CN114259601B - 活细胞仿生角膜前板层及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种活细胞仿生角膜前板层及其制备方法，包括如下步骤：A1、混合角膜基质细胞和胶原蛋白，制备具有有序胶原蛋白的仿生角膜基质层；A2、在仿生角膜基质层表面上布置细胞外基质蛋白；A3、打印上皮细胞球，培养获得活细胞仿生角膜前板层。本发明的制备方法能通过仿生平台和3D生物打印技术联合构建含有生物材料的活细胞仿生角膜前板层，该制备方法简单、方便、高效，制备得到的活细胞仿生角膜前板层其结构和生理功能与天然角膜相近，生物相容性和修复效果良好，能有效修复损伤角膜组织，有望用于构建天然角膜替代物，以治疗角膜盲等病症。

Description

活细胞仿生角膜前板层及其制备方法

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，更具体地，涉及一种活细胞仿生角膜前板层及其制备方法。

背景技术

角膜是眼睛最外面的透明窗口，由于外伤或其他疾病造成角膜盲是视力丧失的主要原因之一。据世界卫生组织和地区性调查统计，全球约有2.8亿人视力受到损害，3900万人失明，其中超过5％的人是角膜盲。约2300万人患有单侧角膜失明，约有12％或490万人为双眼角膜失明。全球每年超过1000万人因角膜疾病而失明，每70名患者中只有1人接受治疗。目前，角膜盲有效的首选治疗方法是角膜移植，以健康的供体替代受损的角膜。角膜移植是全世界最常见的固体组织移植类型之一，每年进行约18万例角膜移植。角膜病是我国第二致盲性眼病，仅次于白内障。每年我国需要做角膜移植的患者近30万，但实施角膜移植的患者仅有4000多例。由于严重缺少合适的供体，致使很多角膜盲患者在黑暗中苦苦等待，最后丧失了视力。然而，随着老年人口的增长和人均寿命增加，能够满足患者需求的供体角膜越来越稀缺。另外，供体角膜移植还有伴随免疫排斥反应、相关并发症及病毒传染的风险。角膜盲患者因视力障碍，丧失自理能力，需要他人护理，因此该疾病严重影响患者生活质量，同时带来巨大的社会、经济问题。因此，亟需解决供体角膜短缺问题。

近些年来，构建天然角膜替代物被认为是让角膜盲患者重见光明的可行途径，理想的角膜替代物需要结构和生理功能与天然角膜相近，但目前已有的脱细胞角膜产品由于无细胞，所以在生理功能上与天然角膜有很大差距，对患者的修复效果不佳。因此，构建有活细胞的、生物相容性和修复效果良好的角膜替代物成为目前亟需解决的技术问题。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种活细胞仿生角膜前板层及其制备方法，通过联合仿生平台和3D生物打印技术将角膜细胞和生物材料集成，构建了具有与天然角膜相近形态结构和生理功能的活细胞仿生角膜前板层，且所述活细胞仿生角膜板层组织具有良好的生物相容性和修复效果，有望成为替代天然角膜并实现其功能的可植入物。

本发明采取的技术方案是，一种活细胞仿生角膜前板层的制备方法，包括如下步骤：

A1、混合角膜基质细胞和胶原蛋白，制备具有有序胶原蛋白的仿生角膜基质层；

A2、在仿生角膜基质层表面上布置细胞外基质蛋白；

A3、打印上皮细胞球，培养获得活细胞仿生角膜前板层。

通过本发明提供的活细胞仿生角膜前板层制备方法，可制备得到具有有序取向的胶原纤维和角膜基质细胞层的仿生角膜基质层，结合3D生物打印技术，得到具有与天然角膜相近形态结构和生理功能的活细胞仿生角膜前板层，且能有效修复损伤角膜组织。该方法简单、方便、高效，制备得到的活细胞仿生角膜前板层，其结构和生理功能与天然角膜相近，生物相容性和修复效果良好。

优选地，步骤A1中将混合的角膜基质细胞和胶原蛋白置于具有拉伸性的载体模具中，通过循环拉伸载体模具获得具有有序胶原蛋白的仿生角膜基质层。本发明通过载体模具与角膜基质细胞和胶原蛋白混合液的配合，以制备出具有有序胶原蛋白的仿生角膜基质层，在仿生角膜基质层这一层次建立良好的基础，以便于后续加工形成与天然角膜相近的进一步结构。

优选地，仿生角膜基质层为球面状，步骤A1具体包括：

A11、提取角膜基质细胞并进行传代培养，获得P3、P4或P5代角膜基质细胞；

A12、将P3、P4或P5代角膜基质细胞和胶原蛋白进行混合，并注入具有拉伸性的载体模具中，载体模具内腔底部设有用于形成球面状仿生角膜基质层的凸起；

A13、通过机械循环拉伸载体模具，制备具有有序胶原蛋白的仿生角膜基质层；

在一个实施例中，为制备结构与天然角膜基质层相似的仿生角膜基质层，本发明通过计算机软件根据人眼角膜数据进行3D建模，再根据建模的参数，以制备相应的载体模具及载体模具上用于形成球面状仿生角膜基质层的凸起，从而构建结构与天然角膜基质层相似的球面状仿生角膜基质层结构。以提高结构、生理层面上与天然角膜的相似性，提高效果。同样的，还采用同样的建模方式制备与球面状仿生角膜基质层后表面配合的三维支架，以便于对基质层进行后续加工。除此之外，在该过程中通过建模软件还可构建3D仿生角膜模型，针对该3D仿生角膜模型进行研究，有利于研究组织微环境对细胞行为、细胞间相互作用和细胞基质通讯的影响；在3D环境中的细胞可以通过生理途径获取营养、代谢物、氧气和信号分子，本发明构建的3D仿生角膜模型还便于模仿复杂内环境的细胞和基质的相互作用，以更好了解角膜愈合、修复和病发机制，为制备出效果更佳的角膜结构提供基础。

进一步地，A12步骤中，所述P3、P4或P5代角膜基质细胞的浓度为1×10⁵～3×10⁵个/ml。

更优选地，步骤A2具体包括：在仿生角膜基质层表面上布置细胞外基质蛋白，置于与球面状仿生角膜基质层后表面相配合的三维支架上培养。

优选地，所述循环拉伸为正交双向的循环拉伸。循环拉伸条件设为：800～900循环，拉伸时间20～40min，拉伸幅度5～15％，拉伸频率为0.5-2Hz。由于角膜基质层细胞是正交结构，即不同层细胞取向是相互正交的，因此本发明采取正交双向的循环拉伸的模式，更利于得到与天然角膜相近的有取向排列的仿生角膜基质层。

除此之外，也可以通过单向的循环拉伸获得具有有序胶原蛋白的仿生角膜基质层。

更进一步地，将循环拉伸后制备得到的仿生角膜基质层放入无菌10mm培养皿，然后置于二氧化碳培养箱培养。

优选地，载体模具为聚二甲基硅氧烷制成。聚二甲基硅氧烷是一种高弹性的有机硅化合物，具有无色无味无毒、耐热性好、防水性好、生理惰性、良好的生物兼容性和化学稳定性等性能，与其他硬性物质不同的是，聚二甲基硅氧烷材料可使在其上面的物质具有一定的缓冲作用，因此本发明使用带凹槽、可水平和垂直拉伸的聚二甲基硅氧烷载体模具，对载入聚二甲基硅氧烷载体模具凹槽内的含有角膜基质细胞的胶原溶液进行机械拉伸。

优选地，在加入混合的角膜基质细胞和胶原蛋白前，对聚二甲基硅氧烷进行表面修饰。在本发明的一个具体的实施例中，通过聚多巴胺溶液对聚二甲基硅氧烷凹槽进行表面修饰，胶原溶液能更好地黏附到内腔表面，有利于制备得到有序排列的胶原纤维。组织内胶原纤维的有序排列能实现机体的特殊功能，如角膜基质中胶原有序排列对维持透明起着重要作用，而且体外胶原纤维的有序排列还能很好模拟体内生理活动。

优选地，细胞外基质蛋白为重组人层粘连蛋白Laminin 521。细胞外基质蛋白在上皮细胞层和仿生角膜基质层的中间，相当于角膜结构的前弹力层结构，Laminin 521(细胞外基质蛋白)具有滋养细胞的功能,支持上皮细胞层和角膜基质层的起始连接和滋养,使成功构建前板层。

优选地，在步骤A2布置细胞外基质蛋白前，对步骤A1获得的仿生角膜基质层进行加工，以形成外周分布有槽状仿生角膜缘龛的含角膜缘龛仿生角膜基质层。

人角膜上皮位于最外层，约50μm厚，约占角膜厚度的10％，有5～7层非角质化分层的鳞状上皮并形成桥粒紧密连接，起着渗透屏障保护作用。上皮细胞的完整性是角膜视力良好的基本保障，上皮细胞的更新换代来源于角膜缘干细胞(LSCs)，角膜缘干细胞位于角膜缘基底部形成的特殊“Vogt栅栏”，而角膜缘干细胞功能障碍会导致角膜上皮更新不足，临床上称为角膜缘干细胞缺乏症(LSCD)，LSCD是一种视觉破坏性疾病。但体外培养的角膜中心上皮细胞，存在增殖能力差、传代不易成活的问题，不断走向终端分化。角膜缘干细胞的生长增殖能力较强，可不断往上实现上皮细胞分化。角膜缘干细胞生存在微环境—基底部特殊的“Vogt栅栏”中，细胞密集，排列无序，角膜缘干细胞能一直保持干性不进行终极分化为上皮的原因，是与其所处的角膜缘区的“干细胞龛(stem cell niche)”结构(Vogt栅栏)密切相关，该微结构能维持角膜缘干细胞的干性，防止其分化。为此，本发明还对仿生角膜基质层进行加工，以获得含角膜缘龛仿生角膜基质层。即制备带有“干细胞龛”结构的仿生角膜组织，以利于角膜缘干细胞维持干性，促进角膜组织构建以及角膜板层组织移植。

优选地，加工过程包括：将步骤A1获得的仿生角膜基质层置于硅片上压印或翻印，所述硅片外围设有周向分布的凸出结构。

优选地，凸出结构截面为长方形、梯形或扇形。更优选地，凸出结构为长方体。

优选地，仿生角膜基质层为球面状。更优选地，槽状仿生角膜缘龛周向分布于仿生角膜基质层的外周侧。

球面状的3D仿生角膜基质结构在板层角膜移植中有重要意义，3D仿生角膜基质具有与天然角膜相似的尺寸和曲率，在结构上更加匹配，能与天然角膜贴合紧密，更有利于角膜移植与角膜组织融合，能促进引导角膜的修复和再生。而且在功能上3D仿生角膜移植能维持一定的弧度，维持有效率的屈光，减少光的散射。

仿生角膜基质层为球面状时，更优选地，所述硅片表面的外围有一环向心的长方体凸出结构，所述凸出结构的大小为(400～100)μm×(100～25)μm×(200～50)μm，外环直径为8～12mm。本发明在硅片表面的外环上设计“Vogt栅栏”拓扑结构，得到表面上有一环向心凸出的长方体微结构。在本发明的一个实施例中，将仿生角膜基质层置于硅片微结构表面，通过印压、培养得到带有角膜缘微结构的仿生角膜基质片，将角膜上皮细胞球置于带有角膜缘微结构的仿生角膜基质片上，角膜上皮细胞球能贴壁生长展开，且角膜缘干细胞能在仿生微结构处驻留，保持干性并不断增殖上皮，实现仿生角膜基质片表面上皮化。

优选地，仿生角膜基质层为球面状，前表面几何中心区直径为2～4mm，前表面的曲率半径为7.5～8mm，后表面的曲率半径为6～7mm，前表面几何中心区的壁厚为0.3～0.7mm，周边部的壁厚为0.9～1.39mm。

优选地，步骤A3通过3D生物打印细胞球打印上皮细胞球，在布置有细胞外基质蛋白的仿生角膜基质层中间顶部、外围设置有一个或多个打印点。

更优选地，所述中间顶部有一个打印位点，外围均匀分布6个打印位点。为了使角膜上皮细胞在仿生角膜组织上快速上皮化，设计了曲率3D打印模式，角膜上皮细胞球打印点设计在角膜缘周围有六个和顶部一个。

更优选地，在3D生物打印上皮细胞球后，进行喷雾，所述喷雾的喷雾液为细胞上皮培养基。角膜上皮细胞和表面的皮肤细胞类似，暴露在空气中，因此气液交界面对于角膜上皮生长分化起着重要的作用。由于气液交界面有利于上皮细胞形成复层生长，在打印的上皮细胞球完全长开后，对其进行定时喷雾，喷射细胞上皮培养基。喷雾的作用是使仿生角膜上皮组织产生气液交界面效果，角膜上皮细胞可在气液交界面的培养环境下快速增殖和分裂，最终产生具有复层上皮结构的前板层组织用于后续移植研究。

本发明的另一目的在于提供一种由上述制备方法制备的活细胞仿生角膜前板层。由本发明制备得到的活细胞仿生角膜前板层具有角膜前板层的类似结构，具有复层的角膜上皮、角膜前弹力层和角膜基质层，所述活细胞仿生角膜前板层具有曲率结构并具有较高的透明度，表面光滑平整，可应用于制备治疗角膜盲的植入物、角膜替代物，使角膜修复达到最好的效果。

本发明的另一目的在于提供一种活细胞仿生角膜前板层，包括含角膜基质细胞和胶原蛋白的仿生角膜基质层、布置于仿生角膜基质层上的细胞外基质蛋白、位于细胞外基质蛋白之间和/或细胞外基质蛋白上方的上皮细胞。在本发明的一个以上实施例中，通过前述制备方法能获得所述结构的活细胞仿生角膜前板层，与天然角膜的角膜前板层具有类似结构，能达到较佳的角膜前板层功效。

优选地，仿生角膜基质层前表面外周侧周向分布有作为仿生角膜缘龛的槽状结构。通过在带有凸出结构的硅片或其他材料上压印或翻印，能形成类似于干细胞龛的仿生角膜缘龛槽状结构。

优选地，仿生角膜基质层为具有有序排列胶原蛋白的角膜基质层。

本发明的再一目的在于提供前述活细胞仿生角膜前板层在制备治疗角膜盲的植入物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种活细胞仿生角膜前板层及其制备方法，通过仿生平台和3D生物打印技术联合构建了含有生物材料的活细胞仿生角膜前板层，该制备方法简单、方便、高效，制备得到的活细胞仿生角膜前板层，其结构和生理功能与天然角膜相近，生物相容性和修复效果良好，能有效修复损伤角膜组织，可用于构建天然角膜替代物，以治疗角膜盲等病症。

附图说明

图1为机械拉伸仿生平台：(A)示意图；(B)实物图；(C)软件控制界面图。

图2为两种PDMS载体模型和循环拉伸方案：(A)US-PDMS载体模具、BS-PDMS载体模具制备流程图；(B)US-PDMS载体模具、BS-PDMS载体模具拉伸示意图，虚线表示拉伸后形状；(C)循环拉伸条件图，循环拉伸幅度10％，频率1Hz；(D)循环拉伸时间和方向示意图。

图3为仿生角膜基质层制备图：(A)人眼模型的代表性维度图；(B)角膜的圆顶状模型；(C)角膜的截面图；(D)曲率PDMS角膜模型的制备工艺；(E)曲率PDMS角膜模型和曲率3D仿生角膜基质模型示意图。

图4为角膜缘微结构的制备图：(A)硅片上制备角膜缘微结构图案；(B)翻印了带有角膜缘微结构的仿生角膜基质层；(C)上皮细胞球种植在仿生角膜缘微结构；(D)免疫印迹分析CEpCs细胞球在仿生角膜缘微结构中CK3和P63的表达；(E)CEpCs在培养板(tissueculture plate,TCP)、球形以及球形在仿生微结构中CK3和P63的表达。

图5为细胞球形3D打印构建角膜前板层组织：(A)细胞球形3D打印机示意图；(B)细胞球形3d打印机实物图；(C)角膜上皮细胞球在96孔圆底板用于自动化精准打印；(D)细胞球3D打印曲率角膜组织的支撑结构；(E)曲率角膜上打印细胞球体位置的俯视图；(F)细胞球3D打印构建曲率角膜前板层组织侧视图。

图6为仿生角膜前板层组织示意图。

图7为仿生角膜前板层组织外观图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。

本申请研究使用的Ⅰ型胶原材料来源于牛的真皮组织，由广州创尔生物公司赠送。

实施例

实施步骤1仿生角膜基质层的制备

1.1机械拉伸仿生平台

机械拉伸仿生平台主要包括机械运行系统、软件控制系统和胶原载体系统，如图1所示。所述机械运行系统包括控制器、电机驱动器、步进电机、2个丝杆、2个滑块臂、滑块和平板底座，所述滑块臂和丝杆连接固定在同一平面，有利于对聚二甲基硅氧烷(PDMS)载体模具的拉伸或压缩。

所述软件控制系统可以控制运动方向、时间、频率和运动步长。软件控制系统连接机械运行系统的控制器，控制器控制电机驱动器，在软件控制系统的指令下电机驱动器触发步进电机，电机带动滑块在丝杆上运动，最终通过滑块臂实现对PDMS载体模具拉伸或压缩运动。

所述胶原载体系统与机械运行系统连接，所述胶原载体系统包括PDMS载体模具，所述PDMS载体模具固定在两个滑块臂上，通过软件控制系统控制PDMS载体的循环拉伸运动。

1.2PDMS载体模具的制备

PDMS载体模具的制备，包括如下步骤：

首先，在固体模具底部先浇注一层薄的5％琼脂糖凝胶，便于PDMS从模具剥离；将Sylgard 184液体A组及液体B组固化剂按10:1(w/w)的比例混合，真空干燥箱排出混合物的气泡，浇注在凝有一层薄琼脂糖凝胶的固体模具上；于65℃烘箱5h，凝固，冷却后将凝固的PDMS载体从固体模具上剥离，得到可拉伸的PDMS载体(本步骤中以带凹槽的PDMS载体模具示例)，其尺寸为(5～7)×(3～5)×(0.5～1.5)cm³(不包含内腔中的凹槽，仅内腔中凹槽上方的长方体空间)，内部带有一个凹槽，所述凹槽的尺寸为(2.2～2.4)×(1～3)×(0.5～1)cm³。US-PDMS载体、BS-PDMS载体制备过程如图2(A)所示。

PDMS载体模具使用前，先置于水中超声清洗，并用2mg/ml聚多巴胺溶液对PDMS载体凹槽内涂布2h，然后吸弃多余的聚多巴胺溶液，用ddH₂O清洗三次。对PDMS载体模具凹槽进行表面修饰后，胶原溶液更能黏附到凹槽表面，有利于制备有序排列胶原膜。

1.3循环拉伸

循环拉伸具有两种模型，分别是单向拉伸和正交双向拉伸，如图2B所示，US-PDMS载体用于单向拉伸，BS-PDMS载体用于正交双向拉伸，US-PDMS载体和BS-PDMS载体的虚线表示拉伸后形状。

拉伸条件设定为：拉伸时间20～40min，拉伸幅度5～15％，拉伸频率为0.5-2Hz(图2C)；循环拉伸时间和方向(图2D)：US-PDMS载体20～40min上下循环拉伸；BS-PDMS载体0～20min上下循环拉伸，15～40min左右循环拉伸。

1.4胶原溶胶的配制：

胶原蛋白成胶的主要因素有离子强度、pH和温度。将Ⅰ型胶原蛋白溶于乙酸溶液中，pH约为4.6，粘度525mm²/S，密度约为6.25mg/ml，置于4℃冰箱保存。将预冷的胶原溶液与配置的pH＝8、10×DMEM充分混合后，离心排除气泡，得到配置的胶原溶液，密度约5mg/ml，pH约为7.4，该配制的胶原溶液用于后续制备仿生角膜基质层。

1.5人角膜基质细胞培养

实验步骤如下：用1％双抗-庆大霉素无菌-PBS冲洗取下来的角膜基质组织3次，然后置于5mg/mlⅠ型胶原酶-DMEM/F12消化液中，37℃环境下消化12h；基质胶原完全消化后，离心，吸弃上清液，收集基质细胞，5％FBS，DMEM/F12重悬培养。每2天换一次培养液，根据细胞生长密度，3-5天可传一代。培养得到P3-P5代的人角膜基质细胞hCSKs，用于后续实验研究。

1.6曲率3D角膜模型的制备

通过Solidworks软件将角膜结构参数(图3A)进行三维建模，设计建立人眼角膜的3D模型(图3B、3C)，根据角膜3D模型和参考1.2制备BS-PDMS模具方法，制备用于形成球面状仿生角膜基质层的载体模具，制备工艺如图3D所示。

1.7仿生3D人角膜基质层的制备

将P4代的人角膜基质细胞(hCSKs)在培养板贴壁生长到80-90％，吸弃培养液，用PBS清洗，然后胰酶消化3min，接着1000rpm，5min离心收集hCSKs；配制10×DMEM重悬hCSKs，细胞浓度大约为2×10⁶个/ml；然后与Ⅰ型胶原充分混合，通过离心去除气泡，得到细胞密度最终约为2×10⁵个/ml的hCSKs-collagenⅠ混合溶液。将1.5mlhCSKs-collagenⅠ混合溶液浇注在机械拉伸仿生平台的BS-PDMS载体模具的内腔中，循环拉伸制备出仿生角膜基质层，PDMS模具内腔的凸起和球面状3D仿生角膜基质层的配合如图3E所示，制备完成后将仿生角膜基质层放入无菌10mm培养皿，然后置于二氧化碳培养箱培养。

实施步骤2仿生角膜缘龛制备

仿生角膜缘模型制备：通过光刻技术制备硅片材料表面拓扑结构，硅片外围有一环向心的凸出长方体结构，凸出长方体的大小为132μm×32μm×70μm，外环直径为10mm，即得到表面具有角膜缘微结构的硅片。硅片上制备角膜缘微结构图如图4A所示。

在硅片有角膜缘微结构的表面放置仿生角膜基质层，然后在仿生角膜基质层上覆盖尼龙膜和0.8～1.2mm玻璃板，置于恒温恒湿培养箱12～36h。培养后的仿生角膜基质层表面上出现角膜缘仿生结构(图4B)，后续将在带有角膜缘微结构的仿生角膜基质层上打印上皮细胞球，实现构建含有基质和上皮细胞的前板层角膜组织结构。

将角膜上皮细胞球转移到带有角膜缘微结构的仿生角膜基质片上(如图4C)，结果显示，上皮细胞球能贴壁，而且生长展开，角膜缘干细胞能在仿生微结构处驻留，保持干性并不断增殖上皮，实现仿生角膜基质片表面上皮化。通过免疫印迹实验结果可知，仿生微结构可以维持角膜缘干细胞标记物P63和上皮细胞标志物CK3的表达(图4D、4E)，可见该结构对于角膜组织构建以及角膜板层组织移植具有重要意义。

实施步骤33D生物打印仿生角膜上皮层

本实施步骤中采用的3D生物打印系统与现有专利CN201610698213.5相同。

3.1.3D生物打印机

3D生物打印机主要包含四个系统模块：显微系统、加注系统、定位系统以及承载系统。其中，显微系统是打印机的“眼睛”，加注系统是打印机的“手”，能够把目标——角膜上皮细胞球转移到目的位置，该过程还包括对细胞球的吸起和释放；定位系统是打印机的移动部件，通过X、Y和Z轴多维协同运动，精准高效到达打印目的位置，定位系统具有微米量级的定位精度，能精准定位细胞球(300～600μm)；承载系统是打印机的躯干，用于支撑打印机的其他系统模块。

细胞球3D生物打印机连接的软件系统的设计，需要能够实现自动化控制整个打印过程，同时实验人员能便捷地操作细胞球3D打印机，提高工作效率。该软件系统包括：吸取点与释放点的设置、串口连接设置、打印参数设置等。

3.2.上皮细胞球3D生物打印

细胞球3D生物打印均在无菌环境下运行，以确保细胞不被污染，因此需把打印机的机械系统装置放置在超净工作台内，在细胞球3D生物打印机使用前需要校正、调试。将已培养好的上皮细胞球96孔圆底超低黏附培养板固定在承载系统上，并在承载系统的接收位置上放置已经构建好的曲率3D仿生角膜基质层。打开3D生物打印机的软件系统，设置打印参数，设置吸取点、轴移动速度，然后执行，3D打印机将按照软件系统的设置，吸取96孔培养板的吸取点细胞球，有序转移到设定的放置点，最终实现上皮细胞球3D打印。

图5A是3D生物打印机示意图，图5B、5C、5D是3D生物打印机实物系统图。在设计的细胞球3D生物打印机承载平台上放置培养角膜上皮细胞球的96孔板，每孔细胞密度为4×10⁵mm³，在96孔板旁有两个35mm培养皿是细胞球接收区域。加注系统是通过控制龙门架上的200μl移液枪来实现细胞球的抓取和释放。96孔成球板和接收皿在水平底座上通过电机X、Y移动轴精准调整水平位置，移液枪在Z移动轴方向调整高度；P轴即Z轴上下移动可以控制移液枪吸取和释放细胞球。图5E、5F是3D打印构建角膜上皮层示意图，在设定的程序下，96孔板的上皮细胞球可以自动有序打印到圆顶状3D仿生角膜基质层的外围和顶部。为了让仿生角膜基质层能够粘住细胞球，加入少量低浓度的纤维蛋白和凝血酶混合液，打印结束后转移到CO₂培养箱，细胞球3h可以贴壁。采用喷雾方式给角膜上皮细胞球提供湿润的培养环境。

实施步骤4仿生角膜前板层组织的构建

4.1.细胞球形3D打印

角膜上皮层上皮细胞的球形打印制备：首先，如前述步骤准备，将角膜基质细胞与胶原材料为原料置于机械拉伸仿生平台的BS-PDMS载体模具的凹槽内，经循环拉伸，制备得到仿生角膜基质层；然后利用光刻和压印技术，将仿生角膜基质层在硅片表面压印出角膜缘微结构，接着用重组人层粘连蛋白Laminin 521铺在带有微结构的仿生角膜基质表面，放置曲率3D角膜模型PDMS模具上，置于恒温恒湿箱24h，箱内温度37℃，饱和湿度，CO₂浓度5％。

然后，将有曲率和角膜缘微结构的3D仿生角膜基质层放置在球形3D生物打印机的承载系统上，启动打印后将上皮细胞球打印在设定的位置。为了角膜上皮细胞在仿生角膜组织上快速上皮化，设计了曲率3D打印模式，角膜上皮细胞球打印点设计在角膜缘周围有六个和顶部一个。(内置程序设置为点打印，打印点位为：在角膜缘周围有六个和顶部一个，六个点均匀分布在角膜缘的圆圈上，顶部一个点位于1.7所制备的仿生曲率3D角膜基质层顶部)

4.2.气液交界面培养仿生组织

在3D生物打印的上皮细胞球完全长开后，对制备得到的仿生角膜前板层进行定时喷雾，喷雾液是细胞上皮培养基。通过定时喷雾使仿生角膜上皮组织产生气液交界面效果，角膜上皮细胞可在气液交界面的培养环境下快速增殖和分裂，最终产生具有复层上皮结构的前板层组织。

具体地，所述细胞上皮培养基包括：

表1角膜上皮细胞培养基成分(50ml)

仿生角膜前板层组织的结构如图6所示，通过仿生平台与3D生物打印技术结合构建了仿生角膜前板层组织，所述仿生角膜前板层组织具有角膜前板层的类似结构，具有复层的角膜上皮层和角膜基质层，其中角膜上皮层和角膜基质层的中间有一层Laminin521隔开，Laminin521层相当于是角膜前弹力层结构。

图7是仿生角膜前板层组织外观图，仿生角膜前板层具有曲率结构并具有较高的透明度，表面光滑平整。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种活细胞仿生角膜前板层的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

A1、混合角膜基质细胞和胶原蛋白，制备具有有序胶原蛋白的仿生角膜基质层；

A2、在仿生角膜基质层上布置细胞外基质蛋白；

A3、打印上皮细胞球，培养获得活细胞仿生角膜前板层；

仿生角膜基质层为球面状，步骤A1具体包括：

A11、提取角膜基质细胞并进行传代培养，获得P3、P4或P5代角膜基质细胞；

A12、将P3、P4或P5代角膜基质细胞和胶原蛋白进行混合，并注入具有拉伸性的载体模具中，载体模具内腔底部设有用于形成球面状仿生角膜基质层的凸起；

A13、通过机械循环拉伸载体模具，制备具有有序胶原蛋白的仿生角膜基质层；

所述角膜基质细胞为人角膜基质细胞；步骤A12具体包括：将角膜基质细胞在培养板贴壁生长到80-90%，吸弃培养液，用PBS清洗，然后胰酶消化、离心收集角膜基质细胞；重悬角膜基质细胞，然后与胶原蛋白充分混合，通过离心去除气泡，得到角膜基质细胞-胶原蛋白混合溶液；将混合溶液浇注在机械拉伸仿生平台的载体模具内腔中；步骤A13中通过机械循环单向拉伸或正交双向拉伸载体模具，制备具有有序胶原蛋白的仿生角膜基质层；

在步骤A2布置细胞外基质蛋白前，对步骤A1获得的仿生角膜基质层进行加工，以形成外周分布有仿生角膜缘龛的含角膜缘龛仿生角膜基质层；仿生角膜缘龛截面为长方形、梯形或扇形。

2.根据权利要求1所述的活细胞仿生角膜前板层的制备方法，其特征在于，加工过程包括：将步骤A1获得的仿生角膜基质层置于硅片上压印或翻印，所述硅片外围设有周向分布的凸出结构。

3.根据权利要求1~2任一项所述的活细胞仿生角膜前板层的制备方法，其特征在于，步骤A3通过3D生物打印细胞球打印上皮细胞球，在布置有细胞外基质蛋白的仿生角膜基质层中间顶部、外围设置有一个或多个打印点。

4.由权利要求1~3任一项所述制备方法制备的活细胞仿生角膜前板层。

5.一种活细胞仿生角膜前板层，其特征在于，通过权利要求1~3任一项所述制备方法制备，包括含角膜基质细胞和胶原蛋白的仿生角膜基质层、布置于仿生角膜基质层上的细胞外基质蛋白、位于细胞外基质蛋白之间和/或细胞外基质蛋白上方的上皮细胞。

6.根据权利要求5所述的活细胞仿生角膜前板层，其特征在于，仿生角膜基质层前表面外周侧周向分布有作为仿生角膜缘龛的槽状结构。

7.权利要求4所述或权利要求5~6任一项所述活细胞仿生角膜前板层在制备治疗角膜盲的植入物中的应用。

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