CN117258047A - 一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，尤其是涉及一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶及其制备方法和应用。一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶，包括猪牙髓组织脱细胞外基质，所述猪牙髓组织脱细胞外基质的含量为5‑10mg/mL。猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶具有良好的结构稳定性、可注射性和热驱动凝胶化能力的流变学性能、生物相容性、促进细胞迁移、成牙分化和血管生成能力，能够维持牙髓干细胞的活性，并能再生出具有丰富血管结构和类成牙本质细胞层的新生类牙髓组织。

Description

一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，尤其是涉及一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

天然组织由细胞和细胞外基质(ECM)成分组成，细胞外基质是由细胞分泌到胞外空间的蛋白和多糖构成的精密有序的网络结构，构成ECM的大分子种类繁多，大致可以分为提供结构强度的胶原蛋白和弹性蛋白，以凝胶样基质形式发挥空间填充功能的糖胺聚糖(GAG)和蛋白聚糖如肝素、硫酸肝素等，起黏着作用的非胶原糖蛋白如纤连蛋白和层粘连蛋白以及其他几种糖蛋白，它们能够结合生长因子如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子等生物活性成分，对细胞的存活、增殖、分化、黏附、迁移等有着直接的影响。组织脱细胞是指采用一定的方式将细胞成分从天然组织中去除，而尽可能保留细胞外基质成分从而获取脱细胞外基质(decellularized extracellular matrix，dECM)，该dECM可以保留组织特异性的细胞分化信号，经研究证实其可以促进相应组织的修复或再生。

合适的脱细胞方案的选择取决于组织的来源、类型和最终的目的，不同来源的组织，包括不同物种间的同一类组织，由于存在组织成分上的差异而需要不同的脱细胞方法，因此脱细胞方法具有组织的特异性。目前研究中，大部分针对牙髓类组织的脱细胞方案主要采用SDS作为洗涤剂之一，但SDS可能会对细胞外基质成分造成更多的丢失和破坏，且不利于清洗具有残留毒性。目前衡量脱细胞效果的国际通用标准主要包括：残留的双链DNA含量应小于50ng/mg（干重），DNA片段的长度应该小于200个碱基且用DAPI或H&E染色应在dECM中完全没有细胞核物质。

理想的生物活性水凝胶支架的特性应与天然组织细胞外基质的结构和生物学特性相似。近年来，随着水凝胶理论和技术的快速发展，逐渐衍生出了心脏、肺、肾脏、神经、脂肪等的天然器官或组织的脱细胞外基质水凝胶产品，相关研究证实其不仅具有水凝胶的结构特性和反应性如流动性和热响应性质等，而且保留了天然组织特异性的生化信号和细胞外基质功能，已成为组织修复和再生最有前途的材料之一。天然组织脱细胞外基质水凝胶的制备通常是先将各组织来源的脱细胞外基质冻干并磨成粉末，然后用酸性胃蛋白酶溶液按一定浓度比例进行消化溶解适当时间，再通过调节溶液盐离子浓度和 pH 值制备成生理盐度和中性的脱细胞外基质预凝胶液，最后通过改变温度或加入交联剂，诱导交联形成水凝胶。其中一般需较长时间才能使dECM 组织完全溶解形成均匀的预凝胶溶液，且目前猪牙髓组织来源的脱细胞外基质水凝胶尚未被开发。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶及其制备方法和应用。猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶具有良好的结构稳定性、可注射性和热驱动凝胶化能力的流变学性能、生物相容性、促进细胞迁移、成牙分化和血管生成能力，能够维持牙髓干细胞的活性，并能再生出具有丰富血管结构和类成牙本质细胞层的新生类牙髓组织。

为此，本发明第一方面提供了一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶，包括猪牙髓组织脱细胞外基质，所述猪牙髓组织脱细胞外基质的含量为5-10mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述猪牙髓组织脱细胞外基质的含量优选为7.5-10mg/mL。

在一些例子中，所述猪牙髓组织脱细胞外基质的含量可以为5mg/mL、7.5mg/mL或10mg/mL。

本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

S1：采用胰蛋白酶-EDTA（Trypsin/EDTA）作用处理后的猪牙髓组织制备猪牙髓组织脱细胞外基质；

S2：将步骤S1制备得到的猪牙髓组织脱细胞外基质加入酸性蛋白酶溶液中溶解得到8-12mg/mL的猪牙髓组织脱细胞外基质消化液；

S3：调节步骤S2制备得到的猪牙髓组织脱细胞外基质消化液的pH和生理盐度，再采用PBS稀释为5-10mg/mL的预凝胶液；

S4：将步骤S3制备得到的预凝胶液通过改变温度形成水凝胶。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S1中采用胰蛋白酶-EDTA于30-37℃作用处理后的猪牙髓组织12-18h；优选为采用胰蛋白酶-EDTA于35-37℃作用处理后的猪牙髓组织12-14h；例如，采用胰蛋白酶-EDTA于37℃作用处理后的猪牙髓组织12h。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S1中采用胰蛋白酶-EDTA酶解液与处理后的猪牙髓组织的体积比9-12:1；优选为9-10:1，例如为10:1；所述胰蛋白酶的质量浓度为0.02%，所述EDTA的质量浓度为0.05%。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S1还包括采用Triton X-100 和DNaseⅠ酶作用处理后的猪牙髓组织；所述Triton X-100的体积百分比为2%，所述DNaseⅠ酶的浓度为0.02mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述Triton X-100 和DNaseⅠ酶与处理后的猪牙髓组织的体积比均为9-12:1；优选为9-10:1，例如为10:1。

在本发明的一些实施方式中，所述Triton X-100于4℃作用处理后的猪牙髓组织3h；所述DNaseⅠ酶于37℃作用处理后的猪牙髓组织24h。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S1包括以下具体步骤：

G1：将处理后的猪牙髓组织与Trypsin/EDTA酶解液以体积比1:9-12混合，置于30-37℃摇床上处理12-18h，每 2h换液，随后在4℃摇床上采用双去离子水清洗3h，每30min换液，再离心去除多余水分；

G2：将步骤G1得到的猪牙髓组织以体积比1:9-12与 Triton X-100混合，置于4℃摇床上处理3h，每1h换液，随后在4℃摇床上采用双去离子水清洗12h，每2h换液，再离心去除多余水分；

G3：将步骤G2得到的猪牙髓组织以体积比1:9-12与DNaseⅠ酶混合，置于37℃摇床上处理24h，随后在4℃摇床上采用双去离子水清洗24h，每2h换液，再离心以去除多余水分；

G4：将步骤G3得到的猪牙髓组织脱细胞外基质冻存于-80℃备用或置于真空冷冻干燥机中冻干8h，保存于-20℃备用。

胰蛋白酶会切割从精氨酸/赖氨酸残基的羧基末端粘附到细胞上的蛋白质，而EDTA 可直接从 ECM 的细胞粘附位点螯合二价金属离子，打破细胞对基质的黏附，从而实现细胞内容物与组织表面的分离；TritonX-100通过破坏DNA-蛋白质、脂质-脂质和脂质-蛋白质的相互作用解离并去除细胞成分，同时可以保留蛋白质-蛋白质的相互作用从而保持天然蛋白质结构；在去污剂不能有效去除残留DNA的情况下，常采用核酸酶（Dnase I）切割核酸序列使核内外的核物质降解来帮助去除核苷酸。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S2中优选得到将步骤S1制备得到的猪牙髓组织脱细胞外基质加入酸性蛋白酶溶液中溶解得到8-10mg/mL的猪牙髓组织脱细胞外基质消化液；例如为10mg/mL的猪牙髓组织脱细胞外基质消化液。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S2中酸性蛋白酶溶液为胃蛋白酶乙酸溶液；所述猪牙髓组织脱细胞外基质与胃蛋白酶的质量比为10:1。

在本发明的一些实施方式中，所述酸性蛋白酶溶液中的胃蛋白酶在乙酸溶液中的含量为0.8-1.2mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S2具体包括：称取80-120mg冻干的步骤S1制备的猪牙髓组织脱细胞外基质（dECM）置于10mL的0.5M乙酸溶液中，并按dECM和胃蛋白酶的质量比为10:1加入8-12mg的胃蛋白酶粉末，置于磁力搅拌仪上室温消化溶解72h，随后3000rpm离心5min去除未溶解颗粒，获得8-12mg/mL的dECM消化液。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S3包括以下具体步骤：

H1：于冰上采用预冷的10M的NaOH 调节步骤S2制备得到的10mg/mL的dECM消化液的pH值至7.2-7.4；

H2：于冰上向步骤H1得到的dECM消化液加入其总体积1/9的10×PBS用于调节dECM消化液的盐度至1×PBS的生理盐度；

H3：于冰上将步骤H2得到的dECM消化液采用1×PBS稀释制备成5-10mg/mL的预凝胶液，保存于-20℃备用；使用时提前 8h冰上缓慢解冻，不可反复冻融。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤H1-H3全程均在冰上进行，避免dECM消化液中和调节为预凝胶液及稀释过程中因受热过早凝胶化。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S4中将步骤S3制备得到的预凝胶液置于37℃孵箱30min进行凝胶化形成水凝胶。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S1之前将猪牙髓组织分切，依次使用梯度浓度的青霉素-链霉素溶液和无菌双去离子水清洗，得到处理后的猪牙髓组织。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S1之前处理猪牙髓组织包括以下步骤：

M1：将获取的猪恒牙牙髓切除根部与牙囊组织相连部分，再将猪牙髓组织分切成底宽约3mm 的锥形条状组织；

M2：依次使用10%青霉素-链霉素溶液、5%青霉素-链霉素溶液、2%青霉素-链霉素溶液（无菌 PBS 配制），每组清洗 3 次，15min/次；

M3：再无菌双去离子水清洗 15min/次×3 次，得到处理后的猪牙髓组织备用。

本发明第三方面提供了一种如本发明第一方面所述的水凝胶或如本发明第二方面所述的制备方法制备的水凝胶在牙髓再生中的应用。

本发明的有益效果：

（1）本发明提供一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶，具有良好的流变学性能（包括结构稳定性、可注射性和热驱动凝胶化能力）、生物相容性、促进细胞迁移、成牙分化和血管生成能力。

（2）本发明提供的一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶的制备方法，先制备8-12mg/mL具有一定流动性的dECM消化液，后续可以较简便、短时间的形成dECM 组织完全溶解形成的均匀的、所需浓度的预凝胶溶液，同时利于制备具有良好的流变学性能（包括结构稳定性、可注射性和热驱动凝胶化能力）的猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶。

（3）本发明提供的一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶应用于牙髓再生，能够维持牙髓干细胞的活性，并能再生出具有丰富血管结构和类成牙本质细胞层的新生类牙髓组织。

附图说明

图1为试验例1中对不同方法制备的猪牙髓组织脱细胞外基质的对比结果图；其中，A-组织DAPI染色和H&E染色图，B-DNA含量；

图2为试验例2中对实验例1制备的猪牙髓组织脱细胞外基质的表征结果图；其中，A-组织Masson染色和番红O染色图，B-扫描电镜图，C-总胶原蛋白含量，D-GAG含量；

图3为试验例3和试验例4中dECM消化液的流动性和预凝胶液的凝胶化状态图；其中，a-冻干的猪牙髓组织脱细胞外基质细小颗粒，b-不同浓度 dECM 消化液，c-不同浓度的预凝胶液，d-不同浓度的水凝胶；

图4为试验例5中不同浓度的水凝胶的扫描电镜结构图；

图5为试验例6中不同浓度的水凝胶的流变学结果图；其中，A-粘度曲线，B-热驱动凝胶化曲线，C-动态模量曲线；

图6为试验例7中水凝胶与牙髓干细胞共同孵育结果图；其中，A-细胞活死荧光染色图，B-牙髓干细胞存活率；

图7为试验例8中水凝胶促进牙髓干细胞迁移的Transwell实验和细胞划痕实验结果图；其中，A-Transwell细胞迁移实验的示意图及对应细胞结晶紫染色图，B-细胞划痕实验图，C-Transwell实验迁移细胞数量，D-划痕12h后划痕伤口愈合面积百分比，E-划痕24h后划痕伤口愈合面积百分比；

图8为试验例9中水凝胶促进人脐静脉内皮细胞成管结果图；其中，A-细胞图，B-交叉点数量，C-网格数量，D-节点数量；

图9为试验例10中水凝胶促进牙髓干细胞成神经相关标志物和成牙相关标志物基因表达结果图；其中，A-DMP-1表达量，B-Nestin表达量，C-GFAP表达量；

图10为试验例11中水凝胶进行裸鼠背部皮下移植的结果图；其中，A-H&E染色图，B-免疫荧光染色图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。

实施例1

本实施例提供一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶，包括猪牙髓组织脱细胞外基质，所述猪牙髓组织脱细胞外基质的含量为5mg/mL。

本实施例还提供一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

S1：将获取的猪恒牙牙髓切除根部与牙囊组织相连部分，再将猪牙髓组织分切成底宽约3mm 的锥形条状组织；依次使用10%青霉素-链霉素溶液、5%青霉素-链霉素溶液、2%青霉素-链霉素溶液（无菌 PBS 配制），每组清洗 3 次，15min/次；再无菌双去离子水清洗15min/次×3 次，得到处理后的猪牙髓组织备用；

S2：将处理后的猪牙髓组织与Trypsin/EDTA酶解液以体积比1:10混合，置于37℃摇床上处理12h，每2h换液，随后在4℃摇床上采用双去离子水清洗3h，每30min换液，再离心去除多余水分；再将猪牙髓组织以体积比1:10与Triton X-100混合，置于4℃摇床上处理3h，每1h换液，随后在4℃摇床上采用双去离子水清洗12h，每2h换液，再离心去除多余水分；再将牙髓组织以体积比1:10与DNaseⅠ酶混合，置于37℃摇床上处理24h，随后在4℃摇床上采用双去离子水清洗24h，每2h换液，再离心以去除多余水分，得到猪牙髓组织脱细胞外基质；再将猪牙髓组织脱细胞外基质冻存于-80℃备用或置于真空冷冻干燥机中冻干8h，保存于-20℃备用；

S3：称取100mg冻干的步骤S2制备的猪牙髓组织脱细胞外基质置于10mL的0.5M乙酸溶液中，并按dECM和胃蛋白酶的质量比为10:1加入10mg的胃蛋白酶粉末，置于磁力搅拌仪上室温消化溶解72h，随后3000rpm离心5min去除未溶解颗粒，获得10mg/mL的dECM消化液；

S4：于冰上采用预冷的10M的NaOH 调节步骤S3制备得到的10mg/mL的dECM消化液的pH值至7.2-7.4；于冰上向dECM消化液加入其总体积1/9的10×PBS用于调节dECM消化液的盐度至1×PBS的生理盐度；于冰上将dECM消化液采用1×PBS稀释制备成5mg/mL的预凝胶液，保存于-20℃备用；使用时提前8h冰上缓慢解冻，不可反复冻融；

S5：将步骤S3制备得到的预凝胶液于冰上解冻后置于37℃孵箱30min进行凝胶化形成水凝胶。

实施例2

本实施例提供一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶，包括猪牙髓组织脱细胞外基质，所述猪牙髓组织脱细胞外基质的含量为5mg/mL。

本实施例采用实施例1提供的制备方法进行制备一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶；唯一的区别是，步骤S2中将处理后的猪牙髓组织与Trypsin/EDTA酶解液混合后置于37℃摇床上处理18h。

实施例3

本实施例提供一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶，包括猪牙髓组织脱细胞外基质，所述猪牙髓组织脱细胞外基质的含量为7.5mg/mL。

本实施例采用实施例1提供的制备方法进行制备一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶；唯一的区别是，步骤S4中于冰上将dECM消化液采用1×PBS稀释制备成7.5mg/mL的预凝胶液。

实施例4

本实施例提供一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶，包括猪牙髓组织脱细胞外基质，所述猪牙髓组织脱细胞外基质的含量为10mg/mL。

本实施例采用实施例1提供的制备方法进行制备一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶；唯一的区别是，步骤S4中制备成10mg/mL的预凝胶液。

对比例1

本对比例采用实施例1提供的制备方法进行制备一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶；唯一的区别是，步骤S2中将处理后的猪牙髓组织与Trypsin/EDTA酶解液混合后置于4℃摇床上处理12h。

对比例2

本对比例采用实施例1提供的制备方法进行制备一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶；唯一的区别是，步骤S2中将处理后的猪牙髓组织与Trypsin/EDTA酶解液混合后置于37℃摇床上处理6h。

对比例3

本对比例采用实施例1提供的制备方法进行制备一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶；唯一的区别是，步骤S3中称取150mg冻干的猪牙髓组织脱细胞外基质置于10mL的0.5M乙酸溶液中，并加入15mg的胃蛋白酶粉末，置于磁力搅拌仪上室温消化溶解72h，随后3000rpm离心5min去除未溶解颗粒，获得15mg/mL的dECM消化液。

对比例4

本对比例采用实施例1提供的制备方法进行制备一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶；唯一的区别是，步骤S3中称取200mg冻干的猪牙髓组织脱细胞外基质置于10mL的0.5M乙酸溶液中，并加入20mg的胃蛋白酶粉末，置于磁力搅拌仪上室温消化溶解72h，随后3000rpm离心5min去除未溶解颗粒，获得20mg/mL的dECM消化液。

对比例5

本对比例采用实施例1提供的制备方法进行制备一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶；唯一的区别是，步骤S4中于冰上将dECM消化液采用1×PBS稀释制备成1mg/mL的预凝胶液。

对比例6

本对比例采用实施例1提供的制备方法进行制备一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶；唯一的区别是，步骤S4中于冰上将dECM消化液采用1×PBS稀释制备成2.5mg/mL的预凝胶液。

试验例1

对实施例1-2制备的猪牙髓组织脱细胞外基质（P3、P4）和对比例1-2制备的猪牙髓组织脱细胞外基质（P1、P2）分别进行DAPI染色和H&E染色，并进行DNA含量检测。结果如图1所示。

由图1结果可知，本发明实施例1-2制备的猪牙髓组织脱细胞外基质经DAPI和H&E染色结果表明没有残留可见的细胞核物质，经DNA含量检测鉴定结果表明残留DNA小于50ng/mg（干重），满足国际通用标准要求的脱细胞效果；即通过本发明的方法能够成功实现猪牙髓组织脱细胞并达到国际标准；其中本发明实施例1的方法既能在脱去绝大部分细胞成分的同时保留更多细胞外基质成分，是针对猪牙髓组织最优选的脱细胞方法。

试验例2

对实施例1制备的猪牙髓组织脱细胞外基质进行Masson染色和番红O染色，并进行扫描电镜检测、总胶原蛋白和GAG含量检测。结果如图2所示。

由图2结果可知，本发明实施例1的方法能在脱去绝大部分细胞成分的同时保留了更多细胞外基质成分，主要保留了细胞外基质中大部分的胶原成分和部分GAG成分，同时胶原纤维交织排列成网状结构，组织疏松多孔。

试验例3

分别取1mL的实施例1和对比例3-4制备的dECM消化液于玻璃瓶中，水平放置15min以观察各dECM消化液的流动性。结果如图3所示。

由图3结果可知，本发明实施例1制得的dECM消化液浓度为10mg/mL时具有一定的流动性，利于后续制备流变学性能良好的猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶，且可以较简便、短时间的形成dECM 组织完全溶解形成的均匀的、所需浓度的预凝胶溶液。

试验例4

分别取1mL的实施例1、实施例3-4和对比例5-6制备的预凝胶液于玻璃瓶中，置于37℃孵箱30min进行凝胶化。结果如图3所示。

由图3结果可知，本发明实施例1和实施例3-4制得的dECM预凝胶液能够较好的实现凝胶化形成猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶；即制备具有良好的流变学性能的猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶中的猪牙髓组织脱细胞外基质的含量优选为5-10mg/mL。

试验例5

分别对实施例1、实施例3-4制备的一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶进行扫描电镜检测。结果如图4所示。

由图4结果可知，本发明实施例1和实施例3-4制得的猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶具有较好的结构稳定性，分别由直径不同的胶原纤维构成，随着浓度的增加，胶原纤维的直径增大。

试验例6

分别对实施例1、实施例3-4制备的一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶进行流变学分析，包括粘度、热驱动凝胶化和动态模量检测。结果如图5所示。

由图5结果可知，本发明实施例1和实施例3-4制得的猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶的低剪切粘度较高，说明具有较好的防沉降性、抗分水性、抗流挂性和储存稳定性，即具有良好的可注射性；同时在18-30℃即具有较好的凝胶化性能；且随加载频率增加，动态模量变化不大，说明本发明制备的猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶具有较好的流变学性能和力学强度。

试验例7

分别将实施例1、实施例3-4制备的一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶包裹牙髓干细胞共同孵育，分别于孵育1天、4天和7天进行细胞活死荧光染色并检测牙髓干细胞存活率。结果如图6所示。

由图6结果可知，本发明制备的猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶内培养的牙髓干细胞具有良好的细胞活力，说明本发明制备的猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶具有良好的生物相容性。

试验例8

将实施例1、实施例3-4制备的一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶分别作用于牙髓干细胞进行Transwell细胞迁移实验和细胞划痕实验。结果如图7所示。

由图7结果可知，本发明制备的猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶可以促进牙髓干细胞的迁移，且猪牙髓组织脱细胞外基质浓度为7.5mg/mL的水凝胶促进细胞迁移的效果最显著。

试验例9

将实施例1、实施例3-4制备的一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶分别用PBS浸提24h得到dECM水凝胶浸提液，实验组取100μL的dECM水凝胶浸提液+900μL的ECM(内皮细胞完全培养液)与人脐静脉内皮细胞在基质胶上孵育4h；对照组采用内皮细胞完全培养液与人脐静脉内皮细胞孵育，空白组采用PBS与人脐静脉内皮细胞孵育；孵育后查看细胞状态并对人脐静脉内皮细胞的管状结构进行统计。结果如图8所示。

由图8结果可知，本发明制备的猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶可以在体外促进人脐静脉内皮细胞形成管状结构，且猪牙髓组织脱细胞外基质浓度为10mg/mL的水凝胶促进人脐静脉内皮细胞形成管状结构的效果最显著。

试验例10

将实施例1、实施例3-4制备的一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶分别包裹牙髓干细胞孵育7d，孵育后检测牙髓干细胞成神经相关标志物GFAP、Nestin和成牙相关标志物DMP-1的基因表达量。结果如图9所示。

由图9结果可知，本发明制备的猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶可以在体外促进牙髓干细胞成神经相关标志物GFAP、Nestin和成牙相关标志物DMP-1的表达，且猪牙髓组织脱细胞外基质浓度为10mg/mL的水凝胶促进成牙、成神经相关标志物的表达效果最显著。

试验例11

采用人牙根管制成套管（TDM），将套管中注入载有牙髓干细胞的实施例1、实施例3-4制备的预凝胶液，再于37℃处理30min进行凝胶化形成移植体，将移植体进行裸鼠背部皮下移植，移植8周后取出移植体，固定脱矿后包埋切片进行H&E染色并对成牙相关标志物DSPP进行免疫荧光染色检测。结果如图10所示。

由图10结果可知，本发明制备的猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶能够再生出具有丰富血管结构和类成牙本质细胞层（正常牙髓组织中重要的结构之一）的新生类牙髓组织；说明本发明制备的猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶能够应用于牙髓再生。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (10)

1.一种猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶，其特征在于，包括猪牙髓组织脱细胞外基质，所述猪牙髓组织脱细胞外基质的含量为5-10mg/mL。

2.一种如权利要求1所述的猪牙髓组织脱细胞外基质水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

S1：采用胰蛋白酶-EDTA作用处理后的猪牙髓组织制备猪牙髓组织脱细胞外基质；

S2：将步骤S1制备得到的猪牙髓组织脱细胞外基质加入酸性蛋白酶溶液中溶解得到8-12mg/mL的猪牙髓组织脱细胞外基质消化液；

S3：调节步骤S2制备得到的猪牙髓组织脱细胞外基质消化液的pH和生理盐度，再采用PBS稀释为5-10mg/mL的预凝胶液；

S4：将步骤S3制备得到的预凝胶液通过改变温度形成水凝胶。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中采用胰蛋白酶-EDTA于30-37℃作用处理后的猪牙髓组织12-18h。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中采用胰蛋白酶-EDTA酶解液与处理后的猪牙髓组织的体积比9-12:1；所述胰蛋白酶的质量浓度为0.02%，所述EDTA的质量浓度为0.05%。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1还包括采用Triton X-100和DNaseⅠ酶作用处理后的猪牙髓组织；所述Triton X-100的体积百分比为2%，所述DNaseⅠ酶的浓度为0.02mg/mL。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述Triton X-100于4℃作用处理后的猪牙髓组织3h；所述DNaseⅠ酶于37℃作用处理后的猪牙髓组织24h。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中酸性蛋白酶溶液为胃蛋白酶乙酸溶液；所述猪牙髓组织脱细胞外基质与胃蛋白酶的质量比为10:1。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酸性蛋白酶溶液中的胃蛋白酶在乙酸溶液中的含量为0.8-1.2mg/mL。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1之前将猪牙髓组织分切，依次使用梯度浓度的青霉素-链霉素溶液和无菌双去离子水清洗，得到处理后的猪牙髓组织。

10.一种如权利要求1所述的水凝胶或如权利要求2-9中任意一项所述的制备方法制备的水凝胶在牙髓再生中的应用。