CN110152061A - 一种胶原蛋白复合生物活性支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胶原蛋白复合生物活性支架及其制备方法,是以Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶于醋酸溶液中,加入DME/F12培养基和NaOH溶液制备Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液,以CSCI和β‑甘油磷酸钠溶于DME/F12培养基中制备温敏性CSCI溶液,以Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液与温敏性CSCI溶液混合制备胶原蛋白复合生物活性支架。本发明胶原蛋白复合生物活性支架可以作为组织工程化心肌注入心肌缺血区域,用于治疗心肌梗死类缺血性心脏病。
Description
技术领域
本发明属于组织工程技术领域,涉及一种生物活性支架,特别是涉及一种基于CSCI(氯化壳聚糖)与胶原蛋白的复合生物活性支架,以及该生物活性支架的制备方法。本发明的生物活性支架具有温敏性,适合用于治疗心肌梗死类缺血性心脏病。
背景技术
心肌梗死(Myocardial infarction,MI)是一种由冠状动脉堵塞而导致心肌细胞缺血坏死的疾病,严重危害着人类的身体健康。成年心肌细胞损伤坏死后,逐渐被纤维瘢痕组织替代。新形成的纤维瘢痕一方面导致心室重塑和心力衰竭,另一方面,导致MI区域电生理异质性增加,加重心脏收缩不同步所引起的心衰,并容易诱发致命的恶性心律失常甚至猝死。
目前针对MI的药物治疗、介入治疗以及外科冠状动脉旁路搭桥术只能恢复局部心肌的血液供应,延缓不利的心肌重塑,并不能从根本上解决MI后心脏功能进行性下降这一根本问题。
近年来,心肌组织工程学已经成为医学研究领域的热点之一。其中,可注射性心肌组织支架对于MI的治疗可以在一定程度上预防不利的基质重塑,减少梗死扩张和瘢痕纤维化,进而调控心梗微环境。
氯化壳聚糖(CSCI)是一种优良的可注射水凝胶支架材料,具有良好的生物降解性和相容性。CSCI水凝胶不仅具有天然的抗菌消炎性能,可以消除心梗微环境多余的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),同时可以作为传递载体参与相应组织的修复,提高传递物的移植部位驻留率。研究表明,壳聚糖水凝胶心肌内注射对MI后左心室重构有明显的抑制作用,也可以改善梗死区域血管密度。
然而,单一成分CSCI水凝胶的机械强度和物质结构不受人工调节,缺乏良好的可塑性和表面活性,因此,为了解决单纯壳聚糖水凝胶出现的上述问题,应选择一种新的生物材料与CSCI水凝胶结合制备复合水凝胶。
胶原蛋白及其衍生物是心肌组织工程中常用的的生物材料之一。胶原蛋白水凝胶不仅能参与细胞的迁移、分化和增殖,也能促进移植部位血管新生,具有良好的治疗效应。有研究证实,胶原蛋白水凝胶移植入MI部位,可以改善梗死区微血管密度,参与心梗后的短期心肌修复。
但是胶原蛋白水凝胶的降解速度过快,无法发挥长时间的缓释作用,常与其他生物材料复合应用。其中,Ⅰ型胶原蛋白是细胞外基质的重要组成部分,在复合支架中具有可调节的硬度和张力,将其与壳聚糖水凝胶复合,可以充分发挥各成分在复合水凝胶中的生物学作用。
近年来兴起的干细胞治疗是一种新型的MI治疗手段,依靠干细胞的强增殖性和多向分化潜能,可以缓解心肌细胞受到的损伤。同时,也有研究将生长因子与干细胞联合用于治疗MI。很多研究采用基因和小RNA直接靶向治疗缺血受损细胞,改善心肌细胞线粒体功能。有研究表明,将中药萃取成分局部心肌注射,有利于缓解心肌缺血区域的心肌细胞代谢异常。
将可注射性水凝胶与上述干细胞、生长因子、基因、小RNA和中药等成分结合,进一步制备复合生物活性支架,不仅可以达到修复受损心肌的目的,而且可以消除心脏局部微环境及免疫排斥反应的影响。
CN 101574514A公开了一种基于壳聚糖水凝胶和生长因子治疗心肌梗死的产品,其应用温敏性壳聚糖水凝胶为支架材料,携带几种促血管生长因子注射移植到MI模型动物梗死区域,明显促进了心室重塑。但是该专利中所涉及支架材料携带成分单一,缺乏可控的机械强度和理化性能,生物活性较差。
发明内容
本发明的目的是提供一种胶原蛋白复合生物活性支架,以及所述生物活性支架的制备方法。将本发明生物活性支架以体外注射方法注入MI心肌缺血区域,具有良好的亲水性和组织相容性,可以模拟心肌细胞微环境的生化和机械特性,以达到改善心功能的目的。
本发明所述的胶原蛋白复合生物活性支架是一种以CSCI和Ⅰ型鼠尾胶原蛋白作为靶点,结合β-甘油磷酸钠(β-Glycerophosphoric acid disodium salt,β-GP)制备得到的温敏性CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合水凝胶。所述复合水凝胶在常温下为流动性强的液态,37℃凝胶化形成水凝胶。
本发明是采用下述方法制备所述胶原蛋白复合生物活性支架的。
1)、冰浴下,将Ⅰ型鼠尾胶原蛋白固状物溶于醋酸溶液中,加入DME/F12培养基和NaOH溶液混合,制备得到Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液;
2)、分别将CSCI和β-甘油磷酸钠溶于DME/F12培养基中,混合制备温敏性CSCI溶液;
3)、冰浴下,将Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液与温敏性CSCI溶液混合,37℃细胞培养箱中固定成胶,制备得到所述具有温敏性的胶原蛋白复合生物活性支架。
其中,具体地,所述Ⅰ型鼠尾胶原蛋白与温敏性CSCI的质量比为1∶6~9。
更具体地,所述温敏性CSCI溶液的制备中,所述CSCI与β-甘油磷酸钠的质量比为1∶5~6。
优选地,本发明是将所述CSCI与β-甘油磷酸钠分别制备成质量分数为2%和45%的DME/F12培养基溶液,混合制备温敏性CSCI溶液。
更优选地,所述温敏性CSCI溶液和Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液的pH值均为7.35~7.45。
本发明上述制备得到的胶原蛋白复合生物活性支架可以作为组织工程化心肌,以体外注射的方法注入心肌梗死心肌缺血区域,用于治疗心肌梗死类缺血性心脏病。
进一步地,还可以使用本发明所述胶原蛋白复合生物活性支架包被携带具有心肌梗死治疗作用的药物,以制备具有心肌修复作用的复合生物活性支架。
所述药物包括干细胞、生长因子、基因、小RNA、中药,可以是其中的任意一种,也可以是几种的组合物。
具有温敏性的复合水凝胶在移植部位发生相变成胶后逐步降解,其中包被携带的药物成分被缓慢释放,原位发生生物学效应。
本发明胶原蛋白复合生物活性支架的制备原料均为天然生物材料,具有良好的生物相容性和可降解性,一方面,CSCI可以提供海绵状的空间孔径结构及可控制的硬度,而Ⅰ型鼠尾胶原蛋白的加入改善了复合水凝胶材料的弹性及张力;另一方面,温敏性CSCI与Ⅰ型鼠尾胶原蛋白之间依靠分子间氢键及氨基和羧基间静电相互作用连接,毒性残留少。
本发明制备的胶原蛋白复合生物活性支架理化性能优良,具体体现在:1、凝胶化时间适宜,注入体内(37℃)后短时间即可原位成胶;2、凝胶体具有适宜心脏细胞黏附及扩散的孔径大小,孔隙率达90%以上,便于营养物质的流通;3、凝胶体具有较强的凝胶强度,分子间的相互作用力较强;4、凝胶体的降解速度与细胞增殖分化速度相吻合。
将本发明制备的胶原蛋白复合生物活性支架注射移植到小鼠MI模型心脏梗死区及后壁区域,可以明显延缓心室重构,防止心脏扩大,梗死区室壁变薄,也明显防止了心功能进行性下降。
本发明制备的胶原蛋白复合生物活性支架具有良好的亲水性和组织相容性,将其作为组织工程化心肌进行MI后局部移植,采用体外注射方法注入心肌缺血区域,可以模拟心肌细胞微环境的生化和机械特性,以期达到改善心功能的目的,而且由于其对患者造成的创伤较小,更易于进行临床应用,具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为CSCI、温敏性CSCI-β-GP、CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架的FT-IR光谱图。
图2为CSCI水凝胶和不同实施例制备CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架的SEM扫描电镜图及孔径大小统计分析图。
图3为CSCI水凝胶和不同实施例制备CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架的孔隙率统计分析图。
图4为CSCI水凝胶和不同实施例制备CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架的力学性能比较图。
图5为CSCI水凝胶和不同实施例制备CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架的平衡溶胀度统计分析图。
图6为CSCI水凝胶和不同实施例制备CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架的体外降解分析图。
图7为MI小鼠模型心肌内注射不同组药物后的心脏超声心动图及心功能参数统计图。
图8为不同组药物移植MI小鼠模型的组织学观察图(Masson染色图)及梗死室壁区域统计图。
图9为不同组药物移植MI小鼠模型的炎症反应图(HE染色图)及炎性细胞浸润情况统计图。
图10为不同组药物移植MI小鼠的微血管密度统计图(CD31免疫组化染色图)。
具体实施方式
下述实施例仅为本发明的优选技术方案,并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1
将C57BL/6J小鼠(雌雄不限)的尾部从鼠尾根部剪下,用自来水、蒸馏水依次洗净后,75%乙醇浸泡消毒15~20min。
手术剪剪去鼠尾尖1~2mm,从根部剥离皮,按照由尾根至尾尖的方向,用镊子抽取银白色肌腱,避免抽取到肌肉组织。
将抽取的肌腱置于100mL烧杯中,生理盐水清洗后称重。为避免鼠尾肌腱所含的胶原蛋白变性,此步骤严格在冰浴上进行。
用手术剪剪碎银白色肌腱(越碎越好),置于50mL离心管中,每克鼠尾肌腱加入0.1%醋酸溶液50mL,摇晃使其分布均匀,4℃放置48~72h,并不时摇动,充分溶解肌腱。
待肌腱充分溶解后,将所得复合溶液离心,4℃,4000rpm离心30min,取上清,即得Ⅰ型鼠尾胶原蛋白原液;-20℃冷冻过夜后,将原液冷冻干燥48h,得到Ⅰ型鼠尾胶原蛋白固状物。
称取0.2g氯化壳聚糖(CSCI)粉末,溶于10mL DME/F12培养基中,600rpm下充分搅拌5h至完全溶解,高压蒸汽灭菌(121℃,20min),得到质量分数2%的CSCI溶液,性状为均一的淡黄色胶冻状液体,记为A液。
称取2.25g β-甘油磷酸钠(β-GP)粉末,溶于5mL DME/F12培养基中,冰浴下600rpm充分搅拌2h至完全溶解,0.22µm滤器过滤除菌,得到质量分数45%的β-GP溶液,性状为淡红色清亮液体,记为B液。
冰浴下,将2.5mL B液逐滴加入600rpm搅拌下的10mL A液中,滴加完毕后,继续保持搅拌状态2h,使其充分反应,调节pH值至7.35~7.45,得到温敏性CSCI-β-GP溶液,4℃备用。
称取1g上述提取的Ⅰ型鼠尾胶原蛋白固状物,溶于200mL 0.1%醋酸溶液中。冰浴下600rpm充分搅拌6h至完全溶解,得到浓度为5mg/mL的Ⅰ型鼠尾胶原蛋白备用液。
冰浴下,取2mL上述Ⅰ型鼠尾胶原蛋白备用液加入冰浴的15mL离心管中,加入6.9mLDME/F12培养基,然后加入到120μL 0.1mol/L NaOH溶液中,立即混匀。最后加入1mL DME/F12培养基,混匀后调节pH值为7.35~7.45,得到浓度为1mg/mL的Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液,4℃备用。
冰浴下,将16mL温敏性CSCI-β-GP溶液均匀加入到2mL上述Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液中,搅拌至充分混合均匀,注入玻璃试管中,置于37℃细胞培养箱,待溶液成胶后,制备得到CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架。
本实施例制备生物活性支架的平均凝胶化时间为6.33min。
分别取CSCI、温敏性CSCI-β-GP和CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架,冷冻干燥后测定其FT-IR图谱,结果如图1所示。
图1中A、B、C分别对应CSCI、温敏性CSCI-β-GP和CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架的FT-IR图谱。CSCI图谱中,1069cm-1处为C-O-C特征吸收峰,1621cm-1处为N-H特征吸收峰,3442cm-1处为-OH特征吸收峰与-NH2吸收峰叠加形成的伸缩振动吸收峰。将CSCI图谱与温敏性CSCI-β-GP图谱、CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架图谱对比可知,CSCI的3442cm-1特征吸收峰向低频方向发生了移动,CSCI-β-GP移动至3207cm-1,生物活性支架移动至3247cm-1,说明由于N-H键能的降低,CSCI与β-GP之间形成了配位键;而生物活性支架中1621cm-1特征吸收峰的消失,则证明CSCI与Ⅰ型鼠尾胶原蛋白之间有氢键生成。
FT-IR结果显示,三种原料之间有氢键、酰胺键和配位键生成,成功交联构建得到了CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架水凝胶。
实施例2。
冰浴下,取14.2mL实施例1制备的温敏性CSCI-β-GP溶液,均匀加入到2mL实施例1制备的Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液中,搅拌至充分混合均匀,注入玻璃试管中,置于37℃细胞培养箱固定成胶,制备得到CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架。
本实施例制备生物活性支架的平均凝胶化时间为5.98min。
实施例3。
冰浴下,取12.4mL实施例1制备的温敏性CSCI-β-GP溶液,均匀加入到2mL实施例1制备的Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液中,搅拌至充分混合均匀,注入玻璃试管中,置于37℃细胞培养箱固定成胶,制备得到CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架。
本实施例制备生物活性支架的平均凝胶化时间为5.81min。
实施例4。
冰浴下,取10.7mL实施例1制备的温敏性CSCI-β-GP溶液,均匀加入到2mL实施例1制备的Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液中,搅拌至充分混合均匀,注入玻璃试管中,置于37℃细胞培养箱固定成胶,制备得到CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架。
本实施例制备生物活性支架的平均凝胶化时间为5.67min。
实验例1:胶原蛋白复合生物活性支架的微观结构分析。
将实施例1~4制备的CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架冷冻干燥后,切成2mm×2mm的小块,采用SEM扫描电镜对样品的横截面进行扫描,观察其表观形态,结果如图2所示。
与图2A所示的CSCI水凝胶比较,本发明实施例1~4制备CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架(分别对应图2B~E)的孔径明显增大。根据图2F的统计数据,本发明实施例1~4复合生物活性支架的孔径大小依次为278.33±38.94μm、261.67±41.54μm、254.41±46.82μm和247.82±31.15μm。
适当孔径大小的支架材料,对于其的血管化和细胞摄取营养物质非常重要。有研究表明,200~300μm的孔径大小适合于细胞血管化和生长,而更小或更大的孔径却不适合细胞的伸展。上述结果显示,本发明实施例1~4制备复合生物活性支架的孔径大小均符合所述对孔径的要求,明显优于单纯CSCI水凝胶的孔径大小。
实验例2:胶原蛋白复合生物活性支架的孔隙率测定。
以无水乙醇为溶剂,通过浸泡称重法测定CSCI水凝胶及实施例1~4制备CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架的孔隙率。
将实施例1~4制备的CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架冷冻干燥,置于无水乙醇中,4℃下放置48h,使其达到恒定重量。
复合生物活性支架的平均孔隙率=(Va/Ve)×100%。其中,复合生物活性支架吸收的无水乙醇体积Va=(W48-W0)/ρ;Ve为复合生物活性支架的体积;W48为浸泡48h时复合生物活性支架的质量;W0为复合生物活性支架的初始质量;ρ为无水乙醇密度。
图3为CSCI水凝胶及实施例1~4制备CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架的孔隙率统计分析图。相比于CSCI水凝胶,实施例1~4制备复合生物活性支架的孔隙率均达到90%以上。随着Ⅰ型鼠尾胶原蛋白含量的增加,复合生物活性支架的孔隙结构更为丰富且致密,体现了复合生物活性支架内部的稳定和均一,同时也利于黏附细胞的物质交换及携带物质的释放、迁移。
实验例3:胶原蛋白复合生物活性支架的力学性能测定。
将CSCI水凝胶和实施例1~4制备的CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架分别制备成直径2cm、高3cm的圆柱体,置于万能实验仪下,圆柱形探头置于圆柱体表面,并以0.5mm/min的速度下降,测定圆柱体破裂时的压力,定义为凝胶强度,以Kpa表示。
图4为所测试凝胶强度的统计分析图。相比于CSCI水凝胶10.48±1.47Kpa的凝胶强度值,实施例1~4复合生物活性支架的凝胶强度分别达到了34.48±1.47Kpa、33.19±1.38Kpa、32.31±0.85Kpa和30.28±0.18Kpa。
正常心脏心肌在舒张期阶段的平均硬度为30Kpa,而MI发生后,梗死区域抗压能力减弱,以实施例1~4复合生物活性支架进行梗死区域心肌注射后,可以明显延缓心梗后期由于心室壁变薄造成的急性心脏破裂。相较于CSCI水凝胶,实施例1~4复合生物活性支架的凝胶强度更适合于心肌移植。
实验例4:胶原蛋白复合生物活性支架的平衡溶胀度测定。
将实施例1~4制备的CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架冷冻干燥,依次记录质量,浸泡于37℃PBS溶液(pH=7.35)中进行溶胀,期间每隔30min取出复合生物活性支架,以滤纸吸干表面水分,称重记录,直至达到最大溶胀。
复合生物活性支架的平衡溶胀度=(Wi-Wf)/Wf。其中,Wi为达到最大溶胀时复合生物活性支架的重量,Wf为复合生物活性支架的干重。
从图5的平衡溶胀度统计数据可以看出,实施例1~4复合生物活性支架的平衡溶胀度都比CSCI水凝胶略小,说明复合生物活性支架的孔隙结构更为稳定致密,对细胞的迁移作用也更低,更有利于复合生物活性支架的体外移植,注射到在体梗死心肌后,不会因溶胀度过大而影响心肌细胞的微环境。
实验例5:胶原蛋白复合生物活性支架的体外降解率测定。
将实施例1~4制备的CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架在37℃PBS溶液中充分溶胀达到平衡后,更换新鲜的PBS溶液,置于37℃恒温水浴锅中。每隔一天记录复合生物活性支架的质量,并更换新鲜的PBS溶液。
复合生物活性支架的体外降解率=(Wi/W0)×100%。其中,Wi为降解过程中复合生物活性支架的质量,W0为复合生物活性支架的初始质量。
根据图6的体外降解率统计分析图,与CSCI水凝胶比较,实施例1~4复合生物活性支架的降解性能更优。前7天,复合生物活性支架的未交联部分快速降解,利于在体携带细胞因子、基因、中药成分等的快速原位释放,同时,由于心梗前期、尤其是前7天内不良炎症反应发展迅速,亟需CSCI在抗炎方面的作用发挥;之后7天,降解速度减慢,更有利于体内、外细胞在复合生物活性支架内的黏附,复合生物活性支架携带的药物成分也得以在梗死区域长时生效。
应用例:胶原蛋白复合生物活性支架用于心肌梗死小鼠模型治疗。
以实施例1制备的CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架作为凝胶组药物。
将冻存的Sca-1+干细胞复苏后,重悬于PBS缓冲液中,调整细胞密度为107/mL得到Sca-1+细胞悬液。冰浴下,取1mL上述Sca-1+细胞悬液,均匀混合于9mL实施例1制备的CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合生物活性支架,制备得到负载Sca-1+干细胞的复合生物活性支架,作为药物组药物。
以PBS缓冲液作为对照组药物。
选取8周雄性C57BL/6J小鼠,异氟烷呼吸麻醉,仰卧固定,酒精消毒小鼠切口部位皮毛。沿腋窝与胸骨下端连线,在其心脏部位第3、4肋间隙位置做1.5cm切口,以5-0丝线打一荷包松结后,钝性分离胸前壁肌肉组织,于第4肋间隙轻轻挤压,将心脏置于胸腔外,用6-0号丝线结扎冠状动脉左主降支,见心尖变灰白后,心肌梗死模型建立成功。
将造模成功小鼠随机分为对照组、凝胶组和药物组,分别注射相应治疗组药物。注射总剂量20μL,分3点注射于小鼠模型梗死区域及后壁区域,然后快速心脏复位,闭合肋间隙及胸壁肌肉及皮肤组织,将5-0丝线打好的松荷包关紧,心肌局部注射手术完成。
术后第1、7、14、28天,依次检测超声心动图,评估不同治疗组药物对心梗小鼠心脏的功能调节。随后各个时间点处死小鼠,固定并制作心脏石蜡切片,分别进行Masson染色用于评估心脏结构改变,HE染色用于评估炎性指标,CD31染色用于评估梗死区域微血管密度。
1)胶原蛋白复合生物活性支架对心梗小鼠的心脏功能调节。
缺血前及心梗后第1、7、14、28天,依次进行超声心动图检测,检测结果如图7。
从图中可以看出,MI后28天时,药物组小鼠左心室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)分别为58±1.9%和29±1.2%,凝胶组小鼠LVEF和LVFS分别为53±3.1%和24±2.2%,显著高于对照组的26±1.7%和17±1.5%(* P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001,图7B、C)。药物组和凝胶组小鼠左室舒张末期内径(LVID,d)分别为4.2±0.71%和5.0±0.88%,显著低于对照组的6.2±0.39%(* P<0.05,图7D)。
另外,超声心动图也显示出凝胶组和药物组心梗模型小鼠的心功能明显改善,心脏功能指标在28天内倾向于向正常心脏基线偏移(图7A)。
2)胶原蛋白复合生物活性支架原位移植对心脏结构的改变。
心梗后第1、7、14、28天,分别处死小鼠,固定并制作心脏石蜡切片,进行Masson染色和HE染色,试验结果如图8、图9所示。
Masson染色结果显示:MI后28天时,药物组和凝胶组心肌梗死面积分别为32.1±2.19%和36.8±1.67%,较对照组(55.8±1.46%)均明显减小(* P<0.05,图8B);药物组和凝胶组梗死区域室壁厚度分别为1.42±0.027%和1.29±0.056%,较对照组(0.72±0.061%)也显著增加(** P<0.01,图8C),证明凝胶组和药物组能明显阻止梗死瘢痕的扩展与室壁变薄。
图9的HE染色结果显示,与对照组比较,药物组和凝胶组心脏石蜡切片在各个时间点出现细胞肥大、细胞间质增加及炎性细胞浸润等的变化均明显减轻(* P<0.05)。
3)胶原蛋白复合生物活性支架对小鼠心梗区域微血管密度的影响。
心梗后第1、7、14、28天,分别处死小鼠,收集心脏标本,以CD31抗体进行免疫荧光染色,标记新生血管内皮。
研究结果表明,药物组和凝胶组治疗后可以显著改善心梗区缺血状况,促进毛细血管增生(图10A);MI后28天,药物组和凝胶组微血管密度高达40.3±0.25/10×视野、37.5±0.41/10×视野,显著高于对照组的25.1±0.65/×10视野(* P<0.05,** P<0.01,图10B)。
Claims (10)
1.一种胶原蛋白复合生物活性支架的制备方法,其特征是:
1)、冰浴下,将Ⅰ型鼠尾胶原蛋白固状物溶于醋酸溶液中,加入DME/F12培养基和NaOH溶液混合,制备得到Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液;
2)、分别将CSCI和β-甘油磷酸钠溶于DME/F12培养基中,混合制备温敏性CSCI溶液;
3)、冰浴下,将Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液与温敏性CSCI溶液混合,37℃细胞培养箱中固定成胶,制备得到所述具有温敏性的胶原蛋白复合生物活性支架。
2.根据权利要求1所述的胶原蛋白复合生物活性支架的制备方法,其特征是按照Ⅰ型鼠尾胶原蛋白与温敏性CSCI的质量比为1∶6~9,将所述Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液与温敏性CSCI溶液混合。
3.根据权利要求1所述的胶原蛋白复合生物活性支架的制备方法,其特征是所述温敏性CSCI溶液的制备中,CSCI与β-甘油磷酸钠的质量比为1∶5~6。
4.根据权利要求1或3所述的胶原蛋白复合生物活性支架的制备方法,其特征是将所述CSCI与β-甘油磷酸钠分别制备成质量分数为2%和45%的DME/F12培养基溶液,混合制备温敏性CSCI溶液。
5.根据权利要求1或2所述的胶原蛋白复合生物活性支架的制备方法,其特征是所述温敏性CSCI溶液和Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液的pH值均为7.35~7.45。
6.以权利要求1~5任一制备方法制备得到的胶原蛋白复合生物活性支架,所述胶原蛋白复合生物活性支架是以CSCI和Ⅰ型鼠尾胶原蛋白为靶点,结合β-甘油磷酸钠得到的温敏性CSCI-Ⅰ型鼠尾胶原蛋白复合水凝胶,常温下为流动性强的液态,37℃凝胶化形成水凝胶。
7.权利要求6所述胶原蛋白复合生物活性支架作为用于治疗心肌梗死类缺血性心脏病的组织工程化心肌的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征是将所述胶原蛋白复合生物活性支架以体外注射的方法注入心肌梗死心肌的缺血区域。
9.根据权利要求7所述的应用,其特征是使用所述胶原蛋白复合生物活性支架包被携带具有心肌梗死治疗作用的药物。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征是所述包被携带的具有心肌梗死治疗作用的药物是干细胞、生长因子、基因、小RNA、中药中的一种或几种的组合。
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