CN107236046B - 一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107236046B
CN107236046B CN201710339825.XA CN201710339825A CN107236046B CN 107236046 B CN107236046 B CN 107236046B CN 201710339825 A CN201710339825 A CN 201710339825A CN 107236046 B CN107236046 B CN 107236046B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
gly
ala
her2
recombinant human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710339825.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN107236046A (zh
Inventor
徐根兴
华子春
谷鹏
荣志刚
朱浩文
黄佩华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHANGZHOU HIGH-TECH RESEARCH INSTITUTE OF NANJING University
JIANGSU WUZHONG PHARMACEUTICAL Group Corp.
Original Assignee
Changzhou High-Tech Research Institute Of Nanjing University
Suzhou Zhongkai Biology Pharmaceutical Factory Jiangsu Wuzhong Pharmaceutical Group Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changzhou High-Tech Research Institute Of Nanjing University, Suzhou Zhongkai Biology Pharmaceutical Factory Jiangsu Wuzhong Pharmaceutical Group Corp filed Critical Changzhou High-Tech Research Institute Of Nanjing University
Priority to CN201710339825.XA priority Critical patent/CN107236046B/zh
Publication of CN107236046A publication Critical patent/CN107236046A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107236046B publication Critical patent/CN107236046B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种Her2纳米抗体二聚体与一种重组人内皮抑素构成融合蛋白及其制备方法和应用，重组人内皮抑素融合蛋白包括Her2纳米抗体二聚体和重组人内皮抑素蛋白，该融合蛋白易于纯化，能特异性靶向Her2高表达的乳腺癌细胞，并具有较好的穿膜效果，能有效抑制肿瘤细胞生长；本发明公开了重组人内皮抑素融合蛋白可应用于制备临床上靶向检测或治疗乳腺癌的药物，可提高药物在肿瘤病变部位的浓度，相应提高了量效比；本发明还公开了重组人内皮抑素融合蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌，以及基因工程制备方法，以应用于融合蛋白的临床生产制备。

Description

一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤需要功能性的血管网络提供氧气、养料并清除代谢产物。肿瘤除了通过与宿主血管融合而获得部分血管外，还必须通过形成新生血管网构建自己的血管系统，这样才能持续地生长和发展。如果没有血管系统提供氧气和养料，实体瘤的增长不会超过1mm3。实体肿瘤的生长和转移依赖于新生血管生成的学说的提出，为肿瘤治疗开辟了一个新的途径。
1997年，哈佛大学O’Reilly等发现小鼠血管内皮瘤(EOMA)细胞系的培养液能够抑制血管内皮细胞的增殖。通过分离纯化得到一种新的蛋白质，命名为鼠的Endostatin，后来翻译成血管内皮抑制素(简称内皮抑素)。内皮抑素是由细胞外基质成分胶原XⅧ的羧基末端水解而来的一种动物体内天然存在的蛋白，是一种内源性血管形成抑制因子，能有效地抑制机体内病理性血管的形成，具有广谱的抗肿瘤作用。关于人血管内皮抑制素(ES)，在临床研究中发现，Down’s综合症病人的ES表达水平较高，实体瘤发病率很低；癌症患者血清中ES的含量有利于总生存时间的延长。体外研究发现，ES特异性地抑制微血管内皮细胞的增殖、迁移、粘附和存活，能有效地抑制鸡胚尿囊膜(CAM)新生血管的形成，而实验性动物研究也证实ES有显著的抗肿瘤作用。目前发现ES可以和内皮细胞(ECs)表面多个非特异性受体结合，抑制ECs在血管形成中的作用。人血管内皮抑制素同样具有抑制肿瘤的作用，因此，关于人内皮抑素的研究也越来越多。
中国专利文献CN1177005A是国际上关于内皮抑素的最早获得授权的专利之一，其中通过大肠杆菌表达了人内皮抑素基因，是人胶原蛋白十八基因1503-2055表达的蛋白活性片段，184个氨基酸，分子量20KD，与小鼠内皮抑素氨基酸序列有85.33％的同源性，目前已经完成三期临床研究。我国以大肠杆菌表达系统生产了新型重组人内皮抑素(recombinant human endostatin，rh-ES，商品名Endostar，恩度)，其氨基末端经过基因修饰加上了9个氨基酸序列(MGGSHHHHH)，形成6个组氨酸标签，从而简化了纯化工艺，中国食品药品监督管理局(SFDA)在2005年9月批准了恩度联合NP(诺维本+顺铂)方案治疗晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)的适应症。但是Endostar在使用时仍存在一些缺点，如由于其体内半衰期短，入胞能力差，临床上的使用剂量较大，增加了患者的经济和身体负担。为解决上述问题，中国专利文献CN105646701A中公开了一种与Endostar有13个氨基酸差异的重组内皮抑素蛋白，该重组内皮抑素蛋白更容易进入血管内皮细胞和鸡胚绒毛尿囊膜血管内皮细胞，蛋白穿膜效果和N端的结构稳定性都有了显著提高。虽然改造后的重组内皮抑素其抑制肿瘤细胞生长的效果显著提高，但重组内皮抑素进入人体后由于不具备器官靶向性，会在体内随内循环进入各处，导致其组织分布的相对平均，未能在病灶部位形成有效的抗肿瘤浓度，且由于其未能有效地输送至病变部位会产生扩散降解，因此临床使用剂量较高和使用周期较长。为了提高重组内皮抑素蛋白的靶向性，目前采用的融合蛋白通常采用人源的单克隆抗体融合到重组内皮抑素蛋白上以提高靶向性，如美国专利文献US9611313B2中，将人类野生型人内皮抑制素huEndo或突变形式的人内皮抑制素(huEndo-P125A)融合到人源化抗HER2IgG3抗体的3'端，产生两种抗HER2人内皮抑素融合蛋白αHER2-huEndo和HER2IgG3-huEndo-P125A，然而采用人源的单克隆抗体虽然能够提高靶向性，但是申请人发现人源的单克隆抗体穿膜效果较差，限制了抗HER2人内皮抑素融合蛋白的应用。
Her2是由原癌基因Her2/neu编码的185KD的跨膜受体，是表皮生长因子(EGF)酪氨酸蛋白激酶受体家族的成员。大约26％的乳腺癌出现Her2基因的高表达，其过度活化可能与肿瘤的增殖、浸润和转移等行为有关，因此Her2被认为是乳腺癌检测和治疗的最佳靶点，已经有相应的抗体药物如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗等临床使用。曲妥珠单抗治疗Her2阳性乳腺癌疗效确切，但即使是Her2高表达或基因扩增的患者，有效率也仅为12％～34％。纳米抗体(nanobody,Nb)是近年来发现的一种新型抗体，即重链单域抗体VHH(variable domainof heavy chain of heavy-chainantibody)，来源自骆驼体内存在着天然缺失轻链的重链抗体(heavy-chain antibody,HCAb)，克隆其可变区而得到的只由一个重链可变区组成的单域抗体，是目前可以得到的具有完整功能的稳定的可结合抗原的最小单位。其相对分子质量为15KD，比单抗小很多，可以有效地穿透浓密的组织，到达传统抗体无法到达的地方，并且纳米抗体迅速通过肾脏系统的过滤排出身体。因此，当纳米抗体用放射性或荧光染料标记，可以在给药后在靶细胞部位产生非常高的对比度，对肿瘤的检测和靶向治疗具有非常重要的临床价值。但纳米抗体单体由于分子量过小，进入人体后稳定性差，作为药物使用时需要多次服药以维持药用浓度；同时纳米抗体在保藏以及运输过程中容易发生降解，不利于长时间保藏与运输，使纳米抗体的使用成本升高，影响了纳米抗体作为疾病治疗药物开发中的药用效果，因此，现有技术中还未提出一种利用纳米抗体制备重组人内皮抑素融合蛋白的方案。
发明内容
因此，本发明要解决的第一个技术问题在于克服现有技术中纳米抗体单体在进入人体后易分解，保藏时稳定性较低，易随保藏时间延长而发生降解的缺陷，从而提供一种可以长时间稳定保藏和运输的Her2纳米抗体二聚体。
本发明要解决的第二个技术问题在于克服现有技术中的重组人内皮抑素进入人体后由于不具备器官靶向性或靶向性差,未能有效地输送至病变部位产生扩散降解，从而提供一种可以靶向Her2阳性乳腺癌病变部位，并能有效抑制乳腺癌细胞增殖的重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用。
本发明提供了一种Her2纳米抗体二聚体，所述Her2纳米抗体二聚体包括2个Her2纳米抗体单体、连接肽和Her2结合肽。
所述的Her2纳米抗体二聚体，所述连接肽序列如SEQ ID NO.4所示，所述Her2结合肽序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的Her2纳米抗体二聚体，所述Her2纳米抗体二聚体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明提供了一种编码上述Her2纳米抗体二聚体的基因，所述Her2纳米抗体二聚体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了一种重组人内皮抑素融合蛋白，所述重组人内皮抑素融合蛋白包括上述Her2纳米抗体二聚体和重组人内皮抑素蛋白。
所述的重组人内皮抑素融合蛋白，所述重组人内皮抑素蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.5所示。
所述的重组人内皮抑素融合蛋白，所述重组人内皮抑素蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
所述的重组人内皮抑素融合蛋白，所述Her2纳米抗体二聚体连接于所述重组人内皮抑素蛋白的N端或C端。
所述的重组人内皮抑素融合蛋白，所述重组人内皮抑素融合蛋白还包括连接Her2纳米抗体二聚体和所述重组人内皮抑素蛋白的连接肽，所述连接肽序列如SEQ ID NO.4所示。
所述的重组人内皮抑素融合蛋白，所述重组人内皮抑素融合蛋白选自如下蛋白：
(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)，其氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示；
(N)-重组人内皮抑素蛋白-Her2纳米抗体二聚体-(C)，其氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示；或
(N)-Her2纳米抗体二聚体-连接肽-重组人内皮抑素蛋白-(C)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明提供了一种编码上述重组人内皮抑素融合蛋白的基因，所述编码基因选自如下基因：
(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
(N)-重组人内皮抑素蛋白-Her2纳米抗体二聚体-(C)的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；或
(N)-Her2纳米抗体二聚体-连接肽-重组人内皮抑素蛋白-(C)的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
上述的(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)，即表示所述的重组人内皮抑素融合蛋白从N端到C端依次为Her2纳米抗体二聚体、重组人内皮抑素蛋白；同理，所述的(N)-重组人内皮抑素蛋白-Her2纳米抗体二聚体-(C)，表示所述的重组人内皮抑素融合蛋白从N端到C端依次为重组人内皮抑素蛋白、Her2纳米抗体二聚体；(N)-Her2纳米抗体二聚体-连接肽-重组人内皮抑素蛋白-(C)，表示所述的重组人内皮抑素融合蛋白从N端到C端依次为Her2纳米抗体二聚体、连接肽和重组人内皮抑素蛋白。
本发明提供了包含上述的Her2纳米抗体二聚体的编码基因或上述的重组人内皮抑素融合蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
本发明提供了一种重组人内皮抑素融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)构建所述Her2纳米抗体二聚体的编码基因和所述重组人内皮抑素融合蛋白的编码基因；
(2)将步骤(1)中的编码基因克隆至表达载体中得到重组表达载体；
(3)将步骤(2)中获得的所述重组表达载体转化宿主细胞，获得表达重组人内皮抑素融合蛋白的工程菌，发酵培养得到所述重组人内皮抑素融合蛋白；
(4)纯化分离得到的所述重组人内皮抑素融合蛋白。
本发明提供了上述重组人内皮抑素融合蛋白在制备检测或靶向治疗乳腺癌的药物中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下优点：
1、本发明所述的Her2纳米抗体二聚体，包括2个Her2纳米抗体单体、连接肽和Her2结合肽；二聚体形态的Her2纳米抗体单体进入体内后的稳定性显著提高，同时Her2纳米抗体二聚体能够长时间保存，易于保藏和运输，降低了抗体的使用成本；Her2纳米抗体二聚体包括2个Her2纳米抗体单体，在结合癌细胞中Her2受体时产生协同抑制作用，增强了对癌细胞的抑制作用；Her2纳米抗体二聚体包括Her2结合肽，Her2结合肽与Her2受体特异性结合，提高了Her2纳米抗体二聚体靶向Her2的结合亲和力。
2、本发明所述的重组人内皮抑素融合蛋白，包括Her2纳米抗体二聚体和重组人内皮抑素蛋白；重组人内皮抑素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，该重组内皮抑素蛋白更容易进入血管内皮细胞和鸡胚绒毛尿囊膜血管内皮细胞，蛋白穿膜效果和N端的结构稳定性都有了显著提高，可以直接抑制肿瘤细胞生长，并发挥更好的抑制新生血管内皮细胞生成的作用；Her2纳米抗体二聚体连接于所述重组人内皮抑素蛋白的N端或C端，使重组人内皮抑素蛋白能够直接靶向Her2高表达的乳腺癌细胞，从而特异性抑制乳腺癌细胞和癌症病变区域新生血管的形成，达到治疗乳腺癌的效果；重组内皮抑素蛋白在病变区富集可减少全身用量，降低副作用，提高量效比。
3、本发明所述的重组人内皮抑素融合蛋白同时发挥高效抑制肿瘤新生血管内皮细胞生成和靶向癌症病变部位的功能，能够应用于制备检测或靶向治疗Her2高表达的乳腺癌的药物。
4、本发明所述的重组人内皮抑素融合蛋白，由于纳米抗体具有较好的亲水性和可溶性，提高了重组人内皮抑素融合蛋白在体内的吸收率和其作为靶向检测和治疗肿瘤药物的利用率。
5、本发明所述的编码重组人内皮抑素融合蛋白的基因，由于重组人内皮抑素融合蛋白能够靶向Her2高表达的肿瘤细胞并高效抑制肿瘤新生血管内皮细胞生成，上述编码重组人内皮抑素融合蛋白的基因可应用于检测或治疗Her2高表达的肿瘤。
6、本发明所述的包含Her2纳米抗体二聚体的编码基因或重组人内皮抑素融合蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌，以及重组人内皮抑素融合蛋白的制备方法，为制备检测或治疗乳腺癌潜在药物提供了新的基因工程表达载体、细胞系以及重组菌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1 为本发明实施例1中pET-28a-Dim-1重组载体测序检测结果；
图2 为本发明实施例1中TOP10-pET28a-Dim-endo(m)质粒测序检测结果；
图3 为本发明实施例1中TOP10-pET28a-Dim-endo(m)的质粒图谱；
图4 为本发明实施例1中(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)诱导表达的鉴定结果；
其中图A显示20℃诱导18h后融合蛋白表达的SDS-PAGE检测结果，泳道1：IPTG0.5mM诱导后上清中融合蛋白，泳道2：IPTG 0.5mM诱导后沉淀中融合蛋白，泳道3：IPTG1.0mM诱导后上清中融合蛋白，泳道4：IPTG 1.0mM诱导后沉淀中融合蛋白；
图B显示37℃诱导6h后融合蛋白表达的SDS-PAGE检测结果，泳道1：IPTG 0.5mM诱导后上清中融合蛋白，泳道2：IPTG 0.5mM诱导后沉淀中融合蛋白，泳道3：IPTG 1.0mM诱导后上清中融合蛋白，泳道4：IPTG 1.0mM诱导后沉淀中融合蛋白；
图C显示融合蛋白表达的量化图，柱形图从左向右依次显示IPTG 0.5mM、20℃诱导18h后的上清、IPTG 0.5mM、20℃诱导18h后的沉淀，IPTG 1.0mM、20℃诱导18h后的上清、IPTG 1.0mM、20℃诱导18h后的沉淀，IPTG 0.5mM、37℃诱导6h后的上清、IPTG 0.5mM、37℃诱导6h后的沉淀，IPTG 1.0mM、37℃诱导6h后的上清、IPTG 1.0mM、37℃诱导6h后的沉淀；
图5 为本发明实施例1中(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)纯化复性后的鉴定结果；
其中图A显示(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)纯化和复性后SDS-PAGE检测结果，泳道1：PBS洗涤2次后的电泳图，泳道2：PBS洗涤3次后的电泳图，泳道3：PBS洗涤4次后的电泳图，泳道4：PBS洗涤5次后的电泳图；
图B显示(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)纯化复性后的梯度复性；M为标准蛋白。
图6 为本发明实施例4中pET-28a-Dim、pET-28a-Tet和pET-28a-Hex的质粒图谱，其中图A显示pET-28a-Dim的质粒图谱，图B显示pET-28a-Tet的质粒图谱，图C显示pET-28a-Hex的质粒图谱；
图7 为本发明实施例4中Her2纳米抗体二聚体诱导表达的鉴定结果；
其中图A显示不同诱导条件下Her2纳米抗体二聚体表达的SDS-PAGE检测结果，泳道自左向右依次表示诱导条件为：(IPTG 0mM,37℃,6h)(IPTG 0.5mM,37℃,6h)(IPTG1.0mM,37℃,6h)(IPTG 0mM,20℃,12h)(IPTG 0.5mM,20℃,12h)(IPTG 1.0mM,20℃,12h)；
图B显示Her2纳米抗体二聚体表达的量化图，柱形图从左向右依次显示(IPTG0mM,37℃,6h)(IPTG 0.5mM,37℃,6h)(IPTG 1.0mM,37℃,6h)(IPTG 0mM,20℃,12h)(IPTG0.5mM,20℃,12h)(IPTG 1.0mM,20℃,12h)诱导后的上清和(IPTG 0mM,37℃,6h)(IPTG0.5mM,37℃,6h)(IPTG 1.0mM,37℃,6h)(IPTG 0mM,20℃,12h)(IPTG 0.5mM,20℃,12h)(IPTG 1.0mM,20℃,12h)诱导后的沉淀；
图8 为本发明实施例4中Her2纳米抗体四聚体诱导表达的鉴定结果；
其中图A显示不同诱导条件下Her2纳米抗体四聚体表达的SDS-PAGE检测结果，泳道自左向右依次表示诱导条件为：(IPTG 0mM,37℃,6h)(IPTG 0.5mM,37℃,6h)(IPTG1.0mM,37℃,6h)(IPTG 0mM,20℃,12h)(IPTG 0.5mM,20℃,12h)(IPTG 1.0mM,20℃,12h)；
图B显示Her2纳米抗体四聚体表达的量化图，柱形图从左向右依次显示(IPTG0mM,37℃,6h)(IPTG 0.5mM,37℃,6h)(IPTG 1.0mM,37℃,6h)(IPTG 0mM,20℃,12h)(IPTG0.5mM,20℃,12h)(IPTG 1.0mM,20℃,12h)诱导后的上清和(IPTG 0mM,37℃,6h)(IPTG0.5mM,37℃,6h)(IPTG 1.0mM,37℃,6h)(IPTG 0mM,20℃,12h)(IPTG 0.5mM,20℃,12h)(IPTG 1.0mM,20℃,12h)诱导后的沉淀；
图9 为本发明实施例4中Her2纳米抗体六聚体诱导表达的鉴定结果；
其中图A显示不同诱导条件下Her2纳米抗体六聚体表达的SDS-PAGE检测结果，泳道自左向右依次表示诱导条件为：(IPTG 0mM,37℃,6h)(IPTG 0.5mM,37℃,6h)(IPTG1.0mM,37℃,6h)(IPTG 0mM,20℃,12h)(IPTG 0.5mM,20℃,12h)(IPTG 1.0mM,20℃,12h)；
图B显示Her2纳米抗体六聚体表达的量化图，柱形图从左向右依次显示(IPTG0mM,37℃,6h)(IPTG 0.5mM,37℃,6h)(IPTG 1.0mM,37℃,6h)(IPTG 0mM,20℃,12h)(IPTG0.5mM,20℃,12h)(IPTG 1.0mM,20℃,12h)诱导后的上清和(IPTG 0mM,37℃,6h)(IPTG0.5mM,37℃,6h)(IPTG 1.0mM,37℃,6h)(IPTG 0mM,20℃,12h)(IPTG 0.5mM,20℃,12h)(IPTG 1.0mM,20℃,12h)诱导后的沉淀；
图10 为本发明实施例4中动态光散射(DLS)实验检测Her2纳米抗体多聚体的粒径大小分布比例；
其中图A显示Her2纳米抗体二聚体的粒径大小分布比例；图B显示Her2纳米抗体四聚体的粒径大小分布比例；图C显示Her2纳米抗体六聚体的粒径大小分布比例；
图11 为本发明实施例4中圆二色谱法测定Her2纳米抗体多聚体的二级结构；
图12 为本发明实施例4中Her2纳米抗体二聚体、Her2纳米抗体四聚体和Her2纳米抗体六聚体在4℃、-20℃和-80℃下放置14天后蛋白剩余情况；
其中图A显示放置14天后剩余蛋白的SDS-PAGE检测结果，泳道1、2、3依次显示Her2纳米抗体二聚体在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道4、5、6依次显示Her2纳米抗体四聚体在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道7、8、9依次显示Her2纳米抗体六聚体在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白；
图B显示放置14天后剩余蛋白的量化图；
图13 为本发明实施例4中Her2纳米抗体二聚体、Her2纳米抗体四聚体和Her2纳米抗体六聚体在4℃、-20℃和-80℃下放置21天后蛋白剩余情况；
其中图A显示放置21天后剩余蛋白的SDS-PAGE检测结果，泳道1、2、3依次显示Her2纳米抗体二聚体在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道4、5、6依次显示Her2纳米抗体四聚体在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道7、8、9依次显示Her2纳米抗体六聚体在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白；
图B显示放置21天后剩余蛋白的量化图；
图14 为本发明实施例4中Her2纳米抗体二聚体、Her2纳米抗体四聚体和Her2纳米抗体六聚体在4℃、-20℃和-80℃下放置42天后蛋白剩余情况；
其中图A显示放置42天后剩余蛋白的SDS-PAGE检测结果，泳道1、2、3依次显示Her2纳米抗体二聚体在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道4、5、6依次显示Her2纳米抗体四聚体在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道7、8、9依次显示Her2纳米抗体六聚体在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白；
图B显示放置42天后剩余蛋白的量化图；
图15 为本发明实施例4中Her2纳米抗体二聚体、Her2纳米抗体四聚体和Her2纳米抗体六聚体在4℃、-20℃和-80℃下放置60天后蛋白剩余情况；
其中图A显示放置60天后剩余蛋白的SDS-PAGE检测结果，泳道1、2、3依次显示Her2纳米抗体二聚体在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道4、5、6依次显示Her2纳米抗体四聚体在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道7、8、9依次显示Her2纳米抗体六聚体在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白；
图B显示放置60天后剩余蛋白的量化图；
图16 为本发明实施例5中(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)对乳腺癌细胞SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231和正常乳腺细胞HBL100的抑制作用；柱形图由左至右依次蛋白浓度为5.50ug/ml对细胞SK-BR-3、MDA-MB-231、MCF-7和HBL100的抑制效果；蛋白浓度为13.75ug/ml对细胞SK-BR-3、MDA-MB-231、MCF-7和HBL100的抑制效果；蛋白浓度为27.50ug/ml对细胞SK-BR-3、MDA-MB-231、MCF-7和HBL100的抑制效果；
图17 为本发明实施例6中细胞免疫荧光检测Her2纳米抗体二聚体与乳腺癌细胞SK-BR-3的结合情况；图片由左至右依次显示细胞核DAPI染色结果、Her2纳米抗体二聚体在细胞中的染色定位结果和前两者染色的融合结果；
图18 为本发明实施例7中细胞免疫荧光检测(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)与乳腺癌细胞的结合情况；横向第一排显示SK-BR-3细胞中的免疫荧光检测结果，横向第二排显示MCF-7细胞中的免疫荧光检测结果；竖向第一列显示细胞核DAPI染色结果，竖向第二列显示(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)在细胞中的染色定位结果，竖向第三列为第一列和第二列染色的融合结果。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，所有引物合成以及测序工作由南京金斯瑞生物有限公司完成，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。如pET28a(+)购自Novagen公司，菌株Bl21(DE3)购自Novagen公司；下述实施例中所涉及的细胞均来自上海细胞所。
实施例1(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)的制备
1、构建TOP10-pET28a-Dim-endo(m)重组表达载体
所述Her2纳米抗体二聚体包括2个Her2纳米抗体单体、连接肽和Her2结合肽，所述Her2结合肽序列如SEQ ID NO.2所示，所述连接肽序列如SEQ ID NO.4所示，所述Her2纳米抗体二聚体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
1)由南京金斯瑞公司依据SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列合成Her2纳米抗体二聚体基因，利用引物1(5’-CAAGTCAAACTGGTGGAATCG-3’)和引物2(5’-CACGTCCATGTAACACGCATAG-3’)通过PCR在Her2纳米抗体二聚体基因的氨基端添加BamHI酶切位点，羧基端添加EcoRI酶切位点，克隆进入pET28a(+)载体的BamHI和EcoRI两个酶切位点位置，测序验证重组载体，验证结果如图1所示，序列符合SEQ ID NO.3所示的质粒即为pET-28a-Dim-1重组载体；
2)设计引物Endo-F和Endo-R，Endo-F序列为5’-ATGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGC-3’，Endo-R序列为5’-TTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCTG-3’，以pET28a-m-endostatin(保存于南京大学)为DNA模板，利用上述两种引物PCR扩增重组人内皮抑素融合蛋白基因，PCR扩增体系下所示：
DNA模板,1μl，
Endo-R,3pmoL,2μl，
Endo-F,3pmoL,2μl，
dNTP Mixture,1μl，
Taq DNA聚合酶,1μl，
ddH2O,补齐50μl；
PCR反应条件为：94℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸10min，30个循环；72℃退火10min。将PCR扩增产物纯化后和步骤1)中得到的所述pET-28a-Dim-1重组载体同时用EcoRI和XhoI双酶切，跑胶纯化，连接，连接体系如下所示：
pET-28a-Dim(EcoRI和XhoI双酶切),1μl，
PCR扩增片段,10μl，
10×T4ligase buffer,2μl，
T4ligase,1μl，
ddH2O,补齐20μl，
混匀后，22℃反应2h后，65℃10min或70℃5min终止反应。
3)将步骤2)中得到的连接产物转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，涂布Kan抗性平板进行筛选，通过对菌液PCR和测序筛选序列符合SEQ ID NO.10所示的质粒，测序结果如图2所示，即获得(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)基因克隆载体TOP10-pET28a-Dim-endo(m)(如图3所示)。
2、(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)的诱导表达和纯化
1)将质粒TOP10-pET28a-Dim-endo(m)转化到表达菌株Bl21(DE3)中。诱导表达菌株表达，在不同的IPTG诱导剂浓度(0.5mmol/L和1.0mmol/L)和不同的诱导温度(20℃和37℃)下分别诱导表达，在20℃培养温度下诱导18h，37℃培养温度下诱导6h。
2)离心收集菌体，将菌体超声破碎后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳，鉴定结果如图4所示，结果显示诱导后菌体在50KD附近有明显表达带，与预期相符；且在不同的诱导条件下融合蛋白均主要存在于沉淀中，即融合蛋白以包涵体的形式存在；IPTG浓度为0.5mM、20℃诱导18h后的沉淀中得到最高表达量的融合蛋白。
3)选用包涵体变性复性的方法纯化目的蛋白，首先大量诱导表达目的蛋白，离心获取菌体沉淀，预冷PBS悬浮后，超声破碎菌体，高速离心得到包涵体。离心得到的包涵体中含有一些细胞碎片和杂蛋白，通过PBS反复洗涤后，包涵体中目的蛋白的纯度有所上升。然后使用变性液(含质量浓度1％β-巯基乙醇的6M盐酸胍溶液)对包涵体进行溶解提纯，经20mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液沉淀后，加入6M盐酸胍进行包涵体的再溶解，高速离心获取的上清即为纯度较高的包涵体溶液。随后在变性环境(6M盐酸胍)下，使用NTA-Ni柱进行目的蛋白的纯化，最终获得目的蛋白溶液。
由于纯化得到的蛋白溶液中含有6M盐酸胍，蛋白处于变性可溶状态，需要进行复性才能获取具有活性的蛋白质。采用梯度透析法：(1)复性液I含4M盐酸胍，1mM还原型谷胱甘肽(GSH)，0.1mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)，20mM醋酸缓冲液(NaAc-HAc)(pH 5.0)溶液，4℃旋转透析12h；(2)复性液II含2M盐酸胍，1mM GSH，0.1mM GSSG，20mM NaAc-HAc(pH 5.0)溶液，4℃旋转透析12h；(3)复性液III含1M盐酸胍，1mM GSH，0.1mM GSSG，20mM NaAc-HAc(pH5.0)溶液，4℃旋转透析12h；(4)复性液IV为20mM NaAc-HAc(pH 5.0)溶液，4℃旋转透析12h；(5)重复步骤(4)一次。复性得到的(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)溶液经超滤浓缩后，加入冻干保护剂甘油后分装并保存于-20℃冰箱，所述(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。复性后的融合蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot检测，结果如图5所示，结果显示在50KD附近可得到明显条带，蛋白复性效率高。
实施例2(N)-重组人内皮抑素蛋白-Her2纳米抗体二聚体-(C)的制备
1、构建TOP10-pET28a-endo(m)-Dim重组表达载体
1)将实施例1中合成的序列为SEQ ID NO.3所示的Her2纳米抗体二聚体基因，利用引物3(5’-CAAGTCAAACTGGTGGAATCG-3’)和引物4(5’-TAACACGTCCATGTAACACGCATAG-3’)通过PCR在氨基端添加EcoRI酶切位点，羧基端添加XhoI酶切位点，克隆进入pET28a(+)载体的EcoRI和XhoI两个酶切位点位置，得到pET-28a-Dim-2重组载体；
2)设计引物Endo-F’和Endo-R’，Endo-F’(5’-ATGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGC-3’)，Endo-R’(5’-CTTGGAGGCAGTCATGAAGCTG-3’)，以pET28a-m-endostatin为DNA模板，利用上述两种引物PCR扩增重组人内皮抑素融合蛋白基因，PCR扩增体系依据实施例1中所述的PCR扩增体系；
PCR反应条件为：94℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃退火10min。将PCR扩增产物纯化后和步骤1)中得到的pET-28a-Dim-2同时用BamHI和EcoRI双酶切，跑胶纯化，连接，连接体系和连接条件依据实施例1中所述方法进行。
3)将步骤2)中得到的连接产物转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，涂布Kan抗性平板进行筛选，通过菌液PCR和测序筛选序列符合SEQ ID NO.11所示的质粒，即获得(N)-重组人内皮抑素蛋白-Her2纳米抗体二聚体-(C)基因克隆载体TOP10-pET28a-endo(m)-Dim。
2、(N)-重组人内皮抑素蛋白-Her2纳米抗体二聚体-(C)的诱导表达和纯化
依据实施例1中蛋白诱导和纯化方法，获得复性的(N)-重组人内皮抑素蛋白-Her2纳米抗体二聚体-(C)，其其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
实施例3(N)-Her2纳米抗体二聚体-连接肽-重组人内皮抑素蛋白-(C)的制备
1、构建TOP10-pET28a-Dim-linker-endo(m)重组表达载体
1)将实施例1中合成的序列为SEQ ID NO.3所示的Her2纳米抗体二聚体基因，利用引物1和引物2通过PCR在氨基端BamHI酶切位点，在羧基端沿蛋白编码方向添加连接肽序列和EcoRI酶切位点；所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示；将上述Her2纳米抗体二聚体基因克隆进入pET28a(+)载体的BamHI和EcoRI两个酶切位点位置，得到pET-28a-Dim-3重组载体；
2)以实施例1中所述的引物和PCR方法扩增重组人内皮抑素融合蛋白基因，并通过EcoRI和XhoI位点与pET-28a-Dim-3重组载体进行连接。
3)将步骤2)中得到的连接产物转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中，涂布Kan抗性平板进行筛选，通过菌液PCR和测序筛选序列符合SEQ ID NO.12所示的质粒，即获得(N)-Her2纳米抗体二聚体-连接肽-重组人内皮抑素蛋白-(C)基因克隆载体TOP10-pET28a-Dim-linker-endo(m)。
2、(N)-Her2纳米抗体二聚体-连接肽-重组人内皮抑素蛋白-(C)的诱导表达和纯化。
依据实施例1中蛋白诱导和纯化方法，获得复性的(N)-Her2纳米抗体二聚体-连接肽-重组人内皮抑素蛋白-(C)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
实施例4Her2纳米抗体二聚体的性能评估
1、构建Her2纳米抗体二聚体(pET-28a-Dim)、Her2纳米抗体四聚体(pET-28a-Tet)和Her2纳米抗体六聚体(pET-28a-Hex)的重组表达载体
1)设计Her2纳米抗体二聚体、Her2纳米抗体四聚体和Her2纳米抗体六聚体的编码基因，上述多聚体由Her2纳米抗体单体通过连接肽相连，并由南京金斯瑞公司依据下述序列进行基因合成：
Her2纳米抗体二聚体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；Her2纳米抗体四聚体的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示；Her2纳米抗体六聚体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，核苷酸序列如SEQID NO.17所示。
利用引物1和引物2通过PCR方法在Her2纳米抗体二聚体的氨基端引入NdeI位点，羧基端引入XhoI位点，克隆至pET28a(+)载体的NdeI和XhoI两个酶切位点位置，得到pET-28a-Dim重组载体(图6-A)；利用引物5(5'-CAAGTCAAACTGGTGGAATCG-3')和引物6(5'-CACGTCCATGTAACACGCATAAAG-3')在Her2纳米抗体四聚体的氨基端引入BamHI位点，羧基端引入HindIII位点，克隆至pET28a(+)载体的BamHI和HindIII两个酶切位点位置，得到pET-28a-Tet重组载体(图6-B)；利用引物7(5'-CAAGTCAAACTGGTGGAATCG-3')和引物8(5'-CACGTCCATGTAACACGCATAAAG-3')在Her2纳米抗体六聚体的氨基端引入BamHI位点，羧基端引入XhoI位点，克隆至pET28a(+)载体的BamHI和XhoI两个酶切位点位置，得到pET-28a-Hex重组载体(图6-C)；酶切得到片段大小～750bp的质粒为构建成功的pET-28a-Dim重组载体,酶切得到片段大小～1500bp的质粒为构建成功的pET-28a-Tet重组载体,酶切得到片段大小～2200bp的质粒为构建成功的pET-28a-Hex重组载体。
2)分别在(IPTG 0mM,37℃,6h)(IPTG 0.5mM,37℃,6h)(IPTG 1.0mM,37℃,6h)(IPTG 0mM,20℃,12h)(IPTG 0.5mM,20℃,12h)(IPTG 1.0mM,20℃,12h)六种条件下诱导Her2纳米抗体二聚体表达，表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳检测(图7)，结果显示诱导后菌体在27KD附近有明显表达带，与预期相符；在不添加IPTG时，菌体基本不表达Her2纳米抗体二聚体；使用IPTG诱导产生的Her2纳米抗体二聚体在不同的诱导条件下均主要存在于沉淀中，即Her2纳米抗体二聚体以包涵体的形式存在；IPTG 1.0mM 20℃诱导12h后的沉淀中得到最高表达量的Her2纳米抗体二聚体蛋白。
3)在步骤2)所述的六种条件下诱导Her2纳米抗体四聚体表达，表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳检测(图8)，结果显示诱导后菌体在53KD附近有明显表达带，与预期相符；在不添加IPTG时，菌体表达量较低；使用IPTG诱导产生的Her2纳米抗体四聚体在不同的诱导条件下均主要存在于沉淀中，即Her2纳米抗体四聚体以包涵体的形式存在；IPTG 1.0mM 20℃诱导12h后的沉淀中得到最高表达量的Her2纳米抗体四聚体蛋白。
4)在步骤2)所述的六种条件下诱导诱导Her2纳米抗体六聚体表达，表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳检测(图9)，结果显示诱导后菌体在75KD附近有明显表达带，与预期相符；在不添加IPTG时，菌体表达量较低；使用IPTG诱导产生的Her2纳米抗体六聚体在不同的诱导条件下均主要存在于沉淀中，即Her2纳米抗体六聚体以包涵体的形式存在；IPTG1.0mM 20℃诱导12h后的沉淀中得到最高表达量的Her2纳米抗体六聚体蛋白。
5)依据实施例1中所述的蛋白纯化、复性方法，得到Her2纳米抗体二聚体、Her2纳米抗体四聚体和Her2纳米抗体六聚体蛋白溶液。
2、Her2纳米抗体的物理学性能检测
1)动态光散射(DLS)实验
将步骤1中得到的三种蛋白溶液，使用醋酸盐缓冲液(pH 5.5)稀释成1mg/ml，后取1.5mL放入贝克曼库尔特LS 13 320系列激光粒度分析仪粒径池后在25℃下测量蛋白粒径。醋酸盐缓冲液(pH 5.5)用于基线调零。
2)圆二色实验
运用圆二色仪(JASCO,日本)检测三种纳米抗体蛋白的二级结构，蛋白溶液浓度为12μg/ml，扫描范围为190-250nm。
3)蛋白稳定性
将步骤1中得到的三种蛋白溶液进行分装，每管40μl，分别放置于4℃，-20℃和-80℃温度下，待放置14天、21天、42天和60天后，SDS-PAGE检测蛋白稳定性。
3、结果与讨论
1)动态光散射(DLS)实验
通过动态光散射(DLS)分析测定纯化纳米抗体粒径的尺寸分布：Her2纳米抗体二聚体的平均粒径是92.57±0.94nm(图10-A),Her2纳米抗体四聚体蛋白的平均粒径是140.83±1.13nm(图10-B),Her2纳米抗体六聚体蛋白的平均粒径是395.45±0.59nm(图10-C)。随着纳米抗体粒径的增大，在蛋白纯化复性过程中析出的沉淀也会逐渐增加，从而影响纳米抗体的复性效率和产量。
2)圆二色结果
采用圆二色谱法测定纳米抗体蛋白的二级结构，通过CDpro软件在195-250nm波长范围内测得纳米抗体的相对摩尔椭圆率(deg.cm2.dmol-1)。如图11所示，Her2纳米抗体二聚体、Her2纳米抗体四聚体和Her2纳米抗体六聚体的α螺旋的比重分别为1.88％、3.16％和3.55％，呈现上升趋势；β折叠的比重分别为42.32％、33.79％和24.27％，呈现下降趋势。由于蛋白质表面的疏水性随α-螺旋含量的增加而减小，随β-折叠及不规则性含量的增加而增加。结果表明，Her2纳米抗体六聚体的表面疏水性远远高于Her2纳米抗体四聚体和Her2纳米抗体二聚体，这使得Her2纳米抗体六聚体相比Her2纳米抗体二聚体在纯化时易于积累和沉淀，从而影响其复性效率和产量。
3)蛋白稳定性
如图12所示，三种纳米抗体蛋白在4℃、-20℃和-80℃温度下放置14天后，三种抗体的相对浓度可保持在90％以上；如图13所示，在4℃下放置21天后三种抗体均能保持相应的浓度(75％～80％)；如图14所示，三种抗体在-20℃和-80℃时的稳定性较好，能够维持42天左右，且Her2纳米抗体二聚体和Her2纳米抗体四聚体的稳定性优于Her2纳米抗体六聚体。如图15所示，当放置在不同的温度60天后，目标蛋白已经失去了一半以上，Her2纳米抗体六聚体剩余量已不足30％，不能继续使用。Her2纳米抗体二聚体和Her2纳米抗体四聚体具有较好的稳定性，在没有保护剂的情况下，放置在4℃可以使用三个星期，在低温(-20℃和-80℃)可放置六至七周左右，平均剩余量在70％以上。
实验结论：Her2纳米抗体二聚体的稳定性高，加上保护剂可长时间运输及保藏，可降低抗体使用成本；Her2纳米抗体二聚体对比纳米抗体单体有更大的分子量，可延长纳米抗体进入人体后的半衰期，提高了纳米抗体在体内的稳定性；Her2纳米抗体二聚体对比其他多聚体，有较小的蛋白粒径和较高亲水性的蛋白结构，有利于蛋白诱导后的纯化复性，并可提高蛋白的吸收率。
实施例5重组人内皮抑素融合蛋白对乳腺癌的抑制作用
通过CCK-8实验分别检测(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)、(N)-重组人内皮抑素蛋白-Her2纳米抗体二聚体-(C)和(N)-Her2纳米抗体二聚体-连接肽-重组人内皮抑素蛋白-(C)三种融合蛋白对乳腺癌细胞SK-BR-3生长的抑制效果，三种蛋白对乳腺癌细胞的抑制效果无明显差异，选择(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)检测对乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231生长的抑制效果，正常乳腺细胞HBL100作为对照。
CCK-8检测重组人内皮抑素融合蛋白对细胞活力的影响，具体步骤如下：
1)将细胞转接至96孔板中，待到细胞密度生长至50％覆盖率，弃去原培养基，用无菌PBS洗一次；
3)将重组人内皮抑素融合蛋白用不含胎牛血清的DMEM培养基稀释成梯度浓度的溶液，分别加入到96孔板中，每孔100μL，另设置直接加入100μL DMEM培养基的空白对照组，设3组重复；
4)将培养板置于37℃，含5％CO2的培养箱中继续进行培养；
5)培养24小时后，吸去培养基，每孔加入100μL单独DMEM培养液和10μL CCK-8试剂，置于37℃培养箱中继续培养2h后，用酶标仪在450nm处检测吸光值。由于细胞数量与OD450的值成正比，所以OD450的值即可以反映细胞的相对数量。按照以下公式进行细胞活力的计算：
Figure BDA0001294935170000111
抑制率数据以x±s表示，统计学处理采用GraphPad Prim软件包，组间差异采用单向方差分析。统计学显著性水平为P<0.05，所有的P值均为双尾检验。
CCK8实验结果显示三种融合蛋白对乳腺癌细胞SK-BR-3生长的抑制效果没有明显差别，结合蛋白表达纯化结果，最终于选择(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)蛋白作为检测蛋白，并检测该融合蛋白对多种乳腺癌细胞的抑制效果。
检测结果如图16所示：随着(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)蛋白浓度的升高，对乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3和MDA-MB-231的抑制作用也随之加强，其中对Her2阳性细胞株SK-BR-3的抑制效果要明显优于对其它乳腺癌细胞株的抑制效果，27.50ug/mL的(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)蛋白对SK-BR-3细胞的抑制率达80％。
结果分析：因为(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)的Her2纳米抗体二聚体同时具有靶向作用和穿膜肽的作用，使融合蛋白靶向Her2高表达乳腺癌细胞株SK-BR-3的表面，与细胞表面的Her2受体特异性结合；融合蛋白的重组人内皮抑素蛋白部分是经过改造的人内皮抑素蛋白，重组人内皮抑素蛋白的N端包括穿膜肽序列(氨基酸序列：RRRRRRRRR)，具有更好的蛋白穿膜效果和N端的结构稳定性，在Her2纳米抗体二聚体与细胞表面Her2受体结合后，重组人内皮抑素蛋白部分进入细胞内，直接抑制肿瘤细胞生长。Her2纳米抗体二聚体包括Her2结合肽，Her2结合肽与Her2受体特异性结合进一步提高了Her2纳米抗体二聚体靶向Her2受体的结合亲和力；Her2纳米抗体二聚体包括2个Her2纳米抗体单体，在结合乳腺癌细胞中Her2抗原时对癌细胞可产生协同抑制作用，进一步增强了(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)对乳腺癌细胞的抑制效果。
实施例6Her2纳米抗体二聚体对乳腺癌细胞的靶向作用
1、CCK-8检测重组纳米抗体对细胞活力的影响
分别将SKBR3细胞、MCF7细胞以合适的浓度转接至96孔板中，待到细胞密度生长至50％覆盖率，按以下步骤对细胞进行处理：
(1)弃去原培养基，用无菌PBS洗一次；
(2)将纳米抗体母液用不含胎牛血清的DMEM培养基稀释成梯度浓度的溶液，分别加入到96孔板中，每孔100μL，另设置对照组，直接加入100μL DMEM培养基。设3组重复；
(3)将培养板置于37℃，含5％CO2的培养箱中继续进行培养；
(4)培养24小时后，吸去培养基，每孔加入100μL单独DMEM培养液和10μLCCK-8试剂，置于37℃培养箱中继续培养2h后，用酶标仪在450nm处检测吸光值。由于细胞数量与OD450的值成正比，所以OD450的值即可以反映细胞的相对数量。按照以下公式进行细胞活力的计算：
Figure BDA0001294935170000121
2、FITC标记纳米抗体蛋白
将三种纳米抗体蛋白Dim nanobody、Tet nanobody和Hex nanobody上样到sephadex G-50脱盐柱中，洗脱液为0.1M Na2CO3(pH＝9.0)，收集最大吸收峰时的洗脱液，经BSA试剂盒测量蛋白的浓度，每1mg蛋白加入25μL溶于DMSO的1mg/ml FITC，37℃下避光孵育1h。将标记好的蛋白在避光条件下透析约24h，以去除游离的FITC。最终获得FITC-labelednanobodies，测量蛋白体积并计算蛋白浓度。
3、细胞结合实验
将培养好的细胞取出培养箱，弃去培液，用无菌的PBS溶液清洗细胞2次，胰酶消化细胞1-2min，加新鲜培液终止反应，用移液器将细胞吹打混匀，将细胞悬液分装到2mL EP管中，4℃下2000rpm离心5min，吸走上清，PBS重悬细胞后再次离心除去上清。加入用新鲜陪液稀释的同浓度的FITC-labeled nanobodies后重悬，37℃孵育30min后，4℃2000rpm离心5min，PBS洗涤两次以去除未结合的游离蛋白，加入1mL PBS悬浮后转移到流式管中，使用流式细胞仪进行分析。
4、细胞免疫荧光
将乳腺癌细胞传代到事先放有盖玻片的六孔板中，在CO2培养箱中培养8h后细胞贴壁生长良好时，吸去培养液后用预冷的PBS轻轻洗涤两次，4％多聚甲醛固定1h。预冷PBS洗涤三次，每孔加入0.02mg/ml的FITC-labeled nanobodies，每孔培液体积为2mL，室温孵育1h后，预冷PBS洗涤三次后，DAPI染色30min，封片剂封片，置于荧光显微镜下观察。
如图17所示，在乳腺癌细胞SK-BR-3的细胞质中可检测到强的荧光，表明Her2纳米抗体二聚体能够高效靶向SK-BR-3细胞，并富集于细胞质中。
结果分析：Her2纳米抗体二聚体可以靶向识别SK-BR-3细胞表面表达的Her2受体，并与Her2受体特异性结合；由于纳米抗体良好的穿透性，Her2纳米抗体二聚体通过细胞膜后集中在SK-BR-3细胞质中。Her2纳米抗体二聚体中的Her2纳米抗体单体，在结合到SK-BR-3细胞后对癌细胞的生长产生协同抑制作用。
实施例7重组人内皮抑素融合蛋白对乳腺癌细胞的靶向作用
细胞免疫荧光检测(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)与乳腺癌细胞的结合效果，细胞免疫荧光检测步骤如下：
1)将乳腺癌细胞SK-BR-3和MCF-7培养一段时间后，传代到放有盖玻片的六孔板中，加新鲜培液培养过夜；
2)PBS洗涤细胞三次后，4％多聚甲醛溶液固定细胞30分钟，PBS洗涤3次；
3)5％血清PBS室温封闭细胞30分钟，去除封闭液；
4)兔多抗内皮抑素抗体(1：200)室温孵育2小时，封闭液洗涤3次；羊抗兔Cy3荧光标记二抗孵育1小时(避光)，PBS洗涤3次；
5)荧光倒置显微镜观察。
如图18所示，在乳腺癌细胞SK-BR-3的细胞质中可检测到强的荧光，表明(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)蛋白与SK-BR-3细胞结合量高，并定位于细胞质中；在MCF-7细胞中，荧光效果弱，表明(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)与MCF-7细胞结合量少。
结果分析：(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)具有对Her2阳性乳腺癌细胞株SK-BR-3的特异性结合和识别作用，穿膜肽可以将融合蛋白带入细胞内部。在Her2纳米抗体二聚体和穿膜肽的双重作用下，免疫荧光主要集中在SK-BR-3细胞质中。证明较多的(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)进入到高表达Her2受体的乳腺癌细胞SK-BR-3的细胞质中，进一步证实了该融合蛋白作为检测和治疗Her2和高表达的乳腺癌细胞的药用效果。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏吴中医药集团有限公司苏州中凯生物制药厂
<120> 一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用
<130> HA201700829
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Pro Asn
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Arg Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ala Asn Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ser Thr Ala Thr Asn Trp Asp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
145 150 155 160
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys
210 215 220
Val Ala Pro Trp Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Phe Cys Asp Gly Phe Tyr Ala Cys Tyr Met Asp Val
245 250
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Phe Cys Asp Gly Phe Tyr Ala Cys Tyr Met Asp Val
1 5 10
<210> 3
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caagtcaaac tggtggaatc gggtggtggc ctggttcagc cgggtggtag cctgcgtctg 60
tcgtgtgccg cctcgggttc gggttttagc ccgaacgtta tgggttggta tcgtcagacc 120
ccgggtaacc gtcgtgaatg ggtcgcagcc gcaaataaat atggtaccac gacctacgcg 180
gattctgtga aaggccgttt tgctattagt cgcgacaacg cgaaaacgac cgtctacctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc ggaagatacc gctgtgtatt actgcgctgc gtcaacggcg 300
accaattggg actatcatta ctggggtcag ggcacgcaag tgaccgttag ctctggcggt 360
ggtggttccg gtggtggtgg ttcacaggtt aaactggtcg aaagcggtgg tggtctggtt 420
caaccgggcg gcagcctgcg tctgtcttgt gccgcaagtg gttttacgtt cgatgactat 480
gcaatgagct gggtgcgtca ggcaccgggt aaaggcctgg aatgggtttc agctatttcg 540
tggaacggtg gctcgaccta ttacgccgaa agcatgaaag gccgttttac gatctcgcgc 600
gataacacca aaaatatgct gtatctgcag atgaatagcc tgaaagccga agataccggt 660
ctgtattact gcgttgcacc gtggaaattt tggggccagg gcacgcaagt caccgtgagt 720
tccttttgcg atggcttcta tgcgtgttac atggacgtg 759
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His Ser His Arg Asp Phe
1 5 10 15
Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly
20 25 30
Met Arg Gly Asp Arg Gly Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala
35 40 45
Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln
50 55 60
Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile
65 70 75 80
Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe
85 90 95
Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe
100 105 110
Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val
115 120 125
Trp His Gly Ser Asp Ala Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys
130 135 140
Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser
145 150 155 160
Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His
165 170 175
Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys
180 185 190
<210> 6
<211> 576
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgcgccgcc gccgccgccg ccgccgccgc cacagccacc gcgacttcca gccggtgctc 60
cacctggttg cgctcaacag ccccctgtca ggcggcatgc ggggcgatcg cggggacttc 120
cagtgcttcc agcaggcgcg ggccgtgggg ctggcgggca ccttccgcgc cttcctgtcc 180
tcgcgcctgc aggacctgta cagcatcgtg cgccgtgccg accgcgcagc cgtgcccatc 240
gtcaacctca aggacgagct gctgtttccc agctgggagg ctctgttctc aggctctgag 300
ggtccgctga agcccggggc acgcatcttc tcctttgacg gcaaggacgt cctgaggcac 360
cccacctggc cccagaagag cgtgtggcat ggctcggacg caaacgggcg caggctgacc 420
gagagctact gtgagacgtg gcggacggag gctccctcgg ccacgggcca ggcctcctcg 480
ctgctggggg gcaggctcct ggggcagagt gccgcgagct gccatcacgc ctacatcgtg 540
ctctgcattg agaacagctt catgactgcc tccaag 576
<210> 7
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Pro Asn
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Arg Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ala Asn Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ser Thr Ala Thr Asn Trp Asp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
145 150 155 160
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys
210 215 220
Val Ala Pro Trp Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Phe Cys Asp Gly Phe Tyr Ala Cys Tyr Met Asp Val Glu Phe Met
245 250 255
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His Ser His Arg Asp Phe Gln
260 265 270
Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met
275 280 285
Arg Gly Asp Arg Gly Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val
290 295 300
Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val
325 330 335
Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser
340 345 350
Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp
355 360 365
Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp
370 375 380
His Gly Ser Asp Ala Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu
385 390 395 400
Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu
405 410 415
Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala
420 425 430
Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys
435 440 445
<210> 8
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Met Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His Ser His Arg Asp Phe
1 5 10 15
Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly
20 25 30
Met Arg Gly Asp Arg Gly Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala
35 40 45
Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln
50 55 60
Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile
65 70 75 80
Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe
85 90 95
Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe
100 105 110
Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val
115 120 125
Trp His Gly Ser Asp Ala Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys
130 135 140
Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser
145 150 155 160
Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His
165 170 175
Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys
180 185 190
Glu Phe Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
195 200 205
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser
210 215 220
Pro Asn Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Arg Arg Glu
225 230 235 240
Trp Val Ala Ala Ala Asn Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser
245 250 255
Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val
260 265 270
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Thr Ala Thr Asn Trp Asp Tyr His Tyr Trp Gly Gln
290 295 300
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
305 310 315 320
Gly Ser Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
325 330 335
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp
340 345 350
Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
355 360 365
Trp Val Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu
370 375 380
Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met
385 390 395 400
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr
405 410 415
Tyr Cys Val Ala Pro Trp Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
420 425 430
Val Ser Ser Phe Cys Asp Gly Phe Tyr Ala Cys Tyr Met Asp Val
435 440 445
<210> 9
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Pro Asn
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Arg Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ala Asn Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ser Thr Ala Thr Asn Trp Asp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
145 150 155 160
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys
210 215 220
Val Ala Pro Trp Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Phe Cys Asp Gly Phe Tyr Ala Cys Tyr Met Asp Val Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Phe Met Arg Arg Arg Arg Arg Arg
260 265 270
Arg Arg Arg His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val
275 280 285
Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Asp Arg Gly Asp
290 295 300
Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe
305 310 315 320
Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg
325 330 335
Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu
340 345 350
Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu
355 360 365
Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg
370 375 380
His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Ala Asn
385 390 395 400
Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala
405 410 415
Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu
420 425 430
Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile
435 440 445
Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys
450 455
<210> 10
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caagtcaaac tggtggaatc gggtggtggc ctggttcagc cgggtggtag cctgcgtctg 60
tcgtgtgccg cctcgggttc gggttttagc ccgaacgtta tgggttggta tcgtcagacc 120
ccgggtaacc gtcgtgaatg ggtcgcagcc gcaaataaat atggtaccac gacctacgcg 180
gattctgtga aaggccgttt tgctattagt cgcgacaacg cgaaaacgac cgtctacctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc ggaagatacc gctgtgtatt actgcgctgc gtcaacggcg 300
accaattggg actatcatta ctggggtcag ggcacgcaag tgaccgttag ctctggcggt 360
ggtggttccg gtggtggtgg ttcacaggtt aaactggtcg aaagcggtgg tggtctggtt 420
caaccgggcg gcagcctgcg tctgtcttgt gccgcaagtg gttttacgtt cgatgactat 480
gcaatgagct gggtgcgtca ggcaccgggt aaaggcctgg aatgggtttc agctatttcg 540
tggaacggtg gctcgaccta ttacgccgaa agcatgaaag gccgttttac gatctcgcgc 600
gataacacca aaaatatgct gtatctgcag atgaatagcc tgaaagccga agataccggt 660
ctgtattact gcgttgcacc gtggaaattt tggggccagg gcacgcaagt caccgtgagt 720
tccttttgcg atggcttcta tgcgtgttac atggacgtgg aattcatgcg ccgccgccgc 780
cgccgccgcc gccgccacag ccaccgcgac ttccagccgg tgctccacct ggttgcgctc 840
aacagccccc tgtcaggcgg catgcggggc gatcgcgggg acttccagtg cttccagcag 900
gcgcgggccg tggggctggc gggcaccttc cgcgccttcc tgtcctcgcg cctgcaggac 960
ctgtacagca tcgtgcgccg tgccgaccgc gcagccgtgc ccatcgtcaa cctcaaggac 1020
gagctgctgt ttcccagctg ggaggctctg ttctcaggct ctgagggtcc gctgaagccc 1080
ggggcacgca tcttctcctt tgacggcaag gacgtcctga ggcaccccac ctggccccag 1140
aagagcgtgt ggcatggctc ggacgcaaac gggcgcaggc tgaccgagag ctactgtgag 1200
acgtggcgga cggaggctcc ctcggccacg ggccaggcct cctcgctgct ggggggcagg 1260
ctcctggggc agagtgccgc gagctgccat cacgcctaca tcgtgctctg cattgagaac 1320
agcttcatga ctgcctccaa gtaa 1344
<210> 11
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atgcgccgcc gccgccgccg ccgccgccgc cacagccacc gcgacttcca gccggtgctc 60
cacctggttg cgctcaacag ccccctgtca ggcggcatgc ggggcgatcg cggggacttc 120
cagtgcttcc agcaggcgcg ggccgtgggg ctggcgggca ccttccgcgc cttcctgtcc 180
tcgcgcctgc aggacctgta cagcatcgtg cgccgtgccg accgcgcagc cgtgcccatc 240
gtcaacctca aggacgagct gctgtttccc agctgggagg ctctgttctc aggctctgag 300
ggtccgctga agcccggggc acgcatcttc tcctttgacg gcaaggacgt cctgaggcac 360
cccacctggc cccagaagag cgtgtggcat ggctcggacg caaacgggcg caggctgacc 420
gagagctact gtgagacgtg gcggacggag gctccctcgg ccacgggcca ggcctcctcg 480
ctgctggggg gcaggctcct ggggcagagt gccgcgagct gccatcacgc ctacatcgtg 540
ctctgcattg agaacagctt catgactgcc tccaaggaat tccaagtcaa actggtggaa 600
tcgggtggtg gcctggttca gccgggtggt agcctgcgtc tgtcgtgtgc cgcctcgggt 660
tcgggtttta gcccgaacgt tatgggttgg tatcgtcaga ccccgggtaa ccgtcgtgaa 720
tgggtcgcag ccgcaaataa atatggtacc acgacctacg cggattctgt gaaaggccgt 780
tttgctatta gtcgcgacaa cgcgaaaacg accgtctacc tgcaaatgaa cagcctgaaa 840
ccggaagata ccgctgtgta ttactgcgct gcgtcaacgg cgaccaattg ggactatcat 900
tactggggtc agggcacgca agtgaccgtt agctctggcg gtggtggttc cggtggtggt 960
ggttcacagg ttaaactggt cgaaagcggt ggtggtctgg ttcaaccggg cggcagcctg 1020
cgtctgtctt gtgccgcaag tggttttacg ttcgatgact atgcaatgag ctgggtgcgt 1080
caggcaccgg gtaaaggcct ggaatgggtt tcagctattt cgtggaacgg tggctcgacc 1140
tattacgccg aaagcatgaa aggccgtttt acgatctcgc gcgataacac caaaaatatg 1200
ctgtatctgc agatgaatag cctgaaagcc gaagataccg gtctgtatta ctgcgttgca 1260
ccgtggaaat tttggggcca gggcacgcaa gtcaccgtga gttccttttg cgatggcttc 1320
tatgcgtgtt acatggacgt gtaa 1344
<210> 12
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
caagtcaaac tggtggaatc gggtggtggc ctggttcagc cgggtggtag cctgcgtctg 60
tcgtgtgccg cctcgggttc gggttttagc ccgaacgtta tgggttggta tcgtcagacc 120
ccgggtaacc gtcgtgaatg ggtcgcagcc gcaaataaat atggtaccac gacctacgcg 180
gattctgtga aaggccgttt tgctattagt cgcgacaacg cgaaaacgac cgtctacctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc ggaagatacc gctgtgtatt actgcgctgc gtcaacggcg 300
accaattggg actatcatta ctggggtcag ggcacgcaag tgaccgttag ctctggcggt 360
ggtggttccg gtggtggtgg ttcacaggtt aaactggtcg aaagcggtgg tggtctggtt 420
caaccgggcg gcagcctgcg tctgtcttgt gccgcaagtg gttttacgtt cgatgactat 480
gcaatgagct gggtgcgtca ggcaccgggt aaaggcctgg aatgggtttc agctatttcg 540
tggaacggtg gctcgaccta ttacgccgaa agcatgaaag gccgttttac gatctcgcgc 600
gataacacca aaaatatgct gtatctgcag atgaatagcc tgaaagccga agataccggt 660
ctgtattact gcgttgcacc gtggaaattt tggggccagg gcacgcaagt caccgtgagt 720
tccttttgcg atggcttcta tgcgtgttac atggacgtgg gcggtggtgg cagcggtggc 780
ggtggcagcg aattcatgcg ccgccgccgc cgccgccgcc gccgccacag ccaccgcgac 840
ttccagccgg tgctccacct ggttgcgctc aacagccccc tgtcaggcgg catgcggggc 900
gatcgcgggg acttccagtg cttccagcag gcgcgggccg tggggctggc gggcaccttc 960
cgcgccttcc tgtcctcgcg cctgcaggac ctgtacagca tcgtgcgccg tgccgaccgc 1020
gcagccgtgc ccatcgtcaa cctcaaggac gagctgctgt ttcccagctg ggaggctctg 1080
ttctcaggct ctgagggtcc gctgaagccc ggggcacgca tcttctcctt tgacggcaag 1140
gacgtcctga ggcaccccac ctggccccag aagagcgtgt ggcatggctc ggacgcaaac 1200
gggcgcaggc tgaccgagag ctactgtgag acgtggcgga cggaggctcc ctcggccacg 1260
ggccaggcct cctcgctgct ggggggcagg ctcctggggc agagtgccgc gagctgccat 1320
cacgcctaca tcgtgctctg cattgagaac agcttcatga ctgcctccaa gtaa 1374
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggcggtggtg gcagcggtgg cggtggcagc 30
<210> 14
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Pro Asn
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Arg Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ala Asn Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ser Thr Ala Thr Asn Trp Asp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
145 150 155 160
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys
210 215 220
Val Ala Pro Trp Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Pro Asn Val Met Gly Trp Tyr
275 280 285
Arg Gln Thr Pro Gly Asn Arg Arg Glu Trp Val Ala Ala Ala Asn Lys
290 295 300
Tyr Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
325 330 335
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Thr Ala Thr
340 345 350
Asn Trp Asp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Val
370 375 380
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
385 390 395 400
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val
405 410 415
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Trp
420 425 430
Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr
435 440 445
Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
450 455 460
Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Val Ala Pro Trp Lys
465 470 475 480
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Phe Cys Asp Gly
485 490 495
Phe Tyr Ala Cys Tyr Met Asp Val
500
<210> 15
<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
caagtcaaac tggtggaatc gggtggtggc ctggttcagc cgggtggtag cctgcgtctg 60
tcgtgtgccg cctcgggttc gggttttagc ccgaacgtta tgggttggta tcgtcagacc 120
ccgggtaacc gtcgtgaatg ggtcgcagcc gcaaataaat atggtaccac gacctacgcg 180
gattctgtga aaggccgttt tgctattagt cgcgacaacg cgaaaacgac cgtctacctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc ggaagatacc gctgtgtatt actgcgctgc gtcaacggcg 300
accaattggg actatcatta ctggggtcag ggcacgcaag tgaccgttag ctctggcggt 360
ggtggttccg gtggtggtgg ttcacaggtt aaactggtcg aaagcggtgg tggtctggtt 420
caaccgggcg gcagcctgcg tctgtcttgt gccgcaagtg gttttacgtt cgatgactat 480
gcaatgagct gggtgcgtca ggcaccgggt aaaggcctgg aatgggtttc agctatttcg 540
tggaacggtg gctcgaccta ttacgccgaa agcatgaaag gccgttttac gatctcgcgc 600
gataacacca aaaatatgct gtatctgcag atgaatagcc tgaaagccga agataccggt 660
ctgtattact gcgttgcacc gtggaaattt tggggccagg gcacgcaagt caccgtgagt 720
tccggcggtg gtggttccgg tggtggtggt tcacaagtca aactggtgga atcgggtggt 780
ggcctggttc agccgggtgg tagcctgcgt ctgtcgtgtg ccgcctcggg ttcgggtttt 840
agcccgaacg ttatgggttg gtatcgtcag accccgggta accgtcgtga atgggtcgca 900
gccgcaaata aatatggtac cacgacctac gcggattctg tgaaaggccg ttttgctatt 960
agtcgcgaca acgcgaaaac gaccgtctac ctgcaaatga acagcctgaa accggaagat 1020
accgctgtgt attactgcgc tgcgtcaacg gcgaccaatt gggactatca ttactggggt 1080
cagggcacgc aagtgaccgt tagctctggc ggtggtggtt ccggtggtgg tggttcacag 1140
gttaaactgg tcgaaagcgg tggtggtctg gttcaaccgg gcggcagcct gcgtctgtct 1200
tgtgccgcaa gtggttttac gttcgatgac tatgcaatga gctgggtgcg tcaggcaccg 1260
ggtaaaggcc tggaatgggt ttcagctatt tcgtggaacg gtggctcgac ctattacgcc 1320
gaaagcatga aaggccgttt tacgatctcg cgcgataaca ccaaaaatat gctgtatctg 1380
cagatgaata gcctgaaagc cgaagatacc ggtctgtatt actgcgttgc accgtggaaa 1440
ttttggggcc agggcacgca agtcaccgtg agttcctttt gcgatggctt ctatgcgtgt 1500
tacatggacg tg 1512
<210> 16
<211> 755
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Pro Asn
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Arg Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ala Asn Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ser Thr Ala Thr Asn Trp Asp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
145 150 155 160
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys
210 215 220
Val Ala Pro Trp Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Pro Asn Val Met Gly Trp Tyr
275 280 285
Arg Gln Thr Pro Gly Asn Arg Arg Glu Trp Val Ala Ala Ala Asn Lys
290 295 300
Tyr Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
325 330 335
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Thr Ala Thr
340 345 350
Asn Trp Asp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Val
370 375 380
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
385 390 395 400
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val
405 410 415
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Trp
420 425 430
Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr
435 440 445
Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
450 455 460
Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Val Ala Pro Trp Lys
465 470 475 480
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
485 490 495
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
500 505 510
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
515 520 525
Ser Gly Phe Ser Pro Asn Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly
530 535 540
Asn Arg Arg Glu Trp Val Ala Ala Ala Asn Lys Tyr Gly Thr Thr Thr
545 550 555 560
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala
565 570 575
Lys Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
580 585 590
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Thr Ala Thr Asn Trp Asp Tyr His
595 600 605
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
610 615 620
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
625 630 635 640
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
645 650 655
Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
660 665 670
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr
675 680 685
Tyr Tyr Ala Glu Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
690 695 700
Thr Lys Asn Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp
705 710 715 720
Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Val Ala Pro Trp Lys Phe Trp Gly Gln Gly
725 730 735
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Phe Cys Asp Gly Phe Tyr Ala Cys Tyr
740 745 750
Met Asp Val
755
<210> 17
<211> 2265
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
caagtcaaac tggtggaatc gggtggtggc ctggttcagc cgggtggtag cctgcgtctg 60
tcgtgtgccg cctcgggttc gggttttagc ccgaacgtta tgggttggta tcgtcagacc 120
ccgggtaacc gtcgtgaatg ggtcgcagcc gcaaataaat atggtaccac gacctacgcg 180
gattctgtga aaggccgttt tgctattagt cgcgacaacg cgaaaacgac cgtctacctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc ggaagatacc gctgtgtatt actgcgctgc gtcaacggcg 300
accaattggg actatcatta ctggggtcag ggcacgcaag tgaccgttag ctctggcggt 360
ggtggttccg gtggtggtgg ttcacaggtt aaactggtcg aaagcggtgg tggtctggtt 420
caaccgggcg gcagcctgcg tctgtcttgt gccgcaagtg gttttacgtt cgatgactat 480
gcaatgagct gggtgcgtca ggcaccgggt aaaggcctgg aatgggtttc agctatttcg 540
tggaacggtg gctcgaccta ttacgccgaa agcatgaaag gccgttttac gatctcgcgc 600
gataacacca aaaatatgct gtatctgcag atgaatagcc tgaaagccga agataccggt 660
ctgtattact gcgttgcacc gtggaaattt tggggccagg gcacgcaagt caccgtgagt 720
tccggcggtg gtggttccgg tggtggtggt tcacaagtca aactggtgga atcgggtggt 780
ggcctggttc agccgggtgg tagcctgcgt ctgtcgtgtg ccgcctcggg ttcgggtttt 840
agcccgaacg ttatgggttg gtatcgtcag accccgggta accgtcgtga atgggtcgca 900
gccgcaaata aatatggtac cacgacctac gcggattctg tgaaaggccg ttttgctatt 960
agtcgcgaca acgcgaaaac gaccgtctac ctgcaaatga acagcctgaa accggaagat 1020
accgctgtgt attactgcgc tgcgtcaacg gcgaccaatt gggactatca ttactggggt 1080
cagggcacgc aagtgaccgt tagctctggc ggtggtggtt ccggtggtgg tggttcacag 1140
gttaaactgg tcgaaagcgg tggtggtctg gttcaaccgg gcggcagcct gcgtctgtct 1200
tgtgccgcaa gtggttttac gttcgatgac tatgcaatga gctgggtgcg tcaggcaccg 1260
ggtaaaggcc tggaatgggt ttcagctatt tcgtggaacg gtggctcgac ctattacgcc 1320
gaaagcatga aaggccgttt tacgatctcg cgcgataaca ccaaaaatat gctgtatctg 1380
cagatgaata gcctgaaagc cgaagatacc ggtctgtatt actgcgttgc accgtggaaa 1440
ttttggggcc agggcacgca agtcaccgtg agttccggcg gtggtggttc cggtggtggt 1500
ggttcacaag tcaaactggt ggaatcgggt ggtggcctgg ttcagccggg tggtagcctg 1560
cgtctgtcgt gtgccgcctc gggttcgggt tttagcccga acgttatggg ttggtatcgt 1620
cagaccccgg gtaaccgtcg tgaatgggtc gcagccgcaa ataaatatgg taccacgacc 1680
tacgcggatt ctgtgaaagg ccgttttgct attagtcgcg acaacgcgaa aacgaccgtc 1740
tacctgcaaa tgaacagcct gaaaccggaa gataccgctg tgtattactg cgctgcgtca 1800
acggcgacca attgggacta tcattactgg ggtcagggca cgcaagtgac cgttagctct 1860
ggcggtggtg gttccggtgg tggtggttca caggttaaac tggtcgaaag cggtggtggt 1920
ctggttcaac cgggcggcag cctgcgtctg tcttgtgccg caagtggttt tacgttcgat 1980
gactatgcaa tgagctgggt gcgtcaggca ccgggtaaag gcctggaatg ggtttcagct 2040
atttcgtgga acggtggctc gacctattac gccgaaagca tgaaaggccg ttttacgatc 2100
tcgcgcgata acaccaaaaa tatgctgtat ctgcagatga atagcctgaa agccgaagat 2160
accggtctgt attactgcgt tgcaccgtgg aaattttggg gccagggcac gcaagtcacc 2220
gtgagttcct tttgcgatgg cttctatgcg tgttacatgg acgtg 2265

Claims (5)

1.一种重组人内皮抑素融合蛋白，其特征在于，所述重组人内皮抑素融合蛋白包括：
(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
(N)-重组人内皮抑素蛋白-Her2纳米抗体二聚体-(C)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；或
(N)-Her2纳米抗体二聚体-连接肽-重组人内皮抑素蛋白-(C)，其氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示。
2.一种编码权利要求1所述的重组人内皮抑素融合蛋白的基因，其特征在于，所述编码基因选自如下基因：
(N)-Her2纳米抗体二聚体-重组人内皮抑素蛋白-(C)的编码基因，其核苷酸序列如SEQID NO.10所示；
(N)-重组人内皮抑素蛋白-Her2纳米抗体二聚体-(C)的编码基因，其核苷酸序列如SEQID NO.11所示；或
(N)-Her2纳米抗体二聚体-连接肽-重组人内皮抑素蛋白-(C)的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
3.包含权利要求2所述的重组人内皮抑素融合蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
4.一种重组人内皮抑素融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建权利要求2所述的重组人内皮抑素融合蛋白的基因；
(2)将步骤(1)中的编码基因克隆至表达载体中得到重组表达载体；
(3)将步骤(2)中获得的所述重组表达载体转化宿主细胞，获得表达重组人内皮抑素融合蛋白的工程菌，发酵培养得到所述重组人内皮抑素融合蛋白；
(4)纯化分离得到的所述重组人内皮抑素融合蛋白。
5.权利要求1所述的重组人内皮抑素融合蛋白在制备检测或靶向治疗乳腺癌的药物中的应用。
CN201710339825.XA 2017-05-15 2017-05-15 一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用 Active CN107236046B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710339825.XA CN107236046B (zh) 2017-05-15 2017-05-15 一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710339825.XA CN107236046B (zh) 2017-05-15 2017-05-15 一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107236046A CN107236046A (zh) 2017-10-10
CN107236046B true CN107236046B (zh) 2021-05-07

Family

ID=59984948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710339825.XA Active CN107236046B (zh) 2017-05-15 2017-05-15 一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107236046B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018233624A1 (zh) * 2017-06-20 2018-12-27 和迈生物科技有限公司 抗Her2纳米抗体及其编码序列和用途
CN108948209A (zh) * 2018-07-17 2018-12-07 广西医科大学 一种cd105单链抗体-es融合蛋白的制备方法和用途
CN114478793B (zh) * 2020-10-26 2023-09-19 广州奈米微晶生物科技有限公司 CPP-scFv融合蛋白及相应的核酸分子、载体、细胞和药物

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009003145A1 (en) * 2007-06-26 2008-12-31 University Of Miami Antibody-endostatin fusion protein and its variants
EP1718323B1 (en) * 2004-02-20 2011-12-07 The Trustees of The University of Pennsylvania Binding peptidomimetics and uses of the same
CN102321175A (zh) * 2011-09-21 2012-01-18 天津胜发生物技术有限公司 针对乳腺癌Her2/new的纳米抗体或多肽
WO2014025199A2 (ko) * 2012-08-09 2014-02-13 주식회사 한독 스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체 및 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1718323B1 (en) * 2004-02-20 2011-12-07 The Trustees of The University of Pennsylvania Binding peptidomimetics and uses of the same
WO2009003145A1 (en) * 2007-06-26 2008-12-31 University Of Miami Antibody-endostatin fusion protein and its variants
CN102321175A (zh) * 2011-09-21 2012-01-18 天津胜发生物技术有限公司 针对乳腺癌Her2/new的纳米抗体或多肽
WO2014025199A2 (ko) * 2012-08-09 2014-02-13 주식회사 한독 스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체 및 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Nanobody Activation Immunotherapeutic that Selectively Destroys HER2‐Positive Breast Cancer Cells;Melissa A.et al.;《ChemBioChem》;20151111;第17卷(第2期);第155-158页 *
Crystal Structure of a Human Single Domain Antibody Dimer Formed through VH-VH Non-Covalent Interactions;Toya Nath Baral et al.;《PLoS One》;20120112;第7卷(第1期);摘要，第3页左栏第4段，图3 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107236046A (zh) 2017-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106906230B (zh) 重组药物载体蛋白基因及其制备方法与应用
CN107236046B (zh) 一种重组人内皮抑素融合蛋白及其制备方法和应用
WO2013075600A1 (zh) 一种聚乙二醇修饰的整合素阻断剂hm-3及其应用
CN110577592B (zh) 一种重组人纤连蛋白肽
CN102596179A (zh) 脂质体组合物及其用途
WO2023051701A1 (zh) 抗SARS-CoV-2感染的mRNA、蛋白以及抗SARS-CoV-2感染的疫苗
JP2001526040A (ja) ピヒア酵母発現系を用いる抗血管形成タンパク質：エンドスタチン、アンジオスタチンまたはレスチンの生産方法
WO2016138625A1 (zh) TRAIL穿膜肽样突变体MuR6、制备方法及应用
US20240083976A1 (en) Serum albumin-based fusion protein, and nano-assembly, preparation method therefor and application thereof
US20090011984A1 (en) Biotin-binding receptor molecules
CN108840946A (zh) 犬白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种犬长效干扰素
WO2023179789A1 (zh) 干扰趋化素样因子超家族成员6(cmtm6)表达的基因治疗载体的制备和抗肿瘤应用
CN111690071A (zh) 一种具有靶向穿膜性的抗肿瘤多肽
CN101987873A (zh) P53融合蛋白及应用
CN115109795B (zh) 重组人源iii型胶原蛋白注射剂及其在皮肤胶原再生中的应用
CN116003635A (zh) 一种长效纤连蛋白及其制备方法和应用
CN113896803B (zh) 一种肿瘤微酸响应性融合蛋白及其应用
KR20100107300A (ko) ｓｉＲＮＡ 전달용 복합체
CN116023508A (zh) 重组犬PD-1和犬SIRPα双融合蛋白的制备方法及其应用
US20210214399A1 (en) Ph low insertion peptide and composition thereof
CN101302256B (zh) 一种新的重组融合分子及其抗肿瘤治疗作用
CN110627905B (zh) 靶向vegf与egfr的双功能融合蛋白及其应用
CN113667018A (zh) 一种可以进入肿瘤细胞内的BR2-抗p21Ras单链抗体融合蛋白及其制备方法
CN114685670A (zh) Cldn18.2抗体及其应用
CN116621946B (zh) 多肽circ1946-109aa作为食管鳞癌预后标志物的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210716

Address after: 215100 Building 8, No.2, South Dongwu Road, Wuzhong Economic Development Zone, Suzhou City, Jiangsu Province

Patentee after: JIANGSU WUZHONG PHARMACEUTICAL Group Corp.

Patentee after: CHANGZHOU HIGH-TECH RESEARCH INSTITUTE OF NANJING University

Address before: 215100 No.42, Chenghu Road, Wuzhong Economic Development Zone, Suzhou City, Jiangsu Province

Patentee before: SUZHOU ZHONGKAI BIOLOGY PHARMACEUTICAL FACTORY, JIANGSU WUZHONG PHARMACEUTICAL Group Corp.

Patentee before: CHANGZHOU HIGH-TECH RESEARCH INSTITUTE OF NANJING University

TR01 Transfer of patent right