CN100333702C - 一种无细胞的异种角膜基质及制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种无细胞的异种角膜基质及制备方法和用途，异种角膜基质制备方法是：先获取新鲜动物角膜；用化学法和酶法洗脱角膜基质细胞膜成分和去除核酸；将无细胞异种角膜基质脱水处理；保存，备用。本方法通过去除所有角膜基质内的细胞成分，消除了异种角膜基质的抗原性，同时，保留了胶原纤维的完整性和角膜的透明性。这种无细胞异种角膜基质可用于组织工程的人工角膜的构建，或直接做为角膜移植、角膜屈光手术等的医用材料。

Description

一种无细胞的异种角膜基质及制备方法和用途

技术领域

本发明属医用材料，涉及一种角膜基质，尤其涉及一种无细胞异种角膜基质及制备方法，这种无细胞的异种角膜基质既可用于组织工程的人工角膜构建，又可作为医用材料用于角膜移植、屈光手术。

背景技术

角膜病是全球范围内引起致盲的第二大疾病。¹对于角膜病致盲的患者，只有通过角膜移植才能使患者恢复视力。在我国，因角膜病致盲的患者每年大约有25万例，而接受角膜移植的患者每年仅数千例。制约角膜移植开展的根本原因是供体角膜来源的极端匮乏。因此，研究和开发出能替代人角膜的角膜替代物是解决此供需矛盾的关键。

人工角膜的研究已有数十年的历史²，过去的研究主要集中在材料学方面³。因为人角膜是眼球壁的一部分，对移植替代物来说不仅仅要求有严格的光学特性，同时还必须具备与人眼组织良好的生物相容性。近年来，组织工程技术的发展为人工角膜的构建提供了新的思路和方法。Minami等⁵在1993年以胶原凝胶为基质实现了人工角膜的体外重建，但由于凝胶的透明性差和强度低而未能用于移植手术。1999年Griffith等⁶将转基因的内皮和上皮细胞培养在以胶原-硫酸软骨素为基础的基质上，重建了功能、结构都与正常角膜相似的生物角膜，但是也因为基质强度不够而未能进入动物实验阶段，离临床应用就相差更远。因此，人工合成的角膜生物材料至今还很不理想⁴。至今为止有关人工角膜生物材料研究最主要的局限在于，无法制备出与人角膜具有相似的透明性、强度及生物学特性的基质架构。

异种角膜基质如猪角膜基质具有与人角膜基质类似的组织结构、生物物理特性和光学特性⁷。但是异种移植后强烈的排斥反应以及异种移植可能使传染性病原体感染人体，这两大因素导致异种角膜移植至今无法在临床上应用⁸。近年来的研究发现，角膜基质内的基质细胞是引起基质型排斥反应的主要抗原⁹，也是传染性病原体如病毒的载体。而作为角膜基质架构的胶原纤维在种系间高度保守，组织结构和生物物理特性的差异不大，并且抗原性很低，无细胞的异种角膜移植后不产生排斥反应。因此，将动物角膜的基质细胞完全脱去，使之成为无细胞的异种角膜基质可能是人角膜基质的理想替代物。在体外器官重建领域，已有研究通过对异种心瓣膜¹⁰、真皮组织¹¹、肌腱韧带¹²等组织进行脱细胞处理，得到无细胞纤维架构。它们具有无抗原性，良好的生物相容性等优点，并且胶原纤维架构几乎能完整保留。有些脱细胞异种组织已经成功地应用于临床¹³

发明内容

本发明的一个目的是提供一种无细胞异种角膜基质。

本发明的另一个目的是提供这种无细胞异种角膜基质的制备方法，通过以下技术方案实现：

(1)获取新鲜动物角膜基质：摘取动物眼球，修剪眼球表面附属组织后浸泡于5％聚维酮碘中3分钟，然后用500毫升生理盐水冲洗，所用动物主要包括猪、牛、狗，沿角膜缘剪下全角膜，撕去角膜上皮层和后弹力膜，获得动物角膜基质。也可将动物眼球先置-70℃冰冻保存，常温解冻后再行上述操作。

(2)洗脱角膜基质细胞膜成分和去除核酸的处理：①将获得的动物角膜基质置于离子型或非离子型去垢剂溶液中，置于恒温摇床上振荡，目的是将角膜基质细胞膜成分洗脱，去垢剂溶液每6-12小时更换1次，温度保持25℃-37℃，pH值6-8，洗脱时间24-72小时，②经①处理的角膜基质再用核酸酶溶液漂洗，目的是将残留的核糖核酸和脱氧核糖核酸成分洗脱，温度保持27℃-37℃，pH值6-8，③经②处理的角膜基质用平衡盐溶液冲洗48-72小时，得到无细胞的异种角膜基质。

去垢剂的溶液以低张溶液为宜，溶液渗透压为0mosm到299mosm之间，离子型去垢剂优选十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)，非离子型去垢剂优选曲酮X100(Triton X-100)，十二烷基硫酸钠的适宜浓度为0.05％到0.1％之间，曲酮X100的适宜浓度为0.1％到4％之间。为了最大限度地减少蛋白酶对基质胶原的破坏，溶液中宜加入胶原酶抑制剂如二乙胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，合适浓度为1-25mmol/L。核酸酶选择外切酶或内切酶，外切酶选择核糖核酸酶A(RNaseA)及脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)，内切酶选择EcoR I及Hind III等，核糖核酸酶A的浓度范围为0.02mg/ml到1mg/ml，脱氧核糖核酸酶I的浓度范围为0.2mg/ml到10mg/ml，为了能使核酸酶充分发挥作用，核酸酶溶液宜用生理缓冲溶液配制，优选Hank平衡盐溶液(Hanks’balanced salt solution，HBSS)。冲洗所用的平衡盐溶液优选磷酸平衡盐溶液(Phosphate balanced solution，PBS)。

(3)无细胞异种角膜基质脱水处理：用纯甘油进行12-24小时脱水处理。

(4)保存：将脱水后的角膜基质置于85％的甘油溶液中保存，备用。

本发明的又一个目的是这种无细胞异种角膜基质用于组织工程的人工角膜的构建，或直接作为角膜移植、角膜屈光手术等的医用材料。

本发明的主要特点在于经过上述脱细胞处理方法既可以去除动物角膜基质内所有的细胞成分，又可以保存角膜胶原纤维的基本架构，从而保留了角膜的韧性和透明性。处理后的异种角膜基质具有很低的免疫原性和良好的生物相容性。它可以直接用于治疗性角膜移植和板层角膜移植，移植后受体的角膜上皮很快使无细胞异种角膜基质植片的表面上皮化，受体的角膜基质细胞和神经可以重新长入无细胞异种角膜基质植片内，完全达到角膜移植的目的。

附图说明

图1a为冰冻猪角膜脱细胞处理前大体观。

图1b为猪角膜脱细胞处理后大体观。

图2a为冰冻猪角膜脱细胞处理前苏木苏-伊红(HE)染色照片。

图2b为猪角膜脱细胞处理后HE染色照片。

图3a为冰冻猪角膜脱细胞处理前透射电镜照片。

图3b为猪角膜脱细胞处理后透射电镜照片。

图4为以脱细胞猪角膜为供体的板层角膜移植术后。

图5为以脱细胞猪角膜为供体，在兔眼的板层角膜移植，术后4天上皮化完成。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1  脱细胞猪角膜基质的制备

在合格的饲养场中选择健康供体猪，用硫喷妥钠针肌注麻醉后，摘取猪眼球，修剪眼球表面附属组织后将眼球浸泡于5％聚维酮碘中3分钟，然后用500毫升生理盐水冲洗，将其置于-70℃冰冻保存，直至脱细胞处理。

眼球常温下解冻后，手术显微镜下沿角膜缘剪下全角膜，刮去角膜上皮层和撕去后弹力膜，参见图1a、图2a、图3a，然后将该角膜基质置于30ml离子型去垢剂中，置于恒温摇床上以300转/分不间断震荡24小时，每6小时更换溶液一次，离子型去垢剂选用0.05％SDS(SIGMA chemical company，St.Louis，MO)溶于去离子水中，并添加1mmol/L EDTA，处理温度为37℃，溶液pH值为8.0。

取出上述处理后的异种角膜基质，用HBSS(Alcon Laboratories，FortWorth，TX)冲洗1小时，洗除表面的残留溶液，然后置于核酸酶溶液中，以300转/分不间断震荡8小时，核酸酶溶液采用RNaseA 0.02mg/mL，DNaseI 0.2mg/mL(SIGMA chemical company，St.Louis，MO)溶于HBSS(Alcon Laboratories，Fort Worth，TX)中，处理温度为30℃，溶液pH值为7.0。

经过上述两步处理后，将异种角膜基质置于PBS(Invitrogen lifetechnologies，Carlbad，CA)中，100转/分漂洗48小时，处理温度为4℃，溶液pH值为7.0，处理后的角膜再经纯甘油中脱水处理12小时，脱水后角膜透明，参见图1b、图2b、图3b，可转移至85％甘油溶液中长期保存，供使用。

实施例2  脱细胞牛角膜基质的制备

在合格的饲养场中选择健康供体牛，用硫喷妥钠针肌注麻醉后，摘取牛眼球，修剪眼球表面附属组织后将眼球浸泡于5％聚维酮碘中3分钟，然后用500毫升生理盐水冲洗，4摄氏度下运送至实验室。

手术显微镜下沿角膜缘剪下全角膜，刮去上皮层，撕去角膜后弹力膜，然后将上述异种角膜基质置于30ml非离子型去垢剂中，300转/分不间断震荡72小时，每12小时更换溶液一次，非离子型去垢剂采用0.5％Triton X-100(SIGMAchemical company，St.Louis，MO)溶于去离子水中，并添加25mmol/L EDTA(SIGMA chemical company，St.Louis，MO)，处理温度为10℃，溶液pH值为7.0。

取出上述处理后的异种角膜基质，用HBSS(Alcon Laboratories，FortWorth，TX)冲洗0.5小时，洗除表面的残留溶液，然后置于核酸酶溶液中，以300转/分不间断震荡1小时。核酸酶溶液采用RNaseA 1mg/mL及DNaseI 10mg/mL(SIGMA chemical company，St.Louis，MO)溶于HBSS(Alcon Laboratories，Fort Worth，TX)中，处理温度为37℃，溶液pH值为7.0。

经过上述两步处理后，将异种角膜基质置于PBS(Invitrogen lifetechnologies，Carlbad，CA)中以100转/分充分漂洗48小时，处理温度为4℃，溶液pH值为7.0。处理后的角膜再经在纯甘油脱水处理24小时，脱水后角膜透明，可转移至85％甘油溶液中长期保存，供使用。

实施例3  新西兰兔治疗性角膜移植实验

用实施例2方法制备的无细胞牛角膜基质为供体材料(以下称供体)，选健康新西兰兔为受体行治疗性穿透性角膜移植术，将兔用硫喷妥钠肌注成功全麻后，术眼常规PVP碘消毒，铺巾，开睑器开睑，做上下直肌固定缝线，供体角膜用生理盐水冲洗后内基质面朝上置于角膜垫上，用7.5毫米环钻在受体角膜中央钻至前房后，前方内注入粘弹剂，用角膜剪沿钻缘剪除受体角膜制备植床，取植片置于植床上，以10-0尼龙线(Alcon Laboratories，Fort Worth，TX)作16针间断缝合。术毕除去直肌缝线和开睑器，用泰利必妥眼膏(SantanPharmaceutics，Osaka，Japan)涂眼。术后给予每天一次泰利必妥眼膏涂眼。观察结膜充血、上皮化完成和排斥反应发生等情况。移植后发现结膜充血3天后消退，上皮化术后4天完成，在3个月的观察期内无排斥反应发生。

实施例4  新西兰兔板层角膜移植实验

以实施例1方法制备获得的无细胞猪角膜基质为供体材料(以下称供体)，选健康新西兰兔为受体行板层角膜移植术，硫喷妥钠肌注成功全麻后，术眼常规聚维酮碘消毒，铺巾，开睑器开睑，做上下直肌固定缝线，供体角膜用生理盐水冲洗10分钟后内基质面朝上置于角膜垫上，用7.75毫米环钻钻取供体植片。用7.5毫米环钻在受体角膜中央钻至约2/3角膜深度后，用角膜板层刀分离板层。取植片置于植床，以10-0尼龙线(Alcon Laboratories，Fort Worth，TX)作16针间断缝合。术毕除去直肌缝线和开睑器，泰利必妥眼膏涂眼。术后给予每天一次泰利必妥眼膏涂眼。观察结膜充血、上皮化完成状况和角度透明度改变等指标。移植后发现结膜充血3天后消退，上皮化4天完成，在3个月的观察期内无排斥反应发生，角膜透明，参见图4、图5。

无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

本发明涉及的部分参考文献

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Claims (10)

1.一种无细胞的异种角膜基质，以动物角膜为材料，其特征是：提供的是一种无细胞的异种角膜基质。

2.根据权利要求1所述的无细胞异种角膜基质的制备方法，其特征是：通过以下技术方案实现：

(1)获取新鲜动物角膜基质：摘取动物眼球，修剪眼球表面附属组织后浸泡于5％聚维酮碘中3分钟，然后用500毫升生理盐水冲洗，沿角膜缘剪下全角膜，撕去角膜上皮层和后弹力膜，获得动物角膜基质；

(2)洗脱角膜基质细胞膜成分和去除核酸的处理：

①将获得的动物角膜基质置于离子型或非离子型去垢剂溶液中，恒温摇床振荡，去垢剂溶液每6-12小时更换1次，温度保持25℃-37℃，pH值6-8，洗脱时间24-72小时，

②经①处理的角膜基质再用核酸酶溶液漂洗，温度保持27℃-37℃，pH值6-8，

③经②处理的角膜基质用平衡盐溶液冲洗48-72小时，得到无细胞的异种角膜基质；

(3)脱水处理：用纯甘油对无细胞的异种角膜基质进行12-24小时脱水处理；

(4)保存：将脱水后的无细胞的异种角膜基质置于85％的甘油溶液中保存，备用。

3.根据权利要求2所述的无细胞的异种角膜基质的制备方法，其特征是：将摘取的动物眼球先置-70℃冰冻保存，常温解冻后再制备无细胞的异种角膜基质。

4.根据权利要求2或3所述的无细胞异种角膜基质的制备方法，其特征是：去垢剂的溶液选择低张溶液，溶液渗透压为0mosm～299mosm。

5.根据权利要求2或3所述的无细胞异种角膜基质的制备方法，其特征是：离子型去垢剂优选十二烷基硫酸钠，非离子型去垢剂优选曲酮X100，十二烷基硫酸钠的适宜浓度在0.05％到0.1％之间，曲酮X100的适宜浓度在0.1％到4％之间。

6.根据权利要求5所述的无细胞异种角膜基质的制备方法，其特征是：去垢剂溶液中加入胶原酶抑制剂，适宜浓度在1-25mmol/L，胶原酶抑制剂选择二乙胺四乙酸。

7.根据权利要求2所述的无细胞异种角膜基质的制备方法，其特征是：核酸酶选择外切酶或内切酶，外切酶选择核糖核酸酶A及脱氧核糖核酸酶I，内切酶选择EcoR I及Hind III，核糖核酸酶A的浓度范围为0.02mg/ml到1mg/ml，脱氧核糖核酸酶I的浓度范围为0.2mg/ml到10mg/ml。

8.根据权利要求2所述的无细胞异种角膜基质的制备方法，其特征是：冲洗所用的平衡盐溶液优选磷酸平衡盐溶液。

9.根据权利要求1所述的无细胞异种角膜基质在进行组织工程的人工角膜的构建中应用。

10.根据权利要求1所述的无细胞异种角膜基质在制备角膜移植、角膜屈光手术的医用材料中应用。