CN109475663B - 一种脱细胞猪角膜的制备方法及其脱细胞板层角膜和用法 - Google Patents

Abstract

一种猪脱细胞板层角膜的制备方法及其猪脱细胞板层角膜，制备方法为：预处理(S1)：对新鲜猪角膜的预处理,制作板层角膜；干燥处理(S2)：将预处理后板层角膜进行干燥处理；采用酶处理方法进行脱细胞(S3)：将干燥后角膜加入酶溶液；置于震荡培养箱中震荡处理；再将角膜置于震荡培养箱震荡洗涤处理，获得脱细胞角膜。灭菌处理：(S4)。

Description

一种脱细胞猪角膜的制备方法及其脱细胞板层角膜和用法

所属领域

本发明涉及一种脱细胞猪角膜的制备方法，及可以直接用于人角膜移植术的以猪角膜为材料的板层脱细胞角膜及其使用方法。

背景技术

角膜盲是我国的第二大致盲性眼病，角膜移植是角膜盲患者复明唯一有效的治疗手段。但角膜供体材料的匮乏严重影响角膜移植，经过中国科学家十余年努力研发出的以猪角膜为原材料的人工角膜可以代替代人源角膜，并在全世界范围内率先取得临床试验的成功。

现有的研究成果证明，以猪角膜为来源材料制备的人工角膜具有很好的生物相容性。特别是猪角膜具有与人角膜高度近似的组织结构、生物物理学特性和光学特性是角膜替代物的最佳选择的公认结论。而国内的研究成果所取得进展显示，猪角膜已经被作为人角膜移植备用材料一个重要的替代来源之一。目前部分脱细胞的猪角膜产品已经进行临床阶段，并产生一定的临床效果。为解决国内移植用角膜供体严重缺乏的现状提供了极好的解决方案，为国内数百万因角膜致盲的患者带来复明的希望。

角膜位于眼球的前部，是一种结构高度规则、相对无细胞的透明胶原组织。现有的板层脱细胞角膜基质仅包含有前弹力层和基质层。经过必要的脱细胞处理去除基质层内的免疫原性(DNA)，降低猪角膜移植的免疫排斥反应。再通过病毒灭活，灭菌处理降低角膜移植中的动物源性病毒、细菌感染，从而达到板层角膜可以用于移植的必要的生物学指标。

角膜基质层的结构特点在于其基质层内的胶原纤维有序且相互平行的排列，这种排列方式构成了角膜弹性机械强度及其透明度的等物理学特性结构基础。角膜的这个重要特征可以在植入后，诱导受体角膜基质细胞有序、均匀地长入，使角膜保持透明。

基于对上述板层角膜基质特点的分析，角膜基质层排列结构的高度保持，是实现板层角膜必要的生物物理学特性的重要因素。然而，目前的脱细胞方法都会在不同程度上对基质层的有序排列造成损害。其结果是在达到移植条件的必要的生物学指标的同时，都不可避免地破坏了角膜弹性机械强度及其透明度的等物理学特性。特别是角膜的透明度，从而大大地减损了角膜的复明功效。

酶法是角膜脱细胞处理的各种方法中最有效地方法。现有酶解法中使用酶试剂主要有：脂类酶、核酸酶和蛋白酶等；不同的酶类针对特定的细胞成分。其所存在的缺陷：首先，不能达到完全的脱细胞效果；其二，上述所列出的酶、特别是蛋白酶，对角膜细胞外基质也存在明显的破坏作用，导致角膜的透明度下降。

另外，现采用酶解脱细胞方法是，在角膜进行预处理后直接浸入酶溶液中。由于在预处理过程中，角膜的含水量不可避免地增大了，再将角膜直接浸入酶溶液后，酶溶液很难进入角膜内，大大地影响了酶对角膜基质内细胞的降解效果。很多情况下为保证脱细胞效果往往采用延长酶解处理时间的办法，增大了对角膜的透明度的等物理学特性的破坏机率。

角膜的灭菌处理是角膜制备不可或缺的步骤，其作用是完全杀灭角膜内的细菌、病毒等有害微生物。随着各种新的灭菌技术的成熟及广泛应用，辐照灭菌技术引入了角膜的灭菌处理。但是通过大量的角膜辐照灭菌试验结果来看，辐照灭菌后，角膜的透明度、生物力学特性均有比较明显的下降。美国国际组织库在进行的人角膜辐照灭菌试验，以及对比辐照前后角膜的透明度等试验数据分析后指出，常温条件下对人来源的角膜供体进行辐照灭菌，伽马射线可以使细胞外基质发生一些变化，但不会影响角膜透明度。但是，申请人以用动物来源角膜(特别猪角膜)制备的人工角膜的试验得出的结果是，辐照后角膜的理化性能同样会发生改变，从而导致辐照后角膜的透明度、韧性、亲水力与新鲜角膜相比，发生明显变化。

综上所述，现有的角膜制备方法中，去除基质层内的细胞成分，降低免疫排斥反应，灭菌处理降低动物源性病毒感染的两个关键步骤中，都不可避免地破坏了角膜弹性机械强度及其透明度的等物理学特性，特别是角膜的透明度。

目前大量的专利文献以及相关文献中所公开的各种脱细胞猪板层角膜的制备方法及其效果，大都是依据试验室中完成脱细胞处理之后的非干燥角膜状态下取得的。并且因其制备方法的不同，其试验数据或临床效果也不尽完全相同。毋庸置疑，目前公开现有技术，所称的角膜产品及其应用效果仅仅是建立在非干燥角膜的试验数据状态上。而非干燥角膜存在最大的缺陷是极其不容易于保存和运输，很难保证在生产、保存、运输及使用等市场运营的每个环节上产品质量同一性和性能稳定性，还不具备可以在市场上推广使用的条件。

目前研究人员提出的方法是对脱细胞之后的角膜进行必要干燥处理以求获得一种干燥角膜。在其中所列出的诸多常规干燥方法中，真空干燥是常用的干燥方法。本申请人在对现有的所有真空干燥方法获得的大量的试验数据进行研究统计分析后发现，真空干燥方法对人工角膜的不利影响的原因是相对于角膜其干燥过程过于剧烈，从而使得胶原组织排列发生不规则的改变，破坏了原角膜基质层中高度规则的胶原纤维排列，从而大大地影响了角膜的透明度。

而现有技术文献中公开的其它干燥方法基本上不能适于角膜的干燥处理。如自然晾干因时间过长，因环境温度以及较容易污染等问题较多，使得角膜基质内的胶原蛋白变性，角膜因此而丧失其应有的透明度。而冻干或者真空冻干的方法会使得角膜内因结晶而产生不规则空隙并因此而破坏了角膜的规则胶原纤维的排列。

不难证明的事实是，在人工角膜的制备过程中，任何一个处理环节都不可避免对角膜基质层内的规则排列造成的损害，并因此而对制备后的角膜的“透明度”造成极不利的影响。虽然可以有效地解决异体移植用器官的免疫排斥及动物源性病毒感染等问题，但是因制备过程对角膜透明度的不同程度的损伤，同样会在很大程度上影响移植效果。有必要提供一种方法，最大限度在减小对角膜基质层内规则排列的胶原结构的破坏，以确保在通过复杂的制备处理后的角膜仍具有极佳的透明度，达到实现人工角膜产品的市场化的应用的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪脱细胞板层角膜的制备方法，在必要的脱细胞处理和灭菌处理等关键步骤中，在确保达到严格的移植条件所必需的生物学指标的同时，能最大限度地降低对角膜胶原纤维规则排列结构的破坏。保持角膜透明度及其弹性机械强度等物理学特性，特别是将对角膜透明度的破坏降到最低。

本发明的另一个目的在于提供一种猪脱细胞板层角膜的制备方法，对角膜进行干燥处理过程中，最大程度地减少干燥过程对角膜胶原结构的破坏，角膜产品保持有平整光滑外观形态，有利于角膜细胞的生长。

本发明的再一目的在于提供一种猪脱细胞板层角膜的制备方法及其干燥角膜，使其具有方便保存、运输及使用的产品形态。从而克服现有技术中角膜产品依赖其制备方法不同而质量不一、产品难以规范化生产的缺陷，达到批量生产的技术要求。促进我国眼科医疗水平的发展，解决众多因缺乏角膜供体而不能得到有效医治的问题。

本发明的目的是这样实现的，本发明提供的一种猪脱细胞板层角膜的制备方法，至少如下步骤：S1、预处理：对新鲜猪角膜的预处理包括如下处理过程：

S1.1取新鲜猪角膜，清洁后去除上皮层；S1.2制备板层角膜；所述板层角膜仅包括前弹力层和基质层；S1.3清洗干净；

S2:干燥处理：将制备的板层角膜进行干燥处理；

S3:脱细胞处理：将干燥处理后角膜进行脱细胞处理过程：S3.1酶处理：采用DMEM培养基配置全能核酸酶

溶液；将干燥后角膜加入上述酶溶液；置于震荡培养箱中震荡不小于1小时；S3.2清洗：将角膜加入清洗溶液中，置于震荡培养箱震荡洗涤处理，获得脱细胞角膜；

S4:灭菌处理：采用钴60辐照灭菌，辐照剂量不大于25kgy。

由于在本发明中仍采用生物酶解的脱细胞方法，但在本发明中选择使用全能核酸酶

进行酶处理无需再对各种不同酶进行组合使用，即可以取得相当好的脱细胞效果，HE染色无细胞核，DAPI无染色，角膜DNA残留低于100ng/mg。其次，本发明脱细胞方法可以最大限度地保持了角膜与天然角膜极为接近的规则的胶原纤维的排列结构。

另外，在本发明在进行脱细胞处理之前对角膜进行干燥处理，通过降低角膜含水率，增大了角膜与酶溶液间的渗透压差，使得生物酶更容易渗入角膜内，大大地提高了酶的效率，从而缩短酶处理时间。因此，最大限度地减小了酶处理过程对角膜胶原纤维结构造成的损害，达到保持角膜透明度的技术效果。角膜的透光率均可确保在380-780nm波长内达到80％以上。

本发明的一个可选择的实施方式中在S1.2步骤中制备的新鲜板层角膜的厚度为300um～700um。

本发明的一个较佳的实施方式中所述全能核酸酶

溶液的浓度为100～1000U/mg(其U为酶的活性单位)。由于全能核酸酶因产生厂家产品批次、运输方式及保存时间等诸多因素的影响，酶的活性程度也会发生变化，因此酶溶液的浓度随酶的活性程度在上述范围内选择，酶溶液的浓度应当随酶活性的降低而增高。

本发明的一个可选择的实施方式中，所述清洗溶液为蒸馏水或氯化钠溶液或pH6.0至8.0的缓冲溶液。

本发明的一个可选择的实施方式中，角膜在酶溶液中的震荡处理温度15-37℃，略低于该全能核酸酶

厂家推荐使用的最佳温度(35℃左右)，以最大程度地降低酶解过程对角膜基质层内胶原纤维规则排列的破坏。

本发明的一个可选择的实施方式中，角膜在酶溶液中的震荡频率为每分钟50-100次。试验证明的进行酶处理时，较低的震荡频率可以大大地减少对角膜原有胶原排列的破坏程度。

在本发明中的一个选择实施方式中，角膜在清洗处理过程中的温度控制在5-20℃。并在全部的清洗过程基本上保持恒温状态，以避免因温度过高而产生角膜胶原蛋白的变性。

在本发明中的一个较佳的实施方式中，所述钴60辐照灭菌采用低温辐照；将角膜置于填充有制冷剂的保温容器中进行辐照灭菌；通过制冷剂使得角膜在辐照全过程中保持在低于0℃的低温状态下。其中，所述的制冷剂可以是冰或干冰或液氮任意一种。所述角膜低温辐照灭菌全程中温度不得高于0℃。

在本发明中的一个较佳的实施方式中，在进行辐照灭菌前，先将角膜进行单片密封包装，将密封包装后角膜置于低温制冷剂之中进行辐照。角膜在密封包装状态下进行终端灭菌直至临床，有利于角膜在运输及保存等环节上保持角膜的灭菌状态。

在本发明中的另一个较佳的实施例中，在脱细胞处理后对角膜进行干燥处理，制备成含水率含水量为5-20％的干燥角膜，有利于角膜具有作为产品在批量生产以及保存、运输市场商品属性。

在本发明中的一个实施方式中，所述的干燥处理可采用真空干燥。在一个较佳的干燥处理实施方式为所述真空干燥为压力自高向低的逐渐减压的干燥方法。所述逐渐减压中的减压范围值为常压至极限真空。所述逐渐减压干燥的时间不大于24小时。

在本发明中的一个选择实施方式中，真空干燥室内的温度控制在0℃～30℃。

本发明提供的一种脱细胞猪板层角膜，由猪角膜的前弹力层和基质层构成；所述基质层保持有胶原纤维的规则排列结构；角膜DNA残留不大于100ng/mg。在可见光范围内，所述角膜的透光率不低于80％。

本发明提供的另一种脱细胞猪板层角膜，由猪角膜的前弹力层和基质层构成；所述基质层保持有胶原纤维的规则排列结构；角膜DNA残留不大于100ng/mg。在可见光范围内，所述角膜的透光率不低于80％；含水率不大于20％的干燥角膜。

本发明提供的脱细胞板层干燥角膜的使用方法，从灭菌密封包装中取出角膜，浸入生理盐水15-30分钟后，直接用于异种角膜移植术。

在本发明中仍采用生物酶解的脱细胞方法，但在本发明中选择使用全能核酸酶

进行酶处理。本发明的技术效果相当显著：首先，本发明脱细胞效果极佳，角膜HE染色无细胞核，DAPI无染色，角膜DNA残留低于100ng/mg。其次，本发明脱细胞方法，最大限度地保持了角膜胶原纤维的规则排列结构。如图1A～图1C所示，本发明方法获得的角膜电镜结构显示胶原纤维的结构与天然角膜极为接近。

在本发明技术效果，在进行脱细胞处理之前对角膜进行干燥处理，使得进入酶溶液的角膜具有较低含水率，生物酶的更容易渗入角膜内，使得酶的酶解效率被大大地增强了，在保证脱细胞效果的同时，缩短酶处理时间。最大限度地减小了酶处理过程对角膜胶原纤维结构造成的损害。经本发明脱细胞方法处理的角膜的透光率均可确保在在380-780nm波长内达到80％以上。

本发明中的采用的逐渐减压的干燥方法，有效地克服了真空干燥的干燥过于剧烈的缺陷，使得真空干燥的过程变得更加温和，最大限度地减小了干燥过程中对角膜基质层的胶原纤维规则排列的破坏程度。本发明制备方法中所采用的干燥处理方法，应用在制备干燥角膜时，所获得干燥角膜具有表面光滑平整的外观形态，因此而带来的另一显著的临床效果是移植术后上皮细胞贴附和增殖速度快效果好。

附图说明

下面结合附图对本发明及其具体实施方式及其效果作简单地介绍，下面的附图仅仅是选择本发明的一些具体试验例说明，而非本发明的全部。

图1本发明实施例1的流程图；

图1A本发明实施例1中预处理S1的流程图；

图1B本发明实施例2中S2干燥处理的一种实施方式；

图1C本发明实施例2中S2干燥处理的另一种实施方式；

图2本发明实施例2的流程图；

图2A本发明实施例2中S2和S4干燥处理的第三种实施方式；

图3本发明猪脱细胞干燥板层角膜产品照片。

图4本发明猪脱细胞干燥板层角膜HE染色照片。

图5本发明与其它角膜在电镜下胶原结构对比；

图5A人角膜的胶原排列横截面排列结构；

图5B未脱细胞处理的猪角膜胶原横截面排列结构；

图5C本发明经脱细胞处理后的猪角膜的胶原横截面排列结构；

图6本发明猪脱细胞干燥板层角膜向新西兰大白兔板层移植术后照片。

图7A本发明一临床移植术前照片；

图7B为图7A临床移植术后3天照片；

图7C为图7A临床移植术后2个月照片；

图7D为图7A临床移植术后6个月照片；

图7E为图7A临床移植术后1年的照片

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

如图1所示，本实施例1提供的一种猪脱细胞板层角膜的制备方法，至少由四个处理过程。其中：

如图1A所示，第一步骤S1是对猪角膜进行预处理，如图1A所示。具体在本实施例中，预处理至少应当包括如下处理过程：S1.1取新鲜猪角膜，清洁后去除上皮层；S1.2制备板层角膜；所述板层角膜仅包括前弹力层和基质层；S1.3清洗干净；本发明对新鲜猪角膜的预处理主要是完成板层角膜制取，并进行必要的清洗以备进行后续处理程序，因此本发明预处理看S1.1～S1.3的每个处理方法均可以采用任意一种常规的处理方法。

在本实施例1中S1.2步骤中可选择的实施方式中，去除后弹力层和后皮层，构成仅保留前弹力层和基质层的板层角膜；其中一个可选择的实施方式制取新鲜板层角膜厚度为300um～700um。本发明可在这个范围内制备成不同厚度规格板层角膜，以供不同移植病例对角膜厚度进行精准选择需求。

本实施例1的第二步骤S2为干燥处理，将预处理后板层角膜进行干燥处理；本实施例1的S2干燥处理是为了在酶处理前尽可能减少角膜内的含水量，以利于酶溶液渗入角膜内，提升酶处理的速度和效力。因此S2干燥处理方法可采用现有的任意一种常规的干燥方法。

在本S2环节中采用的干燥方法的干燥过程不能过于剧烈，否则将对角膜的胶原排列造成不可恢复的破坏。具体在本实施例1的一个可选择的干燥方法可采用常规的自然晾干方法。但是，由于自然晾干法存在温度较难控制的缺陷，因此自然晾干法适用于小批量，或者试验条件下的使用。自然晾干所需时间比较长，但是考虑到干燥时间太长会对角膜的产生胶原变性的不利影响，因此自然晾干的干燥过程不得大于24小时。由于S2环节是中间处理环节，对角膜的干燥要求是尽可能地减少角膜的含水量。

在本实施例1的一个较佳的干燥方法实施方式是采用真空干燥方法。为避免现有技术中的真空干燥法过于剧烈的缺陷，具体在本实施例1中采用一种压力自高向低的逐渐减压的干燥方法。所述逐渐减压中的减压范围值为常压至极限真空，所述逐渐减压干燥的时间不大于24小时。

如图1B所示，在实施例的一个具体的试验例中,减压范围值为80kpa～0.3kpa,减压干燥的时间12小时。本试验例中，所述逐渐减压是通过对真空调节系统进行压力梯度减压的操作。如图1B所示，减压梯度为80kpa、60kpa、40kpa、20kpa、0.3kpa持续时间分别为2小时、2小时、2小时、1小时、1小时，干燥时间8小时，角膜含水率大大地被降低了。

在本发明中的一个选择实施方式中，真空干燥室内的温度控制在0℃～30℃。

如图1C所示，在实施例1的另一个具体的试验例中,减压范围值为常压至极限真空,减压干燥的时间12小时，真空干燥室内的温度控制在0℃～30℃。本试验例中，所述逐渐减压是具体在本试验中采用连续减压的方式，在一时间段内将压力降至设备最大真空度。本试验例中通过控制真空调节系统，在一段时间内进行连续减压操作，减压曲线如图1C所示。本试验例所采用的连续减压方式可通过自动控制方式实现，无需进行手动操作，因此适用于大批量生产。

在本实施例1较佳的逐渐减压真空干燥方法，经过逐渐减压的方式，经过大约12个小时左右将压力逐步降低至设备最大真空度，从而达到角膜干燥要求。与现有直接进入最大真空环境中进行干燥的方法相比，本实施例逐渐减压的方式干燥过程更为温和，因而最大限度地减小了角膜干燥过程中对基质层的胶原纤维规则排列破坏。与自然晾干相比时间比较短，避免在这个干燥环节造成角膜的蛋白变性。

S3:脱细胞处理：将干燥处理后角膜进行脱细胞处理过程：S3.1酶处理：采用(DMEM)培养基配置全能核酸酶

溶液；按照每片角膜加入0.5-3毫升上述酶溶液；先涡旋震荡至角膜表面气泡去除，排除角膜内的气体；再置于震荡培养箱中震荡不小于1小时；

具体在本实施例1的一个试验例中，按照每片角膜加入0.7毫升上述全能核酸酶

溶液，先采用涡旋震荡方式至角膜表面气泡去除。试验证明，在很短的时间内角膜表面的气泡即已经去除，(通常不会超出1分钟的时间)。而此时角膜内所含气体基本上以气泡形式从角膜基质层内排出。然后进行震荡处理，具体在本试验例中震荡处理2.5～3小时。

在本实施例1的较佳的实施方式中，所述全能核酸酶

溶液的浓度为100～1000U/毫升。由于全能核酸酶

因产生厂家产品批次、运输方式及保存时间等诸多因素的影响，酶的活性程度也会发生变化，因此酶溶液的浓度应当随酶的活性程度进行选择，酶溶液的浓度应当随酶活性的降低而增高。

在实施例1的一种可选择的实施方式中，角膜在酶溶液中的震荡处理温度15-37℃，略低于该全能核酸酶

厂家推荐使用的最佳温度(35℃左右)，以最大程度地降低酶解过程对角膜基质层内规则胶原纤维排列的破坏。具体在本试验例所述震荡处理温度控制在25℃左右。

在实施例1的一个选择实施方式中，角膜在酶溶液中的震荡频率控制在每分钟50-100次较低的水平。具体在本试验例中，所述的震荡频率选择为每分钟75次。试验证明的进行酶处理时，选择一个较低的震荡频率的目的是最大限度在减少对角膜原有胶原排列的破坏程度。

S3.2清洗处理作用是将S3.1酶处理过程中在基质层内产生的细胞残留清洗出来。具体处理方法是按照每片角膜加入不低于5毫升的清洗溶液，震荡洗涤不少于5次，每次不大于30分钟；

在本实施例1的一个选择实施方式中，角膜在清洗处理过程中的温度控制在5-25℃。具体在本试验例中清洗处理过程中的温度控制在15℃左右，并在全部的清洗过程基本上保持恒温，以避免因清洗温度过高而产生角膜胶原蛋白的变性。

本实施例1的一个较佳的实施方式，角膜在洗涤过程中的震荡频率为每分钟100-160次，以促进细胞成分从基质层中游离出来。具体在本试验例中震荡频率为每分钟150次。每次震荡清洗时间15分钟～20分钟。

本实施例1的一个可选择的实施方式中，所述清洗溶液为蒸馏水或氯化钠溶液或pH6.0至8.0的缓冲溶液。具体在本试验例中采用蒸馏水或pH6.0至8.0的缓冲溶液作为清洗溶液。

S4:灭菌处理。本处理程序中指角膜有终端灭菌处理，通过灭菌处理角膜应当达到国家相关的灭菌的标准。具体在本实施例1中采用钴60辐照灭菌，辐照剂量不大于25kgy。基于现有的研究成果显示，采用辐照灭菌不可避免地对角膜的透明度这个重要特性产生不利的影响。因此，在本发明中的一个较佳的实施方式中，所述钴60辐照灭菌采用低温辐照；将角膜置于填充有制冷剂的保温容器中进行辐照灭菌；通过制冷剂使得角膜在辐照全过程中保持在低于0℃的低温状态下。

本实施例1的一个可选择的实施方式中，所述的制冷剂可以是冰或干冰任意一种。具体在本实施例的一个试验例中，所述的制冷剂采用干冰。由于干冰本身具有较低的初始温度(-78℃)，保温容器内不易很快地升温，并较容易获得并保持较低的辐照温度，因此以干冰作为角膜辐照灭菌的制冷剂是本发明的较佳实施方式。可先将角膜先置于干冰中，待角膜迅速降至低温环境温度后再开始进行辐照。

在本实施例的另一个试验例中，所述的制冷剂采用冰，冰的初始温度应当选择于-18～-25℃，即使冰随辐照环境温度的上升而有所升高，冰的温度在全部辐照过程中的保持在低于-5℃的低温状态。从而使得在保温容器内的温度处于远低于0℃的低温环境，有效地避免了在辐照灭菌过程中对角膜的胶原结构的进一步破坏。

在本实施例1的一个较佳的实施方式中，在进行辐照灭菌前，先将角膜进行单片密封包装，将密封包装后角膜置于低温制冷剂之中进行辐照。角膜在密封包装状态下进行终端灭菌直至临床，有利于角膜在运输及保存等环节上保持角膜的灭菌状态。特别是在本实施例中，经过脱细胞处理后角膜为非干燥角膜，可以直接用于移植手术。如需保存一段时间后再使用，可以采用现有技术中对于非干燥角膜的密封包装，如DMEM细胞培养基中保存，密封状态下的低温保存。

综上所述，由于在本实施例中针对角膜制备的所有处理方法中，首先考虑到其对角膜原有地胶原纤维的规则排列结构的破坏影响，并在处理方法中尽可能地采取有效措施避免或者最大限度地减少该破坏的不利因素。试验证明，本发明的制备方法获得的人工角膜最大限度地保持了与天然角膜极为接近的规则的排列结构，在达到国家标准对免疫原性(DNA)残留的要求的情况下，最大限度地减少了制备过程中对角膜基质层内原有的胶原纤维的规则排列结构造成的损害，如图5～图5C所示。因此，本发明制备的角膜具有与人角膜极其近似的弹性机械强度、透明度的等物理学特性，特别是角膜的透明度。经本发明脱细胞方法处理的获得的非干燥角膜，HE染色无细胞核，DAPI无染色，角膜DNA残留量低于100ng/mg，角膜的透光率均可确保在380-780nm波长内达到75％以上。

实施例2

如图2所示，本实施例2提供的一种猪脱细胞板层角膜的制备方法，至少五个处理过程。其中：

第一步骤S1预处理和第二步骤S2干燥处理与实施例1中S1和S2程度大致相同，其中，具体的实施方式可在实施例1所列出的范围内进行选择。故而本实施例2中对第一步骤S1预处理和第二步骤S2干燥处理方法不再赘述。

S3:脱细胞处理，将干燥处理后角膜进行脱细胞处理过程：S3.1酶处理：采用DMEM培养基配置全能核酸酶

溶液；按照每片角膜加入0.5-3毫升上述酶溶液；先涡旋震荡至角膜表面气泡去除，排除角膜内的气体；再置于震荡培养箱中震荡不小于1小时；

具体在本实施例2的一个试验例中，按照每片角膜加入0.5毫升上述全能核酸酶

溶液，先采用涡旋震荡方式至角膜表面气泡去除。具体在本试验例中震荡处理2.5～3小时。

在本实施例2的较佳的实施方式中，所述全能核酸酶

溶液的浓度为300U～500U/毫升。酶溶液的浓度应当随酶的活性程度在300U～500U/毫升范围进行选择。

在实施例2的一种可选择的实施方式中，角膜在酶溶液中的震荡处理温度15-37℃，具体在本试验例所述震荡处理温度控制在25℃左右。

在实施例2的一个具体试验例中，所述的震荡频率选择为每分钟65次。试验证明的进行酶处理时，选择一个较低的震荡频率的目的是最大限度在减少对角膜原有胶原排列的破坏程度。

S3.2清洗处理作用是将S3.1酶处理过程中在基质层内产生的细胞残留清洗出来。具体处理方法是按照每片角膜加入不低于5毫升的清洗溶液，震荡洗涤不少于5次，每次不大于30分钟；

在本实施例2的一个选择实施方式中，角膜在清洗处理过程中的温度控制在5-25℃。具体在本试验例中清洗处理过程中的温度控制在15℃左右，并在全部的清洗过程基本上保持恒温，以避免因清洗温度过高而产生角膜胶原蛋白的变性。

本实施例2的一个较佳的实施方式，角膜在洗涤过程中的震荡频率为每分钟100-160次，以促进细胞成分从基质层中游离出来。在具体试验例中震荡频率为每分钟100次。每次震荡清洗时间10分钟～15分钟。

本实施例2的一个可选择的实施方式中，所述清洗溶液为蒸馏水或氯化钠溶液或pH6.0至8.0的缓冲溶液。具体在本试验例中采用0.9％氯化钠作为清洗溶液。

S4：干燥角膜制备，在本处理程序中，将脱细胞处理后对角膜进行干燥处理，制备成含水率含水量为5％-20％的干燥角膜。本实施例2制备的干燥角膜有利于角膜具有作为产品在批量生产以及保存、运输市场商品属性。

在本实施例2的S4制备干燥角膜的方法的一种可选择实施方式，可以采用实施例2中与前述第二步S2中基本相同的压力自高向低的逐渐减压的干燥方法。所述逐渐减压中的减压范围值为常压至极限真空，所述逐渐减压干燥的时间不大于12小时。其减压曲线如图1B和图1C所示。真空干燥的温度控制在0℃～30℃。

如图2A所示，为本实施例2的S4制备干燥角膜的方法的一种可选择实施方式，在本实施方式中，基本上采用梯度减压的方式，通过5个梯级将压力从80kpa降低到设备最大真空度0.5kpa。但是，在本实施方式中，压力梯度变化时所述真空调节系统调节前一级压力挡逐渐降低到后一级压力挡，即控制真空干燥室内的压力从上一个梯度压力值逐渐减至下一个压力梯度值。减压曲线如图2A所示，通过本实施例2上述三种具体实施方式的干燥角膜制备过程，角膜的含水率为10％～20％，透光率84％～87％。如图2A所示干燥方法同样适用于实施例1和实施例2中脱细胞前的S2干燥处理。

采用本实施例2的上述逐渐减压干燥的方法相对于现有技术中的真空减压方法而言，其干燥过程更加温和。因此所获得的干燥角膜，确保干燥角膜的含水率达到5％～20％范围内，透光率均大于80％。而本实施例2所制备的干燥角膜具有表面光滑平整，无肉眼可见的嵴状突起或者细小褶皱，而这个特征带来的另一显著的临床效果是术后上皮细胞贴附和增殖速度快效果好。

由于本实施例2提供的是干燥角膜的制备过程，因此在S4干燥角膜制备方法中，对干燥角膜的含水率应当达到0～20％标准。

S5：灭菌处理。本处理程序S5就指对干燥角膜有终端灭菌处理，通过灭菌处理角膜应当达到国家相关的灭菌的标准。具体在本实施例2中采用钴60辐照灭菌，辐照剂量不大于25kgy。具体在本实施例2中一个较佳的实施方式中，所述钴60辐照灭菌采用低温辐照；将角膜置于填充有制冷剂的保温容器中进行辐照灭菌；通过制冷剂使得角膜在辐照全过程中保持在低于0℃的低温状态下。

本实施例2的终端灭菌处理的可选择的实施方式中，所述的制冷剂除实施例1中的冰(含蓄冷剂)或干冰，其具体方式基本上与前述的实施例1相同，本实例2中不再重复进行具体说明。

在本实施例2的一个较佳的实施方式中，在进行辐照灭菌前，先将角膜进行单片密封包装，将单片密封包装后角膜置于低温制冷剂之中进行辐照。角膜在密封包装状态下进行终端灭菌直至临床时打开。大量试验证明，在角膜含水率较低的干燥角膜相对于非干燥角膜，进行相同的条件下的低温辐照灭菌，灭菌后的角膜的理化性能变化小，透明度、韧性和亲水力基本上不发生改变，有效地避免了常温状态下辐照对角膜理化性能产生的不利影响。

本发明通过上述制备方法所获得脱细胞猪板层干燥角膜，角膜DNA残留不大于100ng/mg，如图4所示。本发明由猪角膜的前弹力层和基质层构成的板层干燥角膜；其基质层保持有规则排列的胶原纤维结构，如图5～图5C电镜图显示，本发明制备方法获得的角膜与人角膜以及未脱细胞的猪角膜的胶原纤维结构极其接近；含水率不大于20％的干燥角膜在可见光范围内，所述角膜为透光率不低于80％，如图3所示。从图3所示出的本发明干燥角膜图片可以看出，本发明的干燥角膜不仅透明度极佳，同时具有的表面平整度高的产品特性。而大量的试验证明，平整的角膜表面有利于上皮层细胞的贴附与增殖。特别是角膜前弹力层的较好的平整度极有利于提高角膜植入后上皮细胞的生长速度和生长质量。

本发明所述的脱细胞板层干燥角膜的使用方法相当简单容易操作，在术前从灭菌密封包装中取出角膜，浸入生理盐水15-30分钟后，直接用于异种角膜移植术。

另外，本发明提供的干燥角膜无疑是角膜产品最好的产品状态，方便保存、运输。可以实现在保存、运输等市场环节中干燥角膜产品的质量同一性和性能稳定性，可达到大大地延长保存期的效果。

而本实施例2提供的干燥角膜具有另一个重要技术效果是，手术前的复水操作简单，复水时间短。在复水过程中，在角膜的含水量即能达到手术要求，又能恰当地控制复水后角膜的含水量，对于控制或者缩短角膜复明时间非常重要。而本发明完全可以将手术前的复水操作规范化，达到有效地控制角膜复水含水量的问题。

附图6兔角膜行板层人工角膜移植术后3月，角膜完全恢复透明，无排斥反应。

图7A～图7E人接受板层人工角膜移植术后2月，角膜透明无排斥反应。术后视力0.6。本发明在大量的动物试验，以及目前所做的所有角膜移植临床中均取得很好有移植效果。

本发明所述脱细胞猪板层干燥角膜由生物材料构成，相对于人工合成的眼植入材料而言可以很好解决人体的排异问题，可以通过简单的手术人眼进行屈光校正应用，以达到永久的屈光校正效果。

针对上述各实施方式的详细解释，其目的仅在于对本发明进行解释，以便于能够更好地理解本发明，但是，这些描述不能以任何理由解释成是对本发明的限制，特别是，在不同的实施方式中描述的各个特征也可以相互任意组合，从而组成其他实施方式，除了有明确相反的描述，这些特征应被理解为能够应用于任何一个实施方式中，而并不仅局限于所描述的实施方式。

Claims (23)

1.一种猪脱细胞板层角膜的制备方法，至少如下步骤：

S1、预处理：对新鲜猪角膜的预处理包括如下处理：

S1.1取新鲜猪角膜，去除上皮层；

S1.2制备板层角膜；所述板层角膜仅包括前弹力层和基质层；

S1.3清洗干净；

S2:干燥处理：将预处理后板层角膜进行干燥处理；

S3:脱细胞处理：将干燥处理后角膜进行脱细胞处理：

S3.1酶处理：采用DMEM培养基配置全能核酸酶

溶液；将干燥后角膜加入上述酶溶液；置于震荡培养箱中震荡不小于1小时；

S3.2清洗：将角膜加入清洗溶液中，置于震荡培养箱震荡洗涤处理，获得脱细胞角膜；

S4：干燥角膜制备:将脱细胞处理后对角膜进行干燥处理，制备成含水率含水量为5％-20％的干燥角膜；

S5:灭菌处理：采用钴60辐照灭菌，辐照剂量不大于25kgy。

2.如权利要求1所述的猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，在S1.2步骤中取板层角膜厚度为300um～700um。

3.如权利要求1所述的猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，所述配制的全能核酸酶

溶液的浓度为100U～1000U/mg。

4.如权利要求1所述的猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，角膜的清洗溶液为蒸馏水或氯化钠溶液或pH6.0至8.0的缓冲溶液。

5.如权利要求1所述的猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，角膜在酶溶液中的震荡处理温度20-30℃。

6.如权利要求1所述猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，角膜在酶溶液中的震荡频率为每分钟50-80次。

7.如权利要求1所述猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，角膜在震荡洗涤过程中的温度10-20℃。

8.如权利要求1所述猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，角膜在洗涤过程中的震荡频率为每分钟120～160次。

9.如权利要求4所述猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，所述清洗用氯化钠溶液浓度为0.9％。

10.如权利要求1所述猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，所述钴60辐照灭菌采用低温辐照；将角膜置于填充有制冷剂的保温容器中进行辐照灭菌；通过制冷剂使得角膜在辐照全过程中保持在低于0℃的低温状态下。

11.如权利要求10所述猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，所述的制冷剂是冰或干冰。

12.如权利要求10或11所述猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，所述角膜低温辐照灭菌全程中温度不得高于0℃。

13.如权利要求11所述的一种猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，所述在进行辐照灭菌前，先将角膜进行单片密封包装，将密封包装后角膜置于低温制冷剂之中进行辐照。

14.如权利要求12所述的一种猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，所述在进行辐照灭菌前，先将角膜进行单片密封包装，将密封包装后角膜置于低温制冷剂之中进行辐照。

15.如权利要求1所述的猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，在脱细胞处理后对角膜进行干燥处理，制备成含水率含水量为5％-20％的干燥角膜。

16.如权利要求1或15所述的猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，所述的干燥处理可采用真空干燥。

17.如权利要求16所述的猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，所述真空干燥为压力自高向低的逐渐减压的干燥方法。

18.如权利要求17所述的猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，所述逐渐减压中的减压范围值为99～0.3kpa。

19.如权利要求17或18所述的猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，所述逐渐减压干燥的时间不大于24小时。

20.如权利要求16所述的猪脱细胞板层角膜的制备方法，其特征在于，密闭真空干燥室内的温度控制在0℃～30℃。

21.一种如上述权利要求13至19所述的任意一种制备方法所获得的脱细胞猪板层角膜，其特征在于，由猪角膜的前弹力层和基质层构成；所述基质层保持有胶原纤维的规则排列结构；角膜DNA残留不大于100ng/mg；在可见光范围内，所述角膜的透光率不低于70％。

22.一种如上述权利要求13至19所述的任意一种制备方法所获得的脱细胞猪板层角膜，其特征在于，所述板层角膜由猪角膜的前弹力层和基质层构成；所述基质层保持有胶原纤维的规则排列结构；角膜DNA残留不大于100ng/mg；在可见光范围内，所述角膜为透光率不低于70％，含水率不大于20％的干燥角膜。

23.一种如权利要求20所述的脱细胞板层干燥角膜的使用方法，从灭菌密封包装中取出角膜，浸入生理盐水15分钟复水后备用。

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