CN108261566A - 一种经血干细胞膜片的制备方法 - Google Patents

一种经血干细胞膜片的制备方法 Download PDF

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聂苏秦
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Abstract

一种经血干细胞膜片的制备方法，包括以下步骤：一、培养基配制备：1.基础培养基；2.添加组分；3.血清；4.胰蛋白酶配制；5.经血保存液的配制。二、经血干细胞膜片制备：1.人经血干细胞原代培养；2.人宫血干细胞传代培养；3.经血干细胞膜片制备；4.经血干细胞膜片内细胞活性鉴定。

Description

一种经血干细胞膜片的制备方法
技术领域
本发明涉及一种干细胞膜片的制备方法，具体涉及一种经血干细胞膜片的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
细胞膜片技术是上世纪90年代发展起来的一种组织工程技术，该技术无须支架材料和酶消化，通过刺激细胞外基质分泌，能完整的保留细胞外基质和细胞间连接，形成一种由细胞和细胞外基质组成的致密膜片状组织。细胞膜片厚度与机械强度除了与培养基条件有关，还与细胞类型密切相关，干细胞活性和增殖能力明显增强。经血干细胞是一类具有自我更新、多向分化潜能的间充质干细胞，具有增殖能力强、来源广泛且取材方便无创、培养简单的特点。
子宫内膜严重损伤时内膜功能性修复障碍，代之以结缔组织增生修复，子宫前后壁发生纤维化，瘢痕形成，临床上主要表现为宫腔粘连、闭经及子宫性不孕等，目前尚无有效治疗方法。临床上通用方法是宫腔镜手术机械性分离宫腔粘连，术后放置宫内节育器或防粘连材料(主要是透明质酸、Intercoat gel)等，并于术后给予雌激素促进内膜生长。但对子宫内膜严重损伤，无法解决内膜疤痕问题，不能实现内膜功能性修复，且极易发再次粘连。在专利《胶原支架复合骨髓间充质干细胞制备方法及应用》中使用的是胶原支架复合BMSCs，用于治疗严重子宫内膜损伤。该复合材料利用了外源性胶原，而且骨髓间充质干细胞的获取会对患者造成一定的损伤。
经血干细胞是来源于女性经血中的干细胞，具有活性高、分泌因子能力强等特点。经血干细胞膜片利用自身经血干细胞分泌的细胞外基质，完整的保留细胞外基质和细胞间连接，生物相容性好，而且干细胞活性和增殖能力增强，经血干细胞作为治疗严重子宫内膜损伤的活性成分，具有获取方便的优点，其可以补充局部干细胞数量，并分泌生长因子改善局部微环境及免疫调节等作用。经血干细胞分泌因子能力更强，而且分泌的因子更符合子宫内膜修复的需要。经血干细胞自身分泌的细胞外基质支架具有良好的生物相容性、可降解性及安全性。为经血干细胞提供支持位点，提高局部经血干细胞浓度，延长经血干细胞作用时间。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种经血干细胞膜片的制备方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。
本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
一种经血干细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括：
一、培养基配制备：
1.基础培养基；
2.添加组分；
3.血清；
4.胰蛋白酶配制；
5.经血保存液的配制；
二、经血干细胞膜片制备：
1.人经血干细胞原代培养；
2.人宫血干细胞传代培养；
3.经血干细胞膜片制备；
4.经血干细胞膜片内细胞活性鉴定。
其中，所述基础培养基，制备基础培养基；
基础培养基：H-DMEM或者DF12；
形式：干粉、液体；
提供状态：无菌；
配置方法：向基础培养基粉末DMEM，加入无菌超纯水一部分，进行先溶解，然后根据培养基说明书规定的体积进行定容；充分溶解后，0.22微米滤膜进行过滤、封装；然后按照需求，在基础培养液中加入5％-15％的胎牛血清；
或者液体DMEM，直接在容器中加入5％-15％的血清，混匀即可；
pH调节：使用pH试纸或者pH电位计测试培养基pH值，使用用10％的HCl或10％NaOH调节pH 7.0-7.5。
其中，所述添加组分：在基础培养液中加入5％-15％的胎牛血清和50-150ug/mlVc；完全培养基1：基础培养基+5％-15％的胎牛血清；完全培养基2：基础培养基+5％-15％的胎牛血清+50-150ug/ml Vc。
其中，血清种类：动物血清、胎牛血清、人血清，血清的浓度5-15％；
提供状态：无菌、补体灭活
自体血清的制备：
血清分离：将血样进行分离
过滤除菌：将步骤1)得到的样品0.22微米过滤器进行两次过滤；
血清灭活：将步骤2)得到的样品56℃水浴灭活热原至少30min，冰箱冷藏室保存待用；
紫外线照射：有时，在步骤3)获得的样品在使用或者封装前要紫外线照射。
其中，所述胰蛋白酶配制：0.25mg的胶原酶溶解到100ml 0.9％生理盐水中，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌；分装置于5ml离心管中，放置在-20℃冻存，配置成0.25％胰蛋白酶。
其中，所述经血保存液的配制：将医用青霉素和链霉素配制成100ug/ml，在99ml的0.9％生理盐水中加入1ml的青霉素和链霉素。
其中，所述人经血干细胞原代培养：
1.1新鲜采集的抗凝经血装瓶，外表75％酒精擦拭后放置于超净台，并观察样本有无凝血；
1.2将采集瓶中经血转移到50ml离心管中，将离心管置水平离心机内，2500rpm，4℃，15min；
1.3上清液废弃，下层血细胞加生理盐水，血细胞:生理盐水＝1:1，充分混匀；
1.4 50ml离心管内预先加入20ml淋巴细胞分离液；
1.5将稀释的血细胞悬液缓慢加于淋巴细胞分离液上层，不得晃动；
1.6将离心管置水平离心机内，离心，2100rpm，20min，20℃，无刹车状态；
1.7轻轻吸取白膜层，分别置于50ml离心管内，加生理盐水充分混匀；
1.8将白细胞悬液离心，1500rpm，10min，4℃；
1.9弃上清，沉淀用生理盐水清洗三遍，每次1300rpm，10min,并计数；按照5*106/ml用完全培养基1稀释细胞沉淀，接种于100mm的培养皿中，每皿接种10ml，放置于5％CO2，37℃的培养箱中培养。
其中，所述人宫血干细胞传代培养：
2.1待细胞融合度达到90％时，用0.25％胰酶在37℃培养箱中消化约3～5min。在显微镜下观察细胞回缩变圆、细胞间隙增大后，加入完全培养基1终止消化。
2.2将离心管置水平离心机内，离心，1300rpm，5min；
2.3弃去上清液，完全培养基1重悬沉淀，用吸管吹打细胞，以1∶4比例接种至新的100mm培养皿中进行传代培养；
2.4待宫血干细胞培养至3-6代时，用于经血干细胞膜片制备。
其中，所述经血干细胞膜片制备：
3.1取3-6代的经血干细胞经过0.25％胰酶消化，1300rpm离心，5min；
3.2分别用完全培养基1和完全培养基2重悬沉淀，吹打均匀。
3.3按照4×104～1×105/cm2接种至培养皿中。
3.4间隔2-4天更换基础培养基和完全培养基。
3.5待细胞长至8～12天时，可见用完全培养基2的培养皿底层细胞已形成膜片，膜片的边缘翘起来，用镊子可将整张膜片掲起。而用完全培养基1培养的培养皿底部无膜片翘起，很难从培养皿底掲下来。
4.经血干细胞膜片内细胞活性鉴定
4.1固定：将经血干细胞膜片投入预先配好的10％中性福尔马林固定液中，固定10min；
4.2、脱水透明浸蜡：使用全自动密闭脱水机完成；
4.3、石蜡包埋：65℃石蜡包埋；
4.4、切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成厚4μm厚的薄片，切下的薄片放到加热42℃的水中展平，再贴到载玻片上，放60℃恒温箱中烘干；
4.5、脱蜡：用二甲苯脱去切片中的石蜡，再分别浸入100％酒精2min，95％酒精2min，85％酒精2min，75％酒精2min，最后用蒸馏水洗；
4.6染色
①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色10min；
②流水冲洗20s；
③1％盐酸酒精分化15s；
④流水冲洗20s；
⑤入伊红染色液染色3min；
4.7脱水透明：75％酒精20s，95％酒精1min,100％酒精2缸，各5min，二甲苯2缸各5min；
4.8封固：将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，切片标本在显微镜下观察；
4.9观察膜片：切片标本在显微镜下观察(见图2)。
结果显示：细胞膜边缘完整，膜片全层附有细胞，细胞密度较高，呈梭形，细胞核卵圆形，结构清晰，核分裂像偶见。细胞核染色呈紫色，胞浆及基质染色呈红色。
本发明的有益效果：
1、本发明利用自身经血干细胞分泌的细胞外基质，完整的保留细胞外基质和细胞间连接，生物相容性好。
2、本发明自身分泌的细胞外基质支架具有良好的生物相容性、可降解性及安全性。
3、本发明为注射至受损部位的经血干细胞提供支持位点，提高局部经血干细胞浓度，延长经血干细胞作用时间。
附图说明
图1为2号完全培养基培养细胞膜片的照片。
图2为细胞膜片HE染色的照片。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种经血干细胞膜片及其制备方法，包括以下步骤：
一、培养基配制备
1.基础培养基
基础培养基：H-DMEM(或者DF12)；
形式：干粉(纯水、过滤)、液体；
提供状态：无菌
配置方法：向基础培养基粉末(例如DMEM)，加入无菌超纯水一部分，进行先溶解，然后根据培养基说明书规定的体积进行定容。充分溶解后，0.22微米滤膜进行过滤、封装。然后按照需求，在基础培养液中加入5％-15％的胎牛血清。
如果是液体DMEM，直接在容器中加入5％-15％的血清，混匀即可。
pH调节：使用pH试纸(或者pH电位计)测试培养基pH值，如不符合规定，可用10％的HCl或10％NaOH调节，直到符合配方要求，一般在pH 7.0-7.5之间。
2.添加组分
在基础培养液中加入5％-15％的胎牛血清和50-150ug/ml Vc；
完全培养基1：基础培养基+5％-15％的胎牛血清；
完全培养基2：基础培养基+5％-15％的胎牛血清+50-150ug/ml Vc；
3.血清
血清种类：动物血清、胎牛血清、人血清，最佳的自体血清(临床使用)，血清的浓度5-15％；
提供状态：无菌、补体灭活
自体血清的制备：
血清分离：将血样进行分离
过滤除菌：将步骤1)得到的样品0.22微米过滤器进行两次过滤
血清灭活：将步骤2)得到的样品56℃水浴灭活热原至少30min，冰箱冷藏室保存待用。
紫外线照射：有时，在步骤3)获得的样品在使用或者封装前要紫外线照射。
4.0.25％胰蛋白酶配制
0.25mg的胶原酶溶解到100ml 0.9％生理盐水中，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌。分装置于5ml离心管中，放置在-20℃冻存。
5.经血保存液的配制
将医用青霉素和链霉素配制成100ug/ml，在99ml的0.9％生理盐水中加入1ml的青霉素和链霉素。
二、经血干细胞膜片制备
1.人经血干细胞原代培养
1.1新鲜采集的抗凝经血(瓶)外表75％酒精擦拭后放置于超净台，并观察样本有无凝血；
1.2将采集瓶中经血转移到50ml离心管中，将离心管置水平离心机内，2500rpm，4℃，15min；
1.3上清液废弃，上清液取样无菌支原体检测，如若无菌支原体检测阳性，样本舍弃，下层血细胞加生理盐水，血细胞:生理盐水＝1:1，充分混匀。
1.4 50ml离心管内预先加入20ml淋巴细胞分离液；
1.5将稀释的血细胞悬液缓慢加于淋巴细胞分离液上层，不得晃动；
1.6将离心管置水平离心机内，离心，2100rpm，20min，20℃，无刹车状态；
1.7轻轻吸取白膜层，分别置于50ml离心管内，加生理盐水充分混匀；
1.8将白细胞悬液离心，1500rpm，10min，4℃；
1.9弃上清，沉淀用生理盐水清洗三遍，每次1300rpm,10min,并计数。按照5*106/ml用完全培养基1稀释细胞沉淀，接种于100mm的培养皿中，每皿接种10ml，放置于5％CO2，37℃的培养箱中培养。
2.人宫血干细胞传代培养
2.1待细胞融合度达到90％时，用0.25％胰酶在37℃培养箱中消化约3～5min。在显微镜下观察细胞回缩变圆、细胞间隙增大后，加入完全培养基1终止消化。
2.2将离心管置水平离心机内，离心，1300rpm，5分钟。
2.3弃去上清液，完全培养基1重悬沉淀，用吸管吹打细胞，以1∶4比例接种至新的100mm培养皿中进行传代培养。
2.4待宫血干细胞培养至3-6代时，用于经血干细胞膜片制备。
3.经血干细胞膜片制备
3.1取3-6代的经血干细胞经过0.25％胰酶消化，1300rpm离心，5分钟。
3.2分别用完全培养基1和完全培养基2重悬沉淀，吹打均匀。
3.3按照4×104～1×105/cm2接种至培养皿中。
3.4间隔2-4天更换基础培养基和完全培养基。
3.5待细胞长至8～12天时，可见用完全培养基2的培养皿底层细胞已形成膜片，膜片的边缘翘起来，用镊子可将整张膜片掲起。而用完全培养基1培养的培养皿底部无膜片翘起，很难从培养皿底掲下来。
图1为2号完全培养基培养细胞膜片的照片。
表1试剂
4.经血干细胞膜片内细胞活性鉴定
4.1固定：将经血干细胞膜片投入预先配好的10％中性福尔马林固定液中，固定10min；
4.2、脱水透明浸蜡：使用全自动密闭脱水机完成；
4.3、石蜡包埋：65℃石蜡包埋；
4.4、切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成厚4μm厚的薄片。切下的薄片放到加热42℃的水中展平，再贴到载玻片上，放60℃恒温箱中烘干。
4.5、脱蜡：用二甲苯脱去切片中的石蜡，再分别浸入100％酒精2min，95％酒精2min，85％酒精2min，75％酒精2min，最后用蒸馏水洗。
4.6染色：
①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色10min；
②流水冲洗20s；
③1％盐酸酒精分化15s；
④流水冲洗20s；
⑤入伊红染色液染色3min；
4.7脱水透明：75％酒精20s，95％酒精1min,100％酒精2缸，各5min，二甲苯2缸各5min；
4.8封固：将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，切片标本在显微镜下观察；
4.9观察膜片：切片标本在显微镜下观察见图2，图2为细胞膜片HE染色的照片。
结果显示：细胞膜边缘完整，膜片全层附有细胞，细胞密度较高，呈梭形，细胞核卵圆形，结构清晰，核分裂像偶见。细胞核染色呈紫色，胞浆及基质染色呈红色。
以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。

Claims (10)

1.一种经血干细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括：
一、培养基配制备：
1.基础培养基；
2.添加组分；
3.血清；
4.胰蛋白酶配制；
5.经血保存液的配制；
二、经血干细胞膜片制备：
1.人经血干细胞原代培养；
2.人宫血干细胞传代培养；
3.经血干细胞膜片制备；
4.经血干细胞膜片内细胞活性鉴定。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述基础培养基，制备基础培养基；
基础培养基：H-DMEM或者DF12；
形式：干粉、液体；
提供状态：无菌；
配置方法：向基础培养基粉末DMEM，加入无菌超纯水一部分，进行先溶解，然后根据培养基说明书规定的体积进行定容；充分溶解后，0.22微米滤膜进行过滤、封装；然后按照需求，在基础培养液中加入5％-15％的胎牛血清；
或者液体DMEM，直接在容器中加入5％-15％的血清，混匀即可；
pH调节：使用pH试纸或者pH电位计测试培养基pH值，使用10％的HCl或10％NaOH调节pH7.0-7.5。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述添加组分：在基础培养液中加入5％-15％的胎牛血清和50-150ug/ml Vc；完全培养基1：基础培养基+5％-15％的胎牛血清；完全培养基2：基础培养基+5％-15％的胎牛血清+50-150ug/ml Vc。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述血清：血清种类：动物血清、胎牛血清、人血清，血清的浓度5-15％；
提供状态：无菌、补体灭活；
自体血清的制备：
血清分离：将血样进行分离
过滤除菌：将步骤1)得到的样品0.22微米过滤器进行两次过滤；
血清灭活：将步骤2)得到的样品56℃水浴灭活热原至少30min，冰箱冷藏室保存待用；
紫外线照射：有时，在步骤3)获得的样品在使用或者封装前要紫外线照射。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述胰蛋白酶配制：0.25mg的胶原酶溶解到100ml 0.9％生理盐水中，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌；分装置于5ml离心管中，放置在-20℃冻存，配置成0.25％胰蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述经血保存液的配制：将医用青霉素和链霉素配制成100ug/ml，在99ml的0.9％生理盐水中加入1ml的青霉素和链霉素。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述人经血干细胞原代培养
1.1新鲜采集的抗凝经血装瓶，外表75％酒精擦拭后放置于超净台，并观察样本有无凝血；
1.2将采集瓶中经血转移到50ml离心管中，将离心管置水平离心机内，2500rpm，4℃，15min；
1.3上清液废弃，下层血细胞加生理盐水，血细胞:生理盐水＝1:1，充分混匀；
1.4 50ml离心管内预先加入20ml淋巴细胞分离液；
1.5将稀释的血细胞悬液缓慢加于淋巴细胞分离液上层，不得晃动；
1.6将离心管置水平离心机内，离心，2100rpm，20min，20℃，无刹车状态；
1.7轻轻吸取白膜层，分别置于50ml离心管内，加生理盐水充分混匀；
1.8将白细胞悬液离心，1500rpm，10min，4℃；
1.9弃上清，沉淀用生理盐水清洗三遍，每次1300rpm，10min,并计数；按照5*106/ml用完全培养基1稀释细胞沉淀，接种于100mm的培养皿中，每皿接种10ml，放置于5％CO2，37℃的培养箱中培养。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述人宫血干细胞传代培养：
2.1待细胞融合度达到90％时，用0.25％胰酶在37℃培养箱中消化约3～5min；在显微镜下观察细胞回缩变圆、细胞间隙增大后，加入完全培养基1终止消化；
2.2将离心管置水平离心机内，离心，1300rpm，5分钟；
2.3弃去上清液，完全培养基1重悬沉淀，用吸管吹打细胞，以1∶4比例接种至新的100mm培养皿中进行传代培养；
2.4待宫血干细胞培养至3-6代时，用于经血干细胞膜片制备。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述经血干细胞膜片制备：
3.1取3-6代的经血干细胞经过0.25％胰酶消化，1300rpm离心，5分钟；
3.2分别用完全培养基1和完全培养基2重悬沉淀，吹打均匀；
3.3按照4×104～1×105/cm2接种至培养皿中；
3.4间隔2-4天更换基础培养基和完全培养基；
3.5待细胞长至8～12天时，可见用完全培养基2的培养皿底层细胞已形成膜片，膜片的边缘翘起来，用镊子可将整张膜片掲起；而用完全培养基1培养的培养皿底部无膜片翘起，很难从培养皿底掲下来。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述经血干细胞膜片内细胞活性鉴定：
4.1固定：将经血干细胞膜片投入预先配好的10％中性福尔马林固定液中，固定10min；
4.2、脱水透明浸蜡：使用全自动密闭脱水机完成；
4.3、石蜡包埋：65℃石蜡包埋；
4.4、切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成厚4μm厚的薄片，切下的薄片放到加热42℃的水中展平，再贴到载玻片上，放60℃恒温箱中烘干；
4.5、脱蜡：用二甲苯脱去切片中的石蜡，再分别浸入100％酒精2min，95％酒精2min，85％酒精2min，75％酒精2min，最后用蒸馏水洗；
4.6染色：①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色10min；②流水冲洗20s；③1％盐酸酒精分化15s；④流水冲洗20s；⑤入伊红染色液染色3min；
4.7脱水透明：75％酒精20s，95％酒精1min，100％酒精2缸，各5min，二甲苯2缸各5min；
4.8封固：将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固，待树胶略干后，贴上标笺，切片标本在显微镜下观察；
4.9观察膜片：切片标本在显微镜下观察。
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