CN109069263B - 猪角膜脱细胞方法及其脱细胞角膜以及板层干燥角膜使用方法 - Google Patents

Abstract

一种猪角膜的脱细胞方法，采用如下步骤：S1干燥处理：将预处理后角膜干燥至含水量为5％‑20％；S2酶处理：采用DMEM配置Benzonase溶液；将角膜加入上述酶溶液，角膜表面气泡去除后，置于震荡培养箱中震荡处理时间不大于4h；S3清洗：角膜在清洗溶液中震荡洗涤处理不少于5次，每次震荡洗涤时间不大于1h。本发明对角膜的透明度影响降到最低。

Description

猪角膜脱细胞方法及其脱细胞角膜以及板层干燥角膜使用 方法

所属领域

本发明涉及一种作为人工角膜的猪角膜的脱细胞方法，及其以猪角膜为材料的脱细胞角膜，以及脱细胞板层角膜的使用方法。

背景技术

角膜盲是我国的第二大致盲性眼病，角膜移植是复明唯一有效的治疗手段，但角膜供体材料的匮乏严重影响病人进行角膜移植。经过中国科学家十余年努力，研发出的以猪角膜为原材料的人工角膜代替了人角膜，并在全世界范围内率先取得临床试验的成功。

现有的研究成果证明，以猪角膜为来原材料制备的人工角膜具有很好的生物相容性。特别是猪角膜具有与人角膜高度近似的组织结构、生物物理学特性和光学特性是角膜替代物的最佳选择的公认结论。而国内的研究成果所取得进展显示，猪角膜已经被作为人角膜移植备用材料一个重要的替代来源之一。目前部分脱细胞的猪角膜产品已经进行临床阶段，并产生一定的临床效果。为解决国内移植用角膜供体严重缺乏的现状提供了极好的解决方案，为国内数百万因角膜致盲的患者带来复明的希望。

从组织工程的角度而言，以猪角膜作为替代人角膜的移植来源，首要解决的问题是降低猪角膜作为异种角膜移植的排斥率。因此，脱细胞处理是制备角膜为原料的人工角膜必不可少过程。

目前广泛应用于生物材料的脱细胞方法中，：化学去污剂(SDS、Triton X-100、低渗Tris溶液、EDTA、脱氧胆酸钠、原钒酸钠)、生物酶处理(抑肽酶、核酸酶、胰蛋白酶)、物理辅助方式(液氮反复冻融、超声、低温电泳、紫外)三种方式或其组合方式。相对于化学去污剂脱细胞和物理辅助脱细胞方式相比，生物酶脱细胞处理方式具有较好有脱细胞效果。但是现有技术中采用的每一种酶对细胞的作用均不相同，因此欲取得较好的脱细胞效果，也需采用不同的酶进行组合使用。

另外，为达到更佳的脱细胞效果，在采用生物酶脱细胞之前往往采用不同的方法对角膜进行一些处理，如反复冻融、在高渗或低渗溶液中溶涨处理。通过这些处理方法可以破坏基质层细胞的细胞膜，力求在其后所使用的生物酶更容易进入基质细胞，进而消化细胞内的核酸，从而达到去除角膜抗原成分的目的。但是，在上述任何预处理方法的基理包括，使角膜在酶处理之前将其细胞破碎，在酶处理后细胞碎片可以从角膜组织的间隙中游离出来。但同时这必然会使组织原有的胶原纤维结构也因此而变得松散，从而失去原有的胶原纤维排列结构。与此同时，角膜内部的含水率被大大地提高了。并因此使得在其后的酶处理环节中，生物酶溶液很难再进入角膜组织内，通常是采用延长酶处理时间和增大酶用量的方式以达到预期的脱细胞效果。而延长酶处理时间必然会增加对角膜原有的胶原纤维结构破坏的机率。而增大酶用量会使得角膜内的酶残留量增大，同样会对角膜的透明度造成损害。

而在现有技术中另一种常用的冻融方法中，经过反复冻融处理后，角膜基质层内会出现因冰晶而产生的较大的不规则的空隙，虽然达到松散胶原组织的目的，但是这些不规则的空隙对原有的胶原排列结构造成了不可恢复的破坏性。这对于没有透明度要求、规则的胶原纤维排列的特殊要求的其它组织来讲无大影响。但是，角膜不同于其它一切组织的鲜明特点：透明，这也是角膜执行其生理功能的基础。因此，从角膜透明度保持这个角度上讲，人工角膜制备必须力求具有规则排列的胶原纤维排列结构，以使角膜保持有较好的透明度。故而寻找一种理想的脱细胞方式对于维持猪角膜透明性尤为必要。

试验数据证明，采用酶处理方式对于酶的选择非常重要，不同的生物酶所达到的脱细胞效果差异也比较大。另外，酶处理脱细胞方法中，需要依据不同酶，匹配选择酶处理的时间，以及酶溶液的浓度等重要参数进行恰当的选择，才能即达到较好的脱细胞效果。申请人通过对现有技术中所列出的各种酶处理方法进行的脱细胞试验发现，目前已公开的生物酶脱细胞处理方式均不能达到在保持角膜透明前提下脱去角膜细胞效果。故而寻找一种理想的脱细胞方式对于维持猪角膜透明性尤为必要。

发明内容

本发明的目的在于一种动物来源角膜的脱细胞方法，特别是一种以猪角膜来源的人工角膜的脱细胞方法，及其以猪角膜为材料的脱细胞角膜。在保证人工角膜脱细胞要求的情况下，最大限度地保持角膜的特殊胶原纤维排列结构，使得脱细胞处理环节对角膜的透明度影响降到最低。

本发明的另一个目的在于提供一种角膜脱细胞方法，恰当地选择用于脱细胞处理的生物酶的种类，实现更佳的脱细胞效果。使得以猪角膜来源的人工角膜产品的DNA残留符合国内严格的对动物源性生物材料DNA残留的标准。

本发明的再一目的在于提供一种角膜脱细胞方法，在角膜进行酶处理的全过程中，在不对角膜材料进行过度的预处理的情况下，易于生物酶降解作用的发挥，从而达到最大限度地保持角膜基质层原有的胶原纤维规则排列的结构，保持角膜透明前提下，获得较佳的脱细胞效果。

本发明提供的猪角膜的脱细胞方法，对新鲜猪角膜进行预处理，制备全层或板层角膜，采用生物酶对角膜进行脱细胞处理；其中，所述脱细胞处理至少包括如下步骤：S1:干燥处理：将角膜进行干燥处理，增大酶溶液向角膜组织的渗透压，加快角膜对酶溶液的吸收；S2：酶处理：采用DMEM培养基配置全能核酸酶溶液；将干燥后角膜加入上述酶溶液；置于震荡培养箱中震荡处理时间不小于1.0小时；S3:清洗：将角膜加入清洗液中，置于震荡培养箱中震荡洗涤处理，获得脱细胞的猪角膜。

本发明技术效果是相当显著，首先，在本发明中仍采用生物酶处理的脱细胞方法，但在本发明中选择使用全能核酸酶进行酶处理。试验证明，该全能核酸酶其脱细胞效果与现有技术中公开的各种酶及其组合相比，具有脱细胞效果好和效率高的优势，有利于在达到较好的脱细胞效果的同时，可以在最大限度上使角膜保持原有胶原纤维规则排列结构，从而达到本发明的目的。

其次，大量的试验证明，本发明中采用的DMEM培养基配置酶溶液，对角膜基质层原有的胶原排列结构破坏最小。

第三，本发明在进行脱细胞处理之前对角膜进行干燥处理。与现有技术中酶处理前预先对角膜进行冻融或溶涨等处理相反，本发明通过酶处理前的干燥处理，使角膜胶原纤维基本保持干燥前规则排列的结构。特别重要的是经过干燥处理后的角膜含水率较低，增大酶溶液向含水率较低的角膜组织的渗透压。在其后的酶处理过程中，加快了角膜对酶溶液的吸收速度。其所带来的效果是生物酶更容易渗入角膜内部，使得酶处理功效大大提高，从而缩短了酶的处理时间，减少酶的用量，并因此达到最大限度地减小了酶处理过程对角膜胶原纤维结构造成的损害。

采用本发明的脱细胞方法所获得的猪脱细胞角膜的HE染色无细胞核，DAPI无染色，角膜DNA残留量均不大于100ng/mg。最大限度地保持了角膜胶原纤维的规则排列结构。如图1A～图1C所示，本发明方法获得的角膜电镜结构显示胶原纤维的结构与天然角膜极为接近。

本发明的一个可选择实施例中，在S1干燥处理步骤中，所述角膜干燥处理优选至含水量为不大于30％。

本发明的可选择实施例中，所述全能核酸酶溶液的浓度为100U～25000U/毫升。

在本发明的较佳实施例中，所述全能核酸酶最佳选择为美国默克公司生产全能核酸酶

所述全能核酸酶

溶液的浓度为100U～1000U/毫升。本发明所选择的全能核酸酶

可以大大地减少酶的用量，从而达到减少脱细胞后角膜内酶的残留量。

本发明的一个可选择实施方式中，所述板层角膜仅包括前弹力层和基质层。

本发明的一个可选择实施方式中，所述S2酶处理步骤中置于震荡培养箱中震荡处理时间优选为2.0～5.0小时。

本发明的一个较佳的实施方式中，所述S2酶处理步骤中在震荡处理之前，先将角膜进行涡旋震荡至角膜表面气泡去除，通过涡旋震荡将角膜内气体排出而形成空隙，更有利于加快酶的吸收速度，从而缩短酶法脱细胞时间。

本发明的一个可选择实施方式中，所述角膜在酶溶液中的震荡处理温度20℃～30℃；所述角膜在酶溶液中的震荡频率为每分钟50-100次。

本发明的一个可选择实施方式中，在S3清洗处理步骤中，所述洗涤震荡频率为每分钟100-160次；每次震荡洗涤时间不大于30分钟。

本发明的一个可选择实施方式中，所述角膜在洗涤过程中的温度控制在5℃～25℃。

本发明的一个可选择实施方式中，角膜的洗涤溶液为蒸馏水或氯化钠溶液或pH6.0至8.0的缓冲溶液。

本发明的一个可选择实施方式中，所述角膜干燥处理方法为晾干法；晾干至所述角膜设定的干燥度。

本发明的一个可选择实施方式中，所述角膜干燥处理方法为真空干燥法。

本发明的一个较佳的实施方式中，所述角膜干燥处理方法为压力自高向低的逐渐减压的真空干燥法；所述逐渐减压的减压范围为常压至接近极限真空。所述逐渐减压在减压范围内可呈梯度逐级减压。

本发明的一个可选择实施方式中，所述角膜真空干燥方法干燥时间不大于24小时。

本发明提供的一种脱细胞猪角膜，由本发明所述的脱细胞方法获得；所述的脱细胞猪角膜包括全层角膜或板层角膜。其中，所述脱细胞猪角膜的DNA残留不大于100ng/mg。

本发明提供的一种脱细胞猪板层干燥角膜，由本发明所述的脱细胞方法获得；所述猪板层角膜仅包括前弹力层和基质层；所述脱细胞处理后的猪板层干燥角膜含水率不大于20％，透光率大于70％。所述透光率为380nm-780nm波长范围内测得的透光率。所述脱细胞猪板层角膜的DNA残留不大于100ng/mg。

本发明提供的一种脱细胞板层干燥角膜的使用方法，从密封包装中取出脱细胞板层干燥角膜，经过灭菌后生理盐水15-30分钟复水后，直接用于异种角膜移植术。

试验证明，本发明提供的脱细胞猪角膜以及脱细胞板层干燥角膜，角膜HE染色无细胞核，DAPI无染色，角膜DNA残留量均低于100ng/mg。完全能保持角膜胶原纤维的规则排列结构。如图1A～图1C所示，本发明脱细胞方法获得的角膜电镜结构显示胶原纤维的结构与人角膜和未脱细胞处理前的猪角膜的极为接近。

如图2至图3所示，本发明提供的猪角膜脱细胞板层干燥角膜在脱细胞处理过程中，最大限度地减小了酶处理过程对角膜胶原纤维结构造成的损害，因此，本发明提供的板层干燥角膜的透光率在380～780nm波长内测定均达到85％。

如图5A～图5D所示临床角膜移植术案例证明，采用本发明提供的猪脱细胞板层干燥角膜具有极佳的移植效果。为解决国内移植用角膜供体严重缺乏的现状提供了极好的解决方案，为国内数百万因角膜致盲的患者带来复明的希望。

附图说明

下面结合附图对本发明及其具体实施方式及其效果作简单地介绍，下面的附图仅仅是选择本发明的一些具体试验例说明，而非本发明的全部。

图1A人角膜的胶原排列横截面排列结构；

图1B未脱细胞处理的猪角膜胶原横截面排列结构；

图1C本发明经脱细胞处理后的猪角膜的胶原横截面排列结构；

图2本发明猪脱细胞干燥板层角膜产品照片。

图3本发明猪脱细胞干燥板层角膜HE染色照片。

图4本发明猪脱细胞干燥板层角膜向新西兰大白兔板层移植术后照片。

图5A本发明一临床移植术前照片；

图5B为图5A临床移植术后3天照片；

图5C为图5A临床移植术后2个月照片；

图5D为图5A临床移植术后6个月照片；

图5E为图5A临床移植术后1年的照片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例1猪角膜的脱细胞方法，对新鲜猪角膜进行预处理，制备全层或板层角膜后，采用生物酶对角膜进行脱细胞处理。所述脱细胞处理至少包括如下步骤：

S1:干燥处理：将角膜进行干燥处理，增大酶溶液向角膜组织的渗透压，加快角膜对酶溶液的吸收；本发明中的干燥处理与现有技术中脱水处理的区别在于，本发明的干燥处理后角膜内的含水率应当低于新鲜角膜的含水率(而本领域中，脱水处理是指将脱去在制备过程中角膜增加的水分，脱水后角膜保有与新鲜角膜基本相同的含水率)。在本实施例1中，所述角膜干燥处理优选至含水量为不大于30％。在本实施例1中一个具体试验例中，角膜干燥至含水率为15％±3％。干燥状态下的角膜内基本上不存在因溶胀使角膜基质层胶原纤维结构呈过度松解状态，也不会形成因反复冻融而产生过多的不规则孔隙，从而有效地保持了基质层内规则的胶原纤维排列结构。

S2：酶处理：采用DMEM培养基配置全能核酸酶溶液；将干燥后角膜加入上述酶溶液；置于震荡培养箱中震荡处理时间不小于1.0小时；

由于全能核酸酶因生产厂家、产品批次、运输方式及保存时间等诸多因素的影响，酶的活性程度差异较大，因此酶溶液的浓度应当随酶的活性程度进行选择，酶溶液的浓度应当随酶活性的降低而增高。

在本实施例1较佳的实施方式中，在本发明的较佳实施例中，所述全能核酸酶选择为美国默克公司生产全能核酸酶

该全能核酸酶

溶液的浓度为100U～1000U/毫升。本实施方式中所选择的全能核酸酶

可以大大地减少酶的用量，从而达到减少脱细胞后角膜内酶残留的效果。特别是，采用DMEM培养基配置的全能核酸酶

酶溶液的溶剂，可以在保证酶的脱细胞效果的情况下，对角膜原有的胶原排列结构的破坏最小。

在本实施例1较佳的实施方式的一个具体的试验例中，选择DMEM培养基配置浓度为300U～500U/毫升的全能核酸酶

酶溶液的。经检测，在这个具体的试验例中，采用该酶溶液脱细胞处理后所获得的角膜的DNA残留可达到大约50ng/mg的水平。

本实施例1的一个可选择实施方式中，所述S2酶处理步骤中置于震荡培养箱中震荡处理时间优选为2.0～5.0小时。

本实施例1的另一个较佳的实施方式中，所述S2酶处理步骤中，在震荡处理之前，先将角膜进行涡旋震荡至角膜表面气泡去除，通过涡旋震荡将角膜内气体尽快排出并形成有孔隙，更有利于缩短酶处理时间。

本实施例1的一个具体试验例中，按照每片角膜加入0.5～0.8毫升上述酶溶液，先采用涡旋震荡方式至角膜表面气泡去除。试验证明，在很短的时间内角膜表面的气泡即已经去除，(通常不会超出1分钟的时间)。而此时角膜内所含气体基本上以气泡形式从角膜表面排出。然后进行置于震荡培养箱中进行震荡处理，震荡处理时间大约3.0小时。

在本实施例1一个可选择实施方式中，所述角膜在酶溶液中的震荡处理温度20～30℃；这个温度范围适于本发明所采用的生物酶对基质层内细胞的酶解作用更为充分。在本实施例1一个具体试验例中所述震荡处理温度控制在25℃左右。

本实施例1的一个选择实施方式中，角膜在酶溶液中的震荡频率控制在每分钟50-100次较低的水平。在本实施例1的较佳的具体试验例中，所述的震荡频率选择为每分钟75次。试验证明的进行酶处理时，选择一个较低的震荡频率可以达到减少对角膜原有胶原纤维排列的破坏程度的效果。

S3:清洗：将酶处理后的角膜加入清洗液中，置于震荡培养箱中震荡洗涤处理，获得脱细胞的猪角膜。

本实施例1的一个可选择实施方式中，所述洗涤震荡频率为每分钟100-160次；每次震荡洗涤时间不大于30分钟。角膜在洗涤过程中的温度控制在5℃～25℃范围内。具体在本实施例一个较佳的试验例中，清洗处理过程中的温度控制在15℃左右，并在全部的清洗过程基本上保持恒温，避免因温度过高而产生角膜胶原蛋白的变性。

在本实施例中采用浓度为0.9％的氯化钠溶液作为清洗溶液，获得脱细胞的猪角膜。在本实施例1的一个具体试验例中，选择每片角膜加入5毫升浓度为0.9％的氯化钠溶液构成的清洗液，置于震荡培养箱中震荡洗涤处理5次，震荡频率为每分钟150次，每次震荡洗涤处理时间为15分钟。

本发明中在酶处理脱细胞后所进行的清洗处理，其目的将杂蛋白、脱出的细胞残核、酶残留等等支架外其它成分从角膜基质层内进行较为彻底的清除，所获得的脱细胞角膜内会因细胞残留清除后而产生孔隙，在角膜内原有的胶原排列结构不被破坏或者破坏程度较小的情况下，因清除后在角膜内所产生的孔隙率及孔隙位置及孔隙的大小与角膜原细胞保持基本相同，极有利于移植后人体细胞的有序生长。

本实施例1的另一种实施方式中，所述角膜的洗涤溶液还可为蒸馏水或pH6.0至8.0的缓冲溶液。

在发明中在猪角膜预处理过程时进行全层角膜或板层角膜制作，其制作方式可采用任意一种常规的制作方法。本实施例1中一个具体的实施方式中在脱细胞处理前制作成仅包括前弹力层和基质层的板层角膜。

在本发明中，酶处理前的S1干燥处理对角膜的酶处理脱细胞效果产生较为重要的影响，因此在选择干燥方法时，应当选择对角膜胶原排列破坏较小的常规的干燥方法。在本实施例1中可选择的实施方式中，选择干燥过程较为温和的干燥方法晾干法或真空干燥法。

在本实施例1的一个较佳的具体实施方式中，采用压力自高向低的逐渐减压的真空干燥法，所述逐渐减压的减压范围为常压至极限真空。而所述逐渐减压在减压范围内可呈梯度逐级减压。通过逐渐减压能够使得角膜的真空干燥过程更加温和，最大限度地减小在干燥环节对角膜胶原排列结构的破坏。(关于本发明中采用的减压真空干燥法已另案申请，本案不再赘述)。

在在本实施例1一个可选择实施方式中，角膜真空干燥方法干燥时间不大于24小时。在本实施例1的较佳具体实施方式中，真空干燥时间为大约12小时。

本实施例1的脱细胞方法所获得的一种脱细胞猪角膜是由仅包括前弹力层和基质层构成的猪板层角膜。试验证明，采用本实施例1的较佳实施方式所获得的猪脱细胞角膜的DNA残留大约为50ng/mg，透光率大于80％；灭菌后可以直接应用于异种角膜移植。

采用实施例1的脱细胞方法获得的所述脱细胞猪板层角膜，在脱细胞处理后进行干燥处理所获得的干燥角膜，在含水率不大于20％的干燥状态下，所述透光率大于85％。

其中所述透光率可采用常规的检测方法，具体在本实施例中，在380nm-780nm波长范围内所测得的透光率。

本发明的细胞干燥角膜的使用方法，从密封包装中取出脱细胞板层干燥角膜，经过灭菌后生理盐水15-30分钟复水后，直接用于异种角膜移植术。

图5A～图5E为本发明实施例1所述的猪脱细胞板层干燥角膜的人体角膜移植临床术后一组照片，分别为图5A术前病例照片，图5B为术后3天；图5C为术后2个月；图5D为术后6个月；图5E为术后1年。相对于现有的有文献记载的临床效果而言，本实施例1提出的板层干燥角膜的在术后3天即已经呈透明状态，角膜上皮基本修复，未见明显排斥反应，术后1个月角膜完全恢复透明，无新生血管长入，未见排斥反应。术后1年完全透明，基本上达到与人角膜移植效果基本相同，校正视力达1.0。

实施例2

本实施例2猪角膜的脱细胞方法，对新鲜猪角膜进行预处理，制备全层或板层角膜后，采用生物酶对角膜进行脱细胞处理。所述脱细胞处理至少包括如下步骤：

S1:干燥处理：将角膜进行干燥处理，加快角膜对酶溶液的吸收；在本实施例2中一个具体试验例中，角膜干燥至含水量为5％±3％。

S2：酶处理：采用DMEM培养基配置全能核酸酶溶液；将干燥后角膜加入上述酶溶液；置于震荡培养箱中震荡处理时间不小于1.0小时；

在本实施例2较佳的实施方式中，所述全能核酸酶选择为美国默克公司生产全能核酸酶

在本实施方式的一个具体的试验例中，选择DMEM培养基配置浓度为500U～1000U/毫升的全能核酸酶

酶溶液。经检测，在这个具体的试验例中，采用该酶溶液脱细胞处理后所获得的角膜的DNA残留可达到大约20ng/mg的水平。

本实施方式中所选择采用DMEM培养基配置的全能核酸酶(Benzonase^@)可以大大地减少酶的用量，从而达到减少脱细胞后角膜内酶残留的效果。可以在保证酶的脱细胞效果的情况下，对角膜原有的胶原排列结构的破坏最小。

本实施例2的一个可选择实施方式中，所述S2酶处理步骤中置于震荡培养箱中震荡处理时间优选为2.0～5.0小时。

本实施例2的另一个较佳的实施方式中，所述S2酶处理步骤中，在震荡处理之前，先将角膜进行涡旋震荡至角膜表面气泡去除，通过涡旋震荡将角膜内气体尽快排出，更有利于缩短酶处理时间。

本实施例2的一个具体试验例中，按照每片角膜加入1.0～2.0毫升上述酶溶液，先采用涡旋震荡方式至角膜表面气泡去除。试验证明，在很短的时间内角膜表面的气泡即已经去除，(通常不会超出1分钟的时间)。而此时角膜内所含气体基本上以气泡形式从角膜表面排出。然后进行置于震荡培养箱中进行震荡处理，震荡处理时间大约5.5～6.0小时。

在本实施例2一个可选择实施方式中，所述角膜在酶溶液中的震荡处理温度15～37℃；这个温度范围适于本发明所采用的生物酶对基质层内细胞的酶解作用更为充分。在本实施例2一个具体试验例中所述震荡处理温度控制在25℃～30℃。

本本实施例1的一个选择实施方式中，角膜在酶溶液中的震荡频率控制在每分钟50-100次较低的水平。在本实施例2的较佳的具体试验例中，所述的频率选择为每分钟50次。在本具体的试验例中，在适当地增加震荡酶处理时间时，选择一个较低的震荡频率，其目的是减少酶震荡处理对角膜原有胶原纤维排列的破坏程度。

S3:清洗：将酶处理后的角膜加入清洗液中，置于震荡培养箱中震荡洗涤处理，获得脱细胞的猪角膜。本实施例2的一个可选择实施方式中，按照每片角膜加入8毫升的清洗溶液置于震荡培养箱中震荡洗涤处理5次，每次震荡洗涤时间30分钟，获得脱细胞的猪角膜。本实施例2的一个试验例中，所述清洗溶液采用pH6.0至8.0的缓冲溶液。角膜在清洗处理过程中的温度控制在20℃左右。并在全部的清洗过程基本上保持恒温。角膜在洗涤过程中的震荡频率为每分钟100次。

本实施例2中在脱细胞处理前的角膜制作成仅包括前弹力层和基质层的板层角膜。

基于在本发明中，角膜干燥处理对角膜的酶处理脱细胞效果产生较为重要的影响，本实施例2中选择对角膜胶原纤维排列破坏较小的常规的晾干法。试验证明，晾干法可以最大限度地保持基质层的胶原纤维规则排列超微结构。在本实施例2中，板层角膜基质片平辅于超净培养皿中，置于含有干燥剂的保干器中晾干大约16～24小时，可达到本实施例中所设定的角膜含水率不大于30％的水平。

本实施例2的脱细胞方法所获得的一种脱细胞猪角膜是由仅包括前弹力层和基质层构成的猪板层角膜，具有很好的脱细胞的效果，角膜DNA残留检测不大于20ng/mg，酶处理后角膜透光率大于75％；灭菌后可应用于异种角膜移植。

采用本发明的脱细胞方法获得的所述脱细胞猪板层角膜，在脱细胞处理后进行干燥处理所获得的干燥角膜，在含水率不大于20％的干燥状态下，所述透光率大于85％。

本发明所述透光率可采用常规的检测方法，具体在本实施例是，采用380nm-780nm波长范围内所测得的透光率。

本发明的脱细胞干燥角膜的使用方法，从密封包装中取出脱细胞干燥角膜，经过灭菌后生理盐水15-30分钟复水后，直接用于异种角膜移植术。

实施例3

本实施例3提出的猪角膜的脱细胞方法，对新鲜猪角膜进行预处理，制备全层角膜，经干燥后采用生物酶对角膜进行脱细胞处理。所述脱细胞处理至少包括如下步骤：

S1:干燥处理：将预处理后角膜进行干燥处理，干燥至角膜含水量大约为30％；经过干燥处理使得角膜基本上呈干燥角膜状态。

S2:酶处理：采用DMEM培养基配置全能核酸酶

溶液；按照每片角膜加入2.0-3.0毫升上述酶溶液先采用涡旋震荡方式至角膜表面气泡去除；然后进行震荡处理，震荡处理时间大致约7.5～8.0小时。

S3、清洗：按照每片角膜加入10毫升的清洗溶液置于震荡培养箱中震荡洗涤处理3次每次震荡洗涤时间20分钟,获得脱细胞的猪角膜。具体在本实施例3的一个试验例中所述的清洗溶液采用蒸馏水。

在本实施例3中采用任意一种常规的角膜制作方法制作成全层角膜。

在本实施例3的较佳的实施方式中，所述全能核酸酶

)溶液的浓度范围为100～400U/毫升。角膜在酶溶液中的震荡处理温度控制在15℃～20℃。角膜在酶溶液中的震荡频率控制在每分钟80次。

在实施例3中，角膜在清洗处理过程中的温度控制在20℃左右。并在全部的清洗过程基本上保持恒温。角膜在洗涤过程中的震荡频率为每分钟100次。

本实施例3中对于S1的干燥处理方法选择与实施例1相同的逐渐减压真空干燥方法。干燥时间24小时。具体在本实施例中采用了梯度减压的真空干燥方法，即在密闭干燥室内的减压方式为以至少两级自高向低梯度减压，在每一级的压力梯度上持续一时间段；最后一级梯度压力再减压至设定的最大真空度状态至达到角膜含水率20％的干燥度的要求。

本实施例3的脱细胞方法所获得的一种全层脱细胞猪角膜，角膜DNA残留检测不超出95ng/mg。透光率大于70％；灭菌后除去后台层可用于异种角膜移植。

采用本发明的脱细胞方法获得的所述脱细胞猪板层角膜，在脱细胞处理后进行干燥处理所获得的干燥角膜，在含水率不大于20％的干燥状态下，所述透光率大于70％。

本发明所述透光率可采用常规的检测方法，具体在本实施例是，采用380nm-780nm波长范围内所测得的透光率。

实施例4

本实施例4提出的猪角膜的脱细胞方法，对新鲜猪角膜进行预处理，制备板层角膜，经干燥后采用生物酶对角膜进行脱细胞处理。所述脱细胞处理至少包括如下步骤：

S1:干燥处理：将预处理后角膜进行干燥处理，干燥至角膜含水量大约为10％；经过干燥处理使得角膜基本上呈干燥角膜状态。

S2:酶处理：本实施例4选择了除全能核酸酶

之外的其它厂商提供的全能核酸酶。该全能核酸酶浓度范围可依该全能核酸酶活性进行选择。在本实施例中采用国产全能核酸酶(例如上海某生物科技公司)。在本实施例4的具体试验例中，依据该厂商提供的不同批次全能核酸酶产品的活性度选择的浓度范围分别为：1000U～5000U/毫升；5000U～10000U/毫升；10000U～15000U/毫升；15000U～20000U/毫升；20000U～25000U/毫升。按照每片角膜加入2.0-3.0毫升上述酶溶液先采用涡旋震荡方式至角膜表面气泡去除；然后进行震荡处理，在25℃恒温状态下，震荡处理时间大致约3.0～4.0小时。经检测，在上述具体的试验例中，采用该全能核酸酶配制的酶溶液脱细胞处理后所获得的角膜的DNA残留均可达到不大于100ng/mg的标准。

试验证明，本发明选择选择DMEM培养基配置全能核酸酶溶液基本上可以达到提高的脱细胞效果的作用。通过依据不同厂商提供全能核酸酶活性来调节全能核酸酶的浓度范围，实现角膜的DNA残留达到不大于100ng/mg的标准效果。但是，随全能核酸酶的浓度升高会增大了酶的用量，从而角膜内的酶残留量也会随之增大。本实施例4会增加去除酶残留的难度。

S3、清洗：按照每片角膜加入10毫升的清洗溶液置于震荡培养箱中震荡洗涤处理8次，震荡频率为每分钟150次，每次震荡洗涤时间25分钟,获得脱细胞的猪角膜。具体在本实施例4的一个试验例中所述的清洗溶液采用浓度为0.9％的氯化钠溶液。

在本实施例4中采用任意一种常规的角膜制作方法制作成全层角膜。

在实施例4中，在清洗处理过程中的温度控制在20～25℃左右。并在全部的清洗过程基本上保持恒温。角膜在洗涤过程中的震荡频率为每分钟100次。

本实施例4中S1的干燥处理方法选择与实施例1相同的逐渐减压真空干燥方法。

本实施例4的脱细胞方法所获得的一种全层脱细胞猪角膜，角膜DNA残留检测不超出100ng/mg标准。透光率大于70％；灭菌后除去后台层用于异种角膜移植。

采用本实施例4的脱细胞方法获得的所述脱细胞猪板层角膜，在脱细胞处理后进行干燥处理所获得的干燥角膜，在含水率不大于20％的干燥状态下，所述透光率大于70％。

针对上述各实施方式的详细解释，其目的仅在于对本发明进行解释，以便于能够更好地理解本发明，但是，这些描述不能以任何理由解释成是对本发明的限制，特别是，在不同的实施方式中描述的各个特征也可以相互任意组合，从而组成其他实施方式，除了有明确相反的描述，这些特征应被理解为能够应用于任何一个实施方式中，而并不仅局限于所描述的实施方式。

Claims (23)

1.一种猪角膜的脱细胞方法，对新鲜猪角膜进行预处理，制备全层或板层角膜，采用生物酶对角膜进行脱细胞处理；所述脱细胞处理至少包括如下步骤：

S1:干燥处理：将角膜进行干燥处理，加快角膜对酶溶液的吸收；

S2：酶处理：采用DMEM培养基配置全能核酸酶溶液；将干燥后角膜加入上述酶溶液；置于震荡培养箱中震荡处理时间不小于1.0小时；

S3:清洗：将角膜加入清洗液中，置于震荡培养箱中震荡洗涤处理，获得脱细胞的猪角膜。

2.如权利要求1所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，所述板层角膜仅包括前弹力层和基质层。

3.如权利要求1所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，在S1干燥处理步骤中，所述角膜干燥处理至含水量为不大于30％。

4.如权利要求1所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，S2酶处理步骤中，所述全能核酸酶溶液的浓度为100U～25000U/毫升。

5.如权利要求1所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，S2酶处理步骤中，所述全能核酸酶最佳为全能核酸酶

6.如权利要求5所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，所述全能核酸酶

溶液的浓度为100U～1000U/毫升。

7.如权利要求1或5或6所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，S2酶处理步骤中，置于震荡培养箱中震荡处理时间为2.0～5.0小时。

8.如权利要求1所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，S2酶处理步骤中，在震荡处理之前，先将角膜进行涡旋震荡至角膜表面气泡去除。

9.如权利要求1所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，S2酶处理步骤中，所述角膜在酶溶液中的震荡处理温度20℃～30℃。

10.如权利要求1所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，S2酶处理步骤中，所述角膜在酶溶液中的震荡频率为每分钟50-100次。

11.如权利要求1所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，在S3清洗处理步骤中，所述震荡洗涤处理的震荡频率为每分钟100-160次；每次震荡洗涤时间不大于30分钟。

12.如权利要求1所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，所述角膜在洗涤过程中的温度控制在5℃～25℃。

13.如权利要求1所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，角膜的洗涤溶液为蒸馏水或氯化钠溶液或pH6.0至8.0的缓冲溶液。

14.如权利要求1所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，所述角膜干燥处理为晾干法；晾干至所述角膜设定的干燥度。

15.如权利要求1所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，所述角膜干燥处理为真空干燥法。

16.如权利要求15所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，所述角膜干燥处理为压力自高向低的逐渐减压的真空干燥法；所述逐渐减压的减压范围为常压至接近极限真空。

17.如权利要求16所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，所述逐渐减压在减压范围内可呈梯度逐级减压。

18.如权利要求15～17任意一项所述的猪角膜的脱细胞方法，其特征在于，所述角膜真空干燥处理的干燥时间不大于24小时。

19.一种脱细胞猪角膜，其特征在于，所述脱细胞猪角膜由上述任意一项权利要求所述的脱细胞方法获得；所述的脱细胞猪角膜包括全层角膜或板层角膜。

20.如权利要求19所述的脱细胞猪角膜，其特征在于，所述脱细胞猪角膜的DNA残留不大于100ng/mg。

21.一种脱细胞猪板层干燥角膜，由上述权利要求1至18任意一项所述的脱细胞方法获得；所述猪板层干燥角膜仅包括前弹力层和基质层；其特征在于，所述的脱细胞处理后的猪板层干燥角膜含水率不大于20％，透光率大于70％。

22.如权利要求21所述脱细胞猪板层干燥角膜，其特征在于所述的透光率为380nm-780nm波长范围内测得的透光率。

23.如权利要求21或22所述的脱细胞猪板层干燥角膜，其特征在于所述的脱细胞猪板层干燥角膜的DNA残留不大于100ng/mg。

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