CN102170920A - 制造脱细胞基质胶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脱细胞基质胶及其制备方法。具体地讲，本发明公开了一种脱细胞基质胶，所述脱细胞基质胶可用于制备用于包括组织工程和疝修复在内的医学应用的强化脱细胞基质。

Description

制造脱细胞基质胶的方法

本专利申请涉及与本专利申请同日提交的、名称为“Acellular Matrix Glue”(脱细胞基质胶)的共同转让的代理人案卷号为ETH5404USNP的专利申请。

技术领域

本发明一般地涉及天然生物材料领域，具体地涉及生物相容性胶，例如生物胶。

背景技术

细胞外基质(ECM)长期以来被认为是结缔组织的重要结构成分。ECM通常被描述为糖蛋白和蛋白聚糖的附接到细胞表面的丝状结构，它为细胞提供固定点、移动牵引和位置识别。目前有大量证据表明，由细胞营造的ECM生成微环境，而其他细胞会通过分化或保持其分化状态来对该微环境作出反应。ECM提供了细胞组织所附着的基底。基于组织的ECM生物材料和装置已被广泛用于各种医学应用，例如，心脏瓣膜、猪小肠粘膜下层(SIS)、人真皮和牛心包膜。利用已知的常规方法将异源或异种结缔组织(例如皮肤、腱、心包膜和SIS)被脱细胞(或灭活)，以形成一种称为脱细胞基质(acellular matrix)的细胞外基质，该基质也可称为去细胞基质(decellularized matrix)。在脱细胞过程中，除去导致组织排斥的细胞，同时保留原始组织的关键生化成分和结构成分。

脱细胞基质在医疗装置的某些应用中的用途是本领域已知的。一个实例是用于软组织附连、加固或构建的生物假体装置。该装置具有天然存在的细胞外基质薄层和连接到该天然存在的细胞外基质部分的合成网片薄层。可以在真空压力下干燥植入物，结果在SIS的层合物之间以及网片和相邻SIS层合物之间形成物理交联。

还知道可将脱细胞基质与强化生物组织一起使用。将生物成分和非生物成分接合或结合的方法，包括将非生物成分周围的组织、非生物成分周围的组织、或嵌入非生物成分的针织物、织物、编织物或其他纺织物内或覆盖其上的组织加以接合或结合。可以将两种成分共混，或使分离的成分层合并紧密缠绕在另一者的周围。通过添加类似于束带和箍状设计的紧固带，可以向层合构造施加压缩力。

将合成构造与脱细胞基质结合的常规方法的已知缺点和不足包括脱层、可操纵性差和加工技术复杂。因此，需要将脱细胞基质与合成支架结合的新颖方法。

发明内容

因此，本发明公开了新颖脱细胞基质胶，以及制备脱细胞基质胶的新颖方法。本发明还公开了新颖强化脱细胞基质。

所述脱细胞基质胶在水溶液中具有脱细胞基质。

本发明的另一个方面是制备本发明的脱细胞基质胶的新颖方法。该方法包括形成脱细胞基质的一些步骤。将脱细胞基质加入水溶液以形成混合物。让混合物在足够的温度范围内温育足够长的时间，以有效地形成脱细胞基质胶。

本发明的又一个方面是新颖强化脱细胞基质。该基质具有脱细胞基质层、脱细胞基质胶层和增强层。其中，脱细胞基质胶层为本发明的新颖脱细胞基质胶。

本发明的再一个方面是使用本发明的新颖脱细胞基质进行疝修复的方法。

本发明的这些方面和其他方面以及优点将通过下列具体实施方式和附图变得更为显而易见。

附图说明

图1为示意图，示出了用于制备本发明的脱细胞基质胶和本发明的强化脱细胞基质的步骤。

图2为本发明的网片加强脱细胞表皮基质的SEM图像。

具体实施方式

本发明的脱细胞基质胶通过以下步骤制备：提供脱细胞基质；将脱细胞基质混合在水溶液中，以形成脱细胞基质混合物；然后在足够有效的温度下将脱细胞基质混合物温育足够有效的时间，从而得到脱细胞基质胶。

本文将脱细胞基质定义为：已被脱细胞以致细胞核和细胞成分从结构性的细胞外基质中移除的组织。脱细胞基质由包括器官或器官的分离部分的组织制备。组织包括(但不限于)心脏瓣膜、小肠粘膜下层、真皮、羊膜、膀胱、网膜、心包膜、韧带、血管等等。在一个实施例中，组织包括(但不限于)网膜和真皮。在另一个实施例中，组织为真皮。组织可得自各种哺乳动物源，包括(但不限于)人、山羊、猪、牛、绵羊、马等等。使用一些常规的方法将组织脱细胞，其中包括诸如保存组织、脱细胞、洗涤、净化和储存之类的步骤。

脱细胞步骤常常涉及通过用含有洗涤剂的盐溶液萃取和用内切酶消化的方式来除细胞成分。

然后将脱细胞基质转移至水溶液中。在一个实施例中，在转移至水溶液中之前，将脱细胞基质加工成较小的碎块。脱细胞基质可通过诸如以下的常规方法加工成较小的碎块：用剪刀、刀片或小刀切割；用例如球磨和低温研磨磨成粉末；以及喷射研磨。通过将脱细胞基质加工成较小的碎块(例如粉末)，可以形成更大的表面积，从而能更快地溶于水溶液中。在一个实施例中，在加入水溶液中之前，通过低温研磨将脱细胞基质加工成粉末。

可用于实施本发明的水溶液包括(但不限于)水、生理缓冲液和盐水。生理缓冲液包括(但不限于)缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS))、Hank平衡盐溶液、Tris缓冲盐水和Hepes缓冲盐水。在一个实施例中，水溶液为水。

在一个实施例中，水溶液任选地包含足够有效量的增塑剂。增塑剂包括(但不限于)甘油、丙二醇、聚乙二醇。在一个实施例中，增塑剂为甘油。

脱细胞基质胶(例如)通过以下步骤制备：提供诸如脱细胞表皮基质之类的脱细胞基质；然后可选地通过低温研磨将脱细胞表皮基质加工成粉末，该脱细胞基质粉末具有小于约2mm的粒度；将约1.0g脱细胞基质粉末混合到10ml水溶液(例如水或磷酸盐缓冲盐水(PBS))中，以形成脱细胞基质混合物。通常，脱细胞基质的含量按水溶液的重量计为约2重量％至约30重量％，优选地为约5重量％至约20重量％。在另一个实施例中，脱细胞基质的含量按水溶液的重量计为约10重量％。然后将脱细胞基质混合物在足够有效的温度下温育足够有效的时间，通常在约70℃至约100℃下温育约10分钟至约48小时，优选地从约80℃至约90℃，并通常温育约1小时至约5小时。也可以在更高的压力下采用更高的温度，例如在2个大气压下采用120℃的温度。脱细胞基质胶允许被冷却至大约37℃以供立即使用，或冷却至室温或以下，直到准备使用的温度。

在另一个实施例中，可任选地加入足够有效量的增塑剂(如甘油)，以增强胶的柔韧性和润湿性能。增塑剂可按根据增塑剂的性质确定的量来添加。就甘油而言，加入脱细胞基质胶的甘油量按含水胶的重量计通常为约0.5重量％至约10重量％。增塑剂可以在让胶冷却之前或之后添加并均匀混合到含水胶中。优选地，在让胶冷却之前加入甘油，以便甘油混合并均匀分布在胶中。

本文所述的脱细胞基质胶可用来制备用于组织修复和组织工程的强化脱细胞基质。利用本发明的脱细胞基质胶的本发明的强化脱细胞基质由脱细胞基质层、增强层和脱细胞基质胶层组成。尽管不被优选，但如果本领域的技术人员愿意接受与之相伴的缺点(如有)，则本发明的脱细胞基质胶也可用作组织胶或密封剂。

脱细胞基质层由脱细胞基质制备。脱细胞基质由包括器官或器官的分离部分在内的组织制备。组织包括(但不限于)心脏瓣膜、小肠粘膜下层、真皮、羊膜、膀胱、网膜、心包膜、韧带、血管等等。在一个实施例中，组织包括(但不限于)网膜和真皮。在另一个实施例中，组织为真皮。组织可得自各种哺乳动物源，包括(但不限于)人、山羊、猪、牛、绵羊、马等等。如上所述，利用常规的工艺和方法将组织脱细胞，从而得到脱细胞基质。通过将脱细胞基质分切成厚度通常为约50微米至约200微米的薄片，可得到脱细胞基质层。脱细胞基质可用常规的方法撕开，例如使用牛皮片皮机。

增强层优选地为纺织物或类似或等同的材料，包括(但不限于)织造、针织、经编针织(即，花边状)、非织造和编织结构。尽管不被优选，但增强层可以为非纺织物的薄片，例如聚合物薄片。在一个实施例中，增强层为织造纺织物，例如网片。在上述纺织物和材料中，可通过改变纺织物或材料的密度或纹理来调整机械性能。用来制备纺织物的纤维可以是(例如)单丝、纱线、丝线、编织物或者纤维束。诸如聚合物薄片之类的材料可具有在其中形成或钻出的孔洞，并且任选地可为多孔材料。这些纤维和诸如薄片之类的材料可由生物相容性、可生物吸收的材料制成，包括(但不限于)聚乳酸(PLA)(包括聚交酯)、聚乙醇酸(PGA)(包括聚乙交酯)、聚己内酯(PCL)、聚对二氧环己酮(PDO)和聚碳酸亚丙基酯(PTMC)。这些纤维也可由生物相容性、不可吸收的聚合物制成，包括(但不限于)聚烯烃、聚碳酸酯、聚氯乙烯、苯乙烯(包括丙烯腈丁二烯苯乙烯)、尼龙、丙烯酸树脂、热塑性氨基甲酸酯、热塑性弹性体、热固性塑料、聚酰胺、聚酯、可塑性硅、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯醇(PVA)、以及它们的共聚物或共混物。合适的聚烯烃包括(但不限于)聚乙烯、聚丙烯、以及它们的共聚物。在一个实施例中，构成纺织物的纤维由聚丙烯形成。

在一个实施例中，强化脱细胞基质通过提供增强层、脱细胞基质层和脱细胞基质胶制备。应将脱细胞基质胶加热至足够有效的温度(通常从约50℃至约90℃)，以使脱细胞基质的胶原成分变性，然后在使用之前让其冷却至所需温度，通常从约30℃至约50℃，优选地至约37℃。然后，将脱细胞基质胶以足够的量设置在脱细胞基质层和增强层之间，以将基质层和增强层有效地接合，并以常规方式将其干燥，以形成强化脱细胞基质。例如，可通过以下方式制备基质：提供具有顶面和底面的增强层；将一层脱细胞基质胶设置在增强层顶面上；然后在胶层上设置脱细胞基质，从而将增强层和脱细胞基质层粘合在一起。作为另外一种选择，可通过以下方式制备基质：提供脱细胞基质层；将一层脱细胞基质胶设置在脱细胞基质层上；然后在胶层上设置增强层，从而将增强层和脱细胞基质层粘合在一起。多层强化脱细胞基质也可以通过将增强层、脱细胞基质胶层和脱细胞基质层连续地交替来形成，或通过改变结构中层合材料的位置来形成。脱细胞基质胶和脱细胞基质层可由如上所述的同类的组织或不同类的组织制备。在一个实施例中，脱细胞基质层和脱细胞基质胶层由同类的组织制备。

任选地，可通过使用常规方法(例如，使用甲醛蒸汽、戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)或氧化多糖)将脱细胞基质胶层和脱细胞基质层交联而使强化脱细胞基质稳定化。多糖包括(但不限于)透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、乙酰肝素、硫酸乙酰肝素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、海藻酸盐、以及其他长链多糖。在一个实施例中，通过EDC交联使强化脱细胞基质稳定化，即在包含醇(例如乙醇、异丙醇、丙醇)的溶液中加入1％的EDC，溶液中醇的浓度优选地在约40％至约70％之间。

在一个实施例中，一种或多种生物活性剂可被任选地掺入强化脱细胞基质和/或涂敷在强化脱细胞基质上。在一个实施例中，生物活性剂被掺入增强成分中或涂敷到增强成分上。在另一个实施例中，将生物活性剂掺入到脱细胞基质胶中。在又一个实施例中，生物活性剂被掺入到脱细胞基质中。

合适的生物活性剂包括(但不限于)防止感染的药剂(如抗微生物剂和抗生素)、减少发炎的药剂(如抗炎剂)、防止或最小化粘连形成的药剂(例如，氧化再生纤维素(如可得自Ethicon，Inc.的INTERCEED和SURGICEL)和透明质酸)、以及抑制免疫系统的药剂(如免疫抑制剂)、异源或自体的生长因子、蛋白质(包括基质蛋白)、肽、抗体、酶、血小板、富血小板血浆、糖蛋白、激素、细胞因子、糖胺聚糖、核酸、止痛剂、病毒、病毒颗粒、以及细胞类型、趋化剂、抗生素、以及甾体类与非甾体类止痛剂。

也可以在本发明的强化脱细胞基质中加入活组织。活组织源可以变化，并且组织可具有各种构型，然而在一个实施例中，组织任选地以切碎或细分的组织片段或碎片形式存在，这样可以提高组织再生长效率并促进愈合反应(如软骨)。在另一个实施例中，活组织可以任选地是从健康组织获得的组织切片或组织条的形式，其包含能够组织再生和/或重塑的活细胞。

强化脱细胞基质中也可掺入活细胞。合适的细胞类型包括(但不限于)骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、成纤维细胞、干细胞、多能细胞、软骨祖细胞、软骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞、白细胞、脂肪细胞、单核细胞、浆细胞、肥大细胞、脐带细胞、基质细胞、间质干细胞、上皮细胞、成肌细胞、肌腱细胞、韧带成纤维细胞、神经细胞、骨髓细胞、滑膜细胞、胚胎干细胞；源自脂肪组织的前体细胞；外周血祖细胞；从成人组织分离的干细胞；遗传转化细胞；软骨细胞与其他细胞的组合；骨细胞与其他细胞的组合；滑膜细胞与其他细胞的组合；骨髓细胞与其他细胞的组合；间质细胞与其他细胞的组合；基质细胞与其他细胞的组合；干细胞与其他细胞的组合；胚胎干细胞与其他细胞的组合；从成人组织分离的前体细胞与其他细胞的组合；外周血祖细胞与其他细胞的组合；从成人组织分离的干细胞与其他细胞的组合；以及遗传转化细胞与其他细胞的组合。

本发明的强化脱细胞基质还可用于基因治疗技术，其中核酸、病毒或病毒颗粒将所关注的基因递送至特定的细胞或细胞类型，该基因对至少一种所关注的基因产物进行编码。因此，生物活性剂可以是核酸(如，DNA、RNA或寡核苷酸)、病毒、病毒颗粒或非病毒载体。病毒和病毒颗粒可以是DNA或RNA病毒，或者可以源自DNA或RNA病毒。所关注的基因产物优选地选自蛋白质、多肽、干扰核糖核酸(iRNA)、以及它们的组合。

在将足够有效量的适用核酸和/或病毒制剂(即，病毒或病毒颗粒)掺入强化脱细胞基质之后，即可将装置植入具体部位，以引起所需类型的生物学反应。核酸或病毒制剂随后可以被细胞吸收，并且其编码的任何蛋白质都可以由细胞局部产生。在一个实施例中，核酸和病毒制剂可以被组织糜悬浮液的组织片段内的细胞吸收，或者(在一个可选实施例中)核酸或病毒制剂可被受伤组织部位周围组织中的细胞吸收。本领域技术人员将会认识到，产生的蛋白质可以是上述类型的蛋白质，或者是有利于增强组织治愈损伤或疾病、抗感染或减少炎性反应的能力的类似蛋白质。核酸还可以用来阻断可能对组织修复过程或其他正常生物过程产生负面影响的不需要的基因产物的表达。DNA、RNA和病毒制剂常用来完成此类表达阻断功能，其也被称为基因表达敲除。

本领域技术人员应当知道，外科医生、保健专业人员或其他生命科学专业人员可根据医学科学原理和适当的治疗目的确定生物活性剂的特性。还应当理解，可以在制造之前、过程中或之后，或者在通过外科手术植入强化脱细胞基质之前、过程中或之后将生物活性剂掺入强化脱细胞基质中。

本发明的强化脱细胞基质可用于想要强化组织的下列外科手术中，包括但不限于：腹部外科手术，例如疝修复术和骨盆底修复术；整容外科手术，例如乳房上提术和面部提拉术；以及其他组织修复手术，例如旋转套修复术。采用常规组织附连装置(包括胶、缝线、缝钉、平头钉等等)将脱细胞基质安装到组织上。

以下实例旨在说明本发明的原理和实践，而非限制本发明。一旦具有本公开的有益效果，本发明范围和精神内的许多其他实施例对本领域的技术人员来说将显而易见。

实例1

脱细胞基质胶的配制方法

使用6800冷冻研磨机(SPEX CertiPrep(Metuchen，NJ))将以商品名DermMatrix购自Advanced UroScience(St.Paul，Minn.)的脱细胞猪表皮基质研磨成细粉。将1.0g脱细胞表皮基质粉末加入聚丙烯试管内的10ml水溶液中，该溶液中含有7％的甘油和1.3％的乙酸。将试管置于80℃水浴中，并加以磁力搅拌。在80℃下温育3小时之后，胶变得不透明。将胶取出水浴，并在使用前让其冷却至37℃。该方法如图1所示。

实例2

脱细胞猪表皮基质薄层的制备

使用片皮机(由Columbia Organ Leather(Columbia，PA)制造)将以商品名DermMatrix购自Advanced UroScience(St.Paul，Minn.)的脱细胞猪表皮基质分切成薄层，以用作原型制剂。分切之前，将脱细胞猪表皮基质在IPA中浸泡24小时。将8cm×8cm的方形脱细胞猪表皮基质送入片皮机，并分切到最终厚度在0.19mm至0.10mm的范围内。分切之后，将脱细胞猪表皮基质薄片保存在IPA中作进一步处理，直到立即可用。对所有脱细胞猪表皮基质样品重复该过程。

实例3

强化脱细胞猪表皮基质的制备

制备网片加强脱细胞表皮基质的方法如图1所示。用去离子水洗涤实例2制备的分切的脱细胞表皮基质样品，然后在20℃下冻干。将Ultrapro网片(Ethicon Inc.(Somerville，NJ))置于50℃的去离子水中温育10天，除去其可吸收成分，通过这种方式制备轻质聚丙烯网片。将轻质聚丙烯网片置于两层3×5cm的分切的脱细胞表皮基质之间，并用37℃下保存的实例1中制备的3ml脱细胞基质胶粘合在一起。整个构造被冷却至室温，并在细胞培养罩内风干。

实例4

网片加强脱细胞猪表皮基质的稳定化

将按实例3中所述方法制备的强化脱细胞表皮基质用100ml乙醇磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(40％乙醇)洗涤30分钟。然后，将洗涤过的强化脱细胞表皮基质移入50ml新制备的10mg/ml 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的乙醇PBS溶液中。在室温下温育4小时之后，将交联的强化脱细胞基质用6％甘油(w/w)水溶液洗涤两遍。将交联的强化脱细胞基质风干。

实例5

通过SEM评价网片加强脱细胞表皮基质

将实例4中制备的样品安装在显微镜台(microscope stud)上，并使用EMS 550溅射镀膜仪(Electron Microscopy Sciences(Hatfield，PA))镀上金薄层。使用JEOL JSM-5900LV SEM(JEOL(Tokyo，Japan))进行SEM分析。检查各样品的表面和横截面积。SEM图像(参见图2)显示，网片嵌入在两个脱细胞表皮基质薄层的中间。

实例6

疝修复动物模型

采用猪模型，受试者被麻醉并按常规方式准备手术。在脐带上方/颅侧和/或下方/尾侧开出正中切口：穿过皮肤和皮下组织开出腹部正中切口，露出中线/白线内的腹壁筋膜。在白线内制备位于脐带颅侧和尾侧的两个长度约3cm的正中缺损，露出腹膜前脂肪组织和腹膜。将网片加强脱细胞基质修剪到适当尺寸，平放在腹部筋膜上，并用尺寸为#3-0的PROLENE缝线(Ethicon，Inc.(Somerville，NJ))缝合固定。用单根尺寸为USP 3-0的Monocryl缝线缝合皮下组织和皮肤。此外，用局部用皮肤粘合剂粘合皮肤，以防早期伤口污染。

实例7

用强化脱细胞基质进行开放式人体疝修复

以常规方式对病人做开放式疝修复手术准备。以常规方式实施全身麻醉，任选地，可对患者实施常规局部或区域麻醉，这取决于疝的部位和修复的复杂性。任选地将导管插入膀胱，以排出尿液并对膀胱减压。

开出大小刚好足以从疝附近的腹壁取出脂肪和瘢痕组织的切口。将变薄的疝区域的外侧边缘界定，并从该区域内移除过多的组织。然后，施加本发明的强化脱细胞基质，使其在各个方向与变薄的区域重叠数英寸(厘米)，并用不可吸收缝线将其固定。然后使腹壁靠拢，并用非吸收性缝线缝合。栓紧缝线并打结。

相比将合成构造与脱细胞基质结合的常规方法，本发明所公开的构造中的合成构造和脱细胞基质可以完好地结合成一体而避免脱层。因此，这些构造是柔韧的。脱细胞基质胶形成了将生物活性剂掺入这些复合构造内的递送介质。

虽然本发明已通过其详细实施例得到了显示和描述，但本领域技术人员将理解，可对本发明作出形式上和细节上的各种变化而不背离受权利要求书保护的本发明的精神和范围。

Claims (9)

1.一种制备脱细胞基质胶的方法，所述方法包括以下步骤：

提供脱细胞基质；将所述脱细胞基质加入水溶液，以得到混合物；

以及将所述混合物在足够有效的温度下温育足够有效的时间，以形成脱细胞基质胶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述温度在约70℃至约100℃的范围内。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述时间在约10分钟至约48小时的范围内。

4.根据权利要求1所述的方法，另外包括在使用前将所述脱细胞基质胶冷却至约37°的步骤。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱细胞基质包括得自哺乳动物源的脱细胞组织，所述哺乳动物源选自人、山羊、猪、牛、绵羊和马。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述脱细胞组织选自心脏瓣膜、小肠粘膜下层、真皮、羊膜、膀胱、网膜、心包膜、韧带和血管。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述水溶液选自水、生理缓冲液和盐水。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱细胞基质胶另外包含选自甘油、丙二醇和聚乙二醇的增塑剂。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱细胞基质胶包含约2(w/v)％的脱细胞基质和约30(w/v)％的水溶液。

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