CN102143765A - 无细胞基质胶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了无细胞基质胶及其制备方法。具体而言，是可用于制备供医疗应用的增强型无细胞基质的无细胞基质胶，所述医疗应用包括组织工程和疝气修复。

Description

无细胞基质胶

本专利申请涉及与本申请同日提交、代理人案卷号为ETH5409USNP、标题为《制造无细胞基质胶的方法》的共同转让的专利申请。

技术领域

本发明总体而言涉及天然生物材料的领域，更具体而言涉及生物相容性胶如生物胶。

背景技术

一直公认胞外基质(ECM)是结缔组织的重要结构组分。ECM通常被描述为糖蛋白和蛋白聚糖的丝状结构，其连接到细胞表面，给细胞提供锚着、运动牵引力和位置识别。现有相当多的证据证明，细胞所精细产生的ECM会产生出这些细胞和其他细胞要响应的微环境，通过分化或维持它们的分化状态。ECM可作为基材，供粘附于其上的细胞进行组构。基于组织的ECM生物材料和装置已被广泛用于多种医学应用，如心脏瓣膜、猪小肠粘膜下层(SIS)、人真皮和牛心包膜。用已知的常规方法使同种异体的或异种的结缔组织如皮肤、腱、心包膜和SIS进行去细胞化(decellularized)(或者失活)，以提供一类称为无细胞基质的胞外基质，也可称为去细胞化基质。在去细胞化过程中，除去会导致组织排斥的细胞，而保留原始组织的关键生化成分和结构成分。

无细胞基质用于医疗器械中的某些应用是本领域公知的。一个例子是用于软组织连接、增强或构建的生物修复装置。该装置具有一片天然胞外基质和一片结合至该天然胞外基质部分的合成网状织物。可将这种植入物在真空压力下进行干燥，从而导致SIS的各个薄片之间和网状织物与相邻的SIS薄片之间的物理交联。

还已知将无细胞基质与增强型生物组织一起使用。将生物组分与非生物组分结合或组合在一起的方法包括组织包围非生物组分，非生物组分包围组织，或者组织包埋在非生物组分的针织物、机织物、编织物或其他织物当中，或者组织包覆这些织物。两种组分可共混在一起，或者各个组分可层叠并相互紧密卷绕。可通过附上类似于带箍(belt and hoop)式样的紧固带，给层叠的构造物施加压缩力。

常规的将合成构造物与无细胞基质组合在一起的方法的已知缺点和不足包括分层、操作性差和加工技术不方便。因此，需要新的将无细胞基质与合成支架组合在一起的方法。

发明内容

因此，公开了新的无细胞基质胶和新的制备无细胞基质胶的方法。还公开了新的增强型无细胞基质。

无细胞基质胶具有在水溶液中的无细胞基质。

本发明的另一个方面是制备本发明的无细胞基质胶的新方法。该方法包括如下的步骤。提供无细胞基质。将无细胞基质加到水溶液以提供混合物。将混合物在足够的温度范围中温育足够的时间，以有效形成无细胞基质胶。

本发明的又另一个方面是新的增强型无细胞基质。基质具有无细胞基质层、无细胞基质胶层增强层。其中，无细胞基质胶层是本发明的新型无细胞基质胶。

本发明的再一个方面是用本发明的新型无细胞基质进行疝气修复的方法。

通过以下具体实施方式和附图，本发明的这些方面和其他方面以及优点将变得更为显而易见。

附图说明

图1是显示用于制备本发明的无细胞基质胶和本发明的增强型无细胞基质的步骤的图。

图2是本发明的网状织物增强型无细胞真皮基质的SEM图像。

具体实施方式

本发明的无细胞基质胶是如下制备的：提供无细胞基质，将无细胞基质在水溶液中混合以形成无细胞基质混合物，然后将无细胞基质混合物在足够有效的温度下温育足够有效的时间以提供无细胞基质胶。

无细胞基质在本文中定义为已进行了去细胞化使得细胞核和细胞组分从胞外结构基质去除的组织。无细胞基质是从包括器官或器官的分离部分在内的组织制备。组织包括但不限于心脏瓣膜、小肠粘膜下层、真皮、羊膜、膀胱、网膜、心包膜、韧带、血管等。在一个实施例中，组织包括但不限于网膜和真皮。在另一个实施例中，组织是真皮。组织可获自各种哺乳动物来源，包括但不限于人、山羊、猪、牛、绵羊、马等。组织是通过常规技术进行去细胞化，包括诸如组织保存、去细胞化、洗涤、净化和储藏的步骤。

去细胞化步骤通常涉及通过用含有去污剂的盐溶液进行抽提和通过内切核酸酶进行消化来去除细胞组分。

然后将无细胞基质转移到水溶液中。在一个实施例中，先将无细胞基质加工成更小的片块再转移到水溶液中。无细胞基质可通过常规的方法加工成更小的片块，如用剪刀、刀片或小刀切割；磨成粉末，如球磨和低温磨；以及气流磨。将无细胞基质加工成更小的片块如加工成粉末，可提供更多的表面积，从而使得能够更快地溶解到水溶液中。在一个实施例中，先将无细胞基质通过冷冻研磨加工成粉末后再加到水溶液。

可用于实施本发明的水溶液包括但不限于水、生理缓冲液和盐水。生理缓冲液包括但不限于缓冲盐水，如磷酸缓冲盐水(PBS)、Hank平衡盐溶液、Tris缓冲盐水和Hepes缓冲盐水。在一些实施例中，水溶液是水。

在一个实施例中，水溶液任选包含足够有效量的增塑剂。增塑剂包括但不限于甘油、丙二醇、聚乙二醇。在一个实施例中，增塑剂是甘油。

无细胞基质胶例如如下进行制备。提供无细胞基质，如无细胞真皮基质。然后任选通过低温研磨将无细胞真皮基质加工成粉末。无细胞基质粉末的颗粒大小在约2mm以下。将约1.0g的无细胞基质粉末混合到10ml的水溶液如水或磷酸缓冲盐水(PBS)中，以形成无细胞基质混合物。无细胞基质的存在量通常占水溶液的约2％至约30重量％，优选约5％至约20重量％。在另一个实施例中，无细胞基质的存在量占水溶液的约10重量％。然后将无细胞基质混合物在足够有效的温度和时间下进行温育，通常在约70℃至约100℃下约10分钟至约48小时，优选约80℃至约90℃，且通常约1小时至约5小时。可在较高的压力下使用较高的温度，例如在2个大气压下120℃。让无细胞基质胶冷却至大约37℃以供立即使用，或者让其冷却至室温或以下以备使用。

在另一个实施例中，可任选加入足够有效量的增塑剂如甘油，以提高胶的柔韧性和湿润特性。增塑剂的加入量可基于增塑剂的性质。在甘油的情况中，加到无细胞基质胶的甘油的量通常占含水胶的约0.5％至约10重量％。可在让胶冷却之前或之后将增塑剂加入和均匀混合到含水胶中。优选地，在让胶冷却之前加入甘油，以便容易混合和均匀分布在胶中。

本文所述的无细胞基质胶可用于制备用于组织修复和组织工程的增强型无细胞基质。利用本发明无细胞基质胶的本发明增强型无细胞基质由无细胞基质层、增强层合无细胞基质胶层组成。本发明的无细胞基质胶也可用作组织胶或密封剂，倘若本领域技术人员愿意接受其所伴有的缺点(如有的话)，不过这是不优选的。

无细胞基质层是从无细胞基质制备。无细胞基质是从包括器官或器官的分离部分在内的组织制备。组织包括但不限于心脏瓣膜、小肠粘膜下层、真皮、羊膜、膀胱、网膜、心包膜、韧带、血管等。在一个实施例中，组织包括但不限于网膜和真皮。在另一个实施例中，组织是真皮。组织可获自各种哺乳动物来源，包括但不限于人、山羊、猪、牛、绵羊、马等。如上所述，用常规的方法和技术使组织去细胞化以提供无细胞基质。通过将无细胞基质分裂成厚度通常约50微米至约200微米的薄片来获得无细胞基质层。通过常规的技术如使用牛皮分裂机来分裂无细胞基质。

增强层优选是纺织品或者类似的或相当的材料，包括但不限于机织结构、针织结构、经向针织结构(即花边样结构)、无纺结构和编织结构。增强层可以是一片非纺织品的材料，如聚合物片材，不过这不是优选的。在一个实施例中，增强层是机织织物如网状织物。在以上织物和材料中，可通过改变织物或材料的密度或质地来调整机械特性。用于制备织物的纤维可为例如单纤丝、纱线、细丝、辫带或纤维束。诸如聚合物片材的材料可具有在其中形成或钻出的孔，且可任选是多孔的。纤维和材料如片材可由生物相容性、生物可吸收性材料制成，这种材料包括但不限于聚乳酸(PLA)(包括聚丙交酯)、聚乙醇酸(PGA)(包括聚乙醇酸交酯)、聚己内酯(PCL)、聚对二氧环己酮(PDO)和聚碳酸亚丙基酯(PTMC)。纤维也可由生物相容性、非可吸收性聚合物制成，这种材料包括但不限于聚烯烃、聚碳酸酯、聚氯乙烯、苯乙烯(包括丙烯腈丁二烯苯乙烯)、尼龙、丙烯酸树脂、热塑性聚氨酯、热塑性弹性体、热固性塑料、聚酰胺、聚酯、可模压硅橡胶(moldable silicon)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯醇(PVA)以及它们的共聚物和共混物。合适的聚烯烃包括但不限于聚乙烯、聚丙烯和它们的共聚物。在一个实施例中，构成织物的纤维是由聚丙烯形成。

在一个实施例中，增强型无细胞基质是通过提供增强层、无细胞基质层和无细胞基质胶来制备。无细胞基质胶应加热到足够有效的温度，以使无细胞基质的胶原成分变性，通常为约50℃至约90℃，然后让其冷却至所需的温度备用，通常为约30℃至约50℃，优选至约37℃。然后将无细胞基质胶以足够的量放置在无细胞基质层和增强层之间以将基质层和增强层有效结合，并让其以常规方式进行干燥以形成增强型无细胞基质。例如，可如下制作基质：提供具有顶面和底面的增强层，将一层无细胞基质胶放置在增强层的顶面上，然后将无细胞基质放置在胶层上，从而将增强层和无细胞基质层胶结在一起。或者，可如下制作基质：提供无细胞基质层，将一层无细胞基质胶放置在无细胞基质层上，然后将增强层放置在胶层上，从而将增强层和无细胞基质层胶结在一起。还可通过继续交替设置增强层、无细胞基质胶层和无细胞基质层，或者通过改变结构中的各个层叠材料的位置，来提供多层的增强型无细胞基质。无细胞基质胶和无细胞基质层可以是已如上所述从相同的组织类型或者从不同的组织类型制得。在一个实施例中，无细胞基质层和无细胞基质胶层来自相同的组织类型。

任选地，可通过使用常规的方法，如使用甲醛蒸气、戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)或氧化的多糖，将无细胞基质胶层和无细胞基质层进行交联，来使增强型无细胞基质稳定化。多糖包括但不限于透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、乙酰肝素、硫酸乙酰肝素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、海藻酸盐和其他长链多糖。在一个实施例中，增强型无细胞基质通过EDC交联来稳定化，包括在含有醇(如乙醇、异丙醇、丙醇)的溶液中的1％EDC，所述醇的浓度优选在约40％至约70％之间。

在一个实施例中，一种或多种生物活性剂可任选掺入在增强型无细胞基质当中和/或施加到增强型无细胞基质。在一个实施例中，生物活性剂掺入在增强组分当中或包覆在增强组分上。在另一个实施例中，生物活性剂掺入到无细胞基质胶中。在又另一个实施例中，生物活性剂掺入到无细胞基质中。

合适的生物活性剂包括但不限于防止感染的活性剂(例如抗微生物剂和抗生素)、减少感染的活性剂(例如抗炎剂)、防止或尽可能减少粘连形成的活性剂如氧化的再生纤维素(例如INTERCEED和SURGICEL，可获自Ethicon，Inc.)和透明质酸、抑制免疫系统的活性剂(例如免疫抑制剂)、异源或自体同源生长因子、蛋白质(包括基质蛋白质)、肽、抗体、酶、血小板、富含血小板的血浆、糖蛋白、激素、细胞因子、糖胺聚糖、核酸、止痛剂、病毒、病毒颗粒和细胞类型、趋化剂、抗生素以及甾体和非甾体止痛剂。

活组织也可包括在本发明的增强型无细胞基质中。来源可以不同，且组织可具有多种构型，但在一个实施例中，组织任选为切碎或分开的组织碎片或片块的形式，这可增强组织再生长的有效性和促进愈合响应(例如软骨)。在另一个实施例中，活组织可任选为从含有能够进行组织再生和/或重塑的活细胞的健康组织收获的组织片或条的形式。

增强型无细胞基质还可具有掺入在其中的活细胞。合适的细胞类型包括但不限于骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、成纤维细胞、干细胞、多能细胞、软骨细胞祖细胞、软骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞、白细胞、脂肪细胞、单核细胞、浆细胞、肥大细胞、脐带细胞、基质细胞、间充质干细胞、上皮细胞、成肌细胞、腱细胞、韧带成纤维细胞、神经元、骨髓细胞、滑膜细胞、胚胎干细胞、衍自脂肪组织的前体细胞、外周血祖细胞、从成人组织分离的干细胞、遗传转化的细胞、软骨细胞和其他细胞的组合、骨细胞和其他细胞的组合、滑膜细胞和其他细胞的组合、骨髓细胞和其他细胞的组合、间充质细胞和其他细胞的组合、基质细胞和其他细胞的组合、干细胞和其他细胞的组合、胚胎干细胞和其他细胞的组合、从成人组织分离的前体细胞和其他细胞的组合、外周血祖细胞和其他细胞的组合、从成人组织分离的干细胞和其他细胞的组合、以及遗传转化的细胞和其他细胞的组合。

本发明的增强型无细胞基质还可用于基因治疗技术，其中核酸、病毒或病毒颗粒将编码至少一种目的基因产物的目的基因递送到特定的细胞或细胞类型。因此，生物活性剂可以是核酸(例如DNA、RNA或寡核苷酸)、病毒、病毒颗粒或非病毒载体。病毒和病毒颗粒可以是DNA或RNA病毒，或者可以源自DNA或RNA病毒。目的基因产物优选选自蛋白质、多肽、干扰核糖核酸(iRNA)和它们的组合。

一旦足够有效量的可适用的核酸和/或病毒物质(即病毒或病毒颗粒)掺入到了增强型无细胞基质中，接着就可将装置植入到特定部位以引起所需类型的生物响应。核酸或病毒药剂随后可以被细胞吸收，并且其编码的任何蛋白质都可以由细胞局部产生。在一个实施例中，核酸和病毒药剂可以被组织糜悬浮液的组织片段内的细胞吸收，或者(在一个可选实施例中)核酸或病毒药剂可被受伤组织部位周围组织中的细胞吸收。本领域技术人员应会认识到，产生的蛋白质可以是上述类型的蛋白质，或者是有利于增强组织治愈损伤或疾病、抗感染或减少炎性反应的能力的类似蛋白质。核酸还可以用来阻断可能对组织修复过程或其他正常生物过程产生负面影响的不需要的基因产物的表达。DNA、RNA和病毒物质常规用于实现这种表达阻断功能，也称为基因表达敲除。

本领域技术人员会认识到，可由外科医生、健康护理专业人员或其他生命科学专业人员根据医学科学的原理和可适用的治疗目标，来确定生物活性剂的种类。还应理解，可在制造增强型无细胞基质之前、制造过程中或制造之后，或者在手术置入增强型无细胞基质之前、置入过程中或置入之后，将生物活性剂掺入在增强型无细胞基质当中。

本发明的增强型无细胞基质可用于以下需要进行组织增强的手术，包括但不限于腹部手术如疝气修复和骨盆底修复、美容手术如乳房上提和面部提紧以及其他组织修复手术如肌腱套修复。用常规的组织连接装置，包括胶、缝线、缝钉、大头钉等，将无细胞基质安置到组织。

以下实例旨在说明本发明的原理和实施，而非限制本发明。在本公开内容的帮助下，许多落入本发明范围和精神内的另外的实施例对本领域技术人员而言将是显而易见。

实例1

配制无细胞基质胶的方法

用6800冷冻研磨机(SPEX CertiPrep，Metuchen，NJ)将以商品名DermMatrix出售的无细胞猪真皮基质(Advanced UroScience，St.Paul，Minn.)研磨成细粉。将1.0克的无细胞真皮基质粉末加到聚丙烯管中的10ml含有7％甘油和1.3％乙酸的水溶液中。将管放在磁力搅拌下的80℃水浴中。在80℃下温育3小时后，胶变得不透明。将胶从水浴中取出，让其冷却至37℃备用。该方法在图1中示出。

实例2

无细胞猪真皮基质的薄层的制备

用皮革分裂机(由Columbia Organ Leather，Columbia，PA进行)，将以商品名DermMatrix出售的无细胞猪真皮基质(Advanced UroScience，St.Paul，Minn.)分裂成薄层以供进行原型配制。在分裂前，将无细胞猪真皮基质浸泡在IPA中24小时。将8cm×8cm见方的无细胞猪真皮基质送入分裂机中，分裂成0.19mm至0.10mm的最终厚度。在分裂后，将无细胞猪真皮基质片材保藏在IPA中进一步处理备用。对于所有无细胞猪真皮基质样本重复进行这个方法。

实例3

增强型无细胞猪真皮基质的制备

制备网状织物增强型无细胞真皮基质的方法在图1中示出。将实例2中制备的分裂的无细胞真皮基质样本用去离子水洗涤，然后在20℃下冻干。通过将Ultrapro网状织物(Ethicon Inc.Somerville，NJ)在50℃去离子水中温育10天以去除它的可吸收组分，制备出轻重量的聚丙烯网状织物。将轻的聚丙烯网状织物放置在两层的3×5cm分裂无细胞真皮基质之间，用3ml实例1中制备的无细胞基质胶胶结在一起，在37℃下保持。将整个构建物冷却至室温，并在细胞培养排风罩中风干。

实例4

网状织物增强型无细胞猪真皮基质的稳定化

将如实例3中所述制备的增强型无细胞真皮基质用100ml的磷酸缓冲盐水(PBS)乙醇溶液(40％乙醇)洗涤30分钟。然后将洗涤过的增强型无细胞真皮基质转移到50ml的10mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)于(新鲜制备的)乙醇PBS中的溶液。在室温下4小时后，用6％甘油(w/w)水溶液洗涤交联的增强型无细胞基质两次。将交联的增强型无细胞基质风干。

实例5

通过SEM评估网状织物增强型无细胞真皮基质

将实例4中制备的样本安装在显微镜桩(stud)上，并用EMS 550溅射涂布机(Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA)涂覆上金的薄层。用JEOL JSM-5900LV SEM(JEOL，日本东京)进行SEM分析。检查各样本的表面和横截面积。SEM图像(参见图2)显示网状织物包埋在两个无细胞真皮基质薄层的中央。

实例6

疝气修复动物模型

使用猪模型，以常规方式将受试对象麻醉并为手术作准备。在脐上方/朝头盖方向和/或下方/朝尾部方向作出中线切口：穿过皮肤和皮下组织作出腹部中线切口，以暴露中线/白线中的腹壁筋膜。在白线中作出位于脐上方和下方的两个深度大约3cm的正中缺口。将网状织物增强型无细胞基质修整至适当大小，用缝线固定PROLENE缝线(大小#3-0)(Ethicon，Inc.，Somerville，NJ)平坦布展在腹部筋膜上。用单Monocryl缝线(大小USP 3-0)闭合皮下组织和皮肤。另外，用局部皮肤粘合剂将皮肤胶合以防止早期伤口感染。

实例7

用增强型无细胞基质进行开放性人疝气修复

按常规方式使人患者为开放式疝气修复手术作准备。按常规方式进行 全身麻醉，任选地，取决于疝气的位置和修复的复杂性，患者可进行常规的局部或区域麻醉。任选将插管插入到膀胱中以排掉尿和使膀胱减压。

作出切口，其大小正好足以从疝气附近的腹壁移去脂肪和瘢痕组织。确定出弱化的疝气区域的外侧边缘，并从该区域当中除去多余的组织。然后施加本发明的增强型无细胞基质，使得它在所有方向上与弱化的区域重叠达几英寸(厘米)，并用非可吸收的缝线固定就位。然后使腹壁接合，用非可吸收的缝线封闭。将缝线栓紧并打结。

与常规的将合成构建物与无细胞基质组合在一起的方法相比，本发明中所公开的构建物中的合成构建物和无细胞基质很好地结合在一起以避免分层。因此，构建物是柔韧性的。无细胞基质胶为将生物活性剂掺入到复合构建物中提供了递送介质。

虽然本发明已通过其详细实施例得到了显示和描述，但本领域技术人员将理解，可对本发明作出形式上和细节上的各种变化而不背离受权利要求书保护的本发明的精神和范围。

Claims (19)

1.一种无细胞基质胶，其包含无细胞基质和水溶液。

2.根据权利要求1所述的无细胞基质胶，其中所述无细胞基质包含从选自人、山羊、猪、牛、绵羊和马的哺乳动物来源获得的去细胞化组织。

3.根据权利要求2所述的无细胞基质胶，其中所述去细胞化组织选自心脏瓣膜、小肠粘膜下层、真皮、羊膜、膀胱、网膜、心包膜、韧带和血管。

4.根据权利要求1所述的无细胞基质胶，其中所述水溶液选自水、生理缓冲液和盐水。

5.根据权利要求1所述的无细胞基质胶，其还包含选自甘油、丙二醇和聚乙二醇的增塑剂。

6.根据权利要求1所述的无细胞基质胶，其中所述胶包含约2(w/v)％的无细胞基质和约30(w/v)％的水溶液。

7.一种增强型无细胞基质，其包含：无细胞基质层、无细胞基质胶层和增强层。

8.根据权利要求7所述的基质，其中所述无细胞基质胶包含无细胞基质和水溶液。

9.根据权利要求8所述的基质，其中所述无细胞基质胶包含从选自人、山羊、猪、牛、绵羊和马的哺乳动物来源获得的去细胞化组织。

10.根据权利要求7所述的基质，其中所述无细胞基质胶包含选自心脏瓣膜、小肠粘膜下层、真皮、羊膜、膀胱、网膜、心包膜、韧带和血管的去细胞化组织。

11.根据权利要求7所述的基质，其中所述无细胞基质胶包含选自水、生理缓冲液和盐水的水溶液。

12.根据权利要求7所述的基质，其中所述无细胞基质胶另外包含选自甘油、丙二醇和聚乙二醇的增塑剂。

13.根据权利要求7所述的基质，其中所述无细胞基质胶包含约2(w/v)％的无细胞基质和约30(w/v)％的水溶液。

14.根据权利要求7所述的基质，其中所述增强层包含织物。

15.根据权利要求7所述的基质，其中所述增强层包含选自以下的材料：聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚对二氧环己酮(PDO)、聚碳酸亚丙基酯(PTMC)、聚烯烃、聚氯乙烯、尼龙、聚酰胺、聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯以及它们的共聚物和共混物。

16.根据权利要求7所述的基质，其中所述增强层包含聚合物片材。

17.根据权利要求7所述的基质，其中所述无细胞基质胶层和所述无细胞基质层是交联的。

18.一种在手术中增强组织的方法，其包括：

提供增强型无细胞基质，所述基质包含：

无细胞基质层、由无细胞基质胶制成的无细胞基质胶层和增强层；和

将所述基质安置到组织。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述无细胞基质胶包含无细胞基质和水溶液。

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