CN114848792B - 基于子宫内膜干细胞的阴道修复凝胶、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及技术干细胞以及阴道修复制剂领域，尤其涉及基于子宫内膜干细胞的阴道修复凝胶、制备方法及应用。该凝胶包括羧甲基壳聚糖凝胶载体、附着于羧甲基壳聚糖凝胶载体上的子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽，羧甲基壳聚糖凝胶载体具有两个交联结构，分别用于释放所述子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽；阴道修复凝胶以化学键进行相互纠缠形成第一交联结构，经过成晶处理形成第二交联结构。通过将子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽容纳在羧甲基壳聚糖凝胶载体的不同交联结构内，充分利用二者的作用，可用于外用治疗外阴、阴道干燥以及子宫内膜损伤等修复功能。

Description

基于子宫内膜干细胞的阴道修复凝胶、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及技术干细胞以及阴道修复制剂领域，尤其涉及基于子宫内膜干细胞的阴道修复凝胶、制备方法及应用。

背景技术

正常性成熟女性阴道上皮柔软易弯曲，得益于雌激素、乳酸杆菌、阴道pH等维持精密的平衡机制。其可以保持正常水平的水合作用和润滑度。在进行清宫术、诊断性刮宫、子宫内膜消融术、子宫整形术等各种宫腔操作中，如果损伤子宫内膜基底层可导致子宫内膜修复障碍，是薄型子宫内膜形成的重要原因。其中较常见的情况是人工流产后宫腔粘连，即Asherman综合征。子宫内膜长期暴露于孕激素的作用下，可能导致孕激素拮抗雌激素对子宫内膜的增生作用，从而最终引起子宫内膜萎缩，引起细胞微环境改变，不利于子宫内膜的修复。

临床治疗薄型子宫内膜的方法主要有大剂量雌激素治疗、子宫内膜微刺激术、低剂量阿司匹林治疗、己酸己酮可可碱和维生素E治疗、宫内注射粒细胞集落刺激因子治疗、神经肌肉电刺激和生物反馈疗法西地那非治疗、生长激素治疗、中药治疗等。治疗方法虽较多，但总体疗效欠佳，成为生殖医学的一大难点。

子宫内膜干细胞是作为修复子宫内膜的一种新型治疗方向，经血中包含的子宫内膜脱落细胞可在体外分离并培养出子宫内膜间充质干细胞，具有复制快、来源广、取材易、含量多、无创获得等优点，其大量制备子宫内膜干细胞提供支持。然而，现有的子宫内膜干细胞制剂均为液体制剂，在直接抑制后存活率不高，对子宫内膜产生持续再生的作用有限。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于一定程度解决上述技术问题之一。

第一方面，本发明实施例公开了一种基于子宫内膜干细胞的阴道修复凝胶，包括羧甲基壳聚糖凝胶载体、附着于所述羧甲基壳聚糖凝胶载体上的子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽，其中，所述羧甲基壳聚糖凝胶载体具有两个交联结构，分别用于释放所述子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽；所述子宫内膜抗菌肽来源于子宫内膜上皮组织，所述子宫内膜抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～4所示；所述羧甲基壳聚糖凝胶载体以化学键进行相互纠缠形成第一交联结构，经过成晶处理形成第二交联结构。

在本发明实施例中，所述第二交联结构是以中药制剂形成的结晶域。

在本发明实施例中，所述中药制剂以按重量份数计包括苦参100～200份、蛇床子40～50份、金缕梅40～50份、积雪草10～20份、黄连10～20份、黄柏1～5份和乳香1～5份的原材料进行制备得到。

在本发明实施例中，所述子宫内膜干细胞为经过传代培养后高表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105抗原，低表达CD146抗原，不表达CD31、CD34和CD45抗原的传代细胞。

第二方面，本发明实施例公开了第一方面所述的阴道修复凝胶的制备方法，包括获取经传代培养的子宫内膜干细胞、子宫内膜抗菌肽的步骤，制备羧甲基壳聚糖凝胶载体的步骤，以及将所述子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽负载在所述羧甲基壳聚糖凝胶载体上的步骤。

在本发明实施例中，制备羧甲基壳聚糖凝胶载体包括形成第一交联结构以及形成第二交联结构的步骤。

在本发明实施例中，将所述子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽负载在所述羧甲基壳聚糖凝胶载体上的步骤具体包括将子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽加入至含有15％胎牛血清、1％青/链霉素的DMEM/F12培养基中进行培养得到。

在本发明实施例中，所述制备方法还包括将得到的凝胶溶液进行封装的步骤。

第三方面，本发明实施例公开了第一方面涉及的阴道修复凝胶或第二方面涉及的制备方法制得的阴道修复凝胶在制备阴道修复、子宫内膜修复、子宫内膜再生、宫腔粘连或子宫内膜异位症相关制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明通过将子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽容纳在羧甲基壳聚糖凝胶载体的不同交联结构内，充分利用二者的作用，可用于外用治疗外阴、阴道干燥以及子宫内膜损伤等修复功能。在该阴道修复凝胶外用后，其在阴道内通过特殊的持续释放机制，分阶段释放子宫内膜抗菌肽和子宫内膜干细胞。例如先释放中药制剂，利用子宫内膜抗菌肽抑制阴道炎相关细菌的滋生和提高阴道湿润度的作用，治疗阴道炎症、缓解阴道干燥症状，同时还能作为人体润滑剂，并同时具有促进阴道内膜鳞状上皮细胞层修复的作用，可改善阴道劲膜层变薄和修复阴道内膜损伤，使阴道粘膜恢复弹性和柔软，适用于阴道炎和阴道干燥症人群；在对阴道或子宫环境进行改善后，该修复凝胶进入子宫释放子宫内膜干细胞，充分发挥子宫内膜干细胞的再生作用，对子宫内膜进行修复，适用薄膜型子宫内膜修复、子宫内膜异位症、宫腔粘连等症状。

附图说明

图1为本发明实施例提供的CMCS以及对应MCACMCS的红外图谱。

图2为本发明实施例提供的CMC以及对应MCACMC的红外图谱。

图3为本发明实施例1提供的羧甲基壳聚糖凝胶载体微观图。

图4为本发明对比例1提供的羧甲基壳聚糖凝胶载体微观图。

图5为本发明对比例2提供的羧甲基壳聚糖凝胶载体微观图。

图6为本发明实施例5提供的相关子宫内膜干细胞表面抗原表达结果图。

图7为本发明实施例5提供的另一相关子宫内膜干细胞表面抗原表达结果图。

图8为本发明对比例3提供的相关子宫内膜干细胞表面抗原表达结果图。

图9为本发明对比例3提供的另一相关子宫内膜干细胞表面抗原表达结果图。

图10为本发明实施例动物实验提供的HE染色图；图10A为模型组切片染色图；图10B为实施例1提供的阴道修复凝胶移植小鼠子宫切片染色图；图10C为对比例4提供的阴道修复凝胶移植小鼠子宫切片染色图；图10D为对比例5提供的阴道修复凝胶移植小鼠子宫切片染色图；图10E为对比例6提供的阴道修复凝胶移植小鼠子宫切片染色图；图10F为对比例7提供的阴道修复凝胶移植小鼠子宫切片染色图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例公开了基于子宫内膜干细胞的阴道修复凝胶，包括羧甲基壳聚糖凝胶载体、附着于所述羧甲基壳聚糖凝胶载体上的子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽，其中，所述羧甲基壳聚糖凝胶载体具有至少两个交联结构，分别用于释放所述子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽。

本发明通过将子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽容纳在羧甲基壳聚糖凝胶载体的不同交联结构内，充分利用二者的作用，可用于外用治疗外阴、阴道干燥以及子宫内膜损伤等修复功能。在该阴道修复凝胶外用后，其在阴道内通过特殊的持续释放机制，分阶段释放子宫内膜抗菌肽和子宫内膜干细胞。例如先释放中药制剂，利用子宫内膜抗菌肽抑制阴道炎相关细菌的滋生和提高阴道湿润度的作用，治疗阴道炎症、缓解阴道干燥症状，同时还能作为人体润滑剂，并同时具有促进阴道内膜鳞状上皮细胞层修复的作用，可改善阴道劲膜层变薄和修复阴道内膜损伤，使阴道粘膜恢复弹性和柔软，适用于阴道炎和阴道干燥症人群；在对阴道或子宫环境进行改善后，该修复凝胶进入子宫释放子宫内膜干细胞，充分发挥子宫内膜干细胞的再生作用，对子宫内膜进行修复，适用薄膜型子宫内膜修复、子宫内膜异位症、宫腔粘连等症状。

进一步的，本发明实施例提供的阴道修复凝胶以化学键的相互纠缠形成第一交联结构，从而构建第一交联网络，经过成晶处理(促使其形成结晶过程中)，以中药制剂形成结晶域，作为第二交联结构，使得该羧甲基壳聚糖凝胶载体形成第二交联网络。如此形成的阴道修复凝胶表现出分级释放子宫内膜抗菌肽和子宫内膜干细胞的功能，该阴道修复还能表现出持续释放以及优异的修复性能。同时凝胶自身在使用过程中不断降解，释放中药制剂以对阴道进行持续的抗菌，起到保护作用。

具体的，第一交联结构中，该阴道修复凝胶利用其结构中具有自由羧基、氨基或羟基形成氢键或电荷作用进行交联。例如，本发明实施例公开一种羧甲基壳聚糖凝胶载体，其具有自由的羧基和氨基，通过pH控制，实现其内部交联。例如，本发明实施例还公开了一种羧基化的羟基纤维素钠，其同时具有自由的羧基和羟基，通过酯化，即可实现内部的交联，以形成第一交联结构。

进一步的，第一交联结构中，该阴道修复凝胶还利用其结构中具有巯基，以相邻的巯基形成二硫键进行聚合，以形成第一交联结构。

具体的，第二交联结构中，该阴道修复凝胶利用其网络结构与中药制剂的混合物进行结晶处理，以让中药制剂的可溶性溶液从液体中析出并在该阴道修复凝胶的网络结构中形成结晶域，从而让其具有第二交联结构。

具体的，该羧甲基壳聚糖凝胶载体耦合了子宫内膜抗菌肽的高分子复合物。该子宫内膜抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～4任一项所示的多肽物。

具体的，所述子宫内膜干细胞为经过传代培养后高表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105抗原，低表达CD146抗原，不表达CD31、CD34和CD45抗原的传代细胞。

具体的，中药制剂包括以苦参、蛇床子、金缕梅、积雪草、黄连、黄柏和乳香作为原料制备的制剂。更具体的实施例中，该中药制剂为这些中药药材为制备的可溶性药剂。

为此，下方将结合具体的实施例进行说明。

阴道修复凝胶的制备

1、羧甲基壳聚糖凝胶载体

1.1、形成第一交联结构

(1)巯基化羧甲基壳聚糖(MCACMCS)

称取0.3g 2-巯基丁酸(MCA，巨胜化学研究院)，用10mL DMF溶液溶解，密封避光条件下搅拌并进行氮气保护，待充分溶解后，再加入0.372g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，Sigma)和0.257g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，Sigma)DMF液，密避活化6h。

然后将0.75g羧甲基壳聚糖(CMCS，西安沣禾生物科技有限公司)溶于去离子水中溶解制备2％的CMCS水溶液，并加入0.25M的NaOH溶液调节pH值至9.0。

将上述活化的溶液在密封条件下用注射器转移到CMCS水溶液中，避光条件下搅拌反应10h，最后将所得反应溶液于透析膜中在暗处分别用含1:50乙醇-水溶液(V/V)和纯水溶液透析，浓缩即可得到MCACMCS耦合物。

(2)巯基化羧甲基纤维素(MCNACMC)

准确称取0.3g 2-巯基烟酸(MCNA，北京百灵威科技有限公司)用10mL DMF溶液溶解，密封避光条件下搅拌并进行氮气保护，待充分溶解后，再加入0.372g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，Sigma)和0.257g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，Sigma)DMF液，密避活化6h。

然后将1.05g羧甲基纤维素钠(CMC，河南豫兴生物科技有限公司)溶于去离子水中溶解制备2％的CMCS水溶液，并加入0.25M的NaOH溶液调节pH值至9.0。

将上述活化的溶液在密封条件下用注射器转移到CMCS水溶液中，避光条件下搅拌反应10h，最后将所得反应溶液于透析膜中在暗处分别用含1:50乙醇-水溶液(V/V)和纯水溶液透析，浓缩即可得到白色的MCACMC耦合物，低温下储存备用。

1.2、中药溶液

苦参、蛇床子、金缕梅、积雪草、黄连、黄柏和乳香几种中药，分别吸净后，加水煎煮20min后，过滤，去除滤水后，继续加入70％的乙醇溶液于密闭容器中煎煮60min后，过滤收集滤液，再次加入70％的乙醇溶液于密闭容器中煎煮60min后，过滤收集滤液，收集滤液，如此加入多次乙醇溶液于于密闭容器中密闭煎煮直至在每次将滤液与无水乙醇以1～10的体积混合后无沉淀产生即可。如此收集合并滤液。

其中，上述的中药原材料按重量份计为，苦参100～200份、蛇床子40～50份、金缕梅40～50份、积雪草10～20份、黄连10～20份、黄柏1～5份和乳香1～5份。这些中药原材料作为形成至该阴道凝胶中的一种药剂，其整体加入的重量为羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素钠总重量的10～20％，例如上述实施例中，使用的羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素钠总重量为1.8g，则加入中药原材料的总重量为0.18～0.36g。

1.3、形成第二交联结构

将上述形成具有第一交联结构的耦合物(即表1中的巯基化合物)和上述中药溶液进行混合，于超声下充分分散(适当时可加入一定量的乙醇溶液)直至混合液成透明状，在将混合液置于在-20～25℃下冷冻6～8小时，然后在室温下解冻至少10小时，即可形成具有第一交联结构、第二交联结构的羧甲基壳聚糖凝胶载体。

为此，本发明实施方式将上述实施过程作为实施例1，其他实施例参照该实施例1进行制备具有第一交联结构和第二交联结构的凝胶。而对比例1中仅仅使用MCACMCS进行交联。对比例2中仅仅使用MCNACMC进行交联。具体的实施例和对比例过程列入表1中。

表1

1.3、羧甲基壳聚糖凝胶载体的表征

1.3.1、红外表征(FI-RT)

将上述实施例所得的巯基化合物充分干燥，取少量碾成粉末后，分别与干燥的KBr粉末混合、研磨、压片，采用傅立叶红外光谱仪在500～400cm^-1波长范围内扫描，即得到红外吸收光图谱。结果如图1-2分别为巯基化羧甲基壳聚糖和巯基化羧甲基纤维素的红外图谱，图1中CMCS以及对应MCACMCS的图谱在1600cm^-1、1410cm^-1附近均现较强的吸收峰，分别为羧基的C＝O的不对称与对称缩振动。而图1中的MCACMCS的图谱在2600cm^-1处出现吸收峰，对应为巯基伸缩峰，说明对其CMCS进行巯基化处理成功。图2中的MCACMC的图在2610cm^-1处出现吸收峰，对应为巯基伸缩峰，同样说明对CMC进行巯基化处理成功。

1.3.2、巯基含量测定

巯基含量可以通过Ellman’s法测定。首先绘制吸光度对巯基浓度的标准曲线。主要按照表数据进行实验，在用紫外分光光度计于波长450nm处，测定吸光度。绘制标准曲线。用20mL Tris-甘氨酸缓冲液将2.2.2中制备的20mg巯基化羧甲基壳聚糖或巯基化羧甲基纤维素溶解，再加0.21mL 0.5％SDS液，然后再加入0.04mL的Ellman’s试剂，37℃水浴稳定2h。在最大吸收波长450nm处测取吸光度，通过标准曲线计算巯基含量。结果如表1所示，实施例1-4获得的羧甲基壳聚糖凝胶载体巯基含量几乎是对比例1、2的两倍。

1.3.3、扫描电镜分析

称取冻干后(-80℃、24h)的具有第一交联结构和第二交联结构的凝胶2.50mg，向其表面均匀喷洒金粉20min，将扫描电镜(SEM)的放大倍率调至1000倍，最大加速电压设定为15kV，观察凝胶的表面形貌。依次对不同实施例制备的凝胶进行SEM成像。图3为实施例1所示的羧甲基壳聚糖凝胶载体微观图，可见其表面光滑，具有比较均匀大孔，并在大孔之间形成了第二交联结构。图4和图5为对比例1和2制备的羧甲基壳聚糖凝胶载体，尽管二者仍然产生了一些孔洞，但是孔洞较小且不规整，凝胶表面也不光滑。

2、羧甲基壳聚糖凝胶载体负载子宫内膜干细胞及子宫内膜抗菌肽

将上述实施例1-4和对比例1-2分别作为载体进行子宫内膜干细胞及子宫内膜抗菌肽的负载培养。

实验材料：经血源性子宫内膜干细胞(上海优立赛尔生物医药科技)。

复苏细胞：

(1)无菌操作室及超净工作台消毒准备；

(2)备好37℃温水，从液氮罐中取出冻存管，迅速放入37℃温水中水浴，不断震摇，至冻存管冰块完全融化；

(3)将冻存管移入超净工作台，体积分数75％的乙醇消毒并打开冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入5ml的离心管，向离心管中加入3m1培养液，吹打均匀，800r/min，离心5分钟；

(4)弃上清液，向离心管中加入1ml培养液，用吸管吹打均匀，使细胞重悬，将细胞悬液移入新的培养瓶中；

(5)培养瓶中加入4mL DMEM/F12培养基(普诺赛)(其中含20pg/L转化生长因子(TGF，购自Thermo Fisher Scientific)，5μmol/L的白藜芦醇(阿拉丁公司))用吸管吹打均匀，放入37℃，5％CO₂培养箱培养。将上述对子宫内膜干细胞的复苏过程设置成为实施例5，并设置一对比例3，对比例3中使用的培养基并不含有的20pg/L TGF，5μmol/L的白藜芦醇。

(6)分析培养后的细胞表面抗原，分析方法如下：

取生长状态良好子宫内膜干细胞，轻轻用PBS清洗后加适量入胰蛋白酶消化，制成细胞悬液备用；离心后，用预冷的1％BSA(每100mL PBS加入1g BSA)洗涤2次，每次5min，离心后，倾去上清，用预冷的3％BSA(用PBS配制)重悬细胞，用血球计数板技术，调整细胞密度为106个/100μL,100μL/管分装于1.5mL EP管，置于冰上备用；每管分别加入鼠抗人CD29-PE、CD44-FITC、CD73-PE、CD31-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、CD146-PE、CD105-PerCP单克隆抗体20μL，鼠抗人CD90-FITC单克隆抗体2μL(单抗均购自美国eBioscienc公司)，空白组不加任何抗体，置于冰上避光孵育30min；30min后离心，倾去上清，每管加入1mL的1％BSA洗涤3次，每次5min，1500rpm/min离心后，倾弃上清，加入200匹的1％BSA重悬细胞，经70μm筛网过滤至96孔板后，用1mL注射器针头去除气泡，吹打均匀置于流式细胞仪，检测FITC标记、PE标记和PerCP标记细胞各占细胞总数的百分比。

实施例5的结果如图6、7所示：呈克隆性生长的子宫内膜干细胞，经过复苏培养后第2代，采用流式细胞仪器其表面抗原CD29(98.32％)、CD44(96.85％)、CD73(99.12％)、CD45(97.36％)、CD105(94.23％)和CD146(26.34％)均呈阳性表达(图6)，其中，CD146成低阳性表达，而CD31(1.14％)、CD34(0.82％)、CD90(0.97％)呈阴性表达(图7)。

对比例3的结果如图8、9所示，其表面抗原CD29(95.42％)、CD73(93.27％)、CD105(91.82％)和CD44(35.42％)、CD90(37.18％)、CD146(24.05％)均呈阳性表达(图8)，其中，CD44、CD90和CD146成低表达。而CD31(1.23％)、CD34(0.53％)、CD45(1.04％)呈阴性表达(图9)。

负载培养：

(1)取经上述复苏生长状态良好的第二代细胞(实施例5或对比例3分布制备的细胞)消化，将培养液用吸管吸去；

(2)加入0.25％胰蛋白酶溶液，轻摇培养瓶，使胰蛋白酶溶液流遍所有的细胞表面；

(3)观察细胞逐渐圆缩，待大部分细胞圆缩后吸除胰蛋白酶溶液；

(4)加入培养液终止消化，用吸管顺序反复吹打细胞形成单细胞悬液；

(5)取0.1ml单细胞悬液滴加至计数板上，放置显微镜下进行计数，计数四个方格，取平均数得细胞浓度；

(6)用含有体积分数为15％胎牛血清、1％青/链霉素的DMEM/F12培养基将其制备成密度为8×10⁶/ml的单细胞悬液；

(7)将单细胞悬液分别以1ml/孔(约8×10⁴细胞)加入至含有上述实施例1-4和对比例1-2制备得到羧甲基壳聚糖凝胶载体以及子宫内膜抗菌肽的24孔培养板中，将培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中继续静置密闭培养42h，即可得到负载有子宫内膜干细胞以及子宫内膜抗菌肽的凝胶溶液。

具体的，羧甲基壳聚糖凝胶载体在孔板用来为3ml，2mg/mL子宫内膜抗菌肽加入量为20μL，子宫内膜抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。

SEQ ID NO.1：GFTQVVRNPLSCRWNMGVCIPISCPGNMRQIGTCFGPRVPCCRRW(BNBD5，奶牛子宫内膜抗菌肽分离纯化BNBD5基因的克隆及原核表达[D]，2009年6月)；SEQ ID NO.2：Arg-Leu-Cys-Arg-Ile-Val-Val-Ile-Arg-Val-Cys-Arg(Bactenecin,bovine，货号601111，杭州肽佳生物科技有限公司)；SEQ ID NO.3：Ala-Cys-Ser-Ser-Ser-Pro-Ser-Lys-His-Cys-Gly(Transdermal Peptide/TD1 peptide，货号GT-P158，杭州固拓生物科技有限公司)；SEQ ID NO.4)，Cys–Cys–Glu–Tyr-Cys–Cys–Asn–Pro–Ala–Cys–Thr–Gly-Cys–Tyr，货号GT-B019，杭州固拓生物科技有限公司，Cys1 and Cys6,Cys2 and Cys10,Cys5 andCys13)。

(8)每日计数三孔细胞密度和测量子宫内膜抗菌肽含量，取平均值，连续记8d，计算每孔的细胞负载率和子宫内膜抗菌肽负载率，细胞负载率＝(加入细胞量-负载培养后的细胞量)/加入细胞量×100％，子宫内膜抗菌肽负载率＝(加入子宫内膜抗菌肽量-负载培养后的子宫内膜抗菌肽量)/加入子宫内膜抗菌肽量×100％。结果如表2所示，可知对比例4-7的细胞负载率和子宫内膜抗菌肽负载率均低于实施例6-14。

(9)采用细胞计数仪(上海睿钮生物科技有限公司)进行细胞计数，采用HPLC方法测量各子宫内膜抗菌肽含量。

测量方法如下：高效液相色谱仪(赛默飞μlti-Mate3000)；C18(4.6mm×150mm)反相色谱柱(安捷伦)；流动相A0.1％TFA(三氟乙酸)、流动相B(80％乙腈)，柱温:25℃，检测波长:280nm，流速:1mL/min，流动相以B％含量从5％～95％梯度洗脱。

3、凝胶封装

取上述负载有子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽的凝胶溶液100μL，加入与5％wt的海藻酸钠溶液混合至1mL，然后使用1mL注射器吸取混合液，以60μL/s的速度注射至0.15mol/L氯化钙溶液中，置于4℃下15min后取出。迅速转入液氮中，并且保存30min，即可完成对凝胶的封装，封装后的凝胶可于不高于4℃条件下保存。在需要使用时，可将封装的凝胶直接置于45℃的温热的5mL柠檬酸钠溶液中解冻溶解，溶解后即可使用。

阴道修复凝胶性能分析

由此，经过上述方式制备羧甲基壳聚糖凝胶载体分别由实施例1-4和对比例1-2，而上述实施例制备的子宫内膜干细胞具有实施例和对比例3，实施例提供子宫内膜抗菌肽有四种，通过这些实施例的组合，进行凝胶封装后能够制备多种不同的阴道修复凝胶，因此将这些组合列入表2中，以便对这些阴道修复凝胶的性能进行比较。表2中分别对羧甲基壳聚糖凝胶载体、子宫内膜干细胞以及子宫内膜抗菌肽分别进行选择。

表2

1、凝胶细胞存活率测定

将上述实施例6-14和对比例4-7封装得到的凝胶置于45℃的温热的5mL柠檬酸钠溶液中解冻溶解，然后采用BestBio贝博活细胞/死细胞染色试剂盒进行Calcein-AM/PI双染细胞测量凝胶中细胞存活率。具体方法如下：

(1)染色工作液的配制:

该试剂盒包括试剂A：染色液Calcein-AM，100μl，试剂B：染色液PI，100μl；试剂C：10倍稀释染色缓冲液10ml。根据样品数按下列比例配制染色工作液。

取1ml试剂C加9ml无菌去离子水稀释，混匀即成1×染色缓冲液。每10ml 1×染色缓冲液中加入10μl染色液A和3-10μl染色液B，充分混匀，即成染色工作液。用PBS洗涤解冻的封装凝胶两次，用200μl染色工作液将细胞重悬，4℃避光孵育15-30分钟，再次用PBS洗涤细胞，再次用适量PBS重悬细胞。用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。染料-DNA复合物的最大激发490±10nm，最大发射波长分别为515nm和617nm。荧光显微镜(基恩士)下，使用490±10nm波长激发，活细胞为黄绿色，死细胞为红色，用545mm波长激发，能够看到红色的死细胞，计算细胞存活率＝活性细胞量/细胞负载量，每值均测量5次，将计算结果以平均值与标准偏差的形式列入表3中。

2、子宫内膜抗菌肽释放量

同样将上述实施例6-14和对比例4-7封装得到的凝胶置于45℃的温热的5mL柠檬酸钠溶液中解冻溶解，然后将各组凝胶浸没在PBS(pH＝7.4)中，在温度37℃，转速70r/min的恒温水浴振荡器中释放子宫内膜抗菌肽，每隔一段时间取样3mL并补充相同体积的新溶液，释放的溶液样品低温保存，通过上述HPLC方法检测不同时段释放的子宫内膜抗菌肽的释放量，并记录直至不再释放子宫内膜抗菌肽的时间，每值均测量10次，并分别计算最大释放速率以及累积释放率，将计算结果以平均值与标准偏差的形式列入表3中，并对每列数据在不同实施例和对比例之间进行显著性差异比较和标记。最大释放速率为不同时间短检测的孵化液中子宫内膜抗菌肽含量与时间的比值，累积释放率为最终孵化液中子宫内膜抗菌肽含量与子宫内膜抗菌肽负载量的百分比。

将实施例6-14和对比例4-7封装得到的凝胶的细胞负载率、细胞存活率、子宫内膜抗菌肽负载率以及子宫内膜抗菌肽最大释放速率以及累积释放率的结果列入表3中，数值以平均值和标准偏差表示，并对各列数值在不同组别之间进行显著性差异标记。

表3

由表3可知，实施例6-14制备得到阴道修复凝胶中子宫内膜干细胞存活率显著高于对比例4-7，实施例6-14的子宫内膜抗菌肽释放时间均超过了700min，累积释放率均超过了90％，即实施例6-14制备得到的阴道修复凝胶能够有效地将子宫内膜抗菌肽进行释放，并且能够持续释放，这对于充分发挥子宫内膜抗菌肽的抗菌作用具有积极效应。

结合表1和表2可知，实施例6-14采用不同的羧甲基壳聚糖凝胶载体以及不同的子宫内膜干细胞，这都将导致该凝胶对子宫内膜干细胞的存活率影响。由表1、2中可知，实施例6-14使用的羧甲基壳聚糖凝胶载体均分别为实施例1-4，而对比例4-7为对比例1或2；具体而言，例如，实施例6使用了实施例1提供的羧甲基壳聚糖凝胶载体，而对比例4使用了对比例1提供的羧甲基壳聚糖凝胶载体，其他均与实施例6相同，然而，对比例4的子宫内膜干细胞的负载率和存活率均显著低于实施例6，这说明实施例6使用的实施例1提供的羧甲基壳聚糖凝胶载体能够更负载更多的子宫内膜干细胞，并且还能够保持这些细胞的存活，这实施例1提供的羧甲基壳聚糖凝胶载体具有更高的巯基含量以及其形成的羧甲基壳聚糖凝胶载体具有更加均匀的第一交联结构和第二交联结构有关。同样地，对比例1相对于实施例6对于子宫内膜抗菌肽的负载表现出相同的趋势，也是与实施例6使用的羧甲基壳聚糖凝胶载体有关。

而对比例5相对于对比例4，不仅使用了不同的羧甲基壳聚糖凝胶载体，其子宫内膜干细胞使用了对比例3提供的干细胞，直接导致其子宫内膜干细胞的负载率和存活率进一步相对于对比例4显著降低，对比例7相对于对比例6表现出相同的趋势。由此说明，对比例3提供的子宫内膜干细胞由于其表面抗原中CD44、CD90和CD146成现出低表达，将不利于其在羧甲基壳聚糖凝胶载体中的存活，进而不利于其作为制剂对子宫内膜进行修复。

另外，实施例13、14的子宫内膜抗菌肽最大释放速率降至与对比例4-7相当的水平，但是其持续释放时间远大于对比例4-7，也略高于实施例6-10，这说明实施例13、14制备的阴道修复凝胶能够持续释放该种子宫内膜抗菌肽，这可能与实施例13、14使用了如SEQID NO.4所示的子宫内膜抗菌肽有关。这种子宫内膜抗菌肽在其Cys1与Cys6、Cys2与Cys10、Cys5与Cys13之间均形成有二硫键。该子宫内膜抗菌肽除其本身形成四个二硫键以外还能够羧甲基壳聚糖凝胶载体上的巯基再次形成二硫键，还在被封装的凝胶解冻以及37℃孵育过程中能够再次缓慢打开这种二硫键，促使此种子宫内膜抗菌肽展开成为线性链，并从羧甲基壳聚糖凝胶载体中脱离开来，以实现在阴道内缓慢释放的作用，这为十分有助于使其成为阴道修复制剂提供优异的有效性能保障。

动物实验

1、实验动物

由Charles River Japan(CRJ)公司提供SPF级饲养BALB/c裸雌性鼠300只，10～12周、体质量19～22g。实验温度：22～24℃，湿度：45～70％，12h黑白交替，自由采食和饮水。

2、裸鼠单侧子宫内膜机械损伤模型的建立及检测

超净工作台75％酒精消毒，将手术用品75％酒精消毒后置于超净工作台内紫外线照射30min；取动情期BALB/C裸雌性鼠30只，1％戊巴比妥钠按0.75ml/l0g腹腔注射麻醉；待裸鼠无肢体反应后，采用仰卧位，将其四肢固定在铺有无菌垫巾的操作台上；75％酒精消毒术区，于下腹部正中线膀肤上方1.5cm处行纵行切口，用眼科镊提起皮层，眼科剪纵行逐层剪开，于膀肤后方找到子宫，缓慢挑出；于“丫’型子宫一侧(右侧)，用直镊夹起子宫输卵管端，充分暴露子宫角，将右侧子宫角切开切口，用4号注射器针头从子宫角处进入子宫腔三分之二处，进行旋转和来回搔刮4次机械损伤子宫内膜，复位子宫。用青霉素钠盐溶液1ml滴洒于腹腔；在切口处滴洒青霉素钠盐溶液，逐层缝合肌肉及皮肤。将裸鼠移至37℃恒温台上，做好标记，待其自然苏醒后，移入SPF级饲养室饲养。饲养1d、3d、5d后脱颈处死，解剖暴露双侧子宫，做好标记，置于4％多聚甲醛中固定24小时以上，常规石蜡包埋，制作石蜡切片，对石蜡切片进行HE染色，镜检。结果图10(A)所示，图中箭头部位的子宫内膜间质细胞间隙增大，少量白细胞浸润，并且靠近宫腔的间质区域存在因血管损伤漏出的红细胞淤积，表面子宫内膜机械损伤的小鼠模型建立成功。

2、阴道修复凝胶移植

将封装的凝胶直接置于45℃的温热的5mL柠檬酸钠溶液中解冻溶解，备用；

超净工作台75％酒精消毒，将手术用品75％酒精消毒后置于超净工作台内紫外线照射30分钟；取动情期BALB/C裸雌性鼠30只，予1％戊巴比妥钠按0.75ml/l0g腹腔注射麻醉，待裸鼠无肢体反应后，采仰卧位，将其四肢固定在铺有无菌垫巾的操作台上；75％酒精消毒术区，于下腹部正中线膀胱上方1.5cm处行纵行切口，用眼科镊提起皮层，眼科剪纵行逐层剪开，于膀肤后方找到子宫，缓慢挑出；于“Y”型子宫一侧(右侧)，用直镊夹起子宫输卵管端，充分暴露子宫角，将右侧子宫角切开切口，用4号注射器针头从子宫角处进入宫腔三分之二处，进行旋转和来回搔刮4次机械损伤子宫内膜，同法处理左侧子宫；

10min后，用微量注射器取20μl的上述以及解冻的阴道修复凝胶液，自右侧子宫角切口处进针，将细胞混悬液缓慢注射至右侧宫腔内，留针20s，左侧宫腔注入等量PBS作为对照，复位子宫。用青霉素钠盐溶液1ml滴洒于腹腔；在切口处滴洒青霉素钠盐溶液，逐层缝合肌肉及皮肤。将裸鼠移至37℃恒温台上，做好标记，待其自然苏醒后，移入SPF级饲养室饲养。饲养7d后脱颈处死，解剖暴露双侧子宫，做好标记，置于4％多聚甲醛中固定行冰冻切片，并对冰冻切片进行HE染色。如图10(B)所示的实施例1制备的阴道修复凝胶对小鼠子宫进行修复后，未见子宫宫腔间质细胞间隙增大，未见白细胞和血管损伤，表面光滑，表面子宫内膜得到修复；而图10(C-F)分别对应的对比例4-7对小鼠子宫的修复效果欠佳。

3、子宫角蛋白、波形蛋白及VEGF平均光密度检测

检测方法：常规62℃炙烤石蜡切片60min，然后把切片顺序摆在切片架上。二甲苯脱蜡2次各10min，梯度酒精4次各4min，双蒸水1次5min；PBS冲洗3次，每次4min；常规配制PH6.0抗原修复液，140℃高压抗原热修复2min；单独配制pH9.0抗原修复液，140℃高压抗原热修复2min；自然冷却到50℃以下，然后PBS冲洗3次；3％双氧水浸泡15min，PBS冲洗3次；倾去多余血清(勿冲洗)，滴加一抗(角蛋白、波形蛋白、VEGF(血管内皮生长因子)，Gibco公司)放入湿盒中，4 0C冰箱过夜；取出湿盒复温1h，PBS冲洗3次；擦干后加二抗(角蛋白、波形蛋白、VEGF，Gibco公司)，置37℃恒温水浴箱孵育30min，PBS冲洗3次；加辣根过氧化物酶(Gibco公司)，置37℃恒温水浴箱孵育30min，PBS冲洗3次；DAB显色，显微镜下观察并充分水洗终止显色反应；苏木素复染3min，浸自来水3次，分化液3次，流水冲洗5min；梯度酒精4min，二甲苯I、II试剂中各10min使之透明化；中性树胶封片，显微镜下观察，摄片。

采用Image-Pro P1us6.0图像处理软件分析400倍图片，计算平均光密度＝累积光密度/测量区域面积，平均光密度越大，提示蛋白表达水平越高。同时还设置对照组和模型组，模型组即为上述机芯机械损伤造模形成的小鼠，并未进行阴道修复凝胶移植；而对照组即为并未进行机械损伤造模的正常小鼠。结果如表4所示，表4中列出不同实施例和对比例制备的阴道修复凝胶移植小鼠阴道后的各种蛋白表达的平均光密度(测量次数为10次)，数值以平均值和标准偏差表示，并对各列数值在不同组别之间进行显著性差异标记。

表4平均光密度

实施方式	角蛋白	波形蛋白	VEGF
				实施例6	0.25±0.01b	0.071±0.006b	0.27±0.03b
实施例7	0.24±0.03b	0.069±0.004c	0.26±0.02b
				实施例8	0.20±0.06b	0.068±0.010c	0.28±0.04b
实施例9	0.31±0.02a	0.086±0.003b	0.24±0.05b
				实施例10	0.27±0.03ab	0.083±0.003b	0.26±0.04b
实施例11	0.28±0.02ab	0.081±0.001b	0.27±0.03b
				实施例12	0.32±0.04a	0.089±0.005b	0.31±0.02a
实施例13	0.33±0.05a	0.101±0.003a	0.29±0.02b
				实施例14	0.32±0.03a	0.102±0.002a	0.35±0.04a
对比例4	0.12±0.01c	0.027±0.002e	0.087±0.003d
				对比例5	0.15±0.02c	0.030±0.001e	0.095±0.002d
对比例6	0.14±0.02c	0.029±0.004e	0.078±0.003d
				对比例7	0.13±0.01c	0.031±0.002e	0.085±0.005d
对照组	0.16±0.03c	0.054±0.002d	0.14±0.03d
				模型组	0.07±0.02d	0.021±0.001e	0.065±0.004e

角蛋白((PCK)是上皮细胞的标志性蛋白，对维护上皮细胞形态的完整性具有重要作用。波形蛋白主要表达于间质细胞的骨架结构上，其作用是维持细胞结构稳定，参与细胞的有丝分裂、分化增殖、信号转导等。VEGF(血管内皮生长因子)通过结合到受体(VEGFR)调节血管的生长，具有增加血管的通透性、促进内皮细胞增殖、促进血管的生成等重要的生物学功能。

如表4所示，本利用免疫组织化学方法检测内膜损伤裸鼠移植子宫内膜干细胞后的角蛋白、波形蛋白以及VEGF表达情况，移植7天后裸鼠子宫内膜角蛋白表达，镜下见角蛋白染色呈棕黄色，波形蛋白染色呈棕色，VEGF染色呈棕色。移植侧子宫内膜角蛋白、波形蛋白以及VEGF的平均光密度均显著高于模型组和对照组。而三种蛋白的表达上调，均能说明本发明实施例提供的修复凝胶对小鼠子宫内膜具有修复作用。

并且，在表4中，实施例12-14对应的角蛋白、波形蛋白以及VEGF的表达水平还显著高于实施例6-8，这与上述凝胶性能分析结果类似。由于实施例12-14具有更由于细胞存活率以及子宫内膜抗菌肽释放性能致使其具有更加的促进此三种蛋白表达的作用，而这种促进作用与羧甲基壳聚糖凝胶载体、以及羧甲基壳聚糖凝胶载体上负载的子宫内膜干细胞以及子宫内膜抗菌肽有关。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广州金天芳颜化妆品有限公司

<120> 基于子宫内膜干细胞的阴道修复凝胶、制备方法及应用

<141> 2021-07-28

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Gly Phe Thr Gln Val Val Arg Asn Pro Leu Ser Cys Arg Trp Asn Met

1 5 10 15

Gly Val Cys Ile Pro Ile Ser Cys Pro Gly Asn Met Arg Gln Ile Gly

20 25 30

Thr Cys Phe Gly Pro Arg Val Pro Cys Cys Arg Arg Trp

35 40 45

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Ala Leu Cys Ala Ile Val Val Ile Ala Val Cys Ala

1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Ala Cys Ser Ser Ser Pro Ser Leu His Cys Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Cys Cys Gly Thr Cys Cys Ala Pro Ala Cys Thr Gly Cys Thr

1 5 10

Claims (2)

1.一种基于子宫内膜干细胞的阴道修复凝胶的制备方法，其特征在于，所述基于子宫内膜干细胞的阴道修复凝胶，包括羧甲基壳聚糖凝胶载体、附着于所述羧甲基壳聚糖凝胶载体上的子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽，其中，所述羧甲基壳聚糖凝胶载体具有两个交联结构，分别用于释放所述子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽；

所述子宫内膜抗菌肽来源于子宫内膜上皮组织，所述子宫内膜抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述子宫内膜干细胞为经过传代培养后高表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105抗原，低表达CD146抗原，不表达CD31、CD34和CD45抗原的传代细胞；

所述羧甲基壳聚糖凝胶载体以巯基化羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素通过化学键的相互纠缠形成第一交联结构，经过成晶处理，以中药制剂形成结晶域，作为第二交联结构，所述中药制剂以按重量份数计包括苦参100~200份、蛇床子40~50份、金缕梅40~50份、积雪草10~20份、黄连10~20份、黄柏1~5份和乳香1~5份的原材料进行制备得到；

所述第一交联结构中，所述凝胶载体利用其结构中具有自由羧基、氨基或羟基形成氢键或电荷作用，或者利用相邻的巯基形成二硫键进行交联形成第一交联结构；所述第二交联结构中，所述凝胶载体利用其网络结构与中药制剂的混合物进行结晶处理，以让中药制剂的可溶性溶液从液体中析出并在该阴道修复凝胶的网络结构中形成结晶域，从而让其具有第二交联结构；

所述制备方法包括：

获取经传代培养的子宫内膜干细胞、子宫内膜抗菌肽的步骤；

制备凝胶载体的步骤；

将所述子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽负载在所述羧甲基壳聚糖凝胶载体上的步骤；以及

将得到的凝胶溶液进行封装的步骤；

其中，所述制备凝胶载体包括：

将巯基化羧甲基壳聚糖、巯基化羧甲基纤维素和中药溶液混合，于超声下充分分散直至混合液成透明状，在将混合液置于在-20~25℃下冷冻6~8小时，然后在室温下解冻至少10小时，即可形成具有第一交联结构、第二交联结构的凝胶载体；所述中药溶液中的原材料作为形成至该阴道凝胶中的一种药剂，其整体加入的重量为羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素钠总重量的10～20％；

其中，将所述子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽负载在所述羧甲基壳聚糖凝胶载体上的步骤具体包括将子宫内膜干细胞和子宫内膜抗菌肽加入至含有15%胎牛血清、1%青/链霉素的DMEM/F12培养基中进行培养得到。

2.权利要求1所述的制备方法制得的阴道修复凝胶在制备阴道修复、子宫内膜修复、子宫内膜再生、宫腔粘连或子宫内膜异位症相关制剂中的应用。

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