CN102020716B - 基因重组人胶原蛋白融合肽段及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种基因重组人胶原蛋白融合肽段，它的全长为839个氨基酸，其氮端为III型人胶原蛋白908-1137位肽段共229个氨基酸，碳端为I型人胶原蛋白497-1104位肽段共608个氨基酸，两肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸链接。其制备方法由克隆I型即COL1和III型即COL3人胶原蛋白基因的cDNA、毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-COL3a1-COL1a1的构建、基因重组人胶原蛋白融合肽段毕赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3a1-COL1a1的构建、制备基因重组人胶原蛋白融合肽段步骤组成。采用本发明方法制备的基因重组人胶原蛋白融合肽段，经试验，可作为制备化妆品的材料。

Description

基因重组人胶原蛋白融合肽段及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到基因重组人胶原蛋白融合肽段。

背景技术

胶原蛋白(collagen)是广泛分布于动物结缔组织的一组蛋白质家族，也是体内含量最多的一种蛋白质，约占蛋白质总量的25-33％，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用。胶原蛋白作为天然的生物资源，具有合成高分子材料无法比拟的生物相容性和生物可降解性，可广泛应用在医药、化妆品等工业中，它能保持血管壁弹性、防止栓塞、提高软骨以及韧带的润滑、减轻关节僵硬等，其在治疗真皮损伤或缺陷、美容整形、改善睡眠、增强机体免疫力等方面的作用已获得共识，同时它们含有大量极性基团，和甘氨酸等天然保湿因子，且有阻止皮肤中的酪氨酸转化为黑色素的作用，故胶原蛋白有纯天然保湿、美白、防皱、祛斑等作用。另外，胶原蛋白也在食品、保健品和饲料添加剂等行业得到应用。

胶原蛋白最普遍的结构特征是三螺旋结构，由3条α肽链组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型，3条左手螺旋链相互缠绕成右手螺旋结构，形成胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构相对稳定。一级结构分析表明，其多肽链主要由“Gly-x-y”氨基酸序列重复而成。其中甘氨酸占总氨基酸的27％，X通常是Pro(脯氨酸)，Y通常是不由DNA碱基密码子编码的羟基脯氨酸(Hyp)，它是在蛋白质一级结构序列形成之后由特定的酶-脯氨酸-4-羟化酶(prolyl-4-hydroxylase，P4H)作用于序列中的Pro形成的，Hyp羟基通过分子间氢键对稳定胶原螺旋结构起着非常重要的作用。

胶原蛋白是一个庞大的家族，种类繁多，现已至少发现了30余种胶原蛋白链的编码基因，可以形成16种以上的胶原蛋白分子，根据它们在体内的分布和功能特点，目前将胶原分成间质胶原、基底膜胶原和细胞外周胶原。间质型胶原蛋白分子占整个机体胶原的绝大部分，包括I、II、III型胶原蛋白分子，主要分布于皮肤、肌腱等组织，其中II型胶原蛋白由软骨细胞产生。

胶原作为医用生物材料和化妆品原料，最重要的特点在于其低免疫原性。胶原有三种类型的抗原分子，第一类是胶原肽链非螺旋的端肽，第二类是胶原的三股螺旋的构象，第三类是α-链螺旋区的氨基酸顺序。其中第二类抗原因子仅存在于天然胶原分子中，第三类只出现在变性胶原中，而第一类抗原因子在天然和变性胶原中均存在。

生物相容性是指胶原与宿主细胞及组织之间良好的相互作用。无论是在被吸收前作为新组织的骨架，还是被吸收同化进入宿主成为宿主的一部分，都与细胞周围的基质有着良好的相互作用，表现出相互影响的协调性，并成为细胞与组织正常生理功能整体的一部分。

胶原能被特定的蛋白酶降解，即生物降解性。因胶原具有紧密牢固的螺旋结构，所以绝大多数蛋白酶只能切断其侧链，只有特定的蛋白酶在特定的条件下才能降解胶原蛋白，胶原肽键才会断裂。胶原的肽键一旦断裂，其螺旋结构随即被破坏，断裂的胶原多肽就被蛋白酶彻底水解。

生产胶原蛋白传统的也是目前最主要的方法是利用酸、碱法处理动物来源的

组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼等)，从中提取胶原蛋白，另外还有酶解法提取胶原蛋白，这些方法具有较高的回收率，但是这些方法制取的胶原蛋白均为长度不等的混合胶原蛋白肽段，各肽段水溶性不一、难以分离到单独的肽段纯品，同时由于均为异源性胶原蛋白，在临床上表现出排异反应，使其作为生物医学材料或药物载体等方面的应用受到了很大限制。随着现代生物技术的发展，利用转基因技术和基因重组技术，可以在动物、植物和微生物表达体系获得重组人胶原蛋白，解决了传统提取方法存在的病毒隐患等缺点，同时也改善了胶原蛋白的亲水性、免疫排异性等。国内外一些研究机构及生物公司相继投入研发开发重组胶原蛋白，如利用转基因的方法，培育含类人胶原蛋白的小白鼠、通过转基因微量注射得到含重组类人胶原奶汁的哺乳动物，但通过哺乳类或昆虫细胞株生产的成本极高、生产周期长。我国西北大学的范代娣等采用PCR扩增得到数段人胶原蛋白基因片段，接着进行拼接重复，转化大肠杆菌，并通过高密度发酵培养生产人源性胶原蛋白，得到高表达的重组胶原蛋白。2004年，东京农业科技大学的Yao J等对胶原蛋白细胞附着作用和自身交联螺旋相关序列作了研究，设计了长度为240个氨基酸的类胶原蛋白，并在大肠杆菌中得到了表达。但是细菌表达产生的致热原致使表达产物难以应用于临床，目的蛋白常以包涵体形式表达，致使产物纯化困难，另外原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低等缺点也制约其发展。

近年来，利用毕赤酵母真核表达系统大规模生产重组蛋白越来越受到科研工作者的青睐，它与传统的大肠杆菌表达体系相比具有经下优点：(1)表达产率高，由于表达载体利用醇氧化酶基因启动子很强，细胞生长速度快，所以该表达系统表达的外源蛋白产量很高，其表达量比其它系统高10倍甚至100倍，这在表达量方面是一大突破。(2)产物具有天然结构和生物活性，无需变性和复性。(3)培养基采用无机盐，配制简单、价格低廉。(4)高稳定。由于该系统的表达载体不是以自方复制的质粒存在，而是整合在宿主菌的染色体上，所以构建的菌株十分稳定。姚菊明等，杨树林等利用这种高表达、高稳定、高分泌的真核表达系统表达重组类人胶原蛋白均获得高表达，但未见到其大规模生产的报道。

目前市场销售的胶原蛋白均是从动物皮肤、肌腱等组织用酸碱水解提取的胶原蛋白混合肽段，这些肽段的氨基酸序列与人体不完全相同，因此其生物安全性和生物相容性在医用材料研发方面受到限制。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题在于克服上述人源性胶原蛋白及其制备方法的缺点，提供一种与人胶原蛋白对应肽段氨基酸序列完全相同的基因重组人胶原蛋白融合肽段。

本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种快速、简便的基因重组人胶原蛋白融合肽段的制备方法。

本发明所要解决的还有一个技术问题在于为基因重组人胶原蛋白融合肽段提供一种新用途。

解决上述技术问题采用的技术方案是：基因重组人胶原蛋白融合肽段的全长为839个氨基酸，其氮端为III型人胶原蛋白908-1137位肽段共229个氨基酸，碳端为I型人胶原蛋白497-1104位肽段共608个氨基酸，两肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸链接；该基因重组人胶原蛋白融合肽段的氨基酸序列如下：

AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARG

LAGPPGMPGP RGSPGPQGVK GESGKPGANG LSGERGPPGP QGLPGLAGTA 100

GEPGRDGNPG SDGLPGRDGS PGGKGDRGEN GSPGAPGAPG HPGPPGPVGP

AGKSGDRGES GPAGPAGAPG PAGSRGAPGP QGPRGDKGET GERGAAGIKG 200

HRGFPGNPGA PGSPGPAGQQ GAIGSPGPAE FGADGVAGPK GPAGERGSPG

PAGPKGSPGE AGRPGEAGLP GAKGLTGSPG SPGPDGKTGP PGPAGQDGRP 300

GPPGPPGARG QAGVMGFPGP KGAAGEPGKA GERGVPGPPG AVGPAGKDGE

AGAQGPPGPA GPAGERGEQG PAGSPGFQGL PGPAGPPGEA GKPGEQGVPG 400

DLGAPGPSGA RGERGFPGER GVQGPPGPAG PRGANGAPGN DGAKGDAGAP

GAPGSQGAPG LQGMPGERGA AGLPGPKGDR GDAGPKGADG SPGKDGVRGL 500

TGPIGPPGPA GAPGDKGESG PSGPAGPTGA RGAPGDRGEP GPPGPAGFAG

PPGADGQPGA KGEPGDAGAK GDAGPPGPAG PAGPPGPIGN VGAPGAKGAR 600

GSAGPPGATG FPGAAGRVGP PGPSGNAGPP GPPGPAGKEG GKGPRGETGP

AGRPGEVGPP GPPGPAGEKG SPGADGPAGA PGTPGPQGIA GQRGVVGLPG 700

QRGERGFPGL PGPSGEPGKQ GPSGASGERG PPGPMGPPGL AGPPGESGRE

GAPGAEGSPG RDGSPGAKGD RGETGPAGPP GAPGAPGAPG PVGPAGKSGD 800

RGETGPAGPA GPVGPVGARG PAGPQGPRGD KGETGEQGD-            839

上述的基因重组人胶原蛋白融合肽段的制备方法由下述步骤组成：

1、克隆I型即COL1和III型即COL3人胶原蛋白基因的cDNA

从新鲜人胎盘组织中提取总RNA，以总RNA为模板，反转录得cDNA，设计COL1和COL3引物，COL1引物序列为：

F＝CTGGCGCAGATGGTGTTG

R＝CCACGGTGACCCTTTATGC

产物长度为1849bp；

COL3引物序列为：

F＝GAATCTGTGAATCATGCCCTAC

R＝GAAGTCATAATCTCATCGGTGTT

产物长度为3295bp；

以cDNA为模板，进行PCR扩增，提取特异性DNA扩增条带，得COL1和COL3；将COL1和COL3连接于pGM-T载体，转化感受态E.coli DH 5α，涂布平板，经蓝白斑筛选，挑选阳性pGMT-COL1和pGMT-COL3克隆，分别接种于LB培养基中，37℃振荡过夜培养，提取这两种质粒，为下一步做好准备。

2、毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-COL3a1-COL1a1的构建

引物设计：COL3a1上游引物设计两条，引入pPIC9K自身信号肽序列GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT，进行两次扩增，各引物序列如下：

COL1a1引物序列为：

F＝GCGAATTCGGCGCAGATGGTGTTGC，酶切位点EcoR I

R＝TGGAATTCTTAGTCGCCCTGTCGCCTG，酶切位点EcoR I

产物长度1843bp。

COL3a1引物序列为：

F1＝AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTG

F2＝TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT，酶切位点Xho I

R：TTGAATTCTGCAGGTCCTGG，酶切位点EcoR I

产物长度722bp。

pPIC9k-COL1鉴定引物序列为：

F＝GCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCA

R＝TCGCTCTCCAGCCTTGCCG

产物长度1155bp。

分别以pGMT-COL1和pGMT-COL3质粒为模板，进行PCR扩增，提取产物，得CO3a1和CO1a1，双酶切CO3a1和pPIC9K，以T4联接酶处理，得pPIC9K-CO3a1；单酶切CO1a1和pPIC9K-CO3a1，以T4联接酶处理，得pPIC9K-CO3a1-CO1a1；转化感受态E.coli DH 5α，涂布平板，经蓝白斑筛选，挑选阳性克隆，接种于LB培养基中，37℃振荡过夜培养，提取质粒，为下一步做好准备。

3、基因重组人胶原蛋白融合肽段毕赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3a1-COL1a1的构建

抽提pPIC9K-COL3a1-COL1a1质粒并线性化，制备毕赤酵母SMD1168感受态细胞，电击转化，以G418梯度法挑选高拷贝阳性克隆，得基因重组人胶原蛋白融合肽段毕赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3a1-COL1a1，其目标蛋白的基因序列如下：

1     CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTGCGGGT AACACTGGTG CTCCTGGCAG CCCTGGAGTG

61    TCTGGACCAA AAGGTGATGC TGGCCAACCA GGAGAGAAGG GATCGCCTGG TGCCCAGGGC

121   CCACCAGGAG CTCCAGGCCC ACTTGGGATT GCTGGGATCA CTGGAGCACG GGGTCTTGCA

181   GGACCACCAG GCATGCCAGG TCCTAGGGGA AGCCCTGGCC CTCAGGGTGT CAAGGGTGAA

241    AGTGGGAAAC CAGGAGCTAA CGGTCTCAGT GGAGAACGTG GTCCCCCTGG ACCCCAGGGT

301    CTTCCTGGTC TGGCTGGTAC AGCTGGTGAA CCTGGAAGAG ATGGAAACCC TGGATCAGAT

361    GGTCTTCCAG GCCGAGATGG ATCTCCTGGT GGCAAGGGTG ATCGTGGTGA AAATGGCTCT

421    CCTGGTGCCC CTGGCGCTCC TGGTCATCCA GGCCCACCTG GTCCTGTCGG TCCAGCTGGA

481    AAGAGTGGTG ACAGAGGAGA AAGTGGCCCT GCTGGCCCTG CTGGTGCTCC CGGTCCTGCT

541    GGTTCCCGAG GTGCTCCTGG TCCTCAAGGC CCACGTGGTG ACAAAGGTGA AACAGGTGAA

601    CGTGGAGCTG CTGGCATCAA AGGACATCGA GGATTCCCTG GTAATCCAGG TGCCCCAGGT

661    TCTCCAGGCC CTGCTGGTCA GCAGGGTGCA ATCGGCAGTC CAGGACCTGC AGAATTCGGC

721    GCAGATGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT

781    GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC

841    AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT

901    CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT

961    GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG

1021   CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA

1081   GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT

1141   GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA

1201   CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC

1261   GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA

1321   GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT

1381   CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT

1441   CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT

1501   GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC

1561   CCTGGTGACA AGGGTGAAAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT

1621   GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT

1681   GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT

1741   GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT

1801   GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT

1861   GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT

1921   CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA

1981   CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT

2041   GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG

2101   CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC

2161   CCCTCTGGTG AACCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT

2221   GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT

2281   CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT

2341   GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT

2401   GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT

2461   GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT

2521   GAGACAGGCG AACAGGGCGA CTAAGAATTC

4、制备基因重组人胶原蛋白融合肽段

(1)发酵

以步骤(3)构建的基因重组人胶原蛋白融合肽段毕赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3a1-COL1a1为原始菌种，涂布YPD平板获得单菌落，扩繁单菌落分装为甘油菌种保存；每次取甘油菌种，接种于5mL种子YPD培养基中，30℃振荡培养20～24小时，转接于400ml BMGY培养基中，30℃振荡培养至OD600达10～12，作为一级种子；将一级种子接入装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，30℃、pH值为5.0、DO 20％～30％，培养16-20小时，作为二级种子；将二级种子转接入装有30L FBS培养基的50L发酵罐中；生长培养18～20小时，30℃、pH值为5.0、DO 20％～30％，补加甘油至发酵液内的菌体湿重达到150mg，饥饿1-2小时；驯化培养9小时，每三小时为一个驯化时间段，30℃、pH值为5.0、DO 20％～30％，第一段每5分钟补加甲醇1mL，第二段每5分钟补加甲醇2mL，第三段每5分钟补加甲醇3mL；诱导培养72小时，30℃、pH值为5.0、DO 20％～30％，视DO值提高甲醇流加速率并维持补料速度在5-10.9ml/L/h进行发酵，至DO值浮动缩小至5％～8％，发酵结束。

(2)纯化

取发酵液离心除去酵母细胞，得发酵上清液；用截留量为20000的聚砜中空纤维超滤浓缩发酵上清液至原发酵上清液体积的20％，得超滤浓缩液；用凝胶过滤法脱除超滤浓缩液中的无机盐，得脱盐液；用DAEA阴离子交换柱处理脱盐液，以0.02mol/L NaCl水溶液为平衡液，样品溶液PH为8-9，洗脱液PH5-6，NaCl 0.5mol/L；分段收集洗脱液，电泳，色谱法检测纯度，得纯度为85％以上的溶液；用截留量为20000的聚砜中空纤维超滤浓缩至质量浓度为1％～5％。

(3)制备基因重组人胶原蛋白融合肽段

冷冻干燥，得基因重组人胶原蛋白融合肽段。

基因重组人胶原蛋白融合肽段在制备化妆品中的用途。其使用方法如下：

基因重组人胶原蛋白融合肽段在制备化妆品中的用途，所制备的化妆品由下述质量配比的原料制成：

所制备的化妆品由下述最佳质量配比的原料制成：

采用本发明方法所制备的基因重组人胶原蛋白融合肽段，与动物来源的胶原蛋白相比较，其生物相容性和生物安全性均佳。基因重组人胶原蛋白融合肽段经致敏性试验，所试验的基因重组人胶原蛋白融合肽段无致敏性。以基因重组人胶原蛋白融合肽段为原料制备的化妆品，在未开封的情况下存放于4度冰箱，半年内不变质，开封后每天取适量使用，一周内不变质，具有良好的保湿作用。基因重组人胶原蛋白融合肽段可作为美容化妆品使用，根据需要配制成不同浓度的化妆品。

附图说明

图1是实施例1col3和col1基因的PCR产物电泳图。

图2是实施例1重组质粒pGM-T-COL1和pGM-T-COL3的PCR鉴定结果。

图3是实施例1pGM-T-COL3的5’端部分测序图谱。

图4是实施例1pGM-T-COL1的3’端部分测序图谱。

图5是实施例1重组表达载体pPIC9K-COL3a1-COL1a1的构建策略路线图。

图6是实施例1COL1a1和COL3a1序列的PCR产物电泳结果图。

图7是实施例1pPIC9K-COL3a1-COL1a1质粒的PCR鉴定电泳图。

图8是实施例1pPIC9K-COL3a1-COL1a1质粒的酶切鉴定电泳图。

图9是实施例1pPIC9K-COL3a1-COL1a1重组质粒5’端测序结果图谱。

图10是实施例1pPIC9K-COL3a1-COL1a1重组质粒3’端测序结果图谱。

图11是实施例1SMD1168-COL3a1-COL1a1重组子的PCR鉴定电泳图。

图12是实施例1基因重组人蛋白质融合肽段的SDS-PAGE分析图。

图13是实施例1方法制备的基因重组人胶原蛋白融合肽段的电泳检测图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

基因重组人胶原蛋白融合肽段的全长为839个氨基酸，其氮端为III型人胶原蛋白908-1137位肽段共229个氨基酸，碳端为I型人胶原蛋白497-1104位肽段共608个氨基酸，两肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸链接；该基因重组人胶原蛋白融合肽段的氨基酸序列如下：

AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARG

LAGPPGMPGP RGSPGPQGVK GESGKPGANG LSGERGPPGP QGLPGLAGTA 100

GEPGRDGNPG SDGLPGRDGS PGGKGDRGEN GSPGAPGAPG HPGPPGPVGP

AGKSGDRGES GPAGPAGAPG PAGSRGAPGP QGPRGDKGET GERGAAGIKG 200

HRGFPGNPGA PGSPGPAGQQ GAIGSPGPAE FGADGVAGPK GPAGERGSPG

PAGPKGSPGE AGRPGEAGLP GAKGLTGSPG SPGPDGKTGP PGPAGQDGRP 300

GPPGPPGARG QAGVMGFPGP KGAAGEPGKA GERGVPGPPG AVGPAGKDGE 350

AGAQGPPGPA GPAGERGEQG PAGSPGFQGL PGPAGPPGEA GKPGEQGVPG 400

DLGAPGPSGA RGERGFPGER GVQGPPGPAG PRGANGAPGN DGAKGDAGAP

GAPGSQGAPG LQGMPGERGA AGLPGPKGDR GDAGPKGADG SPGKDGVRGL 500

TGPIGPPGPA GAPGDKGESG PSGPAGPTGA RGAPGDRGEP GPPGPAGFAG

PPGADGQPGA KGEPGDAGAK GDAGPPGPAG PAGPPGPIGN VGAPGAKGAR 600

GSAGPPGATG FPGAAGRVGP PGPSGNAGPP GPPGPAGKEG GKGPRGETGP

AGRPGEVGPP GPPGPAGEKG SPGADGPAGA PGTPGPQGIA GQRGVVGLPG 700

QRGERGFPGL PGPSGEPGKQ GPSGASGERG PPGPMGPPGL AGPPGESGRE

GAPGAEGSPG RDGSPGAKGD RGETGPAGPP GAPGAPGAPG PVGPAGKSGD 800

RGETGPAGPA GPVGPVGARG PAGPQGPRGD KGETGEQGD-            839

上述的基因重组人胶原蛋白融合肽段的制备方法如下：

1、克隆I型(COL1)和III型(COL3)人胶原蛋白基因的cDNA

1.1RNA提取

(1)取新鲜人胎盘在液氮中研磨，将研碎的组织放入盛1mL Trizol的离心管中，上下振荡5min，将样品在15-30℃放置15min，使核酸蛋白复合物分离。

(2)在高速冷冻离心机中4℃10,000×g离心10min，吸取上清液。

(3)加0.2mL氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min。

(4)4℃10,000×g离心15min。样品分为黄色有机相、中间层和无色水相三层，RNA主要在水相中，将水相转移到新管中。

(5)加入0.5mL异丙醇，混匀，室温放置10min。

(6)4℃10,000×g离心10min，弃上清，离心后在管侧和管底可见RNA胶状沉淀；

(7)加1mL体积浓度为75％乙醇(用0.1％DEPC处理水配制)洗涤沉淀。

(8)4℃7500×g离心5min，弃上清液。

(9)室温放置晾干，按RNA提取量的多少，加20-100μL无RNase的DEPC处理水，室温溶解后，-70℃保存。

(10)RNA提取完成后，于1％的琼脂糖凝胶上进行检测。

1.2cDNA的反转录

以上述所得总RNA为模板，按下述方法进行反转录，得cDNA。

取溶解于DEPC水中的总RNA 5μL，0.2μg/μL Random hexamers primer 1μL，DEPC水6μL，70℃，孵育5min，置冰上冷却后加入下列试剂：5×Buffer 4μL，10mmol/L dNTPMixture 2μL，20u/μL RNA inhibitor 1μL，25℃，孵育5min，200u/μL反转录酶1μL，总体积20μL。在PTC-100 Thermal Cycler(BIO-RAD)PCR仪中，25℃，10min，42℃反应，60min，70℃，10min终止反应，冰上冷却。

1.3引物的设计

根据GenBank已发表的人胶原蛋白I型和III型基因序列，按照引物设计原则，利用Primer Premier 5.0和DNAMAN软件，设计COL1和COL3基因PCR扩增引物。引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。其序列见表1。

表1COL1和COL3的PCR引物参数

1.4克隆COL1和COL3的基因

1.4.1COL1和COL3的PCR扩增

25μL反应体系中含有：13.3μL灭菌的二蒸水、2.5μL 10×PCR buffer，3.5μL2m mol/L dNTP Mix，2.5μL Mg²⁺，1μL 10μmol/L Primer I，1μL 10μmol/L PrimerII，0.2μL 0.5U/μL Taq酶，1μL cDNA模板。反应条件为：95℃5min，94℃30s，61℃30s，72℃2.5min，30个循环，72℃10min，4℃10min。利用PTC-100 ThermalCycler(BIO-RAD)PCR仪进行扩增。

COL1和COL3的PCR扩增结果见图1。

1.4.2COL1和COL3的扩增片段的分离和克隆

利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按产品说明书，从普通的1.5％琼脂糖凝胶上回收特异性条带，回收产物连接于pGM-T载体，转化感受态E.coli DH 5α，涂布平板，经蓝白斑筛选，挑选阳性克隆接种于10mL LB培养基中，37℃振荡过夜培养。用质粒微量提取试剂盒抽提质粒DNA(碱裂解法)，得pGM-T-COL1和pGM-T-COL3两个重组质粒。两个重组质粒的PCR扩增鉴定结果见图2。

1.4.3重组质粒pGM-T-COL1和pGM-T-COL3的测序鉴定

委托测序公司对两个重组质粒进行基因测序，测序结果与GenBank中的已知人I型和III型胶原蛋白序列作同源性比较，同源性均为100％。测序结果见图3和图4。

2、毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-COL3a1-COL1a1的构建

2.1重组表达载体的构建策略路线图见图5

2.2引物设计

根据引物设计的策略，利用DNAMAN和Primer 5.0软件设计COL1a1和COL3a1基因，同时为了后期蛋白序列的切割，COL3a1上游引物设计两条，引入pPIC9K自身信号肽序列GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT，进行两次扩增，为了证明基因插入的正确性，设计了特异性鉴定引物，9k-COL1。各序列见表2。

表2COL1a1和COL3a1的PCR引物参数

2.3PCR扩增COL1a1和COL3a1序列

分别以pGM-T-COL1和pGM-T-COL3质粒为模板，进行PCR扩增：

反应条件分别为：

COL1a1和COL3a1序列的PCR产物电泳结果见图6。

由图可见，分别在1843bp和722bp处有一条特异DNA条带，与预期大小一致。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按产品说明书，从普通的1.5％琼脂糖凝胶上回收特异性条带，得COL1a1和COL3a1序列，-20℃保存待用。

2.4COL1a1和COL3a1序列的酶切及回收

上述试剂加好后，混匀，37℃水浴消化1.5h-2.0h，终止反应前先取出5μL以0.7％琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按产品说明书，从普通的1.5％琼脂糖凝胶上回收特异性条带，-20℃保存待用。

2.5质粒pPIC9K的转化及提取

(1)取冷冻的DH5α感受态细胞一管，放于冰上解冻，立即加入质粒pPIC9K(≤50ng)，手指轻弹使其混合，在冰中放置30分钟。

(2)42℃水浴热激恰好90秒，不要摇动试管。

(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟。

(4)加入800μL无抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃温育50分钟。

(5)吸取100-200μL菌液，涂于含有卡那霉素(50ug/mL)的固体LB板上。

(6)将平板置于室温待液体被吸收后，倒置于37℃培养箱中，培养12-18小时。

(7)挑选单菌落接种于含有卡那霉素(50ug/mL)的液体LB培养基中，摇床培养，37℃过夜。

(8)利用质粒提取试剂盒操作说明提取pPIC9K质粒。

2.6pPIC9K质粒的Xho I和EcoR I双酶切及回收

利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按产品说明书，从普通的1.5％琼脂糖凝胶上回收特异性条带，-20℃保存待用。

2.7pPIC9K与COL3a1的连接

上述连接体系充分混匀后，于16℃连接2小时。得pPIC9K-COL3a1，其转化和提取方法同上述2.5项所述。

pPIC9K-co3a1质粒的酶切鉴定

以上酶切体系在37℃水浴中反应2小时后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，确定连接正确的质粒pPIC9K-co3a1。

2.8pPIC9K-co3a1质粒的EcoR I单酶切

对双酶切鉴定为连接正解的质粒进行大量提取，并进行EcoR I单酶切。

上述试剂加好后，混匀，37℃水浴消化2h，终止反应前先取出5μL以0.7％琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全，之后进行单酶切后的pPIC9K-co3a1的回收。

2.9pPIC9K-co3a1的去磷酸反应

为了防止pPIC9K-co3a1质粒单酶切后的自连，必须对其进行脱磷反应。

(1)在微量离心管中配制下列反应液，全量定容到50μL。

(2)37℃或50℃反应30分钟。

(3)苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提2次。

(4)氯仿/异戊醇(24∶1)抽提1次。

(5)添加5μl的3M NaOAC。

(6)添加125μl的(2.5倍量)冷乙醇，在-20℃下保冷30～60分钟。

(7)离心分离回收沉淀，用200μl的70％冷乙醇洗净后，减压干燥。

(8)用20μl以下的TE Buffer溶解沉淀。

2.10pPIC9K-co3a1与COL1a1的连接

上述连接体系充分混匀后，于16℃连接2小时。得pPIC9K-COL3a1-COL1a1，其转化和提取方法同上述2.5项所述。

2.11pPIC9K-COL3a1-COL1a1质粒的鉴定

2.11.1pPIC9K-COL3a1-COL1a1质粒的PCR鉴定

鉴定pPIC9K-COL3a1-COL1a1质粒构建是否正确，设计上游引物源自pPIC9K载体信号肽部分5’-GCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCA-3’，下游引物源自COLla1序列中的一段5’-TCGCTCTCCAGCCTTGCCG-3’，如果连接正确，即可扩增出一条长约1155bp的片段。其鉴定结果见图7。

从图7可见，1、3、5、6、8、11号质粒在1155bp左右扩增出一条特异DNA条带，达到预期目的。

2.11.2pPIC9K-COL3a1-COL1a1质粒的酶切鉴定

根据pPIC9K-COL3a1-COL1a1重组质粒的酶切位点分析，对初步筛选出的重组菌落经小量提取质粒DNA后，选用EcoR I、BamH I进行酶切鉴定，如果连接正确，用EcoR I即可切出一条长度约1800bp左右的片段，而用BamH I即可切出一条2000bp左右的片段。

以上两个酶切体系在37℃水浴中反应2小时后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，其结果见图8。由图8可见连接正确。

2.11.3pPIC9K-COL3a1-COL1a1质粒的目标基因测序鉴定

经PCR和酶切鉴定后，对确定连接正确的pPIC9K-COL3a1-COL1a1重组质粒送往上海生工生物技术有限公司进行序列测定。测序结果见图9、10。

测序结果显示，COL3a1-COL1a1基因序列插入正确，未出现移码突变。

3、基因重组人胶原蛋白融合肽段比赤酵母基因工程菌(SMD1168-COL3a1-COL1a1)的构建：

3.1pPIC9K-COL3a1-COL1a1质粒的线性化

上述试剂加好后，混匀，37℃水浴消化5h，终止反应前先取出5μL以0.7％琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全。之后，用质粒提取试剂盒对线性化质粒进行质粒大提。

3.2毕赤酵母感受态细胞的制备

(1)挑取酵母单菌落，接种至含有5mL YPD培养基试管中，30℃、250-300rpm培养过夜。

(2)取50μL的培养物接种至含有50mL新鲜培养基的300mL三角瓶中，28-30℃、250-300rpm培养过夜，至OD600值达到1.1-1.3。

(3)将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用50mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。

(4)按步骤(3)离心，用25mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。

(5)按步骤(3)离心，用20mL的冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。

(6)按步骤(3)离心，用0.3mL的冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为0.5mL。

(7)分装为80μL一份，-70℃保存。

3.3毕赤酵母的电转化

(1)将浸泡在70％乙醇中的电转化杯取出，用无水乙醇冲洗三遍，于灭过菌的超净台中晾干残余乙醇。

(2)将电转化杯转至冰中预冷10分钟。

(3)将5-20μg的线性化DNA溶解在5-10μL灭菌双蒸水中，毕赤酵母感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中。

(4)电击，电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω；电击时间为4-10msec。

(5)电击完毕后，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mL离心管中。

(6)将菌体悬液涂布于MD平板上，每100μL-200μL涂布一块平板。

3.4多拷贝插入SMD1168-COL3a1-COL1a1重组子的筛选

(1)在生长有转化子的MD平板表面加入2mL灭菌双蒸水，然后用无菌三角涂布器在His+转化子表面轻轻涂刮，并转移到50mL离心管中。

(2)加入20mL灭菌双蒸水稀释，混匀后测定其OD600值(1OD600＝5×10⁷cells/mL)。

(3)取10⁵个细胞涂布于含有0.5mg/mL G418的YPD平板上，倒置，30℃培养72h-96h。

(4)在无菌96孔板中每孔加入200μL YPD液体培养基。

(5)用接菌牙签往步骤(4)分别接入在含有0.5mg/mL G418的YPD平板上获得的转化子，混匀，于30℃培养48h。

(6)48h后，取一块新的无菌96孔板，每孔加入190μL YPD液体培养基。在相应孔中加入10μL第一块96孔板所得的培养物，于30℃培养24h。

(7)24h后，再取一块新的无菌96孔板，每孔加入190μL YPD液体培养基。在相应孔中加入10μL第二块96孔板所得的培养物，于30℃培养24h。

(8)24h后，分别从第三块96孔板中取出1μL分别点在含有1.0mg/mL和4.0mg/mLG418的YPD平板上，于30℃继续培养96h-120h。酵母SMD1168转化子若能在含高浓度G418的培养基上生长，说明该转化子含有多拷贝的目的基因，即有多个pPIC9K-COL3a1-COL1a1片断转化进了酵母SMD1168并同源重组插入了酵母SMD1168的染色体上。经过这一步筛选得到的高拷贝的重组酵母SMD1168-COL3a1-COL1a1将更有可能实现目的蛋白的高效表达。

3.4SMD1168-COL3a1-COL1a1重组子的PCR鉴定

挑取待测酵母转化子，按下述方法进行PCR模板的预制。

(1)挑取高拷贝转化子的单菌落，置于装有200uL去离子水的1.5mL离心管中，2000g离心5min，弃上清。

(2)将装有菌体的离心管置于微波炉加热2min。

(3)转移到-80℃冰冻5min。

(4)再置于微波炉中档加热2min。

(5)重复在-80℃冰冻Smin和微波炉中档加热2min。

(6)加入30gL去离子水，于10000g离心1min，吸取上清作为PCR反应的模板。

(7)使用9k-col1鉴定引物，进行PCR扩增。

(8)PCR结束后，进行琼脂糖电泳检测，在1155bp左右出现条带的，可以初步确定为阳性转化子。其结果见图11。

经过G418不同浓度的反复筛选，最终在高浓度4mg/mL条件下筛选到9个高拷贝重组子，并对其进行菌落PCR鉴定，结果显示，9个重组子都能扩增出约1155bp左右的片段，说明重组子筛选结果正确。

3.5重组酵母SMD1168-COL3a1-COL1a1的诱导表达

(1)分别挑选单菌落，置于装有30mL BMGY培养基的150mL三角瓶中，于28-30℃、250-300rpm培养至OD600为2-6。

(2)室温下1500-3000g离心5min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD600为1.0左右。

(3)将所得的菌液置于500mL的三角瓶中，用四层纱布封口，于28-30℃、250-300rpm的摇床上继续生长。

(4)每24h向培养基中添加无水甲醇至终体积浓度为1％。

(5)按时间点分别取菌液样品，取样量为10mL，置于50mL离心管中，常温，12000rpm离心5min，收集上清，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：12h、24h、36h、48h、60h和72h。

(6)待检测样品于-70℃保存备用。

3.6基因重组人蛋白质融合肽段的SDS-PAGE分析

(1)玻璃板清洗、晾干后安装。

(2)灌注分离胶，在一干净小烧杯中依次加入灭菌水1.1mL，1.5mol/L Tris·Cl(pH8.8)1.3mL，10％SDS 50μL，10％过硫酸铵50μL，30％丙烯酰胺溶液2.5mL，TEMED 2μL，混匀后立即灌注于玻璃板的间隙中，留出灌注浓缩胶所需的空间(梳子的齿长再加1cm)，小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖一层灭菌水。

(3)分离胶聚合完全后(30min-60min)，倾出覆盖液体，用滤纸吸净残留液体。

(4)灌注5％的浓缩胶，在一干净小烧杯中依次加入灭菌水1.4mL，1.0mol/LTris·Cl(pH6.8)250μL，10％SDS 20μL，10％过硫酸铵20μL，30％丙烯酰胺溶液330μL，TEMED 2μL，混匀后立即在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶，小心插入梳子，避免产生气泡。再加入浓缩胶以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。

(5)样品的处理，取蛋白样品加入等体积的含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液，在100℃加热10min以使蛋白质变性。

(6)浓缩胶完全聚合后(30min)，小心移出梳子，立即用灭菌水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺。必要时，用注射器针头把浓缩胶上加样槽之间的齿弄直。把凝胶固定于电泳装置上，槽内外各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

(7)按预定顺序加样，每样品加15μL-20μL。

(8)将电泳装置与电源相连，凝胶上所加电压为100V。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到150V，继续电泳直到嗅酚蓝到达分离胶底部，然后关闭电源。

(9)从电泳装置上卸下玻璃板，取出凝胶。

(10)用至少5倍体积的染色液浸泡凝胶，平缓摇动于室温染色1小时以上。

(11)脱色，把胶用去离子水冲洗3遍，然后置微波炉上加热5分钟。

(12)取出凝胶，使用凝胶成像仪进行图像捕捉和分析。结果见图12：

4、制备基因重组人胶原蛋白融合肽段

4.1发酵

以基因重组人胶原蛋白融合肽段毕赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3a1-COL1a1为原始菌种，涂布YPD平板获得单菌落，扩繁单菌落分装为甘油菌种保存；每次取甘油菌种，接种于5mL种子YPD培养基中，30℃振荡培养20～24小时，转接于400ml BMGY培养基中，30℃振荡培养至ODG00达10～12，作为一级种子；将一级种子接入装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，30℃、pH值为5.0、DO 20％～30％，培养16-20小时，作为二级种子；将二级种子转接入装有30L FBS培养基的50L发酵罐中；生长培养18～20小时，30℃、pH值为5.0、DO 20％～30％，补加甘油至发酵液内的菌体湿重达到150mg，饥饿1-2小时；驯化培养9小时，每三小时为一个驯化时间段，30℃、pH值为5.0、DO 20％～30％，第一段每5分钟补加甲醇1mL，第二段每5分钟补加甲醇2mL，第三段每5分钟补加甲醇3mL；诱导培养72小时，30℃、pH值为5.0、DO 20％～30％，视DO值提高甲醇流加速率并维持补料速度在5-10.9ml/L/h进行发酵，至DO值浮动缩小至5％～8％，发酵结束。

4.2纯化

取发酵液离心除去酵母细胞，得发酵上清液；用截留量为20000的聚砜中空纤维超滤浓缩发酵上清液至原发酵上清液体积的20％，得超滤浓缩液；用凝胶过滤法脱除超滤浓缩液中的无机盐，得脱盐液；用DAEA阴离子交换柱处理脱盐液，以0.02mol/L NaCl水溶液为平衡液，样品溶液PH为8-9，洗脱液PH5-6，NaCl 0.5mol/L；分段收集洗脱液，电泳，色谱法检测纯度，得纯度为85％以上的溶液；用截留量为20000的聚砜中空纤维超滤浓缩至质量浓度为1％～5％。电泳检测结果见图13。

4.3制备基因重组人胶原蛋白融合肽段

冷冻干燥，得基因重组人胶原蛋白融合肽段。

实施例2

采用本发明实施例1制备的基因重组人胶原蛋白融合肽段用于制备化妆品，该化妆品由下述质量配比的原料制成：

其制备方法如下：

取干粉状基因重组人胶原蛋白融合肽段，透明质酸，甘油，溶解于去离子水中，调PH值至6.5～7.5，在无菌环境下用0.22um滤膜过滤，得无色透明的液体，以无菌操作法封装于5ml的玻璃瓶或塑料瓶中，4℃冰箱储存。

实施例3

采用本发明实施例1制备的基因重组人胶原蛋白融合肽段用于制备化妆品，该化妆品由下述质量配比的原料制成：

其制备方法与实施例2相同。

实施例4

采用本发明实施例1制备的基因重组人胶原蛋白融合肽段用于制备化妆品，该化妆品由下述质量配比的原料制成：

其制备方法与实施例2相同。

为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1制备的基因重组人胶原蛋白融合肽段进行了致敏性试验，试验情况如下：

试样：质量分数为1％基因重组人胶原蛋白水溶液。

阳性对照：质量分数为0.1甲醛水溶液。

阴性对照：生理盐水。

实验动物：自色豚鼠30只，雌雄各半，体重260～300g，试验前24小时用电动蒯须剃须刀将动物脊柱两侧击毛，每侧的去毛面积为3×3cm²。

1、试验方法

动物分组：将豚鼠按性别、体重随机分成3组.每组10只.第一组为试验组，第二组为阳性对照组，第三组为阴性对照组。

致敏接触：取1平方厘米纱布块，在试样中侵泡5分钟，作为斑贴物，将其半封闭固定在动物背侧去毛区，持续六小时，去掉斑贴物，观察记录各组动物激发部位的皮肤有无红斑及水肿等现象，每天一次，连续六天，按标准进行评分，并算出致敏率。

结果判断与评价：试验结果以动物皮肤反应强度和致敏阳性率表示。皮肤反应强度评分按下列两种标准进行。

(1)红斑形成很淡的红斑(勉强可见)为1分；轻度边界清晰的红斑为2分；中度红斑(鲜红一深红)为3分；重度红斑(深红一紫红，且有焦痂形成)为4分。

(2)水肿形成很轻微的水肿(几乎观察不到)为1分；轻度水肿(边缘明显高出皮面)为2分；中度水肿(肿胀高出皮面约1mm)为3分；重度水肿(肿胀高出皮面1mm以上，范围超过斑贴区)为4分。

总积分等于红斑分与水肿分之和，并依此确定动物有无过敏反应。致敏阳性率是阳性动物数与合计动物数比值的百分率，根据此百分率对化学物质致敏强度进行分级。致敏强度分级见表3。

表3致敏强度分级

致敏率(％)	等级	致敏强度
			0-8	I	弱致敏性
9-28	II	轻致敏性
			28-64	III	中致敏性
64-80	IV	强致敏性
			81-100	V	极强致敏性

试验结果见表4。

表4致敏性s试验结果表

注：1/3＝1分/3只，即得1分者有3只

从表4可以看出，试验组未出现1例致敏反应的动物，说明所试验的基因重组人胶原蛋白融合肽段无致敏性，至于阴性组有一例出现弱致敏反应，可能因为其它原因造成，而非生理盐水有致敏性。

Claims (5)

1.一种基因重组人胶原蛋白融合肽段，其特征在于：它的全长为839个氨基酸，其氮端为III型人胶原蛋白908-1137位肽段共229个氨基酸，碳端为I型人胶原蛋白497-1104位肽段共608个氨基酸，两肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸链接；该基因重组人胶原蛋白融合肽段的氨基酸序列如下：

AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARG

LAGPPGMPGP RGSPGPQGVK GESGKPGANG LSGERGPPGP QGLPGLAGTA 100

GEPGRDGNPG SDGLPGRDGS PGGKGDRGEN GSPGAPGAPG HPGPPGPVGP

AGKSGDRGES GPAGPAGAPG PAGSRGAPGP QGPRGDKGET GERGAAGIKG 200

HRGFPGNPGA PGSPGPAGQQ GAIGSPGPAE FGADGVAGPK GPAGERGSPG

PAGPKGSPGE AGRPGEAGLP GAKGLTGSPG SPGPDGKTGP PGPAGQDGRP 300

GPPGPPGARG QAGVMGFPGP KGAAGEPGKA GERGVPGPPG AVGPAGKDGE

AGAQGPPGPA GPAGERGEQG PAGSPGFQGL PGPAGPPGEA GKPGEQGVPG 400

DLGAPGPSGA RGERGFPGER GVQGPPGPAG PRGANGAPGN DGAKGDAGAP

GAPGSQGAPG LQGMPGERGA AGLPGPKGDR GDAGPKGADG SPGKDGVRGL 500

TGPIGPPGPA GAPGDKGESG PSGPAGPTGA RGAPGDRGEP GPPGPAGFAG

PPGADGQPGA KGEPGDAGAK GDAGPPGPAG PAGPPGPIGN VGAPGAKGAR 600

GSAGPPGATG FPGAAGRVGP PGPSGNAGPP GPPGPAGKEG GKGPRGETGP

AGRPGEVGPP GPPGPAGEKG SPGADGPAGA PGTPGPQGIA GQRGVVGLPG 700

QRGERGFPGL PGPSGEPGKQ GPSGASGERG PPGPMGPPGL AGPPGESGRE

GAPGAEGSPG RDGSPGAKGD RGETGPAGPP GAPGAPGAPG PVGPAGKSGD 800

RGETGPAGPA GPVGPVGARG PAGPQGPRGD KGETGEQGD-            839

2.一种权利要求1的基因重组人胶原蛋白融合肽段的制备方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：

(1)克隆I型即COL1和III型即COL3人胶原蛋白基因的cDNA

从新鲜人胎盘组织中提取总RNA，以总RNA为模板，反转录得cDNA，设计COL1和COL3引物，COL1引物序列为：

F＝CTGGCGCAGATGGTGTTG

R＝CCACGGTGACCCTTTATGC

产物长度为1849bp；

COL3引物序列为：

F＝GAATCTGTGAATCATGCCCTAC

R＝GAAGTCATAATCTCATCGGTGTT

产物长度为3295bp；

以cDNA为模板，进行PCR扩增，提取特异性DNA扩增条带，得COL1和COL3；将COL1和COL3连接于pGM-T载体，转化感受态E.coli DH 5α，涂布平板，经蓝白斑筛选，挑选阳性pGMT-COL1和pGMT-COL3克隆，分别接种于LB培养基中，37℃振荡过夜培养，提取这两种质粒，为下一步做好准备；

(2)毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-COL3a1-COL1a1的构建

引物设计：COL3a1上游引物设计两条，引入pPIC9K自身信号肽序列GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT，进行两次扩增，各引物序列如下：

COL1a1引物序列为：

F＝GCGAATTCGGCGCAGATGGTGTTGC，酶切位点EcoR I

R＝TGGAATTCTTAGTCGCCCTGTCGCCTG，酶切位点EcoR I

产物长度1843bp；

COL3a1引物序列为：

F1＝AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTG

F2＝TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT，酶切位点Xho I

R：TTGAATTCTGCAGGTCCTGG，酶切位点EcoR I

产物长度722bp；

pPIC9k-COL1鉴定引物序列为：

F＝GCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCA

R＝TCGCTCTCCAGCCTTGCCG

产物长度1155bp；

分别以pGMT-COL1和pGMT-COL3质粒为模板，进行PCR扩增，提取产物，得CO3a1和CO1a1，双酶切CO3a1和pPIC9K，以T4联接酶处理，得pPIC9K-CO3a1；单酶切CO1a1和pPIC9K-CO3a1，以T4联接酶处理，得pPIC9K-CO3a1-CO1a1；转化感受态E.coliDH 5α，涂布平板，经蓝白斑筛选，挑选阳性克隆，接种于LB培养基中，37℃振荡过夜培养，提取质粒，为下一步做好准备；

(3)基因重组人胶原蛋白融合肽段毕赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3a1-COL1a1的构建

抽提pPIC9K-COL3a1-COL1a1质粒并线性化，制备毕赤酵母SMD1168感受态细胞，电击转化，以G418梯度法挑选高拷贝阳性克隆，得基因重组人胶原蛋白融合肽段毕赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3a1-COL1a1，其目标蛋白的基因序列如下：

1     CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTGCGGGT AACACTGGTG CTCCTGGCAG CCCTGGAGTG

61    TCTGGACCAA AAGGTGATGC TGGCCAACCA GGAGAGAAGG GATCGCCTGG TGCCCAGGGC

121   CCACCAGGAG CTCCAGGCCC ACTTGGGATT GCTGGGATCA CTGGAGCACG GGGTCTTGCA

181   GGACCACCAG GCATGCCAGG TCCTAGGGGA AGCCCTGGCC CTCAGGGTGT CAAGGGTGAA

241   AGTGGGAAAC CAGGAGCTAA CGGTCTCAGT GGAGAACGTG GTCCCCCTGG ACCCCAGGGT

301    CTTCCTGGTC TGGCTGGTAC AGCTGGTGAA CCTGGAAGAG ATGGAAACCC TGGATCAGAT

361    GGTCTTCCAG GCCGAGATGG ATCTCCTGGT GGCAAGGGTG ATCGTGGTGA AAATGGCTCT

421    CCTGGTGCCC CTGGCGCTCC TGGTCATCCA GGCCCACCTG GTCCTGTCGG TCCAGCTGGA

481    AAGAGTGGTG ACAGAGGAGA AAGTGGCCCT GCTGGCCCTG CTGGTGCTCC CGGTCCTGCT

541    GGTTCCCGAG GTGCTCCTGG TCCTCAAGGC CCACGTGGTG ACAAAGGTGA AACAGGTGAA

601    CGTGGAGCTG CTGGCATCAA AGGACATCGA GGATTCCCTG GTAATCCAGG TGCCCCAGGT

661    TCTCCAGGCC CTGCTGGTCA GCAGGGTGCA ATCGGCAGTC CAGGACCTGC AGAATTCGGC

721    GCAGATGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT

781    GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC

841    AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT

901    CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT

961    GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG

1021   CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA

1081   GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT

1141   GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA

1201   CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC

1261   GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA

1321   GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT

1381   CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT

1441   CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT

1501   GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC

1561   CCTGGTGACA AGGGTGAAAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT

1621   GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT

1681   GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT

1741   GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT

1801   GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT

1861   GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT

1921   CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA

1981   CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT

2041   GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG

2101   CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC

2161   CCCTCTGGTG AACCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT

2221   GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT

2281   CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT

2341   GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT

2401   GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT

2461   GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT

2521   GAGACAGGCG AACAGGGCGA CTAAGAATTC

(4)制备基因重组人胶原蛋白融合肽段

①发酵

以步骤(3)构建的基因重组人胶原蛋白融合肽段毕赤酵母基因工程菌SMD1168-COL3a1-COL1a1为原始菌种，涂布YPD平板获得单菌落，扩繁单菌落分装为甘油菌种保存；每次取甘油菌种，接种于5mL种子YPD培养基中，30℃振荡培养20～24小时，转接于400ml BMGY培养基中，30℃振荡培养至OD600达10～12，作为一级种子；将一级种子接入装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，30℃、pH值为5.0、DO 20％～30％，培养16-20小时，作为二级种子；将二级种子转接入装有30L FBS培养基的50L发酵罐中；生长培养18～20小时，30℃、pH值为5.0、DO 20％～30％，补加甘油至发酵液内的菌体湿重达到150mg，饥饿1-2小时；驯化培养9小时，每三小时为一个驯化时间段，30℃、pH值为5.0、DO 20％～30％，第一段每5分钟补加甲醇1mL，第二段每5分钟补加甲醇2mL，第三段每5分钟补加甲醇3mL；诱导培养72小时，30℃、pH值为5.0、DO 20％～30％，视DO值提高甲醇流加速率并维持补料速度在5-10.9ml/L/h进行发酵，至DO值浮动缩小至5％～8％，发酵结束；

②纯化

取发酵液离心除去酵母细胞，得发酵上清液；用截留量为20000的聚砜中空纤维超滤浓缩发酵上清液至原发酵上清液体积的20％，得超滤浓缩液；用凝胶过滤法脱除超滤浓缩液中的无机盐，得脱盐液；用DAEA阴离子交换柱处理脱盐液，以0.02mol/L NaCl水溶液为平衡液，样品溶液PH为8-9，洗脱液PH5-6，NaCl 0.5mol/L；分段收集洗脱液，电泳，色谱法检测纯度，得纯度为85％以上的溶液；用截留量为20000的聚砜中空纤维超滤浓缩至质量浓度为1％～5％；

③制备基因重组人胶原蛋白融合肽段

冷冻干燥，得基因重组人胶原蛋白融合肽段。

3.权利要求1的基因重组人胶原蛋白融合肽段在制备化妆品中的用途。

4.按照权利要求3所述的基因重组人胶原蛋白融合肽段在制备化妆品中的用途，其特征在于所制备的化妆品由下述质量配比的原料制成：

5.按照权利要求4所述的基因重组人胶原蛋白融合肽段在制备化妆品中的用途，其特征在于所制备的化妆品由下述质量配比的原料制成：

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