CN115109795B - 重组人源iii型胶原蛋白注射剂及其在皮肤胶原再生中的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及重组III型胶原蛋白技术领域，尤其涉及重组人源III型胶原蛋白注射剂及其在在皮肤胶原再生中的应用。通过构建Col IIIɑ‑1和P4HA融合表达的毕赤酵母X33，制备了能够胞外表达III胶原蛋白ɑ链，对该基因工程菌进行发酵培养，能够大量收获胞外表达的III胶原蛋白ɑ链，极大地利于该蛋白的下游纯化和提取。本申请公开的重组人源III型胶原蛋白注射剂，以独立包装的Col III‑ɑ1‑DOPA和葡萄糖亚铁摩尔比例为5:1的条件下形成具有三螺旋和铁离子配位交联结构的水凝胶，能够增强胶原的粘合性，还能够在体内具有优良的生物相容性，非常适合应用在于中创伤部位的胶原再生和组织填充。

Description

重组人源III型胶原蛋白注射剂及其在皮肤胶原再生中的应用
技术领域
本申请涉及重组III型胶原蛋白技术领域，尤其涉及重组人源III型胶原蛋白注射剂及其在皮肤胶原再生中的应用。
背景技术
由于III型胶原蛋白是由三条ɑ链构成，其是高度羟基化的蛋白，其羟基化残基主要为脯氨酸，实现脯氨酸羟基化主要通过4-脯氨酸羟基化酶在细胞内质网和高尔基体中完成。常用于胶原蛋白的宿主主要为毕赤酵母，其不仅表达产量搞，获得的胶原蛋白能够稳定地形成其三螺旋结构；而且毕赤酵母被认为具有生物安全的真核细胞微生物，其对营养需求低、细胞增殖快，表达量高。然而，毕赤酵母中不具有表达4-脯氨酸羟基化酶，若需要在获得表达III型胶原蛋白的重组毕赤酵母，同时还需要对其进行4-脯氨酸羟基化酶的基因改造。然后现有技术中，并无明显对毕赤酵母进行4-脯氨酸羟基化酶基因改造的先例，并且大多数胶原蛋白基因工程菌表达的III型胶原蛋白均为胞外表达，不利于将其作为生物合成III型胶原蛋白的工程菌。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于至少一定程度上解决上述技术问题之一。
第一方面，本申请实施例公开了一种重组III型胶原蛋白注射剂的制备方法，包括：
分别获得III型胶原蛋白ɑ-1链编码基因的目的片段和4-脯氨酸羟基化酶亚基ɑ-1编码基因的目的片段；
构建III型胶原蛋白ɑ-1链的目的基因和4-脯氨酸羟基化酶亚基ɑ-1 的目的基因的融合表达质粒；
构建重组表达III型胶原蛋白ɑ-1链的重组毕赤酵母菌；
诱导培养所述重组毕赤酵母菌；
收获培养液，离心取上清液，分离纯化得到重组III型胶原蛋白ɑ-1 链；
对所述重组III型胶原蛋白ɑ-1链进行多巴胺修饰，制得所述重组人源III型胶原蛋白注射剂。
在本申请实施例中，“分别获得III型胶原蛋白ɑ-1链编码基因的目的片段和4-脯氨酸羟基化酶亚基ɑ-1编码基因的目的片段”包括体外合成带有酶切位点的III型胶原蛋白ɑ-1链编码基因的目的片段和带有酶切位点的4-脯氨酸羟基化酶亚基ɑ-1编码基因的目的片段，并分别进行PCR 扩增的步骤。
在本申请实施例中，对III型胶原蛋白ɑ-1链编码基因的目的片段进行PCR扩增的反应体系包括：12μL 2×Buffer、1μLCol IIIɑ-1目的片段、 1μL 10μM引物F1、1μL 10μM引物R1、4μL dNTP、1μLPrime STAR、2μL DMSO和8μL无菌双蒸水；其中，F1的核苷酸序列如SEQID NO.1所示， R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本申请实施例中，对4-脯氨酸羟基化酶亚基ɑ-1编码基因的目的片段进行PCR扩增的步骤包括：
利用F2和R2作为引物，以P4HA1目的片段作为模板，进行PCR 扩增，得到扩增的第一中间片段；F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示， R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
利用F3和R3作为引物，以P4HA1目的片段作为模板，进行PCR 扩增，得到扩增的第二中间片段；F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示， R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
以所述第一中间片段、所述第二中间片段和所述P4HA1目的片段为模板，以F2、F3、R2、R3作为以引物进行PCR扩增，即可得到带有酶切位点序列的P4HA1目的片段。
在本申请实施例中，对4-脯氨酸羟基化酶亚基ɑ-1编码基因的目的片段进行PCR扩增的步骤包括：
利用F2和R4作为引物，以P4HA1目的片段作为模板，进行PCR 扩增，得到扩增的第一中间片段；F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示， R4的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
利用F5和R5作为引物，以P4HA1目的片段作为模板，进行PCR 扩增，得到扩增的第二中间片段；F5的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示， R5的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
利用F6和R3作为引物，以P4HA1目的片段作为模板，进行PCR 扩增，得到扩增的第二中间片段；F6的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
以所述第三中间片段、所述第四中间片段、所述第五中间片段和所述P4HA1目的片段为模板，以F2、F5、F6、R4、R5和R3作为以引物进行PCR扩增，即可得到带有酶切位点序列的P4HA1目的片段。
在本申请实施例中，“构建III型胶原蛋白ɑ-1链的目的基因和4-脯氨酸羟基化酶亚基ɑ-1的目的基因的融合表达质粒”的步骤包括：
将带有酶切位点的III型胶原蛋白ɑ-1链编码基因的目的片段与质粒进行酶切反应后，采用T4连接酶连接，得到连接Col IIIɑ-1目的片段的线性化pIRES质粒转入大肠杆菌E.coli DH5ɑ中，筛选阳性菌落，提取重组质粒，以便大量获得重组质粒pIRES-Col IIIɑ-1；
再将带有酶切位点的P4HA1目的片段和提取得到的pIRES-Col III ɑ-1进行双酶切反应后，采用T4连接酶连接，得到连接Col IIIɑ-1目的片段和P4HA1目的片段的线性化pIRES质粒，转入大肠杆菌E.coli DH5ɑ中，筛选阳性菌落，提取重组质粒，以便大量获得重组质粒pIRES-Col III ɑ-1-P4HA1。
在本申请实施例中，将重组质粒pIRES-Col IIIɑ-1-P4HA1转入感受态毕赤酵母X33，于含有博莱霉素的YPDS培养基上培养，收集菌体，筛选阳性转化子，通过PCR扩增鉴定即可得到重组表达Col IIIɑ-1的毕赤酵母X33。
在本申请实施例中，将重组表达Col IIIɑ-1的毕赤酵母X33进行诱导培养，收集培养液，离心，取上清液，即可得到重组表达的Col IIIɑ-1。
第二方面，本申请实施例公开了一种重组人源III型胶原蛋白注射剂，该注射剂包括独立包装的Col III-ɑ1-DOPA溶液和葡萄糖亚铁溶液，该 Col III-ɑ1-DOPA溶液的浓度为1～15mg/mL，该葡萄糖亚铁溶液的浓度为0.01～0.25mg/mL，该注射剂以独立包装的ColIII-ɑ1-DOPA和葡萄糖亚铁摩尔比例为5:1的条件下形成具有三螺旋和铁离子配位交联结构的水凝胶。
第三方面，本申请实施例公开了第一方面制得的重组人源III型胶原蛋白注射剂或第二方面所述的重组人源III型胶原蛋白注射剂在制备皮肤胶原再生制品中的应用。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请实施例通过构建了Col IIIɑ-1和P4HA融合表达质粒 pIRES-Col IIIɑ-1-P4HA1，并将其转入感受态毕赤酵母X33，制备了能够胞外表达III胶原蛋白ɑ链的基因工程菌。通过对该基因工程菌进行发酵培养，能够大量收获胞外表达的III胶原蛋白ɑ链，极大地利于其下游纯化和提取。
为此，本申请实施例进一步利用该III胶原蛋白ɑ链制得了一种重组人源III型胶原蛋白注射剂，该注射剂包括独立包装的Col III-ɑ1-DOPA 溶液和葡萄糖亚铁溶液，可以再以独立包装的Col III-ɑ1-DOPA和葡萄糖亚铁摩尔比例为5:1的条件下形成具有三螺旋和铁离子配位交联结构的水凝胶，能够增强胶原的粘合性，不仅保障了其力学性能的自粘合，还能够在体内具有优良的细胞、组织和生物相容性，非常适合应用在于皮肤或组织中创伤部位的胶原再生和组织填充。
附图说明
图1为本申请实施例提供的重组pIRES-Col IIIɑ-1的酶切鉴定电泳图，泳道依次为Marker、重组pIRES-Col IIIɑ-1和酶切片段。
图2为本申请实施例提供的重组pIRES-Col IIIɑ-1-P4HA1的酶切鉴定电泳图，泳道依次为Marker、重组pIRES-Col IIIɑ-1-P4HA1和酶切片段。
图3为本申请实施例提供的重组毕赤酵母DNA的鉴定电泳图，泳道依次为Marker、重组毕赤酵母DNA片段。
图4为本申请实施例提供的重组Col III工程菌诱导表达发酵液的菌体破碎液和上清液SDS-PAGE图，泳道依次为Marker、菌体破碎液和4 个发酵液上清液。
图5为本申请动物试验提供的重组人源III型胶原蛋白注射剂对豚鼠创面愈合的创面新生皮肤组织的各组HE染色图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
重组质粒pIRES-Col IIIɑ-1的构建
1、Col IIIɑ-1目的基因
本申请实施例采用人源胶III原蛋白ɑ-1链(Col IIIɑ-1)的一个转录本(NCBI XM_047443625.1)序列作为目的基因，采用人工合成其目的片段，并在设计的上游引物中加入限制性内切酶XbaI序列，在下游引物中加入限制性内切酶NotI序列，上游引物(F1)为：gctctagaatggtgaagcttagc，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物(R1)为：atgcggccgctttaacatttcttgaag，如SEQ ID NO.2所示；其中，下划线分别表示XbaI序列和Not1序列。
在一些实施例中，采用F1/R1对合成的Col IIIɑ-1目的片段进行PCR 扩增，以得到带有XbaI序列和Not1序列的目的片段。在一些实施例中，该PCR扩增反应体系包括：12μL 2×Buffer、1μLCol IIIɑ-1目的片段、1μL 10μM引物F1、1μL 10μM引物R1、4μL dNTP、1μLPrime STAR、2μL DMSO和8μL无菌双蒸水。在一些实施例中，该PCR扩增反应的反应程序包括：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火56℃30s，延伸68℃1min， 30个循环后，68℃8min，4℃冷却。
2、双酶切反应
在一些实施例中，将上述扩增得到的带有XbaI序列和Not1序列的 Col IIIɑ-1目的片段和pIRES质粒(Biovector NTCC Inc.)分别经过XbaI 和Not1双酶切，得到的双酶切产物进行T4连接酶连接反应，得到连接 Col IIIɑ-1目的片段的线性化pIRES质粒。
在一些实施例中，对Col IIIɑ-1目的片段进行双酶切的反应体系包括：2μL 10×MBuffer、1.3μL XbaI(Sigma-Aldrich公司)、1.3μL NotI (ABclonal公司)、10μL Col IIIɑ-1目的片段、5.4μL灭菌水。
在一些实施例中，对pIRES质粒进行双酶切的反应体系包括：2μL 10×M Buffer、1.3μL XbaI、1.3μL NotI、5μL pIRES质粒、5.4μL灭菌水。
在一些实施例中，将得到的双酶切产物进行T4连接酶连接反应的反应体系包括：1.5μL 10×M Buffer、5μL Col IIIɑ-1目的片段双酶切产物、 4μL pIRES质粒双酶切产物、1μL T4连接酶(翌圣公司)、5.4μL灭菌水。
3、转化
在一些实施例中，将双酶切连接得到的连接Col IIIɑ-1目的片段的线性化pIRES质粒转化进入大肠杆菌E.coli DH5ɑ中，筛选阳性菌落，提取重组质粒，以便大量获得重组质粒，并对其进行鉴定。
在一些实施例中，转化的步骤具体包括：取大肠杆菌E.coli DH5ɑ(BTN12-11y，北京百奥莱博)感受态细胞悬液200μL转移到无菌的1.5ml 微量离心管中，通入加入连接ColIIIɑ-1目的片段的线性化pIRES质粒 10μL轻轻旋转以混匀后，冰浴30min；再将微量离心管放到预热至42℃循环水浴中静置90s后，快速将该微量离心管转移并冰浴2min后；再向该冰浴后的离心管中加入预热至37℃的LB培养基(不含Amp)700μL，于 37℃、140rpm培养60min使大肠杆菌细胞，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp)；再将培养也转接至固体培养基基(含10μg/mL Amp)上，于37℃倒置培养12～16h以生长出新菌落。
在一些实施例中，筛选阳性菌落的步骤包括：从生长的平板中挑选出具有Amp抗性的菌落，以作为初步阳性菌落，将该初步阳性菌落分别转接至5mL LB液体培养液(含10μg/mL Amp)，37℃、220rpm培养过夜后，于500W超声处理30min后，进行PCR扩增，扩增产物进行酶切(XbaI和NotI双酶切)和凝脂糖凝胶电泳，以确定提取的质粒是否连接成功目的片段。在一个实施例中，上述的PCR扩增反应体系包括：12μL 2×Buffer、1μL质粒、1μL 10μM引物F1、1μL 10μM引物R1、4μL dNTP、 1μLPrime STAR、2μL DMSO和8μL无菌双蒸水。在一些实施例中，该 PCR扩增反应的反应程序包括：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火56℃30s，延伸68℃1min，30个循环后，68℃8min，4℃冷却。如图1所示，从阳性菌落中提取的质粒进行扩增和酶切后的产物，进行凝脂糖凝胶电泳结构显示，其得到了质粒载体片段(6kb)和目的片段(1.3kb)，表明载体构建成功，该重组载体命名为pIRES-Col IIIɑ-1。
融合表达质粒pIRES-Col IIIɑ-1-P4HA1的构建
1、P4HA1目的基因合成及扩增
本申请实施例采用4-脯氨酸羟基化酶亚基ɑ-1链的转录本作为目的基因(NM_000917.4)，采用人工合成目的片段。
在一些实施例中，为大量合成带有酶切位点序列的P4HA1目的片段，并在设计的上游引物中加入限制性内切酶XbaI序列，在下游引物中加入限制性内切酶MIuI序列，共设计了至少两对引物，以便进行PCR扩增得到带有XbaI和MIuI位点序列。
在一个实施例1中，其设计了如下：
上游引物F2为：gctctagagc gcccagtcgcgc，如SEQ ID NO.3所示；
下游引物R2为：tctgtactgtgctgtg，如SEQ ID NO.4所示；
上游引物F3为：cagtacagagtatctaag，如SEQ ID NO.5所示；
下游引物R3为：cgacgcgtcg tttttttaaaaaagatttaagat，如SEQ ID NO.6所示；
其中，下划线分别表示XbaI序列和NotI序列。
在实施例1中，其PCR扩增反应体系包括12μL 2×Buffer、1μL 10μM 模板、1μL游引物、1μL 10μM下游引物、4μL dNTP、1μLPrime STAR、2μL DMSO和9μL无菌双蒸水。在实施例1中，其PCR扩增反应程序包括预变性95℃5min，变性95℃30s，退火56℃30s，延伸68℃1min，30个循环后，68℃8min，4℃冷却。
在实施例1中，先利用F2和R2作为引物，以P4HA1目的片段作为模板，采用上述PCR反应体系和反应程序进行PCR扩增，得到扩增的第一中间片段(1270bp)；先利用F3和R3作为引物，以P4HA1目的片段作为模板，采用上述PCR反应体系和反应程序进行PCR扩增，得到扩增的第二中间片段(1482bp)；再以该第一中间片段、第二中间片段和P4HA1 目的片段(10μM第一中间片段1μL、10μM第二中间片段1μL、 10μMP4HA1目的片段1μL混合加入)为模板，以F2、F3、R2、R3作为以引物(1μL 10μM F2、1μL 10μM F3、1μL 10μM R2、1μL 10μM R3混合加入)，采用上述PCR反应体系和反应程序进行PCR扩增，即可得到带有酶切位点序列的P4HA1目的片段。结果可知，得到的带有酶切位点序列的P4HA1目的片段收率为75.6％。
在一个实施例2中，其设计了如下：
上游引物F2为：gctctagagc gcccagtcgcgc，如SEQ ID NO.3所示；
下游引物R4为：ctgtctctctggcaggtaat，如SEQ ID NO.17所示；
上游引物F5为：agagacagaagtac，如SEQ ID NO.8所示；
下游引物R5为：tgtgataccaacagaa，如SEQ ID NO.9所示；
上游引物F6为：tatcacagaagacaagg，如SEQ ID NO.10所示；
下游引物R3为：cgacgcgtcg tttttttaaaaaagatttaagat，如SEQ ID NO.6所示；
其中，下划线分别表示XbaI序列和Not1序列。
在一个实施例2中，其先利用F2和R4作为引物，以P4HA1目的片段作为模板，采用与实施例1相同的PCR反应体系和反应程序进行PCR 扩增，得到扩增的第三中间片段；利用F5和R5作为引物，以P4HA1目的片段作为模板，采用与实施例1相同的PCR反应体系和反应程序进行 PCR扩增，得到扩增的第四中间片段；利用F6和R3作为引物，以P4HA1 目的片段作为模板，采用与实施例1相同的PCR反应体系和反应程序进行PCR扩增，得到扩增的第五中间片段；再以该第三中间片段、第四中间片段、第五中间片段和P4HA1目的片段(10μM第一中间片段1μL、 10μM第二中间片段1μL、10μM第三中间片段1μL、10μMP4HA1目的片段1μL混合进行反应)为模板，以F2、F5、F6、R4、R5和R3作为以引物(1μL 10μM F2、1μL 10μM F5、1μL 10μM F6、1μL 10μM R4、1μL 10μM R5、1μL 10μM R3混合进行反应)，采用上述PCR反应体系和反应程序进行PCR扩增，即可得到带有酶切位点序列的P4HA1目的片段。结果可知，得到的带有酶切位点序列的P4HA1目的片段收率为92.4％。
在一个对比例1中，以该P4HA1目的片段(10μMP4HA1目的片段 1μL)为模板，以F2和R3作为以引物，采用上述PCR反应体系和反应程序进行PCR扩增，即可得到带有酶切位点序列的P4HA1目的片段。结果可知，得到的带有酶切位点序列的P4HA1目的片段收率为32.5％。
2、pIRES-Col IIIɑ-1的提取
在本申请实施例中，将携带pIRES-Col IIIɑ-1的大肠杆菌阳性菌株于接种于LB液体培养基中，于37℃恒温220rpm过夜培养，收集培养液， 9000rpm离心30s，收集菌体；利用质粒提取实际盒(美国NEB公司)提取，得到pIRES-Col IIIɑ-1质粒。
3、双酶切反应
在一些实施例中，将上述扩增得到的带有XbaI序列和Not1序列的 P4HA1目的片段和提取得到的pIRES-Col IIIɑ-1分别经过XbaI和MIuI 双酶切，得到的双酶切产物进行T4连接酶连接反应，得到连接Col IIIɑ-1 目的片段和P4HA1目的片段的线性化pIRES质粒。
在一些实施例中，对P4HA1目的片段进行双酶切的反应体系包括： 2μL 10×MBuffer、1.3μL XbaI(Sigma-Aldrich公司)、1.3μL MIuI(ABclonal 公司)、10μL P4HA1目的片段、5.4μL灭菌水。
在一些实施例中，对pIRES-Col IIIɑ-1质粒进行双酶切的反应体系包括：2μL 10×M Buffer、1.3μL XbaI、1.3μL MIuI、5μL pIRES质粒、5.4μL 灭菌水。
在一些实施例中，将得到的双酶切产物进行T4连接酶连接反应的反应体系包括：1.5μL 10×M Buffer、5μLP4HA1目的片段双酶切产物、4μL pIRES-Col IIIɑ-1质粒双酶切产物、1μL T4连接酶(翌圣公司)、5.4μL 灭菌水。
4、转化及鉴定
在本申请实施例中，将上述双酶切得到的同时连接Col IIIɑ-1目的片段和P4HA1目的片段的线性化pIRES质粒转化进入大肠杆菌E.coli DH5ɑ中，筛选阳性菌落，提取重组质粒，以便大量获得重组质粒，并对其进行鉴定。具体的转化、筛选和鉴定过程与上述实施例相同。结果如图2所示，从阳性菌落中提取的质粒进行扩增和酶切后的产物，进行凝脂糖凝胶电泳结构显示，其得到了质粒载体片段(6kb)、目的片段(1.3kb)和目的片段(2.7kb)，表明载体构建成功，该重组载体命名为pIRES-Col IIIɑ-1-P4HA1。
重组Col III工程菌的构建
1、制备感受态毕赤酵母X33
将毕赤酵母X33菌株的冻干管(上海钦诚生物科技有限公司)从-80℃环境中取出，置于冰上溶解后，用YPD琼脂平板划线后于30℃培养 24～48h,得到活化的平板菌落。挑起平板菌落至液体YPD液体便宜基中，于30℃培养至OD600至1.3以上，收获菌液，1500g、4℃离心5min，取菌体沉淀，用无菌去离子重悬2次，离心后再次用20mL 1M山梨糖醇水溶液重悬菌体2次，冰浴，即为感受态毕赤酵母X33。
2、转化
在本申请实施例中，先将上述实施例制得的重组质粒pIRES-Col III ɑ-1-P4HA1采用BamHI酶切，使得其线性化，然后将线性化的pIRES-Col IIIɑ-1-P4HA1电转化进入上述制得的感受态毕赤酵母X33，以得到能够重组表达Col III的毕赤酵母，并筛选和鉴定其中的阳性转化子。
在一些实施例中，对重组质粒pIRES-Col IIIɑ-1-P4HA1进行线性化酶切的反应体系包括：重组质粒6μg、BamHI酶(D6053，碧云天)4μL、 10×Buffer 5μL，补水至50μL；反应条件包括：37℃反应6h。
在一些实施例中，电转化的步骤包括：取80μg感受态毕赤酵母，加入10μg线性化质粒，将混合液转到电转杯中，冰浴后，用Bio-Rad MicroPulser电穿孔仪进行电转化，电击后，立即向电转杯中加入1mL含)从不带抗性的YPD平板上挑取毕赤酵母X33单菌落，接种于1mL YPDS 培养基(含酵母提取物10g/L，蛋白脉20g/L，葡萄糖20g/L，山梨醇1M， 100μg/mL博莱霉素(Zeocin，自江晨生物有限公司))，于30℃摇床振荡培养过夜；5000rpm离心收集菌体，用0.9％生理盐水重悬，涂布于含有 250μg/mLG418(Thermo Fisher)的YPD平板上，待菌液被完全吸收后，30℃倒置培养2～3天。
在一些实施例中，对重组酵母的阳性转化子进行筛选与鉴定的步骤包括：挑选能够Zencin抗性的平板上生长的菌落初步判定为阳性克隆，挑长势较好的菌落于YPD液体培养基，30℃过夜培养，离心收集菌体，取酵母基因组，再将基因组进行PCR扩增鉴定。
在一个具体的实施例中，该重组酵母的阳性转化子DNA提取步骤包括：取重组酵母(200μg)，12000rpm离心1min，用无菌水洗涤2次后，加入600μL山梨醇缓冲液和50ULyticase(Sigma)，充分混匀，于30℃酶解破壁30min后，反应物于4000rpm离心10min，收集沉淀；加入向沉淀加入200μL GA缓冲液重悬沉淀，并充分混匀后，向其中加入20μL 蛋白酶K(索莱宝公司)溶液，充分混匀；加入220μLGB缓冲液，充分混匀，于70℃放置10min，离心，去除管盖内壁的水珠，加入220μL无水乙醇，充分颠倒混匀；过DNA吸附柱，重复洗涤三次，干燥以去除吸附材料中残留的漂洗液，即得到重组毕赤酵母DNA溶液，取1μL进行 Col III和P4HA1 PCR扩增，并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
在一些实施例中，对Col III扩增反应的条件与上述鉴定携带 pIRES-Col IIIɑ-1的阳性转化子的实施例相同。对Col III和P4HA1 PCR 扩增反应的条件与实施例2的实施过程相同。结果如图3所示，重组毕赤酵母DNA溶液中能够检出重组质粒10kb的片段，以及目的片段(1.3kb)和目的片段(2.7kb)，说明得到的重组毕赤酵母X33构建成功。
重组Col III工程菌的表达及重组Col III的分离
在本申请实施例中，将重组Col III工程菌按照2％接种量接种至BGM 液体培养基中，30℃振荡培养至OD600至0.8以上时，离心收集菌液，按照10％的转接量接种至含10％木糖醇的BMM液体培养基中，30℃诱导培养72h，收集发酵液，离心，取上清液，加入20％的三氯乙酸，离心取沉淀，溶于上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳。
结果如图4所示，由诱导表达发酵液的上清液SDS-PAGE图可见，重组Col III工程菌诱导表达的Col III并分泌至胞外，表观分子量约40ku。
在本申请实施例中，将重组Col III工程菌的发酵液收集后，离心，取上清液，加入20％的三氯乙酸，离心取沉淀后，用PBS溶解后，上样于由分离分子量3000～60000的Bio-Gel P-60凝胶为填料的凝胶色谱柱(Bio公司)，柱床体积为500mL，柱高与直径的比约为8:1。上样前用pH＝6.8的PBS平衡液平衡层析柱至少3～5个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止(例如流出液的pH值等于上柱的Buffer的pH值)；按照5％的柱床体积(样品液含100mg/mL的重组Col III)，用pH＝6.8的PBS平衡液以5cm/h(线速度)进行洗脱，按照A260nm峰值，收集洗脱液，对收集的洗脱液进行浓缩，冷冻干燥，即可得到重组Col III-ɑ1的冻干品。
重组Col III水凝胶的制备
在本申请实施例中，将通过上述实施例制得的重组Col III-ɑ1经过多巴胺修饰，制得了一种重组人源III型胶原蛋白注射剂。
在一些实施例中，对重组Col III-ɑ1经过多巴胺修饰的步骤包括：活化重组ColIII-ɑ1端羟基、将端羟基活化的重组Col III-ɑ1与盐酸多巴胺偶联以及对其进行铁离子络合的步骤。
在一些实施例中，对重组Col III-ɑ1端羟基进行活化的步骤包括：使用对硝基苯基氯酸甲酯进行活化的步骤。例如，在取10g重组Col III-ɑ1 端羟基充分分散与含0.4％三乙胺的75％丙酮溶液中，在氮气氛围下，将该混合液逐滴加入至含0.1g/mL的对硝基苯基氯酸甲酯(p-NPC)中，混合室温反应48h，用包含氯化钠溶液萃取1次，向得到的有机相中加入无水硫酸钠，充分干燥，浓缩抽滤，将浓缩滤液加入至无水乙醚中，析出沉淀，依次用75％丙酮、75％乙醇和pH＝7.4的PB缓冲液洗涤多次，即可得到纯化的Col III-ɑ1-p-NPC。
在一些实施例中，将端羟基活化的重组Col III-ɑ1与盐酸多巴胺偶联的步骤包括：于氮气氛围下，将0.35g盐酸多巴胺分散溶解在4.5mL N,N- 二甲基甲酰胺，加入320μL三乙胺，充分搅拌20min后，逐滴加入溶解 2g Col III-ɑ1-p-NPC的氯仿溶液，反应48h，减压浓缩，过滤，取滤液滴入至冷的无水乙醚中，抽滤，滤液再次滴入(多次析出以提高产品收率)，将析出的沉淀冷冻干燥后，用10mM HCl溶解后，装入分子截留量为3500 的透析袋，在0.1mM HC1溶液中透析。48h后，浓缩干燥，得纯净Col III-ɑ1-DOPA。利用Wane和Benedic比色方法(WRITE J H,13ENEDICT C V.Assay of dihydroxyphenylalanine(DOPA)ininvertebrate structural proteins[J].Methods Enzymol,1984,107,397-413.)测定多巴胺与重组Col III 偶联率，采用左旋多巴胺作为标准品，得91.5％偶联率的Col III-ɑ1-DOPA。
在一些实施例中，对其进行铁离子络合的步骤包括：按照Col III-ɑ1-DOPA与葡萄酸亚铁的摩尔比为5:1的分量混合溶解在pH＝7.4PB 溶液中，充分搅拌直至形成凝胶状。在一个对比例中，对其进行铁离子络合的步骤包括：按照Col III-ɑ1-DOPA与氯化铁的摩尔比为3:1的分量混合溶解在pH＝7.4PB溶液中，充分搅拌直至形成凝胶状。
对上述实施例制得的重组Col III-ɑ1、Col III-ɑ1-p-NPC、Col III-ɑ1-DOPA和与铁离子络合的水凝胶，分别进行UV-Vis吸收光谱、红外光谱和圆二色谱分析。经过红外分析表明，重组Col III-ɑ1、Col III-ɑ1-p-NPC、Col III-ɑ1-DOPA和与铁离子络合的水凝胶均存在与天然胶原的酰胺A、III相同的光谱特征，表明两者具有相似的结构，并且仅与铁离子络合的水凝胶在1235cm-1和1450cm-1处吸光度的比值约为1.0。由此表明，重组Col III-ɑ1、Col III-ɑ1-p-NPC、Col III-ɑ1-DOPA并未形成三螺旋结构，而与铁离子络合的水凝胶中有三螺旋结构的存在。
动物试验
一、材料与方法
1、试验动物
豚鼠(400150g，广东省医学实验动物中心提供。
2、供试品
经过上述实施例可知，本申请实施例还将提供了一种重组人源III型胶原蛋白注射剂，该注射剂包括独立包装的Col III-ɑ1-DOPA溶液和葡萄糖亚铁溶液。该注射剂可以再以独立包装的Col III-ɑ1-DOPA和葡萄糖亚铁摩尔比例为5:1的条件下形成具有三螺旋和铁离子配位交联结构的水凝胶，能够增强胶原的粘合性，不仅保障了其力学性能的自粘合，还能够在体内具有优良的细胞、组织和生物相容性，非常适合应用在于皮肤或组织中创伤部位的胶原再生和组织填充。在一些优选的实施例中，该 Col III-ɑ1-DOPA溶液的浓度为1～15mg/mL，该葡萄糖亚铁溶液的浓度为 0.01～0.25mg/mL。进一步优选的实施例中，该ColIII-ɑ1-DOPA溶液的浓度为7～12mg/mL，该葡萄糖亚铁溶液的浓度为0.085～0.20mg/mL。
为此，本申请将上述制得的实施例3和对比例3分别提供的重组人源III型胶原蛋白注射剂作为供试品进行相关动物试验。其中，实施例3 提供的重组人源III型胶原蛋白注射剂包括独立包装的Col III-ɑ1-DOPA 溶液和葡萄糖亚铁溶液。对比例3提供的重组人源III型胶原蛋白注射剂包括独立包装的Col III-ɑ1-DOPA溶液和氯化铁溶液。其中，该ColIII-ɑ1-DOPA溶液的浓度为10mg/mL，该葡萄糖亚铁溶液的浓度为 0.15mg/mL，该葡萄糖亚铁溶液的浓度为0.15mg/mL。
3、急性创伤模型及分组实验
提前将豚鼠禁食18h，用10％水合氯醛按照剂量为0.3mL/100g腹腔注射进行麻醉，使用8％硫化钠溶液对大鼠背部两侧脱毛，消毒后，在大鼠的脊柱两侧制作直径为1.0cm的圆形皮肤缺损创面，深度至筋膜层，止血后对创面进行消毒和给药。
将具有创面的豚鼠分为模型组、试验组和对照组，另外不具有创面的正常豚鼠作为正常组。试验组，以实施例3提供的供试品进行给药，在给药前，将其独立包装的10mg/mLCol III-ɑ1-DOPA溶液和0.15mg/mL 该葡萄糖亚铁溶液按照Col III-ɑ1-DOPA和葡萄糖亚铁摩尔比例为5:1的比例混合后，放置30min，转移至一硫酸纸上以形成水凝胶，将硫酸纸携带水凝胶覆盖至豚鼠创面上，并用医用胶带固定，每日换药1次，自由进食，连续给药14日。停药1周后，其创面新生皮肤作为皮肤组织样品。对照1组，以对比例3提供的供试品进行给药，给药方式与试验组相同。对照2组，以实施例2提供的供试品进行给药，给药方式相同，区别在于其在硫酸纸上形成的水凝胶放置48后，再对豚鼠的创面进行给药。
4、评价指标
对伤口的外观进行肉眼观察，并拍照，并分别计算3d,7d和12d给药完成后的创面愈合率(％)＝(原创口面积－未愈创口面积)/原创口面积×100％。
对取样的创口附近的皮肤组织进行HE染色，并进行皮肤化学染色法测定III型胶原蛋白含量：制作皮肤组织样品的石蜡切片，采用有III型胶原多克隆抗体和链霉亲和素-生物素复合物(SABC)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，按抗体稀释度1:200倍进行操作，将石蜡切片经抗原修复后，滴加50g/L牛血清白蛋白封闭液，再分别滴加小鼠抗人III型胶原(一抗)100μL和0.01mol/LpH＝7.3PBS，室温反应1h后置于4℃下过夜，室温先恢复1h，滴加生物素化抗小鼠IgG(二抗)50μL，室温下静置 1h后再滴加试剂SABC静置1h，加入二氨基联苯胺显色，棕黄色为阳性染色。以上各步骤处理的石蜡切片均采用PBS液冲洗。采用计算机图像分析系统测定阳性面积占总面积的百分比，每张切片随机选择3个视野，以平均值和标准偏差进行表示。
本实验还进一步通过WesternBlot检测各组豚鼠创口再生皮肤中 PI3K/Akt信号转导通路PI3K和p-Akt蛋白的表达情况。将皮肤组织样品在液氮中充分预冷后，研磨成粉末后，用RIPA裂解液冰水裂解处理 10min，4℃12000rpm离心处理20min，提取皮肤组织总蛋白，用PBS溶液调整为含20μg/μL的蛋白溶液，采用PI3K ELISA试剂盒(CSB-E08417h，武汉华美生物)和p-Akt ELISA试剂盒(CSB-E08417h，江莱生物)检测其中PI3K和p-Akt含量。
二、结果
表1 创面愈合率％
分组 3d 7d 12d
试验组 71.51±2.27*# 92.36±4.07*# 98.07±1.34*#
对照1组 16.72±0.86* 63.18±2.35 91.86±3.12
对照2组 25.44±0.23*# 69.42±2.43# 94.32±1.65
模型组 6.73±0.15 62.34±1.62 92.03±1.75
正常组 － － － 
表1示出了各组试验在给药第3、7和12天的豚鼠创面愈合率，表中，“*”表示与模型组相比，P<0.05；“#”表示与对照1组，P<0.05，“－”无检测项。由表1可知，试验给药第3天后，试验组、对照1组和对照2组的创面愈合率相对于模型组均具有快速提高，并且试验组和对照2组的创面愈合率显著高于于对照1组；试验给药第7天后，试验组的创面愈合率显著高于对照1组和模型组并超过90％，对照2组的创面愈合率显著高于对照1组；试验给药第12天后、试验组的创面愈合率显著高于对照1组和模型组并且创面完全愈合。由此可知，试验组的豚鼠的创面愈合最快，愈合情况最好，而与之相比对照1组和对照2组的愈合较慢，愈合率不高，并且对照1组甚至与模型组的豚鼠创面自愈合情况类似。由此说明，实施例3提供的重组人源III型胶原蛋白注射剂具有更好的效果，不仅在于其采用了葡萄糖亚铁作为配位金属离子，而且在于其将Col III-ɑ1-DOPA溶液和葡萄糖亚铁溶液进行了独立包装。
为进一步探究本申请实施例提高的重组人源III型胶原蛋白注射剂对豚鼠创面愈合的机制，本申请进一步对创面新生皮肤组织进行取样和HE 染色，结果如图5所示，试验组豚鼠，图中呈红色形状即为胶原，可见皮肤组织真皮层中含有大量呈束状排列的胶原纤维，胶原纤维中可见梭形的被染成蓝色的成纤维细胞核；而对照1组和对照2组的胶原纤维明显少于试验组，并且其中的胶原纤维排列紊乱。再次说明，本申请实施例提供的重组人源III型胶原蛋白注射剂具有更佳的促进大白鼠损伤皮肤中胶原再生和胶原纤维分布正常化的功效，从而能够快速促使其创口愈合。
表2
分组 COL-III(％) PI3K(ng/g) p-Akt(ng/g)
试验组 63.15±3.19a 10.25±1.16a 9.34±1.15a
对照1组 34.57±1.34c 4.21±0.75c 3.29±0.85c
对照2组 41.29±1.78b 6.72±0.52b 5.37±0.96b
模型组 6.06±1.24c 3.76±0.37c 3.81±0.75c
正常组 69.62±3.41a 12.56±2.35a 10.69±1.74a 
表2示出了各组试验豚鼠创面再生皮肤中III型胶原蛋白的相对含量以及PI3K和p-Akt的表达量，表2中对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。由表2可知，模型组中由于对豚鼠的创面再生皮肤中的胶原蛋白含量显著下降，并且其PI3K和p-Akt表达量显著降低。而相对于模型组，试验组在给药后，其胶原蛋白含量、PI3K和p-Akt表达量均显著升高；而且试验组的胶原蛋白含量、PI3K和p-Akt表达也显著高于对照 1组和对组2组。由此说明，采用本申请实施例提供重组人源III型胶原蛋白注射剂对豚鼠创面愈合后，其再生皮肤中的胶原能够显著升高至于正常组无差别，说明其对促进豚鼠创面中的胶原再生；同时促进了其PI3K 和p-Akt表达量升高，推测本申请实施例提供的重组人源III型胶原蛋白注射剂可能通过促进真皮组织PI3K/Akt信号通路促进了豚鼠创面皮肤中胶原再生。而对照1组和对照2组中，使用了对比例3提供的重组人源 III型胶原蛋白注射剂或者提供的注射剂未进行独立包装而提前制备得到了水凝胶，这样均不利于豚鼠皮肤胶原再生。
综上所述，本申请实施例通过构建了Col IIIɑ-1和P4HA融合表达质粒pIRES-ColIIIɑ-1-P4HA1，并将其转入感受态毕赤酵母X33，制备了能够胞外表达III胶原蛋白ɑ链的基因工程菌。通过对该基因工程菌进行发酵培养，能够大量收获胞外表达的III胶原蛋白ɑ链，极大地利于其下游纯化和提取。
为此，本申请实施例进一步利用该III胶原蛋白ɑ链制得了一种重组人源III型胶原蛋白注射剂，该注射剂包括独立包装的Col III-ɑ1-DOPA 溶液和葡萄糖亚铁溶液，可以再以独立包装的Col III-ɑ1-DOPA和葡萄糖亚铁摩尔比例为5:1的条件下形成具有三螺旋和铁离子配位交联结构的水凝胶，能够增强胶原的粘合性，不仅保障了其力学性能的自粘合，还能够在体内具有优良的细胞、组织和生物相容性，非常适合应用在于皮肤或组织中创伤部位的胶原再生和组织填充。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江双糖生物科技有限公司
<120> 重组人源III型胶原蛋白注射剂及其在在皮肤胶原再生中的应用
<141> 2022-06-09
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gctctagaat ggtgaagctt agc 23
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgcggccgc tttaacattt cttgaag 27
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gctctagagc gcccagtcgc gc 22
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tctgtactgt gctgtg 16
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cagtacagag tatctaag 18
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cgacgcgtcg tttttttaaa aaagatttaa gat 33
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ctgtctctct ggcaggtaat 20
<210> 8
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
agagacagaa gtac 14
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tgtgatacca acagaa 16
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tatcacagaa gacaagg 17

Claims (7)

1.一种重组III型胶原蛋白注射剂的制备方法，包括：
分别获得人源III型胶原蛋白ɑ-1链编码基因的目的片段和人源4-脯氨酸羟基化酶亚基ɑ-1编码基因的目的片段；
构建人源III型胶原蛋白ɑ-1链的目的基因和人源4-脯氨酸羟基化酶亚基ɑ-1的目的基因的重组表达质粒；
构建重组表达III型胶原蛋白ɑ-1链的重组毕赤酵母菌；
诱导培养所述重组毕赤酵母菌；
收获培养液，离心取上清液，分离纯化得到重组III型胶原蛋白ɑ-1链；
对所述重组III型胶原蛋白ɑ-1链进行多巴胺修饰，制得所述重组人源III型胶原蛋白注射剂；
其中，“对所述重组III型胶原蛋白ɑ-1链进行多巴胺修饰”的步骤包括：
活化重组ColIII-ɑ1端羟基，包括使用对硝基苯基氯酸甲酯进行活化的步骤；
将端羟基活化的重组Col III-ɑ1与盐酸多巴胺偶联，包括：于氮气氛围下，将盐酸多巴胺分散溶解在 N,N- 二甲基甲酰胺，加入三乙胺，充分搅拌20min后，逐滴加入溶解ColIII-ɑ1-p-NPC的氯仿溶液，反应48h，减压浓缩，过滤，取滤液滴入至冷的无水乙醚中，抽滤，滤液再次滴入，将析出的沉淀冷冻干燥后，用10mM HCl溶解后，装入分子截留量为3500 的透析袋，在0.1mM HC1溶液中透析，48h后，浓缩干燥，得纯净Col III-ɑ1-DOPA；以及
对其进行铁离子络合的步骤，包括：按照Col III-ɑ1-DOPA与葡萄酸亚铁的摩尔比为5:1的分量混合溶解在pH＝7.4PB溶液中，充分搅拌直至形成凝胶状。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，“分别获得人源III型胶原蛋白ɑ-1链编码基因的目的片段和人源4-脯氨酸羟基化酶亚基ɑ-1编码基因的目的片段”包括体外合成带有酶切位点的III型胶原蛋白ɑ-1链编码基因的目的片段和带有酶切位点的4-脯氨酸羟基化酶亚基ɑ-1编码基因的目的片段，并分别进行PCR扩增的步骤。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，对III型胶原蛋白ɑ-1链编码基因的目的片段进行PCR扩增的反应体系包括：12µL 2×Buffer、1µLCol III ɑ-1目的片段、1µL 10µM引物F1、1µL 10µM引物R1、4µL dNTP、1µLPrime STAR、2µL DMSO和8µL无菌双蒸水；其中，F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，“构建人源III型胶原蛋白ɑ-1链的目的基因和人源4-脯氨酸羟基化酶亚基ɑ-1的目的基因的重组表达质粒”的步骤包括：
将带有酶切位点的III型胶原蛋白ɑ-1链编码基因的目的片段与质粒进行酶切反应后，采用T4连接酶连接，得到连接Col III ɑ-1目的片段的线性化pIRES质粒转入大肠杆菌E.coli DH5ɑ中，筛选阳性菌落，提取重组质粒，以便大量获得重组质粒pIRES-Col III ɑ-1；
再将带有酶切位点的P4HA1目的片段和提取得到的pIRES-Col III ɑ-1进行双酶切反应后，采用T4连接酶连接，得到连接Col III ɑ-1目的片段和P4HA1目的片段的线性化pIRES质粒，转入大肠杆菌E.coli DH5ɑ中，筛选阳性菌落，提取重组质粒，以便大量获得重组质粒pIRES-Col III ɑ-1-P4HA1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，将重组质粒pIRES-Col III ɑ-1-P4HA1转入感受态毕赤酵母X33，于含有博莱霉素的YPDS培养基上培养，收集菌体，筛选阳性转化子，通过PCR扩增鉴定得到重组表达Col III ɑ-1的毕赤酵母X33。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，将重组表达Col III ɑ-1的毕赤酵母X33进行诱导培养，收集培养液，离心，取上清液，得到重组表达的Col III ɑ-1。
7.一种如权利要求1~6任一所述的制备方法制得的重组人源III型胶原蛋白注射剂。
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