CN103705984B - 胶原支架复合骨髓间充质干细胞制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及胶原支架复合骨髓间充质干细胞制备方法及应用。本发明为将BMSCs胰酶消化后制备单细胞悬液，取单细胞悬液均匀滴加到胶原支架上，放入培养箱中培养，加入L-DMEM完全培养基继续培养即得胶原支架复合骨髓间充质干细胞。本发明克服了宫腔镜手术机械性分离宫腔粘连，术后放置宫内节育器或防粘连材料，于术后给予雌激素促进内膜生长所带给子宫内膜严重损伤，无法解决内膜疤痕问题，不能实现内膜功能性修复，且极易发再次粘连等缺陷。本发明BMSCs作为治疗严重子宫内膜损伤的活性成分，获取方便，分泌生长因子改善局部微环境及免疫调节，良好的生物相容性、可降解性及安全性，促进疤痕子宫内膜修复，增加内膜厚度及局部血管密度。
Description
技术领域
本发明属于妇产科学领域，涉及胶原支架复合骨髓间充质干细胞制备方法及应用。
背景技术
子宫内膜严重损伤时内膜功能性修复障碍，代之以结缔组织增生修复，子宫前后壁发生纤维化，瘢痕形成，临床上主要表现为宫腔粘连、闭经及子宫性不孕等，目前尚无有效治疗方法。
在本发明之前，对于严重子宫内膜损伤的治疗方法如下：
1、临床上通用方法是宫腔镜手术机械性分离宫腔粘连，术后放置宫内节育器或防粘连材料(主要是透明质酸、Intercoatgel)等，并于术后给予雌激素促进内膜生长。但对子宫内膜严重损伤，无法解决内膜疤痕问题，不能实现内膜功能性修复，且极易发再次粘连。
2、最近有小样本研究报道，宫腔粘连分离后用人新鲜羊膜覆盖创面，该法不能诱导疤痕内膜自身功能性修复，且羊膜还存在免疫炎症和诱发感染等风险。
3、子宫腔灌注粒细胞集落刺激因子，据报道可使部分内膜薄的患者内膜厚度增加，但此法不能保留粒细胞集落刺激因子在局部，作用时间短，局部疗效差，也无法达到促进疤痕内膜生长的效果。
4、骨髓间充质干细胞(Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsBMSCs)在刮宫术后将骨髓间充质干细胞均匀地注射到子宫腔内，术后给予激素替代治疗，能增加患者子宫内膜厚度。但BMSCs局部注射后很难在损伤局部定位，影响疗效。
胶原是细胞外基质的主要成分，其具有来源广泛、生物相容性良好、可降解、制备工艺简单等优点，胶原支架(图1)已经CFDA批准应用于临床皮肤及口腔黏膜修复中。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，提供胶原支架复合骨髓间充质干细胞在治疗严重子宫内膜损伤中的应用。
本发明的技术方案是：
胶原支架复合骨髓间充质干细胞制备方法，其主要技术特征在于将BMSCs与胶原支架复合培养；所述复合培养步骤包括：
(1)将BMSCs胰酶消化后制备单细胞悬液；
(2)取单细胞悬液均匀滴加到胶原支架上：
(3)放入培养箱中培养；
(4)加入L-DMEM完全培养基继续培养即得胶原支架复合骨髓间充质干细胞。
所述步骤(2)中，单细胞悬液细胞数量约1×106／cm2。
所述步骤(3)中，培养箱为37℃、5％CO2培养箱，培养15min。
所述步骤(4)中，加入L-DMEM完全培养基继续培养时间为1h。
胶原支架复合骨髓间充质干细胞可以应用于治疗严重子宫内膜损伤。
所述的严重子宫内膜损伤是指各种原因造成的子宫内膜过度损伤，内膜功能性修复障碍，代之以结缔组织增生修复，子宫壁发生纤维化，瘢痕形成。
所述胶原支架由烟台正海生物技术有限公司提供，已经CFDA批准应用于皮肤及口腔黏膜修复。
所述骨髓间充质干细胞由发明人分离与培养，经流式细胞术细胞表面抗原鉴定(图2)及体外诱导分化鉴定(图3)：CD90、CD44、CD29阳性，CD45、CD34阴性，可诱导分化为骨、脂肪及神经元细胞。
所述胶原支架复合骨髓间充质干细胞由以下方法制备：
培养基湿润胶原支架排气后将BMSCs细胞悬液均匀滴加到胶原支架上(约1×106／cm2)，放入37℃、5％CO2培养箱中培养15min，加入L-DMEM完全培养基继续培养1h。
本发明治疗严重子宫内膜损伤与以往治疗方法相比，具有以下优点：BMSCs作为治疗严重子宫内膜损伤的活性成分，具有获取方便的优点，其可以补充局部干细胞数量，并分泌生长因子改善局部微环境及免疫调节等作用。胶原支架具有良好的生物相容性、可降解性及安全性。其可以为BMSCs提供支持位点，提高局部BMSCs浓度，延长BMSCs作用时间。胶原支架复合BMSCs可以促进疤痕子宫内膜修复，增加内膜厚度及局部血管密度。
附图说明
图1——胶原支架外观及扫描电镜图片示意图。
图2——流式细胞术BMSCs表面标志测定示意图。
图3——BMSCs体外定向诱导分化结果示意图。
图4——HE染色观察BMSCs与胶原支架复合后其在胶原支架中的分布示意图。
图5——扫描电镜观察BMSCs与胶原支架复合后其在胶原支架表面分布示意图。
图6——胶原支架复合BMSCs用于大鼠子宫全层损伤修复后HE染色观察示意图。
图7——胶原支架复合BMSCs用于大鼠子宫全层损伤修复后平滑肌免疫组化示意图。
图8——胶原支架复合BMSCs用于大鼠子宫全层损伤修复后血管免疫组化示意图。
图9——胶原支架复合BMSCs用于大鼠子宫全层损伤修复后妊娠结局比较示意图。
具体实施方式
实施例1：
BMSCs与胶原支架复合培养
1、所用设备，材料，试剂
超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、离心机、扫描电镜、临界点干燥仪、组织包埋冷冻台、石蜡切片机、全自动组织染色机、细胞培养瓶、6孔板、离心管、L-DMEM培养液、胎牛血清、青霉素／链霉素、胰酶、甲醛、戊二醛、二甲苯、浓度梯度乙醇、苏木素、伊红等
2、BMSCs细胞活性保持
(1)培养至贴壁细胞90％融合时，进行传代；
(2)吸除旧培养液，加入PBS洗去残留培养液，吸除PBS；
(3)加入胰酶1ml，轻轻摇动培养瓶；
(4)倒置显微镜下观察，发现细胞质回缩、细胞间隙增大，加入完全培养液终止消化；
(5)吹打瓶壁细胞，使其形成细胞悬液；
(6)将细胞悬液吸入离心管，离心(常温170g，5min)，弃上清；
(7)用完全培养液调整细胞浓度后接种于培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱培养；
(8)隔天换液，继续培养。
3、BMSCs与胶原支架复合培养
(1)胶原支架UP面朝下，置于6孔板中，用培养基充分湿润，适当挤压去除内部空气，用无菌纱布将多余培养基吸干。
(2)取生长良好的BMSCs，胰酶消化后制备单细胞悬液，计数并调整细胞浓度。
(3)取适量单细胞悬液均匀滴加到胶原支架上，细胞数量约1×106／cm2，将6孔板放入37℃、5％CO2培养箱中培养15min，然后缓慢加入2mLL-DMEM完全培养基继续培养，培养1小时。
4、胶原支架为BMSCs提供支持位点
(1)BMSCs在胶原支架中分布
BMSCs与胶原支架复合培养后，分别取培养1h、3h、12h、24h、48h、72h的胶原支架作为样品，HE染色观察细胞在支架表面及内部分布。
样品于10％中性甲醛溶液中固定24小时，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明后浸蜡过夜，石蜡包埋样品后切片，行HE染色，封片，光学显微镜下观察(结果见图4)
结果：HE染色可见胶原呈红色。BMSCs与胶原支架复合培养1h后，可见圆形细胞分布在胶原支架表面。培养3h后可见分布在胶原支架表面BMSCs由圆形变为多角形。培养12h后可见大部分BMSCs为多角形，少量呈梭形，细胞伸出触角相互连接。培养24h后，可见大部分BMSCs由变为梭形，除胶原支架表面分布外，部分细胞散在胶原纤维中。培养48h后，可见梭形BMSCs部分融合，胶原支架中细胞数量增多，细胞周围胶原开始降解。培养72h后，可见梭形BMSCs融合成片，细胞数量明显增加，细胞周围胶原降解。结果表明BMSCs能够粘附于胶原支架表面，并且增殖进入胶原支架内部，保持良好的生物活性。
(2)BMSCs在胶原支架表面形态学观察
BMSCs与胶原支架复合培养后，分别取培养1h、3h、12h、24h、48h、72h的胶原支架作为样品，用扫描电镜观察细胞在膜表面形态。
将样品裁剪为面积约8×8mm薄片，于4℃2.5％戊二醛固定24小时，漂洗样品，梯度乙醇脱水，纯丙酮置换，中间液(醋酸异戊酯)代换，临界点干燥仪中干燥，用导电胶将样品装固在样品台上，扫描电镜观察(结果见图5)。
结果：扫描电镜下可见，胶原支架为疏松多孔组织，具有较广的孔径分布范围和较高的孔隙率。BMSCs与胶原支架复合培养1h后，可见圆形细胞分布在胶原支架表面，少量细胞伸出触角，细胞轮廓清晰可辨。培养3h后可见BMSCs由圆形变为多角形，部分细胞伸出触角相互连接。培养12h后可见分布在胶原支架表面大部分BMSCs变为多角形和梭形，细胞伸出触角相互连接，细胞轮廓尚可辨别。培养24h后可见BMSCs相互融合成片覆盖在胶原支架表面，细胞轮廓不清，在胶原支架内部孔隙中可见细胞存在。继续培养48h和72h后可见胶原支架表面孔隙被融合成片的细胞遮盖，细胞增殖，并进入到胶原支架内部。结果表明BMSCs能够粘附于胶原支架表面，BMSCs与胶原支架之间具有良好的生物相容性。
实施例2：
胶原支架复合BMSCs用于严重子宫损伤动物模型修复治疗中
1、BMSCs使用前鉴定
(1)无菌试验：如培养过程中未出现任何异常，常规在BMSCs与胶原支架复合前3天，最后一次换液后，对每一培养瓶中的上清液作无菌试验，培养细菌和霉菌。
(2)外观及镜下观察：在BMSCs与胶原支架复合的当天，如无菌试验报告无细菌、霉菌生长，对培养瓶中的上清液进行颜色观察，在倒置显微镜下观察细胞形态、细胞密度、有无细菌或霉菌生长。如有可疑，须再次抽样作无菌试验培养细菌、霉菌。
(3)活细胞比例：在BMSCs与胶原支架复合当天对收集的细胞悬液抽样检查活细胞比例占95％以上。
(4)表面标志：在BMSCs与胶原支架复合前3天抽样行表面标志测定：CD34、CD45表达阴性；CD29、CD44、CD90表达阳性。
2、胶原支架复合BMSCs治疗大鼠子宫严重损伤
选取大鼠子宫全层损伤模型为子宫严重操作动物模型——切除长约1.5厘米、宽约0.5厘米，相当于子宫周径一半的全层子宫壁组织。
大鼠麻醉，取下腹部正中纵形切口进入腹腔。于子宫中段子宫系膜对侧切除长约1.5cm、宽约0.5cm全层子宫壁组织。分别将复合有PBS和BMSCs的胶原支架修补缺损部位，关闭腹部切口。术后30天及90天后分别取材行HE染色及免疫组化染色进行组织学评估，术后90天行妊娠试验进行功能学评估。
结果：术后30天及90天组织学评估显示，与胶原支架／PBS组相比，胶原支架／BMSCs组子宫内膜及肌层均较厚，有大量血管、腺体和细胞(图6-8)。妊娠试验显示：胶原支架／BMSCs组妊娠率及手术区域妊娠率较胶原支架／PBS组明显增高(图9)。结果提示：胶原支架／BMSCs能够促进大鼠子宫仝层损伤后子宫内膜和平滑肌再生，提高组织血管化和细胞化，促进子宫妊娠功能恢复。
本发明通过体外培养及动物实验发现，BMSCs能够粘附于胶原支架表面，且与胶原支架之间具有良好的生物相容性，胶原支架复合BMSCs能够促进严重子宫内膜损伤后修复，增加内膜厚度、内膜细胞数量及内膜局部血管密度，无毒性。所以，胶原支架复合BMSCs可以用于治疗严重子宫内膜损伤。
Claims (1)
1.用于治疗子宫内膜损伤胶原支架复合骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)将BMSCs胰酶消化后制备单细胞悬液；
(2)取单细胞悬液均匀滴加到胶原支架上，单细胞悬液细胞数量约1×106/cm2；
(3)放入培养箱中培养，培养箱为37℃、5％CO2培养箱，培养15min；
(4)加入L-DMEM完全培养基继续培养即得胶原支架复合骨髓间充质干细胞，培养时间为1h；
(5)胶原支架复合骨髓间充质干细胞用于制备治疗子宫内膜损伤的复合补片。
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