学交联剂和/或生物交联剂中的至少一种;
所述化学交联剂包括醛类、亚氨酸酯类、N-羟基琥珀酰亚胺酯类(NHS酯)、马来酰亚胺类、卤乙酰基类、二硫代联吡啶、酰肼类、碳二亚酰胺类中的一种或两者以上的混合物;
所述醛类包括戊二醛、甲醛、乙醛中的一种或两者的混合物;
所述生物交联剂包括原花青素、京尼平中的一种或两者的混合物;
所述交联剂的浓度为0.00001~5wt.%,所述交联化的温度为0~40℃,每次交联化的时间为0.5~12h,所述交联化的次数为1~10次。
在本发明的一些具体实施方案中,步骤3具体为:
浸没于0.001wt.%SDS溶液中24h,振荡频率为500rpm,温度为40℃;
置于-80℃中6h,置于20℃中1h,置于-40℃中3h,置于30℃中1h;
超声波清洗,100KHz处理6h,功率1KW,温度为40℃;
浸没于5wt.%SDS溶液中12h,振荡频率为600rpm,温度为30℃;
超声波清洗,40KHz处理3h,功率800W,温度为10℃;
置于-60℃中3h,置于20℃中1h,置于-80℃中30min,置于40℃中2h;
步骤4具体为:
浸没于0.05wt.%戊二醛溶液中2h,浸没温度为30℃,重复浸没2次;
浸没于0.001wt.%京尼平溶液中12h,浸没温度为25℃,重复浸没5次。
在本发明的一些具体实施方案中,步骤3具体为:
浸没于1wt.%SDS溶液中6h,振荡频率为600rpm,温度为30℃;
置于-60℃中3h,置于30℃中3h,置于-40℃中2h,置于20℃中1h;
超声波清洗,100KHz处理2h,功率200W,温度为20℃;
浸没于0.5wt.%SDS溶液中10h,振荡频率为300rpm,温度为20℃;
超声波清洗,50KHz处理4h,功率200W,温度为25℃;
置于-20℃中1h,置于20℃中1h,置于-40℃中30min,置于20℃中1h;
步骤4具体为:
浸没于0.05wt.%乙醛溶液中2h,浸没温度为30℃,重复浸没3次;
浸没于0.001wt.%戊二醛溶液中6h,浸没温度为30℃,重复浸没3次。
在本发明的一些具体实施方案中,步骤3具体为:
浸没于0.02wt.%SDS溶液中10h,振荡频率为400rpm,温度为20℃;
置于-40℃中1~6h,置于30℃中2.5h,置于-40℃中5h,置于20℃中2h;
超声波清洗,60KHz处理4h,功率500KW,温度为0℃;
浸没于0.06wt.%SDS溶液中3h,振荡频率为300rpm,温度为20℃;
超声波清洗,40KHz处理3h,功率400W,温度为30℃;
置于-60℃中1.5h,置于40℃中2h,置于-80℃中30min,置于20℃中2h;
步骤4具体为:
浸没于0.02wt.%京尼平溶液中5h,浸没温度为20℃,重复浸没6次;
浸没于0.02wt.%戊二醛溶液中3h,浸没温度为30℃,重复浸没4次。
在本发明的一些具体实施方案中,所述基因编辑包括巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas)系统中的至少一种。
在本发明的一些具体实施方案中,所述基因编辑包括基因敲除和/或基因转入;
所述基因敲除中敲除的基因包括GGTA1、CMAH、β4GalNT2或PERV中的至少一种;
基因转入中转入的基因包括hCD46、hCD55、hCD47、LEA29Y、hTBM、hTFPI或EPCR中的至少一种。
在本发明的一些具体实施方案中,所述动物包括猪、牛、羊、马、猴、狗、兔、鸡、鼠、蚕、鱼、海洋生物、驴中的至少一种;所述动物为基因编辑后稳定传代3代以上的动物。在另一些具体实施方案中,选用基因编辑后稳定传代5代的动物。
所述鱼包括淡水鱼类。
所述海洋生物包括海洋动物和海洋植物;所述海洋动物包括海洋哺乳动物、海洋爬行动物、海洋鱼类、海洋节肢动物、藤壶、海洋软体动物、海洋棘皮动物或海洋腔肠动物中的一种或多种。所述海洋哺乳动物包括蓝鲸、抹香鲸、虎鲸、齿鲸、海豚、海豹、海狮、儒艮中的一种或多种。所述海洋爬行动物包括海蛇、海龟中的一种或多种。所述海洋鱼类包括前口蝠鲼、电鳐、刺鳐、星鳐、何氏鳐、中国团扇鳐、瞻星鱼、电鳗、康吉鳗、电鲶、箱鲀、鲂鮄、海马、石首鱼类、象鼻鱼、鲨鱼、蝴蝶鱼、刺盖鱼、甲尻鱼、石斑鱼、粗皮鲷、躄鱼、蝙蝠鱼、小丑鱼、带鱼、龙头鱼、烛光鱼、翻车鱼中的一种或多种。所述海洋节肢动物包括鲎、虾、蟹中的一种或多种。所述海洋软体动物包括石鳖、螠蛏、海兔中的一种或多种。所述海洋棘皮动物包括海星、海胆、海参中的一种或多种。所述海洋腔肠动物包括水母、薮枝螅、海蜇、珊瑚或海葵中的一种或多种。所述海洋植物包括浮游藻和底栖藻;所述底栖藻包括绿藻类、褐藻类和红藻类。
在上述研究的基础上,本发明还提供了所述的方法制得的脱细胞真皮材料。
本发明还提供了所述的脱细胞真皮材料在制备组织工程材料、再生医学材料、转化医学材料中的应用。具体应用包括但不限于如下:接触式人工器官,如人工皮肤、异体脱细胞真皮。
在上述研究的基础上,本发明还提供了组合物,包括本发明所述的脱细胞真皮材料以及医学或药学上可接受的活性分子或活细胞,所述活性分子包括生长因子;所述活细胞包括干细胞。
本发明还提供了所述的组合物在组织工程、再生医学、转化医学中的应用。具体应用包括但不限于如下:接触式人工器官,如人工皮肤、异体脱细胞真皮。
本发明提供了一种脱细胞真皮材料的制备方法,以及由此方法制备的真皮材料及其用途。(1)“基因编辑技术”,通过基因编辑技术获得低免疫原性动物,采集真皮原材料,即通过基因编辑技术从材料来源上降低真皮材料的免疫原性;(2)“渐次脱细胞技术”,不同于常规方法(如高浓度试剂一次性脱细胞),采用“少量多次”的原则进行脱细胞处理,比如,通过多次循环使用十二烷基硫酸钠(SDS)浸泡、反复冻融、超声等步骤脱除真皮原材料中免疫抗原活性成分,尽量减少处理过程对材料生物活性等影响;(3)“渐次交联技术”,不同于常规方法(如高浓度交联剂一次性交联),通过低浓度交联剂多次交联,封闭材料中的免疫抗原活性位点。利用本发明加工制备的脱细胞真皮材料,不含活细胞,通过基因编辑技术从真皮原材料源头降低其免疫原性,使用优化的脱细胞处理技术和交联技术进一步降低其免疫原性。本发明的脱细胞真皮材料用于临床皮肤损伤的修复再生和填充材料,在使用过程中可以结合活性分子或活细胞。
本发明脱细胞真皮材料的制备方法,涉及基因编辑技术,与常规方法不同(通过物理、化学、生物方法对既有动物真皮材料进行处理),基因编辑技术是对目标基因进行定点“编辑”,实现对特定DNA片段的修饰,从真皮材料的源头(采集动物)降低其免疫原性。此过程中,根据真皮材料的特点,经过筛选确定编辑系统、目标基因、动物种类等,其中目标基因范围包括GGTA1、CMAH、β4GalNT2和PERV等敲除基因,以及hCD46、hCD55、hCD47、LEA29Y、hTBM、hTFPI和EPCR等转入基因。以GGTA1为例,当异种真皮材料中残留的异种抗原进入人体内时,会引发超急性免疫排斥反应,这种免疫排斥反应的主要靶抗原被认为是由存在于动物组织中的a-Gal抗原引起的,a-Gal抗原存在于除人和高等灵长动物以外的大部分哺乳动物体内;通过基因编辑技术开发a-Gal抗原敲除(GTKO)真皮材料,可以明显降低其免疫原性。
另一方面,本发明脱细胞真皮材料的制备方法,涉及脱细胞技术和交联技术,与常规方法不同(如高浓度SDS溶液单次脱细胞或高浓度戊二醛单次交联),根据基因编辑技术降低其免疫原性的效果,将优化脱细胞处理和交联处理,比如,低浓度SDS溶液多次脱细胞或低浓度戊二醛多次交联,通过温和的处理方式尽量减小处理过程中对材料生物活性等影响。
因此,本发明提供的脱细胞真皮材料及其制备方法和用途具有重要的现实意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1与对比例1的免疫组化检测结果;
图2示实施例1与对比例1的生物活性测试结果;
图3示实施例2与对比例2的免疫组化检测结果;
图4示实施例2与对比例2的生物活性测试结果;
图5示实施例3与对比例3的免疫组化检测结果;
图6示实施例3与对比例3的生物活性测试结果。
具体实施方式
本发明公开了一种脱细胞真皮材料及其制备方法和用途,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种脱细胞真皮材料的制备方法,包括如下步骤:
a.繁育基因编辑动物;
b.采集真皮原材料;
c.将真皮原材料进行多次循环处理,处理方式包括反复冻融、超声、十二烷基硫酸钠(SDS)溶液浸泡;
d.将处理后材料多次浸没于交联剂溶液中。
在一些实施例中,所述基因编辑技术包括巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas)系统中的至少一种。
在一些实施例中,所述基因编辑技术包括基因敲除和基因转入两种,其中,敲除的基因包括GGTA1、CMAH、β4GalNT2和PERV中的至少一种,转入的基因包括hCD46、hCD55、hCD47、LEA29Y、hTBM、hTFPI和EPCR中的至少一种。
在一些实施例中,所述动物包括猪、牛、羊、猴、狗、兔、鼠、鱼、海洋生物、驴中的至少一种;所述用于制备真皮材料的动物为基因编辑后稳定传代3代以上的动物,进一步的,选用基因编辑后稳定传代5代的动物制备真皮材料。
在一些实施例中,所述反复冻融处理中冷冻温度范围为-20~-80℃,冷冻时间为30min~6h,解冻温度范围为0~40℃,解冻时间为1~3h;所述超声处理的频率为40~100KHz,处理时间为30min~6h,超声功率为200W~1
KW,超声温度为0~40℃;所述SDS处理中SDS浓度范围为0.001~5wt.%,振荡频率为300~1000rpm,处理温度为0~40℃,处理时间为0.5~24h;所述多次循环处理是将上述处理方法进行组合使用,每种处理方法的使用次数为0~10次。
在一些实施例中,所述交联剂包括化学交联剂和生物交联剂中的至少一种;进一步的,化学交联剂包括醛类、亚氨酸酯类、N-羟基琥珀酰亚胺酯类(NHS酯)、马来酰亚胺类、卤乙酰基类、二硫代联吡啶、酰肼类、碳二亚酰胺类中的至少一种;更进一步的,醛类包括戊二醛、甲醛、乙醛中的至少一种;生物交联剂包括原花青素、京尼平中的至少一种;交联剂浓度范围为0.00001~5wt.%,浸没温度为0~40℃,单次浸没时间为0.5~12h,浸没次数为1~10次。
本发明还提供了所述方法制备的脱细胞真皮材料。
本发明还提供了所述的脱细胞真皮材料在制备组织工程材料、再生医学材料、转化医学材料中的应用。
本发明提供的脱细胞真皮材料,在使用过程中可以结合活性分子和/或活细胞,活性分子包括生长因子;活细胞包括干细胞。
本发明提供的脱细胞真皮材料及其制备方法和用途中所用试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1
一种猪源脱细胞真皮材料及其制备方法和再生医学应用。
制备方法如下:
a.通过TALEN系统基因编辑制备敲除GGTA1、β4GalNT2,转入hCD47的猪,使用稳定传代5代的基因编辑猪;
b.采集基因编辑猪真皮原材料;
c.将真皮原材料进行如下处理:
c1.浸没于0.001wt.%SDS溶液中24h,振荡频率为500rpm,温度为40℃;
c2.置于-80℃中6h,置于20℃中1h,置于-40℃中3h,置于30℃中1h;
c3.超声波清洗,100KHz处理6h,功率1KW,温度为40℃;
c4.浸没于5wt.%SDS溶液中12h,振荡频率为600rpm,温度为30℃;
c5.超声波清洗,40KHz处理3h,功率800W,温度为10℃;
c6.置于-60℃中3h,置于20℃中1h,置于-80℃中30min,置于40℃中2h;
d.浸没于0.05wt.%戊二醛溶液中2h,浸没温度为30℃,重复浸没2次;
浸没于0.001wt.%京尼平溶液中12h,浸没温度为25℃,重复浸没5次。
通过以上步骤制备的猪源脱细胞真皮材料,用于皮肤修复再生,材料中将添加成纤维细胞。
对比例1
采集普通猪真皮材料。脱细胞处理为:浸没于2wt.%SDS溶液中48h,振荡频率为800rpm,温度为25℃。交联处理为:浸没于2wt.%戊二醛溶液中12h,浸没温度为25℃。
效果例1免疫原性测试
1.1Gal含量检测:通过人α半乳糖苷酶(αGAL)ELISA试剂盒定量检测样品中Gal含量。
结果如下:
参照行业标准《组织工程医疗器械产品动物源性支架材料残留αGal抗原检测》(YY/T1561-2017)中的方法,按照中检院器械所质量评价室的“动物源医疗器槭中残留α-Gal抗原含量和Gal抗原清除率检测标准操作规范”(NIFDC-SOP-F-T-3001)进行检测,敲除GGTA1的猪(GTKO猪,实施例1用猪)皮肤样品的Gal抗原含量低于最低检测限(湿重),对照组野生猪(对比例1用猪)Gal抗原含量为2.03±0.28×1015个/mg(湿重),最低检测限为0.03125(相对于Gal-BSA)μg/mL(相当于8.25×1011个抗原表位/每个反应)。说明实施例1样品具有更低的免疫原性。
1.2免疫组化检测:在大鼠皮下植入样品,经特定时间后,处死实验大鼠,取出植入材料以及周围皮肤组织,用4wt.%多聚甲醛固定液固定,用CD68单抗做免疫组化染色。
结果如图1所示:
CD68单抗进行免疫组化染色,主要标识由于免疫排斥反应测试样品中出现的巨噬细胞(深棕色)。结果表明,经过1个月大鼠皮下植入,实施例1样品发现的巨噬细胞少于对比例1,说明实施例1样品的免疫原性低于对比例1。
效果例2生物活性测试
2.1组织相容性检测:将样品植入大鼠肌肉内,经特定时间后,处死实验大鼠,取出植入材料以及周围肌肉组织,用4wt.%多聚甲醛固定液固定,进行HE染色。
结果如图2所示:
HE染色表明,经过1个月大鼠肌肉植入,实施例1样品和周围肌肉组织完全融合,细胞进入样品生长,而对比例1样品和周围肌肉组织有明显界限,说明实施例1样品的生物活性更好。
实施例2
一种牛源脱细胞真皮材料及其制备方法和再生医学应用。
制备方法如下:
a.通过CRISPR/Cas系统基因编辑制备敲除GGTA1的牛,使用稳定传代3代的基因编辑牛;
b.采集基因编辑牛真皮原材料;
c.将真皮原材料进行如下处理:
c1.浸没于1wt.%SDS溶液中6h,振荡频率为600rpm,温度为30℃;
c2.置于-60℃中3h,置于30℃中3h,置于-40℃中2h,置于20℃中1h;
c3.超声波清洗,100KHz处理2h,功率200W,温度为20℃;
c4.浸没于0.5wt.%SDS溶液中10h,振荡频率为300rpm,温度为20℃;
c5.超声波清洗,50KHz处理4h,功率200W,温度为25℃;
c6.置于-20℃中1h,置于20℃中1h,置于-40℃中30min,置于20℃中1h;
d.浸没于0.05wt.%乙醛溶液中2h,浸没温度为30℃,重复浸没3次;
浸没于0.001wt.%戊二醛溶液中6h,浸没温度为30℃,重复浸没3次。
通过以上步骤制备的牛源脱细胞真皮材料,用于糖尿病足补片。
对比例2
采集普通牛真皮材料。脱细胞处理为:浸没于5wt.%SDS溶液中24h,振荡频率为500rpm,温度为25℃。交联处理为:浸没于1wt.%戊二醛溶液中12h,浸没温度为25℃。
效果例3免疫原性测试
3.1免疫组化检测:在大鼠皮下植入样品,经特定时间后,处死实验大鼠,取出植入材料以及周围皮肤组织,用4wt.%多聚甲醛固定液固定,用CD3单抗做免疫组化染色。
结果如图3所示:
CD3单抗进行免疫组化染色,主要标识由于免疫排斥反应测试样品中出现的T细胞(深棕色)。结果表明,经过1个月大鼠皮下植入,实施例2样品发现的T细胞少于对比例2,说明实施例2样品的免疫原性低于对比例2。
效果例4生物活性测试
4.1组织相容性检测:将样品植入大鼠肌肉内,经特定时间后,处死实验大鼠,取出植入材料以及周围肌肉组织,用4wt.%多聚甲醛固定液固定,进行HE染色。
结果如图4所示:
HE染色表明,经过1个月大鼠肌肉植入,实施例2样品和周围肌肉组织完全融合,细胞进入样品生长,而对比例2样品和周围肌肉组织有明显界限,说明实施例2样品的生物活性更好。
实施例3
一种马源脱细胞真皮材料及其制备方法和再生医学应用。
制备方法如下:
a.通过ZFNs系统基因编辑制备敲除GGTA1、转入hCD46的马,使用稳定传代4代的基因编辑马;
b.采集基因编辑马真皮原材料;
c.将真皮原材料进行如下处理:
c1.浸没于0.02wt.%SDS溶液中10h,振荡频率为400rpm,温度为20℃;
c2.置于-40℃中1~6h,置于30℃中2.5h,置于-40℃中5h,置于20℃中2h;
c3.超声波清洗,60KHz处理4h,功率500KW,温度为0℃;
c4.浸没于0.06wt.%SDS溶液中3h,振荡频率为300rpm,温度为20℃;
c5.超声波清洗,40KHz处理3h,功率400W,温度为30℃;
c6.置于-60℃中1.5h,置于40℃中2h,置于-80℃中30min,置于20℃中2h;
d.浸没于0.02wt.%京尼平溶液中5h,浸没温度为20℃,重复浸没6次;
浸没于0.02wt.%戊二醛溶液中3h,浸没温度为30℃,重复浸没4次。
通过以上步骤制备的马源脱细胞真皮材料,用于胸腔补片。
对比例3
采集普通马真皮材料。脱细胞处理为:浸没于5wt.%SDS溶液中12h,振荡频率为1000rpm,温度为30℃。交联处理为:浸没于2wt.%戊二醛溶液中6h,浸没温度为25℃。
效果例5免疫原性测试
5.1免疫组化检测:在大鼠皮下植入样品,经特定时间后,处死实验大鼠,取出植入材料以及周围皮肤组织,用4wt.%多聚甲醛固定液固定,用CD68单抗做免疫组化染色。
结果如图5所示:
CD68单抗进行免疫组化染色,主要标识由于免疫排斥反应测试样品中出现的巨噬细胞(深棕色)。结果表明,经过2个月大鼠皮下植入,实施例3样品发现的巨噬细胞少于对比例3,说明实施例3样品的免疫原性低于对比例3。
效果例6生物活性测试
6.1组织相容性检测:将样品植入大鼠肌肉内,经特定时间后,处死实验大鼠,取出植入材料以及周围肌肉组织,用4wt.%多聚甲醛固定液固定,进行HE染色。
结果如图6所示:
HE染色表明,经过2个月大鼠肌肉植入,实施例3样品和周围肌肉组织完全融合,细胞进入样品生长,而对比例3样品和周围肌肉组织有明显界限,说明实施例3样品的生物活性更好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种脱细胞真皮材料的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1、繁育基因编辑动物;
步骤2、采集步骤1所述动物的真皮作为原料;
步骤3、取步骤2制得的所述原料脱细胞;
步骤4、取步骤3制得的材料交联化;
其中,步骤3具体为:
浸没于0.001~1wt.%SDS溶液中6~24h,振荡频率为500~1000rpm,温度为0~40℃;
置于-40~-80℃中1~6h,置于20~40℃中1~3h,置于-20~-40℃中3~6h,置于0~30℃中1~2h;
超声波清洗,40~100KHz处理30min~6h,功率200W~1KW,温度为0~40℃;
浸没于0.01~5wt.%SDS溶液中0.5~12h,振荡频率为300~600rpm,温度为20~40℃;
超声波清洗,40~80KHz处理3~6h,功率200W~800W,温度为10~40℃;
置于-20~-60℃中30min~3h,置于20~40℃中1~2h,置于-40~-80℃中30min~3h,置于20~40℃中1~2h。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述交联化采用的交联剂包括化学交联剂和/或生物交联剂中的至少一种;
所述化学交联剂包括醛类、亚氨酸酯类、N-羟基琥珀酰亚胺酯类(NHS酯)、马来酰亚胺类、卤乙酰基类、二硫代联吡啶、酰肼类、碳二亚酰胺类中的一种或两种以上的混合物;
所述醛类包括戊二醛、甲醛、乙醛中的一种或两者的混合物;
所述生物交联剂包括原花青素、京尼平中的一种或两者的混合物;
所述交联剂的浓度为0.00001~5wt.%,所述交联化的温度为0~40℃,每次交联化的时间为0.5~12h,所述交联化的次数为1~10次。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述基因编辑包括巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas)系统中的至少一种。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法,其特征在于,所述基因编辑包括基因敲除和/或基因转入;
所述基因敲除中敲除的基因包括GGTA1、CMAH、β4GalNT2或PERV中的至少一种;
基因转入中转入的基因包括hCD46、hCD55、hCD47、LEA29Y、hTBM、hTFPI或EPCR中的至少一种。
5.如权利要求1至4任一项所述的方法,其特征在于,所述动物包括猪、牛、羊、马、猴、狗、兔、鸡、鼠、蚕、鱼、海洋生物、驴中的至少一种;所述动物为基因编辑后稳定传代3代以上的动物;优选的,选用基因编辑后稳定传代5代的动物。
6.如权利要求1至5任一项所述的方法制得的脱细胞真皮材料。
7.如权利要求6所述的脱细胞真皮材料在制备组织工程材料、再生医学材料、转化医学材料中的应用。
8.组合物,其特征在于,包括如权利要求7所述的脱细胞真皮材料以及医学上可接受的辅料。
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