CN113150173A - 一种重组人胶原蛋白肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，本发明公开了一种重组人胶原蛋白肽，所述的重组人胶原蛋白肽全长为1022个氨基酸，其中N端为Ⅰ型人胶原蛋白241‑780位肽段共540个氨基酸，C端为Ⅲ型人胶原蛋白1141‑1400位肽段和6个His标签共266个氨基酸，中间为Ⅱ型人胶原蛋白244‑459位肽段共216个氨基酸进行链接。本发明还公开一种CHO‑K1细胞株以及该细胞株的制备方法和使用该细胞株制备重组人胶原蛋白肽的方法。本发明制备的人胶原蛋白肽具体三型胶原蛋白的功能，且表达产量高、生产成本低、批次间稳定、质量好。本发明制备的人胶原蛋白肽能够应用于生物医药和化妆品的制备和生产。

Description

一种重组人胶原蛋白肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体涉及一种重组人胶原蛋白肽及其制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白(collagen)是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，某些生物体甚至高达80％以上。胶原蛋白是人体最丰富的蛋白质之一。已经证明胶原蛋白水解物具有显著生物活性，如抗氧化特性，抗高血压活性，降脂活性，以及修复受损皮肤性质。胶原蛋白在皮肤中具有双重作用：提供弹性蛋白和胶原蛋白形成的构建模块，充当配体或结合成纤维细胞受体刺激合成透明质酸。
胶原蛋白种类较多，常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型。在正常皮肤组织中，胶原主要以I、III型胶原纤维的形式存在。I型胶原和Ⅲ型胶原与皮肤损伤修复过程和修复质量紧密相关。正常胎儿皮肤Ⅲ型胶原占60％，随着生长发育，Ⅲ型胶原不断减少，I型胶原不断增加。成人皮肤胶原组成为I型占80％，Ⅲ型占20％。胎儿无瘢痕愈合机制是由于胎儿较强的Ⅲ型胶原的合成能力。
目前胶原蛋白主要有动物组织提取以及基因工程方法制备两种途径来源。天然提取的胶原蛋白是多种不同分子量胶原蛋白组成的混合物，不溶于水，生物相容性较差；此外，由于来源于动物组织，对于动物源疾病或者人传染疾病有交叉感染的风险。通过基因工程方法制备的胶原蛋白，可以解决传统方式提取的胶原蛋白带来的疾病感染风险，并且通过对胶原蛋白氨基酸序列的优化，可以提高胶原蛋白的亲水性、稳定性，优化胶原蛋白的分子量；从而使制备的胶原蛋白具有良好的组织相容性、皮肤透过性，安全性。
胶原蛋白的基本结构是原胶原，每个原胶原分子都由三条a肽链组成，每个a肽链都会形成左手螺旋，三条左手螺旋扭在一起形成一个大的右手三股螺旋结构。胶原蛋白有特定Gly-Xaa-Yaa的重复氨基酸序列组成，其中，Xaa通常是脯氨酸，Yaa通常是羟脯氨酸或者羟赖氨酸。由于胶原蛋白特定的氨基酸组成，通过基因工程方式制备的胶原蛋白，如何提高胶原蛋白稳定性、表达量以及是否能形成正确的折叠结构，是制约其应用的关键方面。因此，胶原蛋白通过基因工程方式制备过程中，需要选择合适的胶原结构域，以及对选择的胶原域的氨基酸序列进行合理的优化能够提高胶原蛋白的制备效率，以及提高制备的胶原蛋白的稳定性及活性。
发明专利(申请号201010527766.7)提出了一种使用毕赤酵母制备重组人胶原蛋白肽的方法，该方法能制备重组人胶原蛋白肽，但是，毕赤酵母表达体系制备的蛋白与人源的还是有一定的差距。
发明内容
本发明要解决的技术问题一是克服现有技术中制备重组人胶原蛋白肽的缺陷和不足；二是提供一种可大规模、简便、成本较低的重组人胶原蛋白肽及其制备方法。
因此，本发明的目的是提供一种重组人胶原蛋白肽及其制备方法和应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一方面，本发明提出了一种重组人胶原蛋白肽，所述的重组人胶原蛋白肽全长为1022个氨基酸，其中N端为Ⅰ型人胶原蛋白241-780位肽段共540个氨基酸，C端为Ⅲ型人胶原蛋白1141-1400位肽段和6个His标签共266个氨基酸，中间为Ⅱ型人胶原蛋白244-459位肽段共216个氨基酸进行链接。
优选地，本发明所述的人胶原蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
再一方面，本发明还提供了一种CHO-K1细胞株，所述的CHO-K1细胞株含有能高效分泌表达重组人胶原蛋白肽的基因，所述的重组人胶原蛋白肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
优选地，本发明所述的的重组人胶原蛋白肽的基因是经过密码子优化后的核苷酸序列；所述的密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
再一方面，本发明还提供了一种制备所述的CHO-K1细胞株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将SEQ ID NO.2所示的基因序列克隆到真核表达载体中，以得到含有重组人胶原蛋白肽编码基因的重组质粒；
2)再将所述重组质粒转染至CHO-K1细胞中，以得到CHO-K1细胞株；
3)通过培养、筛选、驯化步骤2)中所述CHO-K1细胞株，以得到高效分泌表达重组人胶原蛋白肽的细胞株。
优选地，本发明所述的真核表达载体为pEE12.4。
再一方面，本发明还提供了一种使用所述的CHO-K1细胞株制备重组人胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将培养基CD-CHO和培养基Ex-cell 302混合，以得到混合培养基，其中，培养基CD-CHO和培养基Ex-cell 302的体积比为6:4；以及
2)将如权利要求3～4任一权利要求所述的CHO-K1细胞株在所述混合培养基进行发酵培养；
3)取发酵液离心除去细胞，得发酵上清液；用镍柱进行纯化，并用SDS-PAGE电泳检测纯度，BCA检测浓度，得纯度为80％以上、浓度为1.0mg/ml以上的溶液；冷冻干燥，得重组人胶原蛋白肽。
再一方面，本发明还提供了一种所述的重组人胶原蛋白肽在医药或化妆品领域的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明选择的人胶原蛋白肽来源于Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型人胶原蛋白的部分序列，所以，本发明制备的人胶原蛋白肽有这3种人胶原蛋白的功能，能应用于化妆品和医药的制备和生产中。另外，本发明使用哺乳动物细胞表达制备了人胶原蛋白肽，筛选了适合于大规模、工业化生产人胶原蛋白肽的CHO-K1细胞株，因此，本发明制备人胶原蛋白肽的成本低(产量高，分泌表达，可溶性好，易纯化)、质量好(纯度高、真核表达系统，有翻译后修饰功能，与人源的最接近)、批次间稳定性好(同一个细胞株发酵纯化，保证表达蛋白基本一致)。
附图说明
图1重组人胶原蛋白肽SDS-PAGE图，其中M是Marker，1、2分别是130株、45株表达的蛋白。
图2重组人胶原蛋白肽werstern blot图，其中M是Marker，1、2、3分别是抗Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型人胶原蛋白抗体孵育的结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1重组人胶原蛋白肽的制备
1.1重组人胶原蛋白肽设计
重组人胶原蛋白肽全长为1022个氨基酸，其中N端为Ⅰ型人胶原蛋白241-780位肽段共540个氨基酸，C端为Ⅲ型人胶原蛋白1141-1400位肽段和6个His标签共266个氨基酸，中间为Ⅱ型人胶原蛋白244-459位肽段共216个氨基酸进行链接。重组人胶原蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明选择的人胶原蛋白肽来源于Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型人胶原蛋白的部分序列，因此，本发明制备的人胶原蛋白肽有这3种人胶原蛋白的功能。
具体制备该重组人胶原蛋白肽的方法如下：
1.2表达重组人胶原蛋白肽的重组质粒构建
以密码子优化的重组人胶原蛋白肽的核苷酸序列(具体序列如SEQ ID NO.2所示)为模板，分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点进行连接以构建pEE12.4-collagen-6His-6His表达质粒。将鉴定为阳性的重组质粒送到生工生物公司进行序列测定，用软件对测定的核苷酸序列及编码的氨基酸序列进行分析比对，检查阅读框架的正确性。
1.3重组质粒转染CHO-K1细胞及CHO-K1细胞株的筛选
将鉴定正确的pEE12.4-collagen-6His表达质粒转染CHO-K1细胞。转染后24h开始加压筛选：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)，加压7天，中间观察细胞，死细胞多换液。加压筛选至阴性对照细胞基本死光时(约7天)进行单克隆筛选：取出六孔板，弃掉培养基，PBS洗一次，然后加入300μL0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。用DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)重新悬浮细胞，计数。铺板：稀释细胞至5个/mL，取200μL混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4-6h。记录单个细胞的孔。待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，加入100mL0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞液转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，ELISA检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。经过筛选，共收获2株细胞株，编号为130株、45株。
1.4CHO-K1细胞株的悬浮化
将筛选的单克隆细胞株驯化成悬浮培养：从37℃培养箱中取出细胞，弃去上清培养基，用预温的8mL PBS洗细胞一次，并弃去PBS。每个10cm细胞培养皿加入1-2mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。加入4mLDMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)终止消化反应，并用移液枪将细胞吹散。将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。用100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)悬浮细胞，计数。稀释细胞至5×105个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120r/min孵育过夜。生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。每隔24h计数细胞密度及活力。待第一代细胞培养一次后细胞存活率达到94-97％时进行第二代培养。准备：生物安全柜紫外灭菌30min；100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)，EX-CELL 302置于CO2细胞培养箱中预热至37℃。从37℃培养箱中取出细胞转移至50mL离心管中，常温200g离心5min。将DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)和EX-CELL 302按1:1.5混合混匀，重新悬浮细胞，计数。稀释细胞至5×105个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120r/min孵育过夜。生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。每隔24h计数细胞密度及活力。第二代培养两次后得到的细胞存活率大于95％；第三至六代培养三次后得到的细胞存活率大于95％。7周后，细胞接种3天后繁殖三代，密度达到1×106个细胞/mL，同时细胞存活率达到95％，该细胞被认为已经适应悬浮培养。接种密度降低到3×105个/mL。经驯化，130株、45株都满足要求，这表明130株、45株都驯化成功。
1.5CHO-K1细胞株的发酵培养
将130株、45株CHO-K1细胞进行摇瓶发酵培养：60％的CD-CHO+40％的Ex-cell 302混合的培养基(其中CD-CHO和Ex-cell 302均为无血清培养基)对上2种细胞株进行摇瓶发酵验证。从CO2恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。稀释细胞至2.5-3.5×105个细胞/mL接种60mL培养基于一个250mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。每隔24h计数细胞密度及活力，测葡萄糖，当血糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。补料(约第四天)：补充79.6g/L CDEfficient Feed C AGT，添加基础培养基的10％。第5天开始，将CO2培养箱温度调整至32℃。第九天，补充79.6g/L CD Efficient Feed C AGT，添加基础培养基的10％。第十二天，收获细胞上清。
1.6重组人胶原蛋白肽的纯化
取GE excle填料4ml，用BufferA(20mM NaH2PO4，500mM NaCl，0.05％Tween 20，pH7.4)平衡5个柱体积；将4ml填料加入到细胞上清中，于滚瓶机上4℃混匀1h；将填料和细胞上清转移到空层析柱中，流穿细胞上清；洗涤：用含20mM咪唑的BufferA洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。洗脱：用含250mM咪唑的BufferA洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。洗涤：用含500mM咪唑的BufferA洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。透析换液：将含有目的蛋白的咪唑洗脱液倒入透析袋内，用1×PBS透析至少1000倍，取80μl留样检测。图1所示SDS-PAGE检测发酵上清纯化结果(如图1所示，表达后的重组人胶原蛋白肽的分子量约为128kDa，重组人胶原蛋白肽理论分子量约为112kDa，两者差值为重组人胶原蛋白肽在CHO-K1细胞中翻译后修饰所致，均为糖基化结果)。蛋白浓度和纯度测定：采用BCA法测定蛋白浓度，130株、45株蛋白得率约为1.2-1.5g/L；采用HPLC方法检测纯度，纯度都能达到80％以上。这说明经过单克隆化和悬浮化的130株、45株的CHO-K1细胞株适合大规模化发酵生产，成本低(产量高)、质量好(纯度高、真核表达系统，有翻译后修饰功能，与人源的最接近)、批次间稳定性好(同一个细胞株发酵纯化，保证表达蛋白基本一致)。
1.7重组人胶原蛋白的鉴定
使用werstern blot对制备的重组人胶原蛋白进行鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后采用湿转方法将蛋白转至PVDF膜上，5％BSA室温下封闭1h。滴加稀释的一抗：兔抗人Collagen I antibody(1:1000，ab138492，Abcam，Cambridge，UK)、兔抗人Collagen IIantibody(ab188570，1:1000；Abcam，Cambridge，UK)、兔抗人Collagen III(ab184993，1:1000，Abcam，Cambridge，UK)，4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜5min×3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG(ab205718，1:20000，Abcam，Cambridge，UK)稀释液室温下1h。TBST洗膜5min×3次，加入显影液，显影。ImageJ 1.48u软件(National Institutes of Health)进行蛋白定量分析，以各蛋白的灰度值与内参GAPDH的灰度比值进行蛋白定量分析。每次实验重复三次。结果如图2所示，制备的重组人胶原蛋白肽与这三种抗体均能有良好的反应性，说明制备的胶原蛋白肽具有这三型胶原蛋白的基本功能。
实施例2重组人胶原蛋白肽在医药中的应用
参见中国发明专利(申请号为202010717892.2)的实施例4的具体步骤对重组人胶原蛋白对细胞迁移活性的促进作用进行研究。结果如下表，实验组细胞中加入50μl浓度为10μg/ml重组人胶原蛋白肽培养24h后，划痕恢复显著快于对照组。通过Image J软件计算划痕面积，结果表明，重组人胶原蛋白肽处理组细胞划痕恢复面积为97.8％，对照组为61.3％。这说明，本发明的重组人胶原蛋白肽在医药中具有良好的应用前景。
样品 划痕相对恢复面积(％)
重组人胶原蛋白肽 97.8
普通胶原蛋白 67.3
对照组 61.3
实施例3重组人胶原蛋白肽在化妆品中的应用
参见中国发明专利(CN 102020716 B)实施例4对制备的重组人胶原蛋白肽进行检测和验证。结果显示，试验组未出现1例致敏反应的动物(全部正常)，对照组有80％以上动物出现各种致敏反应，说明所试验的重组人胶原蛋白肽无致敏性。该实施例显示，本发明制备的重组人胶原蛋白肽是安全的，可适用于化妆品的制备和使用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序 列 表
<110> 钟小强
<120> 一种重组人胶原蛋白肽及其制备方法和应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1022
<212> PRT
<213> 重组人胶原蛋白肽氨基酸序列
<400> 1
Gly Ser Arg Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Val Arg Gly Pro Asn Gly
1 5 10 15
Asp Ala Gly Arg Pro Gly Glu Pro Gly Leu Met Gly Pro Arg Gly Leu
20 25 30
Pro Gly Ser Pro Gly Asn Ile Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Pro Val
35 40 45
Gly Leu Pro Gly Ile Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly
50 55 60
Ala Arg Gly Glu Pro Gly Asn Ile Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro
65 70 75 80
Thr Gly Asp Pro Gly Lys Asn Gly Asp Lys Gly His Ala Gly Leu Ala
85 90 95
Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly Pro Asp Gly Asn Asn Gly Ala Gln Gly
100 105 110
Pro Pro Gly Pro Gln Gly Val Gln Gly Gly Lys Gly Glu Gln Gly Pro
115 120 125
Pro Gly Pro Pro Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala
130 135 140
Gly Glu Val Gly Lys Pro Gly Glu Arg Gly Leu His Gly Glu Phe Gly
145 150 155 160
Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Glu
165 170 175
Ser Gly Ala Ala Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly Ser Arg Gly Pro Ser
180 185 190
Gly Pro Pro Gly Pro Asp Gly Asn Lys Gly Glu Pro Gly Val Val Gly
195 200 205
Ala Val Gly Thr Ala Gly Pro Ser Gly Pro Ser Gly Leu Pro Gly Glu
210 215 220
Arg Gly Ala Ala Gly Ile Pro Gly Gly Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro
225 230 235 240
Gly Leu Arg Gly Glu Ile Gly Asn Pro Gly Arg Asp Gly Ala Arg Gly
245 250 255
Ala Pro Gly Ala Val Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Thr Gly Asp
260 265 270
Arg Gly Glu Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg
275 280 285
Gly Ser Pro Gly Glu Arg Gly Glu Val Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly
290 295 300
Phe Ala Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu
305 310 315 320
Arg Gly Ala Lys Gly Pro Lys Gly Glu Asn Gly Val Val Gly Pro Thr
325 330 335
Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Asn Gly Pro Pro Gly
340 345 350
Pro Ala Gly Ser Arg Gly Asp Gly Gly Pro Pro Gly Met Thr Gly Phe
355 360 365
Pro Gly Ala Ala Gly Arg Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ile Ser
370 375 380
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Leu Arg Gly
385 390 395 400
Pro Arg Gly Asp Gln Gly Pro Val Gly Arg Thr Gly Glu Val Gly Ala
405 410 415
Val Gly Pro Pro Gly Phe Ala Gly Glu Lys Gly Pro Ser Gly Glu Ala
420 425 430
Gly Thr Ala Gly Pro Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly
435 440 445
Ala Pro Gly Ile Leu Gly Leu Pro Gly Ser Arg Gly Glu Arg Gly Leu
450 455 460
Pro Gly Val Ala Gly Ala Val Gly Glu Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala
465 470 475 480
Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly Ser Pro Gly
485 490 495
Val Asn Gly Ala Pro Gly Glu Ala Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly Asn
500 505 510
Asp Gly Pro Pro Gly Arg Asp Gly Gln Pro Gly His Lys Gly Glu Arg
515 520 525
Gly Tyr Pro Gly Asn Ile Gly Pro Val Gly Ala Ala Gly Ile Ala Gly
530 535 540
Ala Pro Gly Phe Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala
545 550 555 560
Thr Gly Pro Leu Gly Pro Lys Gly Gln Thr Gly Glu Pro Gly Ile Ala
565 570 575
Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly
580 585 590
Pro Gln Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala
595 600 605
Arg Gly Glu Pro Gly Gly Val Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg
610 615 620
Gly Ala Pro Gly Asn Arg Gly Phe Pro Gly Gln Asp Gly Leu Ala Gly
625 630 635 640
Pro Lys Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Pro Ser Gly Leu Ala Gly Pro
645 650 655
Lys Gly Ala Asn Gly Asp Pro Gly Arg Pro Gly Glu Pro Gly Leu Pro
660 665 670
Gly Ala Arg Gly Leu Thr Gly Arg Pro Gly Asp Ala Gly Pro Gln Gly
675 680 685
Lys Val Gly Pro Ser Gly Ala Pro Gly Glu Asp Gly Arg Pro Gly Pro
690 695 700
Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Gln Pro Gly Val Met Gly Phe Pro
705 710 715 720
Gly Pro Lys Gly Ala Asn Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Lys Gly
725 730 735
Leu Pro Gly Ala Pro Gly Leu Arg Gly Leu Pro Gly Lys Asp Gly Glu
740 745 750
Thr Gly Ala Ala Pro Val Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly
755 760 765
Thr Ser Gly His Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Asn
770 775 780
Arg Gly Glu Arg Gly Ser Glu Gly Ser Pro Gly His Pro Gly Gln Pro
785 790 795 800
Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Val
805 810 815
Gly Ala Ala Ala Ile Ala Gly Ile Gly Gly Glu Lys Ala Gly Gly Phe
820 825 830
Ala Pro Tyr Tyr Gly Asp Glu Pro Met Asp Phe Lys Ile Asn Thr Asp
835 840 845
Glu Ile Met Thr Ser Leu Lys Ser Val Asn Gly Gln Ile Glu Ser Leu
850 855 860
Ile Ser Pro Asp Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Asn Cys Arg Asp
865 870 875 880
Leu Lys Phe Cys His Pro Glu Leu Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Val Asp
885 890 895
Pro Asn Gln Gly Cys Lys Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met
900 905 910
Glu Thr Gly Glu Thr Cys Ile Ser Ala Asn Pro Leu Asn Val Pro Arg
915 920 925
Lys His Trp Trp Thr Asp Ser Ser Ala Glu Lys Lys His Val Trp Phe
930 935 940
Gly Glu Ser Met Asp Gly Gly Phe Gln Phe Ser Tyr Gly Asn Pro Glu
945 950 955 960
Leu Pro Glu Asp Val Leu Asp Val His Leu Ala Phe Leu Arg Leu Leu
965 970 975
Ser Ser Arg Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Ile Ala
980 985 990
Tyr Met Asp Gln Ala Ser Gly Asn Val Lys Lys Ala Leu Lys Leu Met
995 1000 1005
Gly Ser Asn Glu Gly Glu Phe His His His His His His
1010 1015 1020
<210> 2
<211> 3066
<212> DNA
<213> 密码子优化后的重组人胶原蛋白肽核苷酸序列
<400> 2
ggctccagag gtgctagtgg gccagctgga gttagaggtc ctaatggtga tgctggtcga 60
cctggagaac ctggactgat gggtcccaga ggattgcccg gttctcccgg taacattggt 120
ccagccggta aagagggacc cgtaggactg cccggaattg atgggagacc tgggccaata 180
ggacccgcag gagcaagggg tgaaccagga aacatcggat ttcccggacc aaaaggacct 240
acaggggacc ctggcaagaa tggagataaa ggccatgctg gtctggcagg agctagagga 300
gcaccaggtc cagatggaaa caacggcgct caaggaccac caggacctca aggagtgcaa 360
ggcggcaaag gtgaacaggg accacctgga cctcctggat ttcaaggact ccctggacca 420
agtggaccag caggtgaagt tggtaagcct ggagagcgcg gcttgcatgg agaatttggc 480
ttgcctggtc ctgcaggacc tagaggtgaa agaggaccac caggagagtc tggagctgcg 540
ggtccaacag gtcccattgg ctctagaggg ccgtcaggtc ctccaggacc agatggaaac 600
aaaggagaac ccggcgtggt tggcgctgta ggaacagctg gaccttctgg acctagtgga 660
ttgcctggcg aaaggggagc agctgggatt cctgggggaa agggagagaa gggtgaaccg 720
gggctccgag gagagattgg taatccagga cgagatggag ccagaggagc accaggagct 780
gttggtgctc caggtcctgc tggtgcaaca ggagatagag gtgaagctgg agcagctgga 840
cctgctggac cagctggtcc aagaggatct cccggagaaa gaggagaggt aggtcctgct 900
ggtcctaatg gtttcgcagg accagcaggg gctgctggac aacctggagc aaagggagag 960
aggggagcca aaggcccaaa gggagagaac ggggttgtgg gaccaactgg accagtagga 1020
gctgcaggac cagctggacc taatggacct cctggacctg ctggttctag aggggatggt 1080
ggacctccag gtatgaccgg attccctgga gcagctggaa gaacagggcc acccggacct 1140
agtggtatct caggaccacc tggaccacct ggaccagctg gaaaagaagg acttagagga 1200
ccgcgcggcg atcaaggacc tgttggtagg actggggaag tgggcgctgt tggtcctcca 1260
ggattcgccg gagagaaggg tccatccggt gaagcaggta cggcaggtcc accaggcaca 1320
cctggaccac agggattgtt gggagcccct ggaattcttg gtttgcccgg atctcgcggt 1380
gaaagagggc ttcctggtgt tgctggagct gtgggagaac caggacctct cggcatagca 1440
ggcccaccag gagctagagg accacctgga gctgtcggat caccgggagt gaatggtgcg 1500
cctggggaag ctggaaggga tggtaatcca ggcaacgatg gaccacccgg tagagacgga 1560
caaccaggcc acaaggggga gagaggatat cctggcaata ttggtccagt aggagcagcc 1620
ggaatagcag gagcccctgg ttttccagga ccaagaggtc cccctggacc acagggtgca 1680
acaggacctt tgggcccaaa aggccagaca ggagaaccag gaattgcagg cttcaaaggc 1740
gagcagggtc ctaagggaga accaggacct gctggtccac aaggagcccc tggaccagca 1800
ggtgaagaag ggaagagggg cgctagaggt gaaccagggg gagtgggacc tattggacca 1860
ccaggagaac gaggtgctcc aggaaaccga ggctttcctg ggcaagatgg actcgctgga 1920
ccaaagggag cacctggtga aagaggccct tcaggattgg cgggacccaa aggcgcaaat 1980
ggtgatcctg gtagaccagg agaaccagga ctccccggag ccagaggact gacaggacga 2040
cctggagatg caggccctca aggcaaagtc ggaccaagtg gtgcacctgg tgaagatggc 2100
agacctggac caccaggccc tcaaggagct aggggtcagc caggagttat gggattccca 2160
ggaccaaaag gtgctaatgg agagccaggt aaggcaggag agaagggatt gcccggtgcc 2220
ccaggactta ggggacttcc aggaaaagac ggcgaaacag gagcagcacc cgtaggtcct 2280
tctggacctc ctggcaaaga tggcacctct gggcatcctg gtcctatcgg cccaccagga 2340
ccaagaggta atagaggtga gagaggctca gaaggaagtc ctggccatcc tggtcaacct 2400
ggaccaccag gacctcctgg agctccagga ccttgctgtg gaggtgtagg agccgctgct 2460
atcgctggca ttggcggtga gaaagccgga ggatttgccc catattacgg ggatgaacct 2520
atggatttca aaattaatac tgatgagatc atgacaagtc tcaagtcagt taatggccag 2580
atcgaatccc tcatcagccc cgatgggtct cgcaagaatc ccgctcgcaa ctgtagagat 2640
cttaaattct gccatcccga actcaagagc ggcgaatatt gggtagatcc taatcagggc 2700
tgcaagttgg atgctattaa agttttttgt aacatggaga ccggtgaaac ttgtatttca 2760
gcgaaccccc ttaatgtgcc aaggaaacac tggtggaccg atagcagcgc cgagaagaaa 2820
catgtctggt tcggagagag tatggatggg gggtttcagt ttagctacgg gaatcccgaa 2880
ctgcctgagg acgtcctcga tgttcatctc gccttccttc ggctcctttc ctctagagcg 2940
agccagaata tcacctacca ctgtaagaac agcatcgctt acatggacca ggctagtggg 3000
aacgtgaaga aggccctgaa gttgatgggg tccaacgagg gcgagtttca ccaccaccat 3060
caccac 3066

Claims (8)

1.一种重组人胶原蛋白肽，其特征在于，所述的重组人胶原蛋白肽全长为1022个氨基酸，其中N端为Ⅰ型人胶原蛋白241-780位肽段共540个氨基酸，C端为Ⅲ型人胶原蛋白1141-1400位肽段和6个His标签共266个氨基酸，中间为Ⅱ型人胶原蛋白244-459位肽段共216个氨基酸进行链接。
2.根据权利要求1所述的人胶原蛋白肽，其特征在于，所述的重组人胶原蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种CHO-K1细胞株，其特征在于，所述的CHO-K1细胞株含有能高效分泌表达重组人胶原蛋白肽的基因，所述的重组人胶原蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求3所述的CHO-K1细胞株，其特征在于，所述的重组人胶原蛋白肽的基因是经过密码子优化后的核苷酸序列；所述的密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.一种制备如权利要求3～4任一权利要求所述的CHO-K1细胞株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将SEQ ID NO.2所示的基因序列克隆到真核表达载体中，以得到含有重组人胶原蛋白肽编码基因的重组质粒；
2)再将所述重组质粒转染至CHO-K1细胞中，以得到CHO-K1细胞株；
3)通过培养、筛选、驯化步骤2)中所述CHO-K1细胞株，以得到高效分泌表达重组人胶原蛋白肽的细胞株。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的真核表达载体为pEE12.4。
7.一种使用如权利要求3～4任一权利要求所述的CHO-K1细胞株制备重组人胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将培养基CD-CHO和培养基Ex-cell 302混合，以得到混合培养基，其中，培养基CD-CHO和培养基Ex-cell 302的体积比为6:4；以及
2)将如权利要求3～4任一权利要求所述的CHO-K1细胞株在所述混合培养基进行发酵培养；
3)取发酵液离心除去细胞，得发酵上清液；用镍柱进行纯化，并用SDS-PAGE电泳检测纯度，BCA检测浓度，得纯度为80％以上、浓度为1.0mg/ml以上的溶液；冷冻干燥，得重组人胶原蛋白肽。
8.一种如权利要求1所述的重组人胶原蛋白肽在医药或化妆品领域的应用。
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