CN102675473B - 基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，该融合蛋白全长762个氨基酸，氮端为Ⅰ型人胶原蛋白500-1099肽段共600个氨基酸，碳端为人碱性成纤维细胞因子共154个氨基酸，两个肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸以及一个含6个氨基酸的柔性肽段连接。制备方法包括：基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体的构建、毕赤酵母电转化、多拷贝插入重组子的筛选、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的发酵、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的纯化步骤。基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白用于制备化妆品。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因重组融合蛋白，特别是碱性成纤维细胞生长因子与胶原蛋白融合蛋白。
背景技术
碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF），是成纤维生长因子家族中的一员，最初是从牛脑垂体中提取得到的，因其能促进成纤维细胞增殖，且等电点为9.6，故将其称之为碱性成纤维细胞生长因子。碱性成纤维细胞生长因子由155个氨基酸组成，分子量约为18kD，对热不稳定，易被蛋白酶降解，它广泛存在于来源于中胚层及神经外胚层的细胞及多种肿瘤细胞中，是一种能促进中胚层及神经外胚层细胞增殖的多肽生长因子。在生物进化上，碱性成纤维细胞生长因子具有很强的保守性，人和牛的碱性成纤维细胞生长因子只有两个氨基酸不同，其氨基酸同源性高达98.7%。
碱性成纤维细胞生长因子的活性半衰期只有几个小时，在体内作用的发挥，需持续长时间与靶细胞上的高亲和力受体结合。成纤维细胞生长因子受体是一类具有自主性磷酸化活性的跨膜糖基化受体，碱性成纤维细胞生长因子与之结合后激活受体细胞内酪氨酸激酶活性区，从而引起一系列信号传递。碱性成纤维细胞生长因子发挥作用还离不开低亲和力受体，即硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的辅助，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖具有促进碱性成纤维细胞生长因子与成纤维细胞生长因子受体结合、增强碱性成纤维细胞生长因子稳定性、调节碱性成纤维细胞生长因子活性等生物学作用。
碱性成纤维细胞生长因子是一种具有广泛生物活性的生长因子，实验证实，碱性成纤维细胞生长因子能有效促进新生血管的形成如毛细血管基底膜降解、内皮细胞迁移增生和胶原的合成等；能通过趋化作用和促细胞迁移作用引导巨噬细胞、间充质细胞、内皮细胞、成纤维细胞等向创伤部位聚集，启动创伤愈合过程，从而促进软组织损伤的修复；能促进软骨细胞产生硫酸软骨蛋白聚糖、Ⅱ型胶原，使其维持分化形态，从而促进骨组织损伤的修复；也能促进神经轴突生长，延长神经细胞的存活期，营养神经，从而修复神经组织损伤；还能促进肢体再生。体内实验证明，碱性成纤维细胞生长因子对去神经支配的两栖动物类肢体再生胚基有促进作用。近些年来，重组碱性成纤维细胞生长因子还被广泛应用于临床治疗创伤、溃疡及神经系统等疾病，但表达量普遍低下而使其生产成本相对较高。
胶原蛋白（collagen）是体内含量最多的一种蛋白质，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用。另外，胶原蛋白具有良好的细胞粘附性，与细胞结合对细胞迁移、胶原分解代谢以及血小板凝聚具有一定的作用。鉴于胶原蛋白固有的生物兼容性、生物降解性和吸收性以及促细胞形成等诸多功能，在生物医用材料、组织工程、化妆品等领域具有广泛的应用价值。碱性成纤维细胞生长因子作为一种临床上治疗各种创伤、烧烫伤、溃疡等的有效药物，与胶原蛋白结合制成的新型生物活性材料，具有快速止血、加速创面愈合和促进组织修复等功能，其在重度渗血创面的止血愈合、妇科宫颈糜烂的治疗及牙周组织再生等临床试验中取得显著效果。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种用途广、使用效果好的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白。
本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种快速、简便的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的制备方法。
本发明还要解决的还有一个技术问题在于为基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白提供一种新用途。
解决上述技术问题采用的技术方案是：该融合蛋白全长762个氨基酸，氮端为Ⅰ型人胶原蛋白500-1099肽段共600个氨基酸，碳端为人碱性成纤维细胞因子共154个氨基酸，两个肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸以及一个含6个氨基酸的柔性肽段连接，该融合蛋白氨基酸序列如下：
1 GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA
61 GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ
121 GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVPGDLGA PGPSGARGER
181 GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP
241 GPKGDRGDAG PKGADGSPGK DGVRGLTGPI GPPGPAGAPG DKGESGPSGP AGPTGARGAP
301 GDRGEPGPPG PAGFAGPPGA DGQPGAKGEP GDAGAKGDAG PPGPAGPAGP PGPIGNVGAP
361 GAKGARGSAG PPGATGFPGA AGRVGPPGPS GNAGPPGPPG PAGKEGGKGP RGETGPAGRP
421 GEVGPPGPPG PAGEKGSPGA DGPAGAPGTP GPQGIAGQRG VVGLPGQRGE RGFPGLPGPS
481 GEPGKQGPSG ASGERGPPGP MGPPGLAGPP GESGREGAPG AEGSPGRDGS PGAKGDRGET
541 GPAGPPGAPG APGAPGPVGP AGKSGDRGET GPAGPAGPVG PVGARGPAGP QGPRGDKGET
601 EFGGSGGSAA GSITTLPALP EDGGSGAFPP GHFKDPKRLY CKNGGFFLRI HPDGRVDGVR
661 EKSDPHIKLQ LQAEERGVVS IKGVCANRYL AMKEDGRLLA SKCVTDECFF FERLESNNYN
721 TYRSRKYTSW YVALKRTGQY KLGSKTGPGQ KAILFLPMSA KS
本发明的柔性肽段的氨基酸序列为Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser。
上述基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的制备方法包括下述步骤：
1、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体的构建
1.1基因的获得
从离体的人胎盘组织中提取总RNA，反转录获得cDNA，根据Ⅰ型人胶原蛋白及碱性成纤维细胞生长因子基因序列，设计PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ、Not Ⅰ和信号肽切割位点AAACGAGAAGCT，碱性成纤维细胞生长因子上游添加柔性肽序列GGAGGAAGCGGAGGAAGC。
Ⅰ型人胶原蛋白(COL600)的引物序列为：
F:CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCA
R:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的引物序列为：
F:GCGAATTCGGAGGAAGCGGAGGAAGCGCAGCCGGGAGCATC
R:ATGCGGCCGCTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAA
采用PCR方法扩增获得Ⅰ型人胶原蛋白和碱性成纤维细胞生长因子基因。
1.2载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白和碱性成纤维细胞生长因子的连接
对pPIC9K及Ⅰ型人胶原蛋白进行Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-COL600；对pPIC9K-COL600质粒与碱性成纤维细胞生长因子分别进行EcoR Ⅰ及Not Ⅰ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-COL600-6P-bFGF；该重组DNA序列如下：pPIC9K载体购置于Invitrogen公司。该重组DNA序列如下：
1 CTCGAGAAAC GAGAAGCTGG TGTTGCTGGT CCCAAGGGTC CCGCTGGTGA ACGTGGTTCT
61 CCTGGCCCTG CTGGCCCCAA AGGATCTCCT GGTGAAGCTG GTCGTCCCGG TGAAGCTGGT
121 CTGCCTGGTG CCAAGGGTCT GACTGGAAGC CCTGGCAGCC CTGGTCCTGA TGGCAAAACT
181 GGCCCCCCTG GTCCCGCCGG TCAAGATGGT CGCCCCGGAC CCCCAGGCCC ACCTGGTGCC
241 CGTGGTCAGG CTGGTGTGAT GGGATTCCCT GGACCTAAAG GTGCTGCTGG AGAGCCCGGC
301 AAGGCTGGAG AGCGAGGTGT TCCCGGACCC CCTGGCGCTG TCGGTCCTGC TGGCAAAGAT
361 GGAGAGGCTG GAGCTCAGGG ACCCCCTGGC CCTGCTGGTC CCGCTGGCGA GAGAGGTGAA
421 CAAGGCCCTG CTGGCTCCCC CGGATTCCAG GGTCTCCCTG GTCCTGCTGG TCCTCCAGGT
481 GAAGCAGGCA AACCTGGTGA ACAGGGTGTT CCTGGAGACC TTGGCGCCCC TGGCCCCTCT
541 GGAGCAAGAG GCGAGAGAGG TTTCCCTGGC GAGCGTGGTG TGCAAGGTCC CCCTGGTCCT
601 GCTGGTCCCC GAGGGGCCAA CGGTGCTCCC GGCAACGATG GTGCTAAGGG TGATGCTGGT
661 GCCCCTGGAG CTCCCGGTAG CCAGGGCGCC CCTGGCCTTC AGGGAATGCC TGGTGAACGT
721 GGTGCAGCTG GTCTTCCAGG GCCTAAGGGT GACAGAGGTG ATGCTGGTCC CAAAGGTGCT
781 GATGGCTCTC CTGGCAAAGA TGGCGTCCGT GGTCTGACTG GCCCCATTGG TCCTCCTGGC
841 CCTGCTGGTG CCCCTGGTGA CAAGGGTGAA AGTGGTCCCA GCGGCCCTGC TGGTCCCACT
901 GGAGCTCGTG GTGCCCCCGG AGACCGTGGT GAGCCTGGTC CCCCCGGCCC TGCTGGCTTT
961 GCTGGCCCCC CTGGTGCTGA CGGCCAACCT GGTGCTAAAG GCGAACCTGG TGATGCTGGT
1021GCTAAAGGCG ATGCTGGTCC CCCTGGCCCT GCCGGACCCG CTGGACCCCC TGGCCCCATT
1081GGTAATGTTG GTGCTCCTGG AGCCAAAGGT GCTCGCGGCA GCGCTGGTCC CCCTGGTGCT
1141ACTGGTTTCC CTGGTGCTGC TGGCCGAGTC GGTCCTCCTG GCCCCTCTGG AAATGCTGGA
1201CCCCCTGGCC CTCCTGGTCC TGCTGGCAAA GAAGGCGGCA AAGGTCCCCG TGGTGAGACT
1261GGCCCTGCTG GACGTCCTGG TGAAGTTGGT CCCCCTGGTC CCCCTGGCCC TGCTGGCGAG
1321AAAGGATCCC CTGGTGCTGA TGGTCCTGCT GGTGCTCCTG GTACTCCCGG GCCTCAAGGT
1381ATTGCTGGAC AGCGTGGTGT GGTCGGCCTG CCTGGTCAGA GAGGAGAGAG AGGCTTCCCT
1441GGTCTTCCTG GCCCCTCTGG TGAACCTGGC AAACAAGGTC CCTCTGGAGC AAGTGGTGAA
1501CGTGGTCCCC CTGGTCCCAT GGGCCCCCCT GGATTGGCTG GACCCCCTGG TGAATCTGGA
1561CGTGAGGGGG CTCCTGGTGC CGAAGGTTCC CCTGGACGAG ACGGTTCTCC TGGCGCCAAG
1621GGTGACCGTG GTGAGACCGG CCCCGCTGGA CCCCCTGGTG CTCCTGGTGC TCCTGGTGCC
1681CCTGGCCCCG TTGGCCCTGC TGGCAAGAGT GGTGATCGTG GTGAGACTGG TCCTGCTGGT
1741CCCGCCGGTC CTGTCGGCCC TGTTGGCGCC CGTGGCCCCG CCGGACCCCA AGGCCCCCGT
1801GGTGACAAGG GTGAGACAGA ATTCGGAGGA AGCGGAGGAA GCGCAGCCGG GAGCATCACC
1861ACGCTGCCCG CCTTGCCCGA GGATGGCGGC AGCGGCGCCT TCCCGCCCGG CCACTTCAAG
1921GACCCCAAGC GGCTGTACTG CAAAAACGGG GGCTTCTTCC TGCGCATCCA CCCCGACGGC
1981CGAGTTGACG GGGTCCGGGA GAAGAGCGAC CCTCACATCA AGCTACAACT TCAAGCAGAA
2041GAGAGAGGAG TTGTGTCTAT CAAAGGAGTG TGTGCTAACC GTTACCTGGC TATGAAGGAA
2101GATGGAAGAT TACTGGCTTC TAAATGTGTT ACGGATGAGT GTTTCTTTTT TGAACGATTG
2161GAATCTAATA ACTACAATAC TTACCGGTCA AGGAAATACA CCAGTTGGTA TGTGGCACTG
2221AAACGAACTG GGCAGTATAA ACTTGGATCC AAAACAGGAC CTGGGCAGAA AGCTATACTT
2281TTTCTTCCAA TGTCTGCTAA GAGCTGAGCGGCC GC
2、毕赤酵母电转化
将10μg经Sal Ⅰ内切酶线性化的pPIC9K-COL600-6P-bFGF质粒，与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，其它毕赤酵母感受态细胞也可使用，如SMD1168、KM71，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30℃倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落。毕赤酵母GS115购买于西安依科西安依科生物技术有限公司。
3、多拷贝插入重组子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，G418购买于西安依科生物技术有限公司，30℃培养，筛选获得转化子。
4、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的发酵
将筛选到的转化子接种于400ml BMGY培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，温度设定为30℃，pH值为5.0，培养16～20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度29℃，pH值为5.5，溶氧控制在20%～30%，流加入质量浓度为75%的含12mL/L PTM1微量元素的甲醇水溶液，FBS培养基与质量浓度为75%的含12mL/L PTM1微量元素的甲醇水溶液的体积比为1:0.25，诱导发酵36～42小时；
5、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的纯化
发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液用截留分子量为100KD中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，再用截留分子量为20KD的中空纤维超滤系统进行超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，制备成基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白。
6、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的检测
将纯化前、纯化后的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法进行检测。
基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备化妆品中的用途。
基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备化妆品中使用，所制备的100g化妆品由下述质量配比的原料按化妆品水剂常规方法制成：
基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备化妆品中使用，所制备的100g化妆品由下述最佳质量配比的原料按化妆品水剂常规方法制成：
采用本发明方法所制备的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，检测其生物活性，表明基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白与碱性成纤维细胞生长因子标品具有相似的促细胞增殖的活性；经皮肤致敏性试验，表明基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白无致敏性。
附图说明
图1是实施例1中重组表达载体pPIC9K-COL600-6P-bFGF的质粒图谱。
图2是实施例1中Ⅰ型人胶原蛋白与碱性成纤维细胞生长因子基因的PCR产物电泳图。
图3是实施例1中pPIC9K-COL600-6P-bFGF质粒双酶切鉴定电泳图。
图4是实施例1中基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图5是实施例1中基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的MTT细胞增殖活性图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本实施例的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的全长762个氨基酸，氮端为Ⅰ型人胶原蛋白500-1099肽段共600个氨基酸，碳端为人碱性成纤维细胞因子共154个氨基酸，两个肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸以及一个含6个氨基酸的柔性肽段连接，该融合蛋白氨基酸序列如下：
1 GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA
61 GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ
121GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVPGDLGA PGPSGARGER
181GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP
241GPKGDRGDAG PKGADGSPGK DGVRGLTGPI GPPGPAGAPG DKGESGPSGP AGPTGARGAP
301GDRGEPGPPG PAGFAGPPGA DGQPGAKGEP GDAGAKGDAG PPGPAGPAGP PGPIGNVGAP
361GAKGARGSAG PPGATGFPGA AGRVGPPGPS GNAGPPGPPG PAGKEGGKGP RGETGPAGRP
421GEVGPPGPPG PAGEKGSPGA DGPAGAPGTP GPQGIAGQRG VVGLPGQRGE RGFPGLPGPS
481GEPGKQGPSG ASGERGPPGP MGPPGLAGPP GESGREGAPG AEGSPGRDGS PGAKGDRGET
541GPAGPPGAPG APGAPGPVGP AGKSGDRGET GPAGPAGPVG PVGARGPAGP QGPRGDKGET
601EFGGSGGSAA GSITTLPALP EDGGSGAFPP GHFKDPKRLY CKNGGFFLRI HPDGRVDGVR
661EKSDPHIKLQ LQAEERGVVS IKGVCANRYL AMKEDGRLLA SKCVTDECFF FERLESNNYN
721TYRSRKYTSW YVALKRTGQY KLGSKTGPGQ KAILFLPMSA KS
上述的柔性肽段的氨基酸序列为Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser。
上述基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的制备方法包括下述步骤：
1、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体的构建构建载体的质粒图谱见图1，基因序列如下：
1 CTCGAGAAAC GAGAAGCTGG TGTTGCTGGT CCCAAGGGTC CCGCTGGTGA ACGTGGTTCT
61 CCTGGCCCTG CTGGCCCCAA AGGATCTCCT GGTGAAGCTG GTCGTCCCGG TGAAGCTGGT
121CTGCCTGGTG CCAAGGGTCT GACTGGAAGC CCTGGCAGCC CTGGTCCTGA TGGCAAAACT
181GGCCCCCCTG GTCCCGCCGG TCAAGATGGT CGCCCCGGAC CCCCAGGCCC ACCTGGTGCC
241CGTGGTCAGG CTGGTGTGAT GGGATTCCCT GGACCTAAAG GTGCTGCTGG AGAGCCCGGC
301AAGGCTGGAG AGCGAGGTGT TCCCGGACCC CCTGGCGCTG TCGGTCCTGC TGGCAAAGAT
361GGAGAGGCTG GAGCTCAGGG ACCCCCTGGC CCTGCTGGTC CCGCTGGCGA GAGAGGTGAA
421 CAAGGCCCTG CTGGCTCCCC CGGATTCCAG GGTCTCCCTG GTCCTGCTGG TCCTCCAGGT
481 GAAGCAGGCA AACCTGGTGA ACAGGGTGTT CCTGGAGACC TTGGCGCCCC TGGCCCCTCT
541 GGAGCAAGAG GCGAGAGAGG TTTCCCTGGC GAGCGTGGTG TGCAAGGTCC CCCTGGTCCT
601 GCTGGTCCCC GAGGGGCCAA CGGTGCTCCC GGCAACGATG GTGCTAAGGG TGATGCTGGT
661 GCCCCTGGAG CTCCCGGTAG CCAGGGCGCC CCTGGCCTTC AGGGAATGCC TGGTGAACGT
721 GGTGCAGCTG GTCTTCCAGG GCCTAAGGGT GACAGAGGTG ATGCTGGTCC CAAAGGTGCT
781 GATGGCTCTC CTGGCAAAGA TGGCGTCCGT GGTCTGACTG GCCCCATTGG TCCTCCTGGC
841 CCTGCTGGTG CCCCTGGTGA CAAGGGTGAA AGTGGTCCCA GCGGCCCTGC TGGTCCCACT
901 GGAGCTCGTG GTGCCCCCGG AGACCGTGGT GAGCCTGGTC CCCCCGGCCC TGCTGGCTTT
961 GCTGGCCCCC CTGGTGCTGA CGGCCAACCT GGTGCTAAAG GCGAACCTGG TGATGCTGGT
1021GCTAAAGGCG ATGCTGGTCC CCCTGGCCCT GCCGGACCCG CTGGACCCCC TGGCCCCATT
1081GGTAATGTTG GTGCTCCTGG AGCCAAAGGT GCTCGCGGCA GCGCTGGTCC CCCTGGTGCT
1141ACTGGTTTCC CTGGTGCTGC TGGCCGAGTC GGTCCTCCTG GCCCCTCTGG AAATGCTGGA
1201CCCCCTGGCC CTCCTGGTCC TGCTGGCAAA GAAGGCGGCA AAGGTCCCCG TGGTGAGACT
1261GGCCCTGCTG GACGTCCTGG TGAAGTTGGT CCCCCTGGTC CCCCTGGCCC TGCTGGCGAG
1321AAAGGATCCC CTGGTGCTGA TGGTCCTGCT GGTGCTCCTG GTACTCCCGG GCCTCAAGGT
1381ATTGCTGGAC AGCGTGGTGT GGTCGGCCTG CCTGGTCAGA GAGGAGAGAG AGGCTTCCCT
1441GGTCTTCCTG GCCCCTCTGG TGAACCTGGC AAACAAGGTC CCTCTGGAGC AAGTGGTGAA
1501CGTGGTCCCC CTGGTCCCAT GGGCCCCCCT GGATTGGCTG GACCCCCTGG TGAATCTGGA
1561CGTGAGGGGG CTCCTGGTGC CGAAGGTTCC CCTGGACGAG ACGGTTCTCC TGGCGCCAAG
1621GGTGACCGTG GTGAGACCGG CCCCGCTGGA CCCCCTGGTG CTCCTGGTGC TCCTGGTGCC
1681CCTGGCCCCG TTGGCCCTGC TGGCAAGAGT GGTGATCGTG GTGAGACTGG TCCTGCTGGT
1741CCCGCCGGTC CTGTCGGCCC TGTTGGCGCC CGTGGCCCCG CCGGACCCCA AGGCCCCCGT
1801GGTGACAAGG GTGAGACAGA ATTCGGAGGA AGCGGAGGAA GCGCAGCCGG GAGCATCACC
1861ACGCTGCCCG CCTTGCCCGA GGATGGCGGC AGCGGCGCCT TCCCGCCCGG CCACTTCAAG
1921GACCCCAAGC GGCTGTACTG CAAAAACGGG GGCTTCTTCC TGCGCATCCA CCCCGACGGC
1981CGAGTTGACG GGGTCCGGGA GAAGAGCGAC CCTCACATCA AGCTACAACT TCAAGCAGAA
2041GAGAGAGGAG TTGTGTCTAT CAAAGGAGTG TGTGCTAACC GTTACCTGGC TATGAAGGAA
2101GATGGAAGAT TACTGGCTTC TAAATGTGTT ACGGATGAGT GTTTCTTTTT TGAACGATTG
2161GAATCTAATA ACTACAATAC TTACCGGTCA AGGAAATACA CCAGTTGGTA TGTGGCACTG
2221AAACGAACTG GGCAGTATAA ACTTGGATCC AAAACAGGAC CTGGGCAGAA AGCTATACTT
2281TTTCTTCCAA TGTCTGCTAA GAGCTGAGCGGCC GC
1.1基因的获得
从离体的人胎盘组织中提取总RNA，采用GeneCopoeia First-Strand cDNA synthesis Kit试剂盒按说明书的使用方法进行反转录，获得cDNA，GeneCopoeia First-Strand cDNA synthesisKit试剂盒由西安依科生物技术有限公司销售。根据Ⅰ型人胶原蛋白及碱性成纤维细胞生长因子基因序列，设计PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ、Not Ⅰ和信号肽切割位点AAACGAGAAGCT，碱性成纤维细胞生长因子上游添加柔性肽序列GGAGGAAGCGGAGGAAGC。
Ⅰ型人胶原蛋白(COL600)的引物序列为：
F:CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCA
R:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的引物序列为：
F:GCGAATTCGGAGGAAGCGGAGGAAGCGCAGCCGGGAGCATC
R:ATGCGGCCGCTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAA
25μL反应体系中含有：13.3μL灭菌的双蒸水、2.5μL10×PCR buffer，3.5μL 2m mol/LdNTP Mix，2.5μL MgCl2，1μL10μmol/L Primer F，1μL10μmol/L Primer R，0.2μL 0.5U/μLTaq酶，1μL cDNA模板。反应条件为：95℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃60s，30个循环，72℃10min，4℃10min，利用PCR仪进行扩增。
Ⅰ型人胶原蛋白和碱性成纤维细胞生长因子的PCR扩增结果见图2。
1.2载体pPIC9K和Ⅰ型人胶原蛋白的双酶切
对pPIC9K和Ⅰ型人胶原蛋白PCR产物利用XhoⅠ和EcoRⅠ内切酶进行双酶切。双酶切体系如下：
上述试剂加好后，混匀，37℃水浴消化2小时，用DNA纯化试剂盒，按产品说明书，从质量百分浓度为1.5%琼脂糖凝胶上回收特异性条带。
1.3载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白的连接
利用T4DNA连接酶对pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白进行连接，反应体系如下：
上述连接体系充分混匀后，于16℃连接12小时。
1.4连接产物的转化
取冷冻的DH5α感受态细胞一管100μL，放于冰上解冻，加入上述连接产物，手指轻弹使其混合，在冰中放置30分钟，42℃水浴热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2～3分钟，加入800μL无抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃温育50分钟，吸取100-200μL菌液，涂于含有卡那霉素（50μg/mL）的固体LB平板上，将固体LB平板倒置于37℃培养箱中，培养12～18小时，挑选单菌落接种于含有卡那霉素（50μg/mL）的液体LB培养基中，摇床37℃过夜培养，用质粒提取试剂盒操作说明提取质粒，质粒命名为pPIC9K-COL600。
1.5pPIC9K-COL600和碱性成纤维细胞生长因子双酶切
对上述提取的pPIC9K-COL600质粒及碱性成纤维细胞生长因子PCR产物利用EcoR Ⅰ和NotⅠ进行双酶切，pPIC9K购置于Invitrogen公司。双酶切体系如下：
上述试剂加好后，混匀，37℃水浴消化2小时，用DNA纯化试剂盒，按产品说明书，从质量百分浓度为1.5%琼脂糖凝胶上回收特异性条带。
1.6pPIC9K-COL600与碱性成纤维细胞生长因子的连接
用T4DNA连接酶对上述回收的pPIC9K-COL600与碱性成纤维细胞生长因子酶切产物进行连接，反应体系如下：
上述连接体系充分混匀后，于16℃连接12小时。
1.7连接产物的转化
转化参考上述1.4的方法，提取质粒命名为pPIC9K-COL600-6P-bFGF。
1.8pPIC9K-COL600-6P-bFGF的酶切鉴定
根据pPIC9K-COL600-6P-bFGF重组质粒的酶切位点分析，对筛选出的重组菌落经小量提取质粒DNA后，选用Xho Ⅰ与Not Ⅰ、EcoR Ⅰ与Not Ⅰ两组酶切体系进行酶切鉴定，酶切体系如下：
以上两个酶切体系在37℃水浴中反应2小时后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，其结果见图3,从图3中可看出经XhoⅠ与Not Ⅰ双酶切，可切出2200bp的条带，EcoR Ⅰ与Not Ⅰ双酶切，可切出500bp的条带，与预期目标一致。
2、毕赤酵母电转化
首先对pPIC9K-COL600-6P-bFGF质粒进行Sal Ⅰ线性化，反应体系如下：
上述试剂加好后，混匀，37℃水浴反应5小时，终止反应前先取出5μL在质量百分浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全。之后，用DNA纯化试剂盒对线性化质粒进行回收。
取10μg上述Sal Ⅰ内切酶线性化的pPIC9K-COL600-6P-bFGF质粒，与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω；电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30℃倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落。
3、多拷贝插入重组子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30℃培养，筛选获得高拷贝转化子。
4、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的发酵
将筛选到的转化子接种于400ml BMGY培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS（1L中含甘油40g、K2SO4 18.2g、H3PO4 26.7ml、CaSO4.2H2O 0.93g、MgSO4 14.9g、KOH4.13g混合制成）培养基的5L发酵罐中，温度设定为30℃，pH值为5.0，培养16～20小时，作为二级种子转接入装有80L FBS培养基的150L大罐发酵。发酵过程中，生长温度30℃，诱导温度29℃，pH值为5.5，溶氧控制在20%～30%，当溶氧陡然上升时，预示基础盐培养基中的甘油已耗尽，开始流加18.15mL/h/L质量百分浓度为50%的甘油，在质量百分浓度为50％甘油中含12mL/L微量元素PTM1（1L中含CuSO4.5H2O 6g、NaI 0.08g、MnSO4.H2O 3g、Na2MoO4.H2O 0.2g、H3BO30.02g、H2SO45ml、CoCl2.6H2O 0.5g、ZnCl220g、FeSO4.7H2O 75g、生物素0.2g，混合制成），维持溶氧在20%～30%。发酵液的湿菌重达到300mg/mL时，停止补料，饥饿1小时，甘油耗尽，流加20L质量百分浓度为75%甲醇诱导发酵，在质量百分浓度为75%甲醇中含12mL/L PTM1微量元素，以速率为7.5ml/L/h流加2～3小时，然后提高速率至10.9ml/L/h流加进行发酵。通过调节转速、罐压和通气量使溶氧大于20%，诱导发酵36～42小时。
5、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的纯化
发酵液的固液分离：发酵结束后，发酵液经离心进行固液分离，取上清液80L。
两级截留超滤法：对上述发酵上清液用截留分子量为100KD中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，再用分子量为20KD的中空纤维超滤系统进行超滤，超滤过程中需不断加三倍于上清液体积的去离子水，最终浓缩至5L，收集浓缩液，冷冻干燥，通过上述两步超滤法即可去除毕赤酵母发酵产生的大量黄绿色物质，同时可达到去除一些杂蛋白和脱盐的目的，由于毕赤酵母发酵产生的杂蛋白较少，通过上述两步超滤法即可获得纯度为80%的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，发酵液上清表达量达1.1g/L。
6、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的检测
将纯化前、纯化后的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法进行检测，检测方法如下：
（1）将40μL蛋白质样品与10μL 5×上样缓冲液混合，放入水浴锅100℃加热5分钟。
（2）将玻璃板和样品梳用洗涤剂洗净，用二次蒸馏水冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干。将两块洗净的玻璃板夹好放入制胶模具中。
（3）按如下体积配制12％分离胶10.0ml，混匀；
向玻璃板间灌制约5.5mL分离胶，立即覆一层二次蒸馏水，30分钟后胶即可聚合。
（4）按如下体积配制5％浓缩胶3.0mL，混匀；
将分离胶上层二次蒸馏水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳，30分钟后胶即可聚合。
（5）装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样50μL/每孔；稳压80V，待溴酚蓝进入浓缩胶，提高电压至120V，待溴酚蓝接近分离胶底部时，停止电泳。
（6）卸下胶板，剥离胶片，将胶片放入染色液中，室温染色2小时；弃去染色液，加入脱色液，置于80rpm脱色摇床上,每20分钟更换一次脱色液，至蛋白条带清晰可见。
（7）使用凝胶成像仪进行图像捕捉和分析，电泳结果见图4，在70KD处出现特异性条带，与基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白预期结果一致，纯化后的电泳条带经灰度值扫描分析，纯度达80%。
采用上述方法制备的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，用于制备化妆品。
基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备化妆品中使用，以制备化妆品100g为例，该化妆品由下述质量百分配比的原料制成：
上述化妆品的制备方法按常规水剂化妆品的制备方法制备。
实施例2
基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备化妆品中使用，以制备化妆品100g为例，该化妆品由下述质量配比的原料制成：
上述化妆品的制备方法按常规化妆品的制备方法制备。
实施例3
基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备化妆品中使用，以制备化妆品100g为例，该化妆品由下述质量配比的原料制成：
上述化妆品的制备方法按常规化妆品水剂的制备方法制备。
为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1制备的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白进行了大量的实验室研究试验，各种实验情况如下：
1、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的活性测定
所制备的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白使用MTT法检测其生物活性，检测方法如下：
取96孔细胞培养板，每孔中加入0.1mL含1×103～1.5×103长至对数期的3T3小鼠成纤维细胞的培养液（含10%小牛血清的PRMI1640培养液），放置于37℃、5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱，24小时后，换以含0.4%小牛血清的PRMI 1640培养液。24小时后，加入不同稀释度的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白和碱性成纤维细胞生长因子标准品，培养72小时后，加入噻唑蓝（MTT，5mg/ml，pH7.4PBS液溶解）25μL/孔培养5小时后加入60μL/孔二甲基亚砜和60μL/孔乙醇的裂解液，15分钟后在酶标仪上570nm波长处测光吸收值。
实验结果见图5，结果显示，基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白与碱性成纤维细胞生长因子标品具有相似的促细胞增殖的活性。
2、皮肤过敏性试验
试样：质量分数为0.1％基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白水溶液。
阳性对照：质量分数为0.1%的甲醛水溶液。
阴性对照：生理盐水。
实验动物：自色豚鼠30只，雌雄各半，体重260～300g，试验前24小时用电动剃须刀将动物脊柱两侧去毛，每侧的去毛面积为3×3cm2。
（1）试验方法
动物分组：将豚鼠按性别、体重随机分成3组．每组l0只。第一组为试验组，第二组为阳性对照组，第三组为阴性对照组。
致敏接触：取1平方厘米纱布块，在试样中侵泡5分钟，作为斑贴物，将其半封闭固定在动物背侧去毛区，持续六小时，去掉斑贴物，观察记录各组动物激发部位的皮肤有无红斑及水肿等现象，每天一次，连续六天，按标准进行评分，并算出致敏率。
结果判断与评价：试验结果以动物皮肤反应强度和致敏阳性率表示。皮肤反应强度评分按下列两种标准进行。
(1)红斑形成很淡的红斑(勉强可见)为1分；轻度边界清晰的红斑为2分；中度红斑(鲜红一深红)为3分；重度红斑(深红一紫红，且有焦痂形成)为4分。
(2)形成很轻微的水肿(几乎观察不到)为1分；轻度水肿(边缘明显高出皮面)为2分；中度水肿(肿胀高出皮面约lmm)为3分；重度水肿(肿胀高出皮面lmm以上，范围超过斑贴区)为4分。
总积分等于红斑分与水肿分之和，并依此确定动物有无过敏反应。致敏阳性率是阳性动物数与合计动物数比值的百分率，根据此百分率对化学物质致敏强度进行分级。
致敏强度分级见表1。
表1致敏强度分级
| 致敏率（%） | 等级 | 致敏强度 |
| 0-8 | Ⅰ | 弱致敏性 |
| 9-28 | Ⅱ | 轻致敏性 |
| 28-64 | Ⅲ | 中致敏性 |
| 64-80 | Ⅳ | 强致敏性 |
| 81-100 | Ⅴ | 极强致敏性 |
试验结果见表2。
表2致敏性试验结果表
注：1/3=1分/3只，即得1分者有3只
从表2可以看出，试验组未出现1例致敏反应的动物，说明所试验的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白无致敏性。
Claims (6)
1.一种基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白全长762个氨基酸，氮端为Ⅰ型人胶原蛋白500-1099肽段共600个氨基酸，碳端为人碱性成纤维细胞生长因子共154个氨基酸，两个肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸以及一个含6个氨基酸的柔性肽段连接，该融合蛋白氨基酸序列如下：
1 GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA
61 GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ
121 GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVPGDLGA PGPSGARGER
181 GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP
241 GPKGDRGDAG PKGADGSPGK DGVRGLTGPI GPPGPAGAPG DKGESGPSGP AGPTGARGAP
301 GDRGEPGPPG PAGFAGPPGA DGQPGAKGEP GDAGAKGDAG PPGPAGPAGP PGPIGNVGAP
361 GAKGARGSAG PPGATGFPGA AGRVGPPGPS GNAGPPGPPG PAGKEGGKGP RGETGPAGRP
421 GEVGPPGPPG PAGEKGSPGA DGPAGAPGTP GPQGIAGQRG VVGLPGQRGE RGFPGLPGPS
481 GEPGKQGPSG ASGERGPPGP MGPPGLAGPP GESGREGAPG AEGSPGRDGS PGAKGDRGET
541 GPAGPPGAPG APGAPGPVGP AGKSGDRGET GPAGPAGPVG PVGARGPAGP QGPRGDKGET
601 EFGGSGGSAA GSITTLPALP EDGGSGAFPP GHFKDPKRLY CKNGGFFLRI HPDGRVDGVR
661 EKSDPHIKLQ LQAEERGVVS IKGVCANRYL AMKEDGRLLA SKCVTDECFF FERLESNNYN
721 TYRSRKYTSW YVALKRTGQY KLGSKTGPGQ KAILFLPMSA KS。
2.根据权利要求1所述的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其特征在于：所述的柔性肽段的氨基酸序列为Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser。
3.一种权利要求1基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的制备方法，其特征在于它包括下述步骤：
（1）基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体的构建
1.1基因的获得
从离体的新生儿胎盘组织中提取总RNA，反转录获得cDNA，根据Ⅰ型人胶原蛋白及碱性成纤维细胞生长因子基因序列，设计PCR扩增引物，引入限制性酶切位点XhoⅠ、EcoR Ⅰ、Not Ⅰ和信号肽切割位点AAACGAGAAGCT，碱性成纤维细胞生长因子上游添加柔性肽序列GGAGGAAGCGGAGGAAGC；
Ⅰ型人胶原蛋白的引物序列为：
F:CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCA
R:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG
碱性成纤维细胞生长因子的引物序列为：
F:GCGAATTCGGAGGAAGCGGAGGAAGCGCAGCCGGGAGCATC
R:ATGCGGCCGCTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAA
采用PCR方法扩增获得Ⅰ型人胶原蛋白和碱性成纤维细胞生长因子基因；
1.2载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白及碱性成纤维细胞生长因子的连接
对pPIC9K及Ⅰ型人胶原蛋白进行XhoⅠ和EcoR Ⅰ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-COL600；对pPIC9K-COL600质粒与碱性成纤维细胞生长因子分别进行EcoR Ⅰ及Not Ⅰ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-COL600-6P-bFGF；该重组DNA序列如下：
1 CTCGAGAAAC GAGAAGCTGG TGTTGCTGGT CCCAAGGGTC CCGCTGGTGA ACGTGGTTCT
61 CCTGGCCCTG CTGGCCCCAA AGGATCTCCT GGTGAAGCTG GTCGTCCCGG TGAAGCTGGT
121 CTGCCTGGTG CCAAGGGTCT GACTGGAAGC CCTGGCAGCC CTGGTCCTGA TGGCAAAACT
181 GGCCCCCCTG GTCCCGCCGG TCAAGATGGT CGCCCCGGAC CCCCAGGCCC ACCTGGTGCC
241 CGTGGTCAGG CTGGTGTGAT GGGATTCCCT GGACCTAAAG GTGCTGCTGG AGAGCCCGGC
301 AAGGCTGGAG AGCGAGGTGT TCCCGGACCC CCTGGCGCTG TCGGTCCTGC TGGCAAAGAT
361 GGAGAGGCTG GAGCTCAGGG ACCCCCTGGC CCTGCTGGTC CCGCTGGCGA GAGAGGTGAA
421 CAAGGCCCTG CTGGCTCCCC CGGATTCCAG GGTCTCCCTG GTCCTGCTGG TCCTCCAGGT
481 GAAGCAGGCA AACCTGGTGA ACAGGGTGTT CCTGGAGACC TTGGCGCCCC TGGCCCCTCT
541 GGAGCAAGAG GCGAGAGAGG TTTCCCTGGC GAGCGTGGTG TGCAAGGTCC CCCTGGTCCT
601 GCTGGTCCCC GAGGGGCCAA CGGTGCTCCC GGCAACGATG GTGCTAAGGG TGATGCTGGT
661 GCCCCTGGAG CTCCCGGTAG CCAGGGCGCC CCTGGCCTTC AGGGAATGCC TGGTGAACGT
721 GGTGCAGCTG GTCTTCCAGG GCCTAAGGGT GACAGAGGTG ATGCTGGTCC CAAAGGTGCT
781 GATGGCTCTC CTGGCAAAGA TGGCGTCCGT GGTCTGACTG GCCCCATTGG TCCTCCTGGC
841 CCTGCTGGTG CCCCTGGTGA CAAGGGTGAA AGTGGTCCCA GCGGCCCTGC TGGTCCCACT
901 GGAGCTCGTG GTGCCCCCGG AGACCGTGGT GAGCCTGGTC CCCCCGGCCC TGCTGGCTTT
961 GCTGGCCCCC CTGGTGCTGA CGGCCAACCT GGTGCTAAAG GCGAACCTGG TGATGCTGGT
1021 GCTAAAGGCG ATGCTGGTCC CCCTGGCCCT GCCGGACCCG CTGGACCCCC TGGCCCCATT
1081 GGTAATGTTG GTGCTCCTGG AGCCAAAGGT GCTCGCGGCA GCGCTGGTCC CCCTGGTGCT
1141 ACTGGTTTCC CTGGTGCTGC TGGCCGAGTC GGTCCTCCTG GCCCCTCTGG AAATGCTGGA
1201 CCCCCTGGCC CTCCTGGTCC TGCTGGCAAA GAAGGCGGCA AAGGTCCCCG TGGTGAGACT
1261 GGCCCTGCTG GACGTCCTGG TGAAGTTGGT CCCCCTGGTC CCCCTGGCCC TGCTGGCGAG
1321 AAAGGATCCC CTGGTGCTGA TGGTCCTGCT GGTGCTCCTG GTACTCCCGG GCCTCAAGGT
1381 ATTGCTGGAC AGCGTGGTGT GGTCGGCCTG CCTGGTCAGA GAGGAGAGAG AGGCTTCCCT
1441 GGTCTTCCTG GCCCCTCTGG TGAACCTGGC AAACAAGGTC CCTCTGGAGC AAGTGGTGAA
1501 CGTGGTCCCC CTGGTCCCAT GGGCCCCCCT GGATTGGCTG GACCCCCTGG TGAATCTGGA
1561 CGTGAGGGGG CTCCTGGTGC CGAAGGTTCC CCTGGACGAG ACGGTTCTCC TGGCGCCAAG
1621 GGTGACCGTG GTGAGACCGG CCCCGCTGGA CCCCCTGGTG CTCCTGGTGC TCCTGGTGCC
1681 CCTGGCCCCG TTGGCCCTGC TGGCAAGAGT GGTGATCGTG GTGAGACTGG TCCTGCTGGT
1741 CCCGCCGGTC CTGTCGGCCC TGTTGGCGCC CGTGGCCCCG CCGGACCCCA AGGCCCCCGT
1801 GGTGACAAGG GTGAGACAGA ATTCGGAGGA AGCGGAGGAA GCGCAGCCGG GAGCATCACC
1861 ACGCTGCCCG CCTTGCCCGA GGATGGCGGC AGCGGCGCCT TCCCGCCCGG CCACTTCAAG
1921 GACCCCAAGC GGCTGTACTG CAAAAACGGG GGCTTCTTCC TGCGCATCCA CCCCGACGGC
1981 CGAGTTGACG GGGTCCGGGA GAAGAGCGAC CCTCACATCA AGCTACAACT TCAAGCAGAA
2041 GAGAGAGGAG TTGTGTCTAT CAAAGGAGTG TGTGCTAACC GTTACCTGGC TATGAAGGAA
2101 GATGGAAGAT TACTGGCTTC TAAATGTGTT ACGGATGAGT GTTTCTTTTT TGAACGATTG
2161 GAATCTAATA ACTACAATAC TTACCGGTCA AGGAAATACA CCAGTTGGTA TGTGGCACTG
2221 AAACGAACTG GGCAGTATAA ACTTGGATCC AAAACAGGAC CTGGGCAGAA AGCTATACTT
2281 TTTCTTCCAA TGTCTGCTAA GAGCTGAGCGGCC GC
（2）毕赤酵母电转化
将10μg经Sal Ⅰ内切酶线性化的pPIC9K-COL600-6P-bFGF质粒，与80μL毕赤酵母感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30℃倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落；
（3）多拷贝插入重组子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30℃培养，筛选获得转化子；
（4）基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的发酵
将筛选到的转化子接种于400mL BMGY培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，温度设定为30℃，pH值为5.0，培养16～20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度29℃，pH值为5.5，溶氧控制在20%～30%，流加入质量浓度为75%的含12mL/L PTM1微量元素的甲醇水溶液，FBS培养基与质量浓度为75%的含12mL/L PTM1微量元素的甲醇水溶液的体积比为1:0.25，诱导发酵36～42小时；
（5）基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的纯化
发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液用截留分子量为100kD中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，再用截留分子量为20kD的中空纤维超滤系统进行超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，制备成基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白。
4.权利要求1的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备化妆品中的用途。
5.根据权利要求4所述的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备化妆品中的用途，其特征在于所制备的100g化妆品由下述质量配比的原料按化妆品水剂的常规方法制成：
6.按照权利要求5所述的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备化妆品中的用途，其特征在于所制备的100g化妆品由下述质量配比的原料按化妆品水剂的常规方法制成：
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