CN107540744A - 重组胶原蛋白及其温敏水凝胶 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了胶原蛋白及其温敏水凝胶。本发明还提供了该温敏水凝胶的制备方法，包括将壳聚糖、胶原蛋白、碳二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺、β‑甘油磷酸钠和碳酸氢钠溶液，37℃下静置。
Description
技术领域
本发明属于多肽技术和生物医学材料领域，具体而言，本发明涉及重组胶原蛋白及其温敏水凝胶。
背景技术
温敏水凝胶是能够感受外界环境温度的变化从而转变成凝胶的智能材料。利用其在低温时是流动液体，达到一定温度即转化为凝胶的性质，通过调整相变温度与体温接近，即可得到用于人体可注射温敏水凝胶。这样的水凝胶在低温时容易与药物或细胞混合，成胶后又具有一定机械强度，近年来在药物缓释、组织修复方面有广泛的应用前景。
现有技术对此也有研究，例如，中国专利申请CN103656749A公开了一种复合型可降解的抗菌人工硬脑膜及其制备方法，其中包含万古霉素或盐酸氧氟沙星注射液，壳聚糖及甘油磷酸钠，然而该专利中没有涉及胶原蛋白，也没有研究胶原蛋白在其中的影响。
中国专利申请CN104971352A公开了一种眼用壳聚糖载药温敏水凝胶及其制备方法，其中需要聚乙烯醇，而且机械强度很弱。
中国专利申请CN101297980A公开了含纳米羟基磷灰石/胶原微粒的骨修复材料及其制备方法，其中含纳米羟基磷灰石/胶原微粒、壳聚糖和甘油磷酸钠，其通过加入羟基磷灰石来增强机械强度。
在现有技术无法预期的情况下，本发明人基于对温敏转变的理解和对机械强度影响因素的研究，开发了一种温敏水凝胶，其中使用的重组胶原蛋白分子量确定，无免疫原性，生物相容性好。另外，本发明人利用创新工艺将重组胶原蛋白、壳聚糖和甘油磷酸钠反应，无需米羟基磷灰石等，即产生了机械强度特别适合关节滑膜修复的温敏水凝胶。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供新的重组胶原蛋白和新的温敏水凝胶。另外，本发明还提供它们的制备方法和应用等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了重组人源胶原蛋白，其氨基酸序列
a)如序列表中的SEQ ID NO：1所示；或
b)是对序列表中的SEQ ID NO：1所示的序列添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。
在第二方面，本发明提供了核酸分子，其编码本发明第一方面的重组人源胶原蛋白。
在第三方面，本发明提供了载体，其含有本发明第二方面的核酸分子。载体优选是表达载体，更优选是酵母表达载体。
在第四方面，本发明提供了宿主细胞，其含有本发明第二方面的核酸分子。宿主细胞可以通过转染或转导本发明第三方面的载体来制备。宿主细胞优选是酵母细胞。
在第五方面，本发明提供了制备本发明第一方面的重组人源胶原蛋白的方法，其包括，用本发明第四方面的宿主细胞表达本发明第一方面的重组人源胶原蛋白，然后分离纯化所述重组人源胶原蛋白。
在第六方面，本发明提供了温敏水凝胶，其由如下方法制备：
(1)将壳聚糖溶解于酸性溶液中，透析后冷冻干燥，获得冷冻干燥产物；
(2)将冷冻干燥产物与重组胶原蛋白混合溶解于水中，得到水溶液；
(3)向水溶液中加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺反应，透析后冷冻干燥，获得反应产物；和，
(4)反应产物加水溶解后加入含β-甘油磷酸钠和碳酸氢钠的溶液，于37℃静置。
其中，重组人源胶原蛋白优选是本发明第一方面的重组人源胶原蛋白。
优选在本发明第六方面的温敏水凝胶中，在步骤(1)中，
酸性溶液是乙酸水溶液，优选其中乙酸含量为0.05-0.2M；
壳聚糖溶解于酸性溶液中所得溶液的壳聚糖含量为2-4％(w/w)；或，
透析时间为3-7天。
优选在本发明第六方面的温敏水凝胶中，在步骤(2)中，
水溶液中壳聚糖含量为1-2％(w/w)；
水溶液中重组胶原蛋白含量为2-4％(w/w)；或，
水是去离子水。
优选在本发明第六方面的温敏水凝胶中，在步骤(3)中，
碳二亚胺的终浓度为5-30mM；
N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为15-90mM；
碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:3；
反应的时间为1-6小时；
反应的温度为室温；或，
透析时间为3-7天。
优选在本发明第六方面的温敏水凝胶中，在步骤(4)中，
反应产物加水溶解后为2～5％(W/W)，优选为2～4％(W/W)；
反应产物、β-甘油磷酸钠和碳酸氢钠的重量比例为20～40：50～150：3～11；或，
静置的时间为2～10分钟。
在第七方面，本发明提供了本发明第六方面的温敏水凝胶的制备方法。优选地，本发明第七方面的制备方法包括如下步骤：
(1)将壳聚糖溶解于酸性溶液中，透析后冷冻干燥，获得冷冻干燥产物；
(2)将冷冻干燥产物与重组胶原蛋白混合溶解于水中，得到水溶液；
(3)向水溶液中加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺反应，透析后冷冻干燥，获得反应产物；和，
(4)反应产物加水溶解后加入含β-甘油磷酸钠和碳酸氢钠的溶液，于37℃静置。
更优选地，本发明第七方面的制备方法也优选本发明第六方面的各个优选的方面。
在第八方面，本发明提供了本发明第六方面的温敏水凝胶在制备医用修复材料中的应用。
优选在本发明第八方面的应用中，医用修复材料是关节滑膜修复材料。
本发明的有益效果在于：本发明采用重组人源胶原蛋白，与传统动物源胶原蛋白相比，其不存在潜在动物源疾病、异体排斥等问题，且易降解，无细胞毒性；本发明的温敏水凝胶所用材料与人体软骨接近，特别适合作为关节滑膜修复的材料；本发明具有适宜的微孔结构，能为细胞生长提供有利环境，从而作为血管或神经修复的支架。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
具体实施方式
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》(第三版)等实验手册中所列方法来实施；其中的试剂均可通过商业渠道获得。
实施例1本发明的重组胶原蛋白的制备
根据本发明人研究设计的重组胶原蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)，委托上海生工生物工程股份有限公司合成其编码基因并克隆入pPIC9K载体，电转化入Pichiapastoris酵母表达菌株GS115。将检测阳性的转化子经BMGY培养基培养24小时后，以10％(V/V)的量接种于发酵培养基(配方：甘油40g、K2SO4 18.2g、H3PO4 26.7ml、CaSO4.2H2O0.93g、MgSO4 14.9g、KOH 4.13g，用水定容至1L)以29℃培养，控制溶氧为22～25％，培养4小时后，加入甲醇至终浓度0.5％(V/V)来诱导表达，于29℃继续振荡培养72小时，期间每隔24小时补加100％甲醇以保持甲醇的终浓度为0.5％(V/V)。发酵液取上清液电泳，经归一法计算，本发明的重组胶原蛋白的表达量为13g/L。
发酵液过滤去除菌体和固体杂质，用中空纤维超滤膜浓缩脱盐，然后将浓缩液上样于用pH为5.0的10mM柠檬酸缓冲液平衡的CM Sepharose FF层析柱，用含0.5M NaCl的pH值为5.0的10mM柠檬酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，再，用中空纤维超滤膜浓缩脱盐，冷冻干燥浓缩液，即得本发明的重组胶原蛋白。
实施例2本发明的温敏水凝胶的制备1
将壳聚糖(北京百灵威科技有限公司，分子量分布100-300kDa)溶于0.1M乙酸溶液中，配制成质量浓度2％的溶液，加入透析袋透析3天后冷冻干燥。将冷冻干燥的壳聚糖和重组胶原蛋白混合溶解于去离子水中，其中壳聚糖和胶原蛋白的质量浓度分别为1.5％和2.5％，然后加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)至终浓度分别为5μM和15μM，混合均匀后于室温静置1小时，于室温透析后冷冻干燥。冷冻干燥的反应物用去离子水溶解，配制成质量浓度2％的溶液，然后向每毫升溶液加入100微升含50％(W/W)β-甘油磷酸钠和0.4M碳酸氢钠的溶液，于37℃静置5分钟，即得本发明的温敏水凝胶1。
实施例3本发明的温敏水凝胶的制备2
将壳聚糖(北京百灵威科技有限公司，分子量分布100-300kDa)溶于0.15M乙酸溶液中，配制成质量浓度3％的溶液，加入透析袋透析5天后冷冻干燥。将冷冻干燥的壳聚糖和重组胶原蛋白混合溶解于去离子水中，其中壳聚糖和胶原蛋白的质量浓度分别为2％和3％，然后加入EDC和NHS至终浓度分别为10μM和30μM，混合均匀后于室温静置2小时，于室温透析后冷冻干燥。冷冻干燥的反应物用去离子水溶解，配制成质量浓度3％的溶液，然后向每毫升溶液加入100微升含50％(W/W)β-甘油磷酸钠和0.4M碳酸氢钠的溶液，于37℃静置5分钟，即得本发明的温敏水凝胶2。
实施例4本发明的温敏水凝胶的制备3
将壳聚糖(北京百灵威科技有限公司，分子量分布100-300kDa)溶于0.1M乙酸溶液中，配制成质量浓度4％的溶液，加入透析袋透析5天后冷冻干燥。将冷冻干燥的壳聚糖和重组胶原蛋白混合溶解于去离子水中，其中壳聚糖和胶原蛋白的质量浓度分别为1％和2％，然后加入EDC和NHS至终浓度分别为15μM和45μM，混合均匀后于室温静置4小时，于室温透析后冷冻干燥。冷冻干燥的反应物用去离子水溶解，配制成质量浓度4％的溶液，然后向每毫升溶液加入100微升含50％(W/W)β-甘油磷酸钠和0.4M碳酸氢钠的溶液，于37℃静置5分钟，即得本发明的温敏水凝胶2。
实施例5本发明的温敏水凝胶的鉴定
经过流变仪分别测试本发明的温敏水凝胶1、2和3，其相变温度分别为37℃、35℃和32℃，在人体温37℃下分别206秒、180秒和90秒即可成胶，37℃下成胶的机械强度分别为4.64kPa、10.18kPa和14.4kPa，特别适合关节滑膜修复。
序列表
<110> 南京艾澜德生物科技有限公司
<120> 重组胶原蛋白及其温敏水凝胶
<130> CN
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 755
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly
1 5 10 15
Gln Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Asn
20 25 30
Glu Gly Gln Pro Gly Gln Pro Gly Gln Asn Gly Gln Pro Gly Glu Pro
35 40 45
Gly Ser Asn Gly Pro Gln Gly Ser Gln Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly
50 55 60
Gln Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Ser
65 70 75 80
Pro Gly Gln Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Glu Gln Gly Lys Pro
85 90 95
Gly Asn Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly Ser Pro Gly
100 105 110
Asn Gln Gly Gln Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Gln
115 120 125
Pro Gly Asn Glu Gly Gln Pro Gly Gln Pro Gly Gln Asn Gly Gln Pro
130 135 140
Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly Pro Gln Gly Ser Gln Gly Asn Pro Gly
145 150 155 160
Lys Asn Gly Gln Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro Gly Asn
165 170 175
Gln Gly Ser Pro Gly Gln Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Glu Gln
180 185 190
Gly Lys Pro Gly Asn Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly
195 200 205
Ser Pro Gly Asn Gln Gly Gln Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly Asn
210 215 220
Pro Gly Gln Pro Gly Asn Glu Gly Gln Pro Gly Gln Pro Gly Gln Asn
225 230 235 240
Gly Gln Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly Pro Gln Gly Ser Gln Gly
245 250 255
Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gln Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gln Gly Ser
260 265 270
Pro Gly Asn Gln Gly Ser Pro Gly Gln Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro
275 280 285
Gly Glu Gln Gly Lys Pro Gly Asn Gln Gly Pro Ala Gly Glu Pro Gly
290 295 300
Asn Pro Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Gln Pro Gly Asn Lys Gly Ser
305 310 315 320
Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Asn Glu Gly Gln Pro Gly Gln Pro
325 330 335
Gly Gln Asn Gly Gln Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly Pro Gln Gly
340 345 350
Ser Gln Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gln Pro Gly Ser Pro Gly Ser
355 360 365
Gln Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Ser Pro Gly Gln Pro Gly Asn Pro
370 375 380
Gly Gln Pro Gly Glu Gln Gly Lys Pro Gly Asn Gln Gly Pro Ala Gly
385 390 395 400
Glu Pro Gly Asn Pro Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Gln Pro Gly Asn
405 410 415
Lys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Asn Glu Gly Gln Pro
420 425 430
Gly Gln Pro Gly Gln Asn Gly Gln Pro Gly Glu Pro Gly Ser Asn Gly
435 440 445
Pro Gln Gly Ser Gln Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gln Pro Gly Ser
450 455 460
Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Ser Pro Gly Gln Pro
465 470 475 480
Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Glu Gln Gly Lys Pro Gly Asn Gln Gly
485 490 495
Pro Ala Gly Glu Pro Gly Asn Pro Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Gln
500 505 510
Pro Gly Asn Lys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Asn Glu
515 520 525
Gly Gln Pro Gly Gln Pro Gly Gln Asn Gly Gln Pro Gly Glu Pro Gly
530 535 540
Ser Asn Gly Pro Gln Gly Ser Gln Gly Asn Pro Gly Lys Asn Gly Gln
545 550 555 560
Pro Gly Ser Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro Gly Asn Gln Gly Ser Pro
565 570 575
Gly Gln Pro Gly Asn Pro Gly Gln Pro Gly Glu Gln Gly Lys Pro Gly
580 585 590
Asn Gln Gly Pro Ala Gly Gly
595
Claims (10)
1.重组胶原蛋白，其氨基酸序列
a)如序列表中的SEQ ID NO：1所示；或
b)是对序列表中的SEQ ID NO：1所示的序列添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。
2.核酸分子，其编码权利要求1所述的重组胶原蛋白。
3.载体或宿主细胞，其含有权利要求2所述的核酸分子。
4.制备权利要求1所述的重组胶原蛋白的方法，其包括，用权利要求3所述的宿主细胞表达权利要求1所述的重组胶原蛋白，然后分离纯化所述重组胶原蛋白。
5.温敏水凝胶，其由如下方法制备：
(1)将壳聚糖溶解于酸性溶液中，透析后冷冻干燥，获得冷冻干燥产物；
(2)将冷冻干燥产物与重组胶原蛋白混合溶解于水中，得到水溶液；
(3)向水溶液中加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺反应，透析后冷冻干燥，获得反应产物；和，
(4)反应产物加水溶解后加入含β-甘油磷酸钠和碳酸氢钠的溶液，于37℃静置。
6.权利要求5所述的温敏水凝胶，其中在步骤(1)中，
酸性溶液是乙酸水溶液，优选其中乙酸含量为0.05-0.2M；
壳聚糖溶解于酸性溶液中所得溶液的壳聚糖含量为2-4％(w/w)；或，
透析时间为3-7天。
7.权利要求5所述的温敏水凝胶，其中在步骤(2)中，
水溶液中壳聚糖含量为1-2％(w/w)；
水溶液中重组胶原蛋白含量为2-4％(w/w)；或，
水是去离子水。
8.权利要求5所述的温敏水凝胶，其中在步骤(3)中，
碳二亚胺的终浓度为5-30mM；
N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为15-90mM；
碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:3；
反应的时间为1-6小时；
反应的温度为室温；或，
透析时间为3-7天。
9.权利要求5所述的温敏水凝胶，其中在步骤(4)中，
反应产物加水溶解后为2～5％(W/W)，优选为2～4％(W/W)；
反应产物、β-甘油磷酸钠和碳酸氢钠的重量比例为20～40：50～150：3～11；或，静置的时间为2～10分钟。
10.权利要求5～9之一所述的温敏水凝胶的制备方法及其在制备医用修复材料(优选如关节滑膜修复材料)中的应用。
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