CN104971380A - 一种脱细胞基质修复凝胶及其制备新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物材料领域，尤其涉及一种脱细胞基质修复凝胶及其制备新方法。本发明公开了一种脱细胞基质修复凝胶及其制备方法，该方法将取自哺乳动物的组织器官通过脱细胞处理和凝胶化处理，制备获得一种脱细胞基质修复凝胶。本发明提供的脱细胞基质修复凝胶消除了异种及异体组织的免疫原性，最大限度的保留了组织细胞外基质成分的活性，能够特异性修复人体受损组织器官，并且适用性强，适用于各种不规则形状修复区域和体内不同部位环境需要，具有巨大的临床价值。
Description
技术领域
本发明涉及组织基质材料制备，尤其涉及一种脱细胞基质修复凝胶及其制备的新方法，属于生物材料领域。
背景技术
组织器官的修复与重建是指组织、器官损伤后由临近健康细胞通过再生来修补恢复的过程，由于组织自发愈合过程固有的缺陷，一旦组织和器官出现缺损或功能障碍时，就会造成一定程度上的再生障碍或者是永久性缺损。因此组织器官的修复与重建一直是生物、医学等相关领域的焦点。伴随着对组织再生修复机制及组织工程学研究的开展和深入，寻找及研制各种有应用价值的可吸收并能促进再生的生物物质，已经成为该领域的一个热点。
细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是由动物细胞合成并分泌到细胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要成分包括胶原纤维、糖蛋白、黏蛋白等，其他成分有氨基葡聚糖（透明质酸、硫酸软骨素）等糖类，还有一些脂质和生长因子。这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构，调节组织的发生和细胞的生理活动，在细胞迁移、分化和增殖方面有着重要的作用。由于细胞外基质可以来源于不同的组织器官，因此不同组织器官的脱细胞基质在成分和三维超微结构上也存在差异，研究证实，源自相同组织器官的细胞外基质在修复相同组织器官的损伤时效果更好，Wang等比较了人脂肪脱细胞基质和脱细胞小肠黏膜上皮微粒的体内成脂能力，结果表明人脂肪脱细胞基质更能有效诱导脂肪组织的形成。
异种或异体细胞抗原由于被宿主认为是外来体，因此引发了宿主的炎性反应和免疫介导的排斥反应。然而细胞外基质是结构蛋白和功能蛋白的复合物，该组分常常在不同物种间保守，并能被异种受体耐受。许多动物组织器官和人体具有相似的细胞外基质成分和结构，通过脱细胞技术获得的ECM生物支架已被广泛应用与人体组织重建，如心脏膜瓣、皮肤、肌腱和硬脑膜等，其三维结构与体内细胞生长的天然环境接近，不仅可以起着支架材料的作用，而且包含多种生长因子，在组织修复和重建中有重要促进作用。
目前制备细胞外基质的脱细胞方法有很多，主要包括物理法、化学法和生物处理法，但是每种脱细胞方法均会改变ECM成分，引起不同程度超微结构的损害，这些改变会影响人体对植入基质材料的反应。因此研究通过温和的脱细胞方法得到细胞外基质，最大限度的保留组织ECM的成分和天然结构，是非常有必要的。
目前国内外研究大多是将细胞外基质用于组织工程支架，通过植入人体代替受损组织器官，为组织器官细胞再生提供支架，并随着自体组织的修复逐渐降解吸收。然而这种传统的细胞外基质支架对于损伤较小、受损区域不规则或无需替代的受损组织则不适用，因此国内外学者已开始尝试改变脱细胞基质的使用形态以满足多种组织或器官修复的需要，申请号为200910191251.1的专利公开了一种用于组织修复的颗粒状生物材料及制备方法，通过将脱细胞基质和胶原、硫酸软骨素、透明质酸、壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸、藻酸盐中任一种或至少两种组合而制备的膜片状生物材料冻干，再在设定参数下常温切割成长条，最后切割成粒径范围在60μm-6000μm的颗粒状，采用注射、喷洒、播撒、填塞方法直接用于组织或器官修复，但是颗粒状材料黏附性差，粒径不均造成吸收不平衡，修复效果不理想；申请号为200980135089.X的专利公开了一种制造脱细胞基质胶的方法，通过将脱细胞基质加入水、生理缓冲液或盐水中在70～100℃下温育10分钟至48小时，形成脱细胞基质胶，用于制备包括组织工程和疝修复在内的医学应用的强化脱细胞基质，但是该方法由于温育温度高，使得脱细胞基质的活性成分如生长因子等被严重破坏，使用效果大大降低。
理想的组织器官修复材料应尽可能模拟人体组织所处的生理环境，为组织再生提供细胞生长空间，能够诱导组织细胞再生分化，促进损伤组织的再生修复，并且能满足不同部位不规则形状的修复需要。
发明内容
本发明针对现有脱细胞基质修复材料的局限性，提供了一种脱细胞基质修复凝胶及其制备方法，通过脱细胞处理和凝胶化处理，将取自哺乳动物的组织器官制备成脱细胞基质修复凝胶，消除了异种（体）组织的免疫原性，最大限度的保留了组织细胞外基质成分的活性，能够特异性修复人体受损组织器官，诱导组织再生，并且适用性强，能满足不同组织各种不规则形状修复区域的需要。
本发明制备脱细胞基质修复凝胶的策略为：首先对动物组织器官进行预处理，清除血迹和污垢，经病毒灭活后剪成碎块，以利于细胞脱除，然后用去垢剂除去细胞膜脂质成分，增加细胞的通透性，再用胰蛋白酶处理，脱除细胞，再经核酸酶降解细胞中各类DNA和RNA成分，经清洗除掉各种去垢剂后得到脱细胞基质，脱细胞基质再经消化和恒温孵育得到脱细胞基质修复凝胶。
进一步的，本发明制备脱细胞基质修复凝胶的具体步骤如下：
1）预处理：用PBS缓冲液清洗除去新鲜动物组织器官上的血迹和污垢；
2）病毒灭活：将前一步骤预处理后的动物组织器官用病毒灭活试剂浸泡进行病毒灭活，所述病毒灭活试剂为过氧乙酸水溶液；
3）剪碎：将前一步骤病毒灭活处理后的动物组织器官剪碎；
4）脱除细胞膜脂质成分：用含去垢剂的PBS缓冲溶液脱除细胞膜脂质成分，脱除处理后采用PBS缓冲液清洗；
5）脱细胞：用含胰蛋白酶和EDTA的PBS缓冲溶液脱除细胞，脱除处理后采用PBS缓冲液清洗；
6）核酸酶处理：用含核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的PBS混合溶液脱除残留的细胞核成分，酶脱除反应结束后采用PBS缓冲液清洗，得到组织脱细胞基质；
7）消化：将前一步骤的组织脱细胞基质置于消化液中振荡进行消化处理，所述消化液为蛋白酶溶液；
8）恒温孵育：消化反应结束后加入PBS缓冲液进行恒温孵育，即可得到脱细胞基质凝胶。
本发明所提供的由细胞外基质制备凝胶的方法简单，条件温和，对细胞外基质中的营养因子和生长因子破坏小，修复效果好；同时本发明还提供了一种温和的组织脱细胞方法，能够快速有效的脱除细胞，并且最大限度的保留细胞外基质成分的活性。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步的，步骤1）所述动物组织器官来源于哺乳动物的组织器官。
所述哺乳动物选自人、猪、牛、羊和兔；所述组织器官选自皮肤、脑膜、膈膜、羊膜、心包膜、心脏瓣膜、小肠粘膜下层、肌肉、血管、肌腱、韧带、软骨、食道、胃、神经和膀胱。
进一步，步骤2）所述病毒灭活试剂为质量浓度0.1%～1%的过氧乙酸水溶液。
进一步，步骤2）所述病毒灭活试剂浸泡的时间为0.5～2h。
进一步，步骤3）动物组织器官剪碎后获得的碎片或碎块的粒径范围为0.1～1cm。
进一步，步骤4）所述的含去垢剂的PBS缓冲溶液，去垢剂的浓度为0.1～2wt%；去垢剂的种类选自曲拉通X-100、脱氧胆酸钠、平平加，以及十二烷基磺酸钠中的任一种。
更进一步，步骤4）所述细胞膜脂质成分的脱除方法为：室温下振荡处理0.5～2h。
进一步，步骤5）所述的含胰蛋白酶和EDTA的PBS缓冲溶液，胰蛋白酶的浓度为0.1～1wt%，EDTA的浓度为0.1～1wt%。
更进一步，步骤5）所述脱除细胞处理的条件为：室温振荡处理1～4h。
进一步，步骤6）所述的含核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的PBS混合溶液，核糖核酸酶的浓度为5～50μg/ml，脱氧核糖核酸酶的浓度为50～500μg/ml。
更进一步，步骤6）所述脱除细胞核成分处理的反应条件为室温振荡1-2h。
进一步，步骤7）所述消化液为0.1～0.5wt%的蛋白酶溶液，所述蛋白酶的种类选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，以及组织蛋白酶中的任一种。
消化液的pH值为上述蛋白酶的最适pH值，可通过市售商品酶的说明书获知。通过调节pH的方法终止消化反应，之后将pH值调至人体体液pH值（pH值7.35～7.45），再进行后续孵育步骤。
更进一步，步骤7）消化处理的时间为24～48h。
进一步，步骤8）所述恒温孵育的时间为24～48h，孵育温度为37±1℃。
本发明第二方面公开了一种脱细胞基质修复凝胶，采用上述方法制备获得。
本发明提供的脱细胞基质修复凝胶由哺乳动物的组织器官经脱细胞和凝胶化处理得到，用于人体受损组织器官的特异性修复。
本发明第三方面公开了前述脱细胞基质修复凝胶的制备方法，以及脱细胞基质修复凝胶在特异性修复人体受损组织器官中的应用。
本发明所述特异性修复，指用源自相同组织器官的脱细胞基质凝胶修复相同的受损组织。
本发明第四方面公开了前述脱细胞基质修复凝胶的制备方法，以及脱细胞基质修复凝胶在制备组织损伤修复制剂中的应用。
本发明的有益效果如下：
1.本发明提供的脱细胞基质修复凝胶及其制备方法最大限度的保留了细胞外基质的有效成分的生物活性（包括各种生长因子），安全性高，适用性强，修复人体受损组织器官具有特异性，能够诱导组织再生修复。
2.本发明提供的脱细胞方法温和有效，通过将动物组织剪碎有利于去垢剂、胰蛋白酶和核酸酶渗透到组织内部，缩短了脱细胞时间，并且能在更温和的条件下彻底脱除细胞成分，对细胞外基质的成分和超微结构的破坏程度小。
本发明所用原料取自异种（体）动物组织器官，来源广泛，制备方法工艺简单，产品使用方便。
附图说明
图1为制备的组织脱细胞基质修复凝胶；
图2为注有神经脱细胞基质凝胶的神经导管；
图3为用注有神经脱细胞基质凝胶的神经导管修复8mm大鼠坐骨神经缺损；
图4为术后三个月新生神经横切片，可见大量新生神经轴突；
图5为术后三个月新生神经纵切片，可见大量新生神经轴突；
图6为皮肤二度烫伤照片；
图7为真皮脱细胞基质修复凝胶涂覆治疗后2个月照片，可见皮肤已完好修复。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1牛坐骨神经脱细胞基质修复凝胶的制备
1.脱细胞基质修复凝胶的制备
取牛坐骨神经20g，PBS缓冲液清洗除去血迹和污垢，用200ml0.1%的过氧乙酸溶液浸泡0.5h灭菌，之后将坐骨神经剪成0.1cm左右的小段，置于200ml浓度为2%的曲拉通X-100PBS缓冲溶液中，振荡处理0.5h，然后用100ml含0.1%胰蛋白酶和1%EDTA的PBS缓冲溶液进行脱细胞处理，振荡4h，之后用200ml含5μg/ml核糖核酸酶和50μg/ml脱氧核糖核酸酶的PBS缓冲溶液脱除残留核酸得到牛坐骨神经脱细胞基质5g，然后用50ml含0.5%胃蛋白酶的0.01M盐酸溶液进行消化，振荡24h后加入5ml的0.1M氢氧化钠溶液和50ml PBS缓冲液，调节pH至7.4，37℃下孵育48h得到牛坐骨神经脱细胞基质修复凝胶。
2.效果实验
用前述制备的牛坐骨神经脱细胞基质修复凝胶注入神经导管（如图2所示），用大鼠做了动物评估实验，以注入牛坐骨神经脱细胞基质修复凝胶的神经导管桥接大鼠坐骨神经8mm缺损（如图3所示）。
术后三个月进行组织切片观察，结果表明神经导管内有大量新生神经轴突，大鼠坐骨神经功能恢复良好，实验结果参见附图4-5。
实施例2猪真皮脱细胞基质修复凝胶的制备
1.脱细胞基质修复凝胶的制备
取猪真皮约100g，PBS缓冲液清洗除去血迹和污垢，用200ml1%的过氧乙酸溶液浸泡2h灭菌，之后将真皮剪成1cm见方的小片，置于500ml浓度为0.1%的脱氧胆酸钠PBS缓冲溶液中，振荡处理2h，然后用500ml含1%胰蛋白酶和0.1%EDTA的PBS缓冲溶液进行脱细胞处理，振荡1h，之后用200ml含50μg/ml核糖核酸酶和500μg/ml脱氧核糖核酸酶的PBS缓冲溶液脱除残留核酸得到猪真皮脱细胞基质32g，然后用200ml含0.1%木瓜蛋白酶的PBS溶液进行消化，振荡48h后调节pH至2使消化终止，加入300ml PBS缓冲液，调pH至7.4，37℃下孵育24h得到猪真皮脱细胞基质修复凝胶。
2.效果实验
用本实施例所制备的猪真皮脱细胞基质修复凝胶涂敷治疗人体皮肤二度烫伤（附图6），2个月后可见皮肤修复完全，并且不留疤痕，具体参见附图（附图7）。可见猪真皮来源的脱细胞基质修复凝胶对病患皮肤疾病或损伤的治疗确实有效。
实施例3牛肌腱脱细胞基质修复凝胶的制备
取牛肌腱20g，PBS缓冲液清洗除去血迹和污垢，用50ml0.5%的过氧乙酸溶液浸泡1h灭菌，之后将肌腱剪成0.5cm左右的小块，置于50ml浓度为0.5%的脂肪醇聚氧乙烯醚（平平加）PBS缓冲溶液中，振荡处理1h，然后用60ml含0.1%胰蛋白酶和0.1%EDTA的PBS缓冲溶液进行脱细胞处理，振荡3h，之后用40ml含10μg/ml核糖核酸酶和50μg/ml脱氧核糖核酸酶的PBS缓冲溶液脱除残留核酸得到牛肌腱脱细胞基质5g，然后用50ml含0.1%胃蛋白酶的0.01M盐酸溶液进行消化，振荡24h后加入5ml的0.1M氢氧化钠溶液和50ml PBS缓冲液，调节pH至7.4，37℃下孵育24h得到牛肌腱脱细胞基质修复凝胶，可以将其涂于受损的肌腱或肌腱缝合口，特异性修复损伤肌腱。
实施例4羊血管脱细胞基质修复凝胶的制备
取羊血管5g，PBS缓冲液清洗除去血迹和污垢，用20ml1%的过氧乙酸溶液浸泡2h灭菌，之后将血管剪成0.2cm长的小段，置于50ml浓度为0.5%的十二烷基磺酸钠PBS缓冲溶液中，振荡处理1.5h，然后用50ml含0.2%胰蛋白酶和0.1%EDTA的PBS缓冲溶液进行脱细胞处理，振荡2h，之后用30ml含5μg/ml核糖核酸酶和50μg/ml脱氧核糖核酸酶的PBS缓冲溶液脱除残留核酸得到羊血管脱细胞基质2g，然后用10ml含0.1%胰蛋白酶的PBS溶液进行消化，振荡30h后调节pH至2终止消化，加入9ml PBS缓冲液，调节pH至7.4，37℃下孵育48h得到羊血管脱细胞基质修复凝胶，可以将其涂于受损的血管或血管缝合口，特异性促进血管修复。
Claims (10)
1.一种制备脱细胞基质修复凝胶的方法，具体步骤如下：
1）预处理：用PBS缓冲液清洗除去新鲜动物组织器官上的血迹和污垢；
2）病毒灭活：将前一步骤预处理后的动物组织器官用病毒灭活试剂浸泡进行病毒灭活，所述病毒灭活试剂为过氧乙酸水溶液；
3）剪碎：将前一步骤病毒灭活处理后的动物组织器官剪碎；
4）脱除细胞膜脂质成分：用含去垢剂的PBS缓冲溶液脱除细胞膜脂质成分，脱除处理后采用PBS缓冲液清洗；
5）脱细胞：用含胰蛋白酶和EDTA的PBS缓冲溶液脱除细胞，脱除处理后采用PBS缓冲液清洗；
6）核酸酶处理：用含核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的PBS混合溶液脱除残留的细胞核成分，酶脱除反应结束后采用PBS缓冲液清洗，得到组织脱细胞基质；
7）消化：将前一步骤的组织脱细胞基质置于消化液中振荡进行消化处理，所述消化液为蛋白酶溶液；
8）恒温孵育：消化反应结束后加入PBS缓冲液进行恒温孵育，即可得到脱细胞基质凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）所述动物组织器官来源于哺乳动物的组织器官。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物选自人、猪、牛、羊和兔；所述组织器官选自皮肤、脑膜、膈膜、羊膜、心包膜、心脏瓣膜、小肠粘膜下层、肌肉、血管、肌腱、韧带、软骨、食道、胃、神经和膀胱。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）所述病毒灭活试剂为质量浓度0.1%～1%的过氧乙酸水溶液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4）所述的含去垢剂的PBS缓冲溶液，去垢剂的浓度为0.1～2wt%；去垢剂的种类选自曲拉通X-100、脱氧胆酸钠、平平加，以及十二烷基磺酸钠中的任一种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5）所述的含胰蛋白酶和EDTA的PBS缓冲溶液，胰蛋白酶的浓度为0.1～1wt%，EDTA的浓度为0.1～1wt%。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤6）所述的含核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的PBS混合溶液，核糖核酸酶的浓度为5～50μg/ml，脱氧核糖核酸酶的浓度为50～500μg/ml。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤7）所述消化液为0.1～0.5wt%的蛋白酶溶液，所述蛋白酶的种类选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，以及组织蛋白酶中的任一种。
9.一种脱细胞基质修复凝胶，采用权利要求1-8任一权利要求所述方法制备获得。
10.权利要求1-8任一权利要求所述制备方法，以及权利要求9所述脱细胞基质修复凝胶在制备组织损伤修复制剂中的应用。
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