CN114478793B

CN114478793B - CPP-scFv融合蛋白及相应的核酸分子、载体、细胞和药物

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Publication number: CN114478793B
Application number: CN202011156145.2A
Authority: CN
Inventors: 请求不公布姓名
Original assignee: Guangzhou Mineralien Biological Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Mineralien Biological Technology Co ltd
Priority date: 2020-10-26
Filing date: 2020-10-26
Publication date: 2023-09-19
Anticipated expiration: 2040-10-26
Also published as: CN114478793A

Abstract

本发明提供了一种CPP‑scFv融合蛋白及相应的核酸分子、载体、细胞和药物，所述CPP‑scFv融合蛋白为由CPP的C端通过接头或以直接连接的方式与scFv的N端连接而成的重组蛋白BP16‑scFv、重组蛋白S413‑scFv、重组蛋白MAP‑scFv中的一种或几种；所述的CPP为BP16、S413、MAP中的一种。在不影响scFv活性的前提下，将穿膜肽与曲妥珠单抗的单链抗体偶联，发挥了穿膜肽的穿膜特性，增强抗体的内吞效果，与胞内靶标结合，增强抗体药物的抗肿瘤活性。CPP‑scFv融合蛋白与scFv抗体具有同等的亲和力，但对HER2+乳腺癌的细胞毒性更强，诱导HER2+乳腺癌细胞凋亡能力更强，同时对HER2阴性乳腺癌细胞的生长无影响，减少不良反应，可以用于HER2+乳腺癌的治疗，为HER2+乳腺癌ADC药物的研究提供了新的突破口。

Description

CPP-scFv融合蛋白及相应的核酸分子、载体、细胞和药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域和医学领域，尤其是指CPP-scFv融合蛋白及相应的核酸分子、载体、细胞和药物。

背景技术

乳腺癌是女性中最常见的恶性癌症类型，致死率在女性癌症中排名第二，仅2018年，新发病例达到210万，占女性癌症患者的24.2％。乳腺癌分为三类，激素阳性(雌激素阳性或孕激素阳性)、人表皮生长因子受体2阳性(human epidermal growthfactorreceptor-2，HER2+)和三阴性乳腺癌，其中HER2+乳腺癌患者约占总患者的25％，具有复发率高、预后差等特点。常规的肿瘤治疗手段主要包括手术、化疗、放疗等。手术切除和化疗通常产生较大的伤害。而传统化疗使用的药物通常是一些细胞毒分子如铂类药物、烷化剂及紫杉醇类等，因缺乏靶向性，进入体内具有全身毒性，出现对正常细胞的杀伤。曲妥珠单抗是1998年由FDA批准的靶向HER2+的单克隆抗体，它的应用显著改善了早期HER2+乳腺癌患者的预后，是目前治疗该类乳腺癌的一线靶向药物。然而曲妥珠单抗单药治疗HER2+晚期乳腺癌有效率仅为20％-30％，联合化疗治疗的有效率最高仅60％。由于内吞能力的不足，产生一定的耐药性和心脏毒性等一系列不良反应，导致至少70％的HER2+乳腺癌患者出现了疾病进展。因此如何能够提高靶向药物的内吞能力，已成为开发新的HER2+药物的方向。

细胞穿膜肽(Cell penetrating peptides，CPPs)是一类可以穿透生物膜并将各种外源物质递送到细胞内的短肽，如siRNA，核酸，小分子治疗剂，蛋白质等。这种有效的转运系统不受细胞类型的影响且具有较低的细胞毒性。根据其理化性质可以分为阳离子穿膜肽、两亲性穿膜肽和疏水性穿膜肽三类。用穿膜肽增加抗体药物的体内递送是解决抗体药物耐药性，增加抗体药物效果的优选方案。单链抗体(single chain antibody，scFv)相对于全抗体积小，具有良好的组织渗透能力，能在血液中快速清除，因此近年来在抗胞内抗原领域得到广泛的应用。

但是，不同的CPP和scFv偶联，会影响到CPP的效果，甚至会影响到scFv的活性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：在不影响scFv靶向活性的前提下，提高曲妥珠scFv进入细胞的能力，提高单个细胞的载药量，提升实际治疗时曲妥珠scFv抑制HER2+肿瘤细胞的生长的治疗效果。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种CPP-scFv融合蛋白，为由CPP的C端通过接头或以直接连接的方式与scFv的N端连接而成的重组蛋白BP16-scFv、重组蛋白S413-scFv、重组蛋白MAP-scFv中的一种或几种；所述的CPP为BP16、S413、MAP中的一种。

进一步地，所述BP16从天蚕素-蜂毒素杂种库中筛选，所述S413由衍生自线性聚阳离子肽皮肤肽素的穿膜序列和衍生自SV40-T抗原的核定位序列嵌合组成，所述MAP为两亲性穿膜肽，所述接头的氨基酸序列长度为2-50个氨基酸。

进一步地，所述重组蛋白BP16-scFv的氨基酸序列为：SEQ ID NO：1，所述重组蛋白S413-scFv的氨基酸序列为：SEQ ID NO：3，所述重组蛋白MAP-scFv的氨基酸序列为：SEQ IDNO：2。

一种核酸分子，包含用于编码上述所述的CPP-scFv融合蛋白的核苷酸序列和/或相应的互补序列。

进一步地，用于编码重组蛋白BP16-scFv的核苷酸序列为：SEQ ID NO：4，用于编码重组蛋白S413-scFv的核苷酸序列为：SEQ ID NO：6，用于编码重组蛋白MAP-scFv的核苷酸序列为：SEQ ID NO：5。

一种载体，包含上述所述的核酸分子。

进一步地，所述载体由所述核酸分子通过引物扩增并连接至质粒PET28b形成；在扩增、连接时，使用的限制性内切酶为Nde Ⅰ和HindⅢ，接头为G₄S；所述引物为BP16-scFv引物、S413-scFv引物、MAP-scFv引物中的一种或几种。

所述BP16-scFv引物由BP16-scFv-F1、BP16-scFv-R1、BP16-scFv-F2和BP16-scFv-R2组成；所述S413-scFv引物由S413-scFv-F1、S413-scFv-R1、S413-scFv-F2和抗体S413-scFv-R2组成；所述MAP-scFv引物由MAP-scFv-F1、MAP-scFv-R1、MAP-scFv-F2和MAP-scFv-R2组成。

所述BP16-scFv-F1的核苷酸序列为：SEQ ID NO：7；所述BP16-scFv-R1的核苷酸序列为：SEQ ID NO：8；所述BP16-scFv-F2的核苷酸序列为：SEQ ID NO：9；所述BP16-scFv-R2的核苷酸序列为：SEQ ID NO：10；所述S413-scFv-F1的核苷酸序列为：SEQ ID NO：15；所述S413-scFv-R1的核苷酸序列为：SEQ ID NO：16；所述S413-scFv-F2的核苷酸序列为：SEQ IDNO：17；所述S413-scFv-R2的核苷酸序列为：SEQ ID NO：18；所述MAP-scFv-F1的核苷酸序列为：SEQ ID NO：11；所述MAP-scFv-R1的核苷酸序列为：SEQ ID NO：12；所述MAP-scFv-F2的核苷酸序列为：SEQ ID NO：13；所述MAP-scFv-R2的核苷酸序列为：SEQ ID NO：14。

一种细胞，转导上述所述的核酸分子、上述所述的载体中的一种或几种；该细胞表达CPP-scFv融合蛋白。

一种药物，其活性成分包含上述所述的CPP-scFv融合蛋白、上述所述的核酸分子、上述所述的载体、上述所述的细胞中的一种或几种。

进一步地，所述的药物为用于治疗HER2+乳腺癌的抗体偶联药物。

本发明的有益效果在于：在确保不影响scFv活性的前提下，将穿膜肽与曲妥珠单抗的单链抗体偶联，发挥了穿膜肽的穿膜特性，增强抗体的内吞效果，与胞内靶标结合，增强抗体药物的抗肿瘤活性。CPP-scFv融合蛋白与scFv抗体具有同等的亲和力，但对HER2+乳腺癌的细胞毒性更强，诱导HER2+乳腺癌细胞凋亡能力更强，同时对HER2阴性乳腺癌细胞的生长无影响，减少不良反应，可以用于HER2+乳腺癌的治疗，为HER2+乳腺癌ADC药物的研究提供了新的突破口。

附图说明

下面结合附图详述本发明的具体结构和特点

图1是本发明试验例1的overlap PCR扩增目的基因片段的1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道1为overlap PCR扩增的BP16-scFv基因片段，泳道2为overlap PCR扩增的MAP-scFv基因片段，泳道3为overlap PCR扩增的S413-scFv基因片段，M为DNA Marker。

图2是本发明的重组质粒PET28b-CPP-scFv的质粒图谱图，其中，2-1为重组质粒PET28b-BP16-scFv，2-2为重组质粒PET28b-S413-scFv，2-3为重组质粒PET28b-MAP-scFv。

图3是本发明试验例2中小量表达中SDS-PAGE和Western Blot检测不同浓度IPTG对融合蛋白BP16-scFv(A、D)、S413-scFv(B、E)和MAP-scFv(C、F)表达的影响。

图4是本发明试验例2中重组质粒PET28b-BP16-scFv、PET28b-S413-scFv、PET28b-MAP-scFv大量表达纯化后的SDS-PAGE(A)和Western Blot结果图(B)，其中，泳道1为S413-scFv(56.9kD)；泳道2为BP16-scFv(55.6kD)；泳道3为MAP-scFv(56.4kD)；泳道M为蛋白Marker。

图5是本发明试验例3中通过微量热泳动技术(MST)研究scFv，BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv与HER2抗原的结合曲线。

图6是本发明试验例4中蛋白scFv，BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv对HER2+乳腺癌细胞SK-BR-3的毒性检测结果分析图。其中，n＝3，^****P<0.0001cell groups vs.scFvgroups，^&&&P<0.001MAP-scFv groups vs.BP16-scFv groups，^###P<0.001MAP-scFv groupsvs.S413-scFv groups，ns表示差异无统计学意义；

图7是本发明试验例4中蛋白scFv，BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv对HER2阴性乳腺癌细胞MCF-7的毒性检测结果分析图，其中，n＝3，ns表示差异无统计学意义；

图8是本发明试验例4中蛋白scFv，BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv对乳腺正常细胞MCF-10A的毒性检测结果分析图，其中，n＝3，ns表示差异无统计学意义；

图9是本发明的通过流式细胞仪分析蛋白scFv，BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv对HER2+细胞SK-BR-3凋亡作用的Annexin V450/7-AAD双染结果分析图；

图10是本发明的通过流式细胞仪分析蛋白scFv，BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv对HER2阴性细胞MCF-7凋亡作用的Annexin V450/7-AAD双染结果分析图。

具体实施方式

本发明最关键的目的为：将穿膜肽BP16或S413或MAP与scFv连接形成新的易于穿过细胞壁的融合蛋白，进而实现高效、特异性杀伤HER2+乳腺癌细胞的目的。

为了进一步论述本发明的可行性，根据本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果的具体实施方式并配合附图详予说明。

实施例1

所述BP16从天蚕素-蜂毒素杂种库中筛选，为阳离子穿膜肽；所述S413由衍生自线性聚阳离子肽皮肤肽素的穿膜序列和衍生自SV40-T抗原的核定位序列嵌合组成；所述MAP为两亲性穿膜肽；所述接头的氨基酸序列长度为2-50个氨基酸，优选为4-20个氨基酸，更优选为G₄S。

实施例2

在实施例1的基础上，所述重组蛋白BP16-scFv的氨基酸序列为：SEQ ID NO：1，所述重组蛋白S413-scFv的氨基酸序列为：SEQ ID NO：3，所述重组蛋白MAP-scFv的氨基酸序列为：SEQ ID NO：2。

实施例3

一种核酸分子，包含用于编码上述实施例中的CPP-scFv融合蛋白的核苷酸序列和/或相应的互补序列。

用于编码重组蛋白BP16-scFv的核苷酸序列为：SEQ ID NO：4，用于编码重组蛋白S413-scFv的核苷酸序列为：SEQ ID NO：6，用于编码重组蛋白MAP-scFv的核苷酸序列为：SEQ ID NO：5。

实施例4

一种载体，包含上述实施例中的核酸分子。所述载体由所述核酸分子通过引物扩增并连接至质粒PET28b形成；在扩增、连接时，使用的限制性内切酶为Nde Ⅰ和HindⅢ，接头为G₄S；所述引物为BP16-scFv引物、S413-scFv引物、MAP-scFv引物中的一种或几种。

所述BP16-scFv引物由BP16-scFv-F1、BP16-scFv-R1、BP16-scFv-F2和BP16-scFv-R2组成；所述S413-scFv引物由S413-scFv-F1、S413-scFv-R1、S413-scFv-F2和S413-scFv-R2组成；所述MAP-scFv引物由MAP-scFv-F1、MAP-scFv-R1、MAP-scFv-F2和MAP-scFv-R2组成。

实施例5

一种细胞，转导上述实施例中的核酸分子、上述实施例中的载体中的一种或几种；该细胞表达CPP-scFv融合蛋白。该细胞优选为转导上述实施例中的核酸分子、上述实施例中的载体中的一种或几种的大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，原核表达时，采用500-1000μM的IPTG进行诱导。

实施例6

一种药物，其活性成分包含上述实施例中的CPP-scFv融合蛋白、上述实施例中的核酸分子、上述实施例中的载体、上述实施例中的细胞中的一种或几种。所述的药物为用于治疗HER2+乳腺癌的抗体偶联药物。

实施例7

一种CPP-scFv融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

将用于编码上述所述的CPP-scFv融合蛋白的核酸分子扩增并连接至质粒PET28b得到载体；将所述载体转入表达系统大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，将得到的阳性转化子并进行原核表达，将表达产物分离纯化后得到所述CPP-scFv融合蛋白。所述核酸分子通过overlap PCR由引物与scFv核苷酸序列偶联得到。连接前，质粒PET28b和核酸分子同时经过限制性内切酶Nde Ⅰ、HindⅢ酶切。

原核表达时，将阳性转化子接种到卡那霉素抗性的LB液体培养基中，过夜培养后，按1:100转接至卡那霉素抗性的LB液体培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入500-1000μM的IPTG，16-20℃条件下，诱导过夜，收菌。

分离纯化时，按照每克菌体加入10-20mL裂解液的比例，先使用裂解液重悬菌体，然后进行超声波或高压破壁，接着在6500-7000rpm条件下离心0.5-1.5h，收集上清液，最后采用结合缓冲液和洗脱缓冲液、通过镍柱亲和层析纯化所述上清液获得高纯度的CPP-scFv融合蛋白。

所述裂解液由20mM磷酸盐、500mM NaCl、20-30mM咪唑、0-2％Tween-20混合形成，pH＝6.8；所述结合缓冲液由20mM磷酸盐、500mM NaCl、20-30mM咪唑混合形成，pH＝6.8；所述洗脱缓冲液由20mM磷酸盐、1M NaCl、500mM咪唑混合形成，pH＝6.8。

为进一步说明本申请的技术方案，以下根据具体试验例作详细说明：

试验例1：重组表达载体PET28b-BP16-scFv、PET28b-S413-scFv、PET28b-MAP-scFv的构建

(1)主要试剂与设备

仪器：T100^TM Thermal Cycler PCR仪购于美国BIO-RAD；Fusion Solo S化学发光成像系统购于法国Vilber。

试剂：Prime STAR HS DNA Polymerase购于日本Takara；Fast Digest NdeI，FastDigest Hind Ⅲ，T4 DNA Ligase均购于美国NEW ENGLAND BioLabs；PET-28b载体，E.coliDH5α，E.coli BL21均购于中国天根生化科技有限公司。

(2)Overlap PCR扩增引物序列的设计详见表1：

表1

Primer	Sequence(5’-3’)	备注
			BP16-scFv-F1	SEQ ID NO：7	CATATG为酶切位点
BP16-scFv-R1	SEQ ID NO：8	AGAACCACCACCACC为G₄S接头
			BP16-scFv-F2	SEQ ID NO：9	GGTGGTGGTGGTTCT为G₄S接头
BP16-scFv-R2	SEQ ID NO：10	AAGCTT为酶切位点
			S413-scFv-F1	SEQ ID NO：15	CATATG为酶切位点
S413-scFv-R1	SEQ ID NO：16	ACTACCTCCTCCTCC为G₄S接头
			S413-scFv-F2	SEQ ID NO：17	GGAGGAGGAGGTAGT为G₄S接头
S413-scFv-R2	SEQ ID NO：18	AAGCTT为酶切位点
			MAP-scFv-F1	SEQ ID NO：11	CATATG为酶切位点
MAP-scFv-R1	SEQ ID NO：12	TGAGCCTCCTCCTCC为G₄S接头
			MAP-scFv-F2	SEQ ID NO：13	GGAGGAGGAGGCTCA为G₄S接头
MAP-scFv-R2	SEQ ID NO：14	AAGCTT为酶切位点

(3)CPP和scFv的PCR扩增体系详见表2：

表2

备注：表2中，当目标为扩增得到用于编码重组蛋白BP16-scFv时，CPP-F1为BP16-scFv-F1，CPP-R1为BP16-scFv-R1，CPP-F2为BP16-scFv-F2，CPP-R2为BP16-scFv-R2。当目标为扩增得到用于编码重组蛋白S413-scFv时，CPP-F1为S413-scFv-F1，CPP-R1为S413-scFv-R1，CPP-F2为S413-scFv-F2，CPP-R2为S413-scFv-R2。当目标为扩增得到用于编码重组蛋白MAP-scFv时，CPP-F1为MAP-scFv-F1，CPP-R1为MAP-scFv-R1，CPP-F2为MAP-scFv-F2，CPP-R2为MAP-scFv-R2。

(4)CPP和scFv的PCR扩增条件详见表3：

表3

(5)Overlap PCR扩增体系详见表4：

表4

(6)Overlap PCR扩增条件详见表5：

表5

(7)通过overlap PCR将穿膜肽BP16、S413、MAP分别与scFv偶联，通过扩增得到BP16-scFv、S413-scFv、MAP-scFv的基因片段，大小分别≈1.54kb、1.58kb和1.57kb，对产物进行1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示。将PCR扩增得到的基因片段进行纯化回收，内切酶NdeⅠ和HindⅢ对上述基因片段和表达质粒PET-28b分别双酶切，37℃，2h。酶切产物纯化回收后，在16℃条件下用T4 DNA Ligase连接过夜将目的基因与PET-28b质粒进行连接。

(8)将连接产物转化到E.coli DH5α菌株中；在含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，菌落PCR及双酶切筛选阳性克隆并进行DNA测序，结果显示与预期核苷酸序列完全一致。说明成功构建PET28b-BP16-scFv、PET28b-S413-scFv、PET28b-MAP-scFv重组质粒，其中，构建所得的PET28b-BP16-scFv、PET28b-S413-scFv、PET28b-MAP-scFv重组质粒的质粒图谱详见图2。

试验例2：重组蛋白BP16-scFv、S413-scFv、MAP-scFv的表达与鉴定

1.重组蛋白BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv的小量表达

将上述试验例1中得到的阳性质粒PET28b-BP16-scFv、PET28b-S413-scFv、PET28b-MAP-scFv分别转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，挑取单克隆接种至1-2mL含有Kan抗性的LB液体培养基中，37℃220rpm过夜培养做种子液并保菌。按1：100的比例，37℃220rpm培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8时，分别加入500μM、800μM、1000μM IPTG诱导蛋白表达，16℃诱导过夜。诱导结束后离心收集菌体，超声裂解，未诱导全液、诱导上清和诱导沉淀分别加入上样缓冲液(上样缓冲液：250mM Tris-HCl(pH 6.8)，10％(W/V)SDS，0.5％(W/V)BPB，50％(V/V)甘油，5％(V/V)β-巯基乙醇)100℃煮沸5min。未诱导全液、诱导上清和诱导沉淀分别进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测，检测结果如图3所示。

在图3中，重组蛋白BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv诱导表达，大小分别为55.6kDa、56.9kDa、56.4kDa，诱导上清和诱导沉淀中均有表达，诱导剂的最适浓度分别为800μM、800μM、500μM。

2.重组蛋白BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv的大量表达及亲和层析纯化

活化上述三种重组蛋白的种子液，按1:100的比例转接Kan抗性的LB液体培养基中，培养至OD₆₀₀≈0.8加入最适浓度的IPTG(具体浓度参照试验例2.1中的结论)，16℃诱导过夜后离心收集菌体。用裂解缓冲液(20mM磷酸盐、500mM NaCl、20mM咪唑、2％Tween-20，pH＝6.8)重悬，超声破碎后，6700rpm离心1h，收集上清，进行Ni²⁺亲和层析纯化，收集纯化后样品，SDS-PAGE和Western Blot检测纯化效果，检测结果详见图4。纯化得到的目的蛋白用1×PBS透析。

图4中，重组蛋白BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv纯化成功，蛋白分子量大小与理论计算结果一致，纯化后BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv蛋白浓度分别为：542.6μg/mL、427.7μg/mL、530.1μg/mL，纯度分别为94.0％、97.1％、91.1％。符合生物学实验要求。

试验例3重组蛋白scFv，BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv与HER2抗原的相互作用研究

利用微量热泳动技术(MST)测定试验例2中纯化的重组蛋白scFv，BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv与HER2抗原(Abcam，英国)的平衡解离常数KD。采用MO NT.115相互作用分析仪测定重组蛋白与HER2抗原结合后热泳信号的变化。

样品制备：用MST工作缓冲液(10mM PBS，10％(W/V)BSA，0.5％(V/V)Tween 20，pH＝6.8)配制400mM的HER2抗原和100mM的重组蛋白scFv，重组蛋白BP16-scFv，重组蛋白S413-scFv，重组蛋白MAP-scFv。将HER2抗原半倍稀释后再与重组蛋白等体积混合均匀。

根据MO NT.115相互作用分析仪操作说明书进行检测，采用K022毛细管(NanoTemper，德国)上机测试，利用MO.Control和MO.Affinity Analysis软件进行数据收集和分析，结果如图5和表6所示。

从图5和表6中可知：scFv，重组蛋白BP16-scFv，重组蛋白S413-scFv，重组蛋白MAP-scFv可与HER2抗原特异性结合，且平衡解离常数KD值具有相等的数量级10^-9，即重组蛋白BP16-scFv，重组蛋白S413-scFv，重组蛋白MAP-scFv与scFv亲和力等同。

表6亲和力测定

试验例4重组蛋白scFv，BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv细胞毒性检测

(1)主要试剂

HER2+乳腺癌细胞SK-BR-3(中科院上海细胞库)；人乳腺癌细胞HER2阴性乳腺癌细胞MCF-7(中科院上海细胞库)；乳腺正常细胞MCF-10A(中科院上海细胞库)。MTT溶液，5mg/mL噻唑蓝(Sigma，美国)，用10mM PBS配制，-20℃避光保存。DMEM培养基(Gibco，ThermoFisher Scientific，美国)；胰酶(Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国)；FBS(Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国)；青霉素-链霉素(Pen-Strep，Gibco，Thermo FisHERScientific，美国)；10mM PBS(Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国)。MTT溶解液(称取10g SDS，量取5ml异丁醇，0.1ml 10M浓盐酸，SDS充分溶解后，用蒸馏水定容至100ml，-20℃保存，使用时需提前在室温溶解)。

(2)细胞毒性检测检测

分别接种1×10⁴/孔的SK-BR-3和MCF-7细胞到96孔板中，每孔100μL培养基，37℃，5％CO₂培养24h；用DMEM完全培养基对重组蛋白scFv，BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv作梯度稀释(12.5、25、50、100、200、400、800nM)，处理细胞72h后，每孔加入20μl MTT溶液，继续培养4h。培养结束后每孔加入100μl MTT溶解液，37℃静置过夜。在酶联免疫检测仪OD₅₇₀ nm处测量各孔的吸光值，以未给药组作对照，取其细胞存活率为100％。计算细胞存活率：细胞存活率％＝(实验组A₅₇₀-空白对照A₅₇₀)/(对照组A₅₇₀空白对照组A₅₇₀)×100。重复实验三次，取平均值。测试分析结果详见图6、图7和图8所示。

从图6、图7和图8中可知，重组蛋白scFv，重组蛋白BP16-scFv，重组蛋白S413-scFv，重组蛋白MAP-scFv仅对HER2+细胞SK-BR-3表现高毒性，对HER2阴性细胞MCF-7和乳腺正常细胞MCF-10A毒性很低，说明了只特异性杀伤HER2+细胞。重组蛋白scFv，BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv均抑制HER2+细胞SK-BR-3生长，并存在浓度依赖性关系，且CPP-scFv融合蛋白明显提高了scFv对SK-BR-3的杀伤能力。

试验例5重组蛋白scFv，BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv诱导细胞凋亡

Annexin450/7-AAD双染法检测，采用流式细胞仪分析抗体scFv，BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv对HER2+细胞SK-BR-3及HER2阴性细胞MCF-7的凋亡作用。

分别接种3×10⁵/孔的SK-BR-3和MCF-7细胞到6孔板中，37℃，5％CO₂培养24h；加入60μg重组蛋白scFv，BP16-scFv，S413-scFv，MAP-scFv处理细胞72h。根据eBioscience^TMAnnexin V Apoptosis Detection Kit eFluor^TM450(Invitrogen，美国)试剂盒染色实验步骤操作。流式细胞仪检测凋亡细胞的百分比。检测结果详见图9、图10和表7、表8所示。

从图9和表7中，scFv早凋/晚凋分别为6.41％和5.92％，BP16-scFv早凋/晚凋分别为18.8％和13.7％，S413-scFv早凋/晚凋分别为8.22％和18.6％，MAP-scFv早凋/晚凋分别为34.7％和19.5％(表7和图9)；CPP增加了scFv对HER2+细胞SK-BR-3的凋亡效率。

表7

SK-BR-3	早凋(％)	晚凋(％)	存活率(％)
				对照	2.33	0.40	97.1
scFv	6.41	5.92	86.9
				BP16-scFv	18.8	13.7	65.3
S413-scFv	8.22	18.6	67.6
				MAP-scFv	34.7	19.5	42.0

从图10和表8中，scFv早凋/晚凋分别为4.80％和0.43％，BP16-scFv早凋/晚凋分别为1.48％和0.66％，S413-scFv早凋/晚凋分别为1.93％和0.80％，MAP-scFv早凋/晚凋分别为1.71％和0.82％(表8和图10)。CPP-scFv与scFv相比，对MCF-7细胞凋亡没有明显差异。

表8

MCF-7	早凋(％)	晚凋(％)	存活率(％)
				对照	0.37	0.70	98.7
scFv	4.80	0.43	94.7
				BP16-scFv	1.48	0.66	97.7
S413-scFv	1.93	0.80	97.0
				MAP-scFv	1.71	0.82	97.4

综上所述，本发明提供的CPP-scFv融合蛋白及相应的核酸分子、载体、细胞和药物中，所述CPP-scFv融合蛋白在确保不影响scFv活性的前提下，由穿膜肽与曲妥珠单抗的scFv偶联形成，发挥了穿膜肽的穿膜特性，增强抗体的内吞效果，与胞内靶标结合，增强抗体药物的抗肿瘤活性。CPP-scFv融合蛋白应用作治疗HER2+乳腺癌的药物时，CPP-scFv融合蛋白与scFv抗体具有同等的亲和力，但对HER2+乳腺癌的细胞毒性更强，诱导HER2+乳腺癌细胞凋亡能力更强，同时对HER2阴性乳腺癌细胞的生长无影响，减少不良反应，可以用于HER2+乳腺癌的治疗，为HER2+乳腺癌ADC药物的研究提供了新的突破口。制备CPP-scFv融合蛋白时，采用大肠杆菌表达体系表达了CPP-scFv融合蛋白，与真核表达系统和其他原核表达系统相比，具有廉价、高效的特点。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 广州奈米微晶生物科技有限公司

<120> CPP-scFv融合蛋白及相应的核酸分子、载体、细胞和药物

<141> 2020-10-26

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 514

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

His Met Lys Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Lys Lys Leu Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Glu Leu Ala Cys Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

20 25 30

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

35 40 45

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp

50 55 60

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala

65 70 75 80

Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser

85 90 95

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

100 105 110

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

145 150 155 160

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

165 170 175

Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln

180 185 190

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn

195 200 205

Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

210 215 220

Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

225 230 235 240

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly

245 250 255

Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

260 265 270

Ser Gly Ser Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile

275 280 285

Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg

290 295 300

Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe

305 310 315 320

Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr

325 330 335

Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met

340 345 350

Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln

355 360 365

Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala

370 375 380

Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys

385 390 395 400

Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu

405 410 415

Tyr Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys

420 425 430

Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly

435 440 445

Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp

450 455 460

Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val

465 470 475 480

Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu

485 490 495

Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

500 505 510

Lys Leu

<210> 2

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

His Met Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Leu Lys Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu

20 25 30

Ala Cys Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser

35 40 45

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

50 55 60

Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

65 70 75 80

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Glu

85 90 95

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe

100 105 110

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

115 120 125

Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

130 135 140

Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

165 170 175

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

180 185 190

Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

195 200 205

Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg

210 215 220

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

225 230 235 240

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

245 250 255

Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met

260 265 270

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ser

275 280 285

Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu

290 295 300

Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu

305 310 315 320

Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr

325 330 335

Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr

340 345 350

Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp

355 360 365

Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile

370 375 380

Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe

385 390 395 400

Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe

405 410 415

Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn

420 425 430

Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys

435 440 445

Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu

450 455 460

Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu

465 470 475 480

Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp

485 490 495

Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala

500 505 510

Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Lys Leu

515 520 525

<210> 3

<211> 528

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

His Met Ala Leu Trp Lys Thr Leu Leu Lys Lys Val Leu Lys Ala Pro

1 5 10 15

Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

Glu Leu Ala Cys Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

35 40 45

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

50 55 60

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln

65 70 75 80

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe

85 90 95

Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr

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115 120 125

Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly

130 135 140

Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

165 170 175

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

180 185 190

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro

195 200 205

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr

210 215 220

Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp

225 230 235 240

Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

245 250 255

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr

260 265 270

Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

275 280 285

Ser Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

290 295 300

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

305 310 315 320

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

325 330 335

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

340 345 350

Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg

355 360 365

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

370 375 380

Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

385 390 395 400

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

405 410 415

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

420 425 430

Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

435 440 445

Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val

450 455 460

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

465 470 475 480

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser

485 490 495

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

500 505 510

Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Lys Leu

515 520 525

<210> 4

<211> 1542

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catatgaaaa agctatttaa aaagattcta aaaaagctag gtggtggtgg ttctgagctc 60

gcatgcgctt gtggaggagg aggatctgat atccaaatga cccagtcccc ctcttctctg 120

tccgcctctg ttggcgaccg ggttactatt acctgtagag cctctcagga tgtgaatacc 180

gccgtggcct ggtatcagca aaagcccgga aaagccccca aactgctcat ctactccgcc 240

tctttcctgg agagcggcgt gccttctaga ttcagcggaa gcaggagtgg caccgacttt 300

accctgacca tttccagcct ccaacccgag gacttcgcca cttactactg ccagcagcac 360

tacaccaccc cccctacatt cggccaaggc acaaaagtgg aaatcaagag aaccggcggc 420

ggaggcagcg gaggaggagg atctggagga ggaggaagcg aggtgcagct cgttgagagc 480

ggaggaggtc tggtgcagcc tggaggatca ctgagactga gctgcgcagc aagtggattc 540

aacataaagg acacatatat tcattgggtg agacaggcac ccggcaaagg actggagtgg 600

gttgctagaa tctaccccac aaacggctac accagatacg ccgacagcgt gaagggcaga 660

ttcaccattt ccgccgacac cagcaagaac acagcctacc tgcagatgaa cagcctgaga 720

gccgaggaca ccgccgttta ctactgcagc agatggggag gcgacggctt ctacgctatg 780

gacgtgtggg gacagggcac cctggttaca gtgagcagcg gatccagcaa aggagaagaa 840

cttttcactg gagttgtccc aattcttgtt gaattagatg gtgatgttaa tgggcacaaa 900

ttttctgtcc gtggagaggg tgaaggtgat gctacaaacg gaaaactcac ccttaaattt 960

atttgcacta ctggaaaact acctgttccg tggccaacac ttgtcactac tctgacctat 1020

ggtgttcaat gcttttcccg ttatccggat cacatgaaac ggcatgactt tttcaagagt 1080

gccatgcccg aaggttatgt acaggaacgc actatatctt tcaaagatga cgggacctac 1140

aagacgcgtg ctgaagtcaa gtttgaaggt gatacccttg ttaatcgtat cgagttaaag 1200

ggtattgatt ttaaagaaga tggaaacatt cttggacaca aactcgagta caactttaac 1260

tcacacaatg tatacatcac ggcagacaaa caaaagaatg gaatcaaagc taacttcaaa 1320

attcgccaca acgttgaaga tggttccgtt caactagcag accattatca acaaaatact 1380

ccaattggcg atggccctgt ccttttacca gacaaccatt acctgtcgac acaatctgtc 1440

ctttcgaaag atcccaacga aaagcgtgac cacatggtcc ttcttgagtt tgtaactgct 1500

gctgggatta cacatggcat ggatgagctc tacaaaaagc tt 1542

<210> 5

<211> 1578

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catatgaagc tggcactgaa gctggccctg aaggccctga aagccgcact gaagctcgcc 60

ggaggaggag gatcaggagg aggaggctca gagctcgcat gcgcttgtgg aggaggagga 120

tctgatatcc aaatgaccca gtccccctct tctctgtccg cctctgttgg cgaccgggtt 180

actattacct gtagagcctc tcaggatgtg aataccgccg tggcctggta tcagcaaaag 240

cccggaaaag cccccaaact gctcatctac tccgcctctt tcctggagag cggcgtgcct 300

tctagattca gcggaagcag gagtggcacc gactttaccc tgaccatttc cagcctccaa 360

cccgaggact tcgccactta ctactgccag cagcactaca ccaccccccc tacattcggc 420

caaggcacaa aagtggaaat caagagaacc ggcggcggag gcagcggagg aggaggatct 480

ggaggaggag gaagcgaggt gcagctcgtt gagagcggag gaggtctggt gcagcctgga 540

ggatcactga gactgagctg cgcagcaagt ggattcaaca taaaggacac atatattcat 600

tgggtgagac aggcacccgg caaaggactg gagtgggttg ctagaatcta ccccacaaac 660

ggctacacca gatacgccga cagcgtgaag ggcagattca ccatttccgc cgacaccagc 720

aagaacacag cctacctgca gatgaacagc ctgagagccg aggacaccgc cgtttactac 780

tgcagcagat ggggaggcga cggcttctac gctatggacg tgtggggaca gggcaccctg 840

gttacagtga gcagcggatc cagcaaagga gaagaacttt tcactggagt tgtcccaatt 900

cttgttgaat tagatggtga tgttaatggg cacaaatttt ctgtccgtgg agagggtgaa 960

ggtgatgcta caaacggaaa actcaccctt aaatttattt gcactactgg aaaactacct 1020

gttccgtggc caacacttgt cactactctg acctatggtg ttcaatgctt ttcccgttat 1080

ccggatcaca tgaaacggca tgactttttc aagagtgcca tgcccgaagg ttatgtacag 1140

gaacgcacta tatctttcaa agatgacggg acctacaaga cgcgtgctga agtcaagttt 1200

gaaggtgata cccttgttaa tcgtatcgag ttaaagggta ttgattttaa agaagatgga 1260

aacattcttg gacacaaact cgagtacaac tttaactcac acaatgtata catcacggca 1320

gacaaacaaa agaatggaat caaagctaac ttcaaaattc gccacaacgt tgaagatggt 1380

tccgttcaac tagcagacca ttatcaacaa aatactccaa ttggcgatgg ccctgtcctt 1440

ttaccagaca accattacct gtcgacacaa tctgtccttt cgaaagatcc caacgaaaag 1500

cgtgaccaca tggtccttct tgagtttgta actgctgctg ggattacaca tggcatggat 1560

gagctctaca aaaagctt 1578

<210> 6

<211> 1584

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catatggctc tgtggaaaac cctgctgaag aaagtgctga aagcccccaa gaaaaagaga 60

aaggtgggag gaggaggaag tggaggagga ggtagtgagc tcgcatgcgc ttgtggagga 120

ggaggatctg atatccaaat gacccagtcc ccctcttctc tgtccgcctc tgttggcgac 180

cgggttacta ttacctgtag agcctctcag gatgtgaata ccgccgtggc ctggtatcag 240

caaaagcccg gaaaagcccc caaactgctc atctactccg cctctttcct ggagagcggc 300

gtgccttcta gattcagcgg aagcaggagt ggcaccgact ttaccctgac catttccagc 360

ctccaacccg aggacttcgc cacttactac tgccagcagc actacaccac cccccctaca 420

ttcggccaag gcacaaaagt ggaaatcaag agaaccggcg gcggaggcag cggaggagga 480

ggatctggag gaggaggaag cgaggtgcag ctcgttgaga gcggaggagg tctggtgcag 540

cctggaggat cactgagact gagctgcgca gcaagtggat tcaacataaa ggacacatat 600

attcattggg tgagacaggc acccggcaaa ggactggagt gggttgctag aatctacccc 660

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accagcaaga acacagccta cctgcagatg aacagcctga gagccgagga caccgccgtt 780

tactactgca gcagatgggg aggcgacggc ttctacgcta tggacgtgtg gggacagggc 840

accctggtta cagtgagcag cggatccagc aaaggagaag aacttttcac tggagttgtc 900

ccaattcttg ttgaattaga tggtgatgtt aatgggcaca aattttctgt ccgtggagag 960

ggtgaaggtg atgctacaaa cggaaaactc acccttaaat ttatttgcac tactggaaaa 1020

ctacctgttc cgtggccaac acttgtcact actctgacct atggtgttca atgcttttcc 1080

cgttatccgg atcacatgaa acggcatgac tttttcaaga gtgccatgcc cgaaggttat 1140

gtacaggaac gcactatatc tttcaaagat gacgggacct acaagacgcg tgctgaagtc 1200

aagtttgaag gtgataccct tgttaatcgt atcgagttaa agggtattga ttttaaagaa 1260

gatggaaaca ttcttggaca caaactcgag tacaacttta actcacacaa tgtatacatc 1320

acggcagaca aacaaaagaa tggaatcaaa gctaacttca aaattcgcca caacgttgaa 1380

gatggttccg ttcaactagc agaccattat caacaaaata ctccaattgg cgatggccct 1440

gtccttttac cagacaacca ttacctgtcg acacaatctg tcctttcgaa agatcccaac 1500

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atggatgagc tctacaaaaa gctt 1584

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<212> DNA

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tgtcatatga aaaagctatt taaaaagatt ct 32

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<210> 10

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<212> DNA

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tgcaagcttt ttgtagagct catccatgcc at 32

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<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tctcatatga agctggcact gaagctggc 29

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<211> 51

<212> DNA

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<211> 51

<212> DNA

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<210> 15

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<212> DNA

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<210> 18

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<212> DNA

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Claims

1.一种CPP-scFv融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为重组蛋白MAP-scFv，其氨基酸序列为：SEQ ID NO：2。

2.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述的CPP-scFv融合蛋白。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列为：SEQ ID NO：5。

4.一种载体，其特征在于，包含权利要求2或3所述的核酸分子。

5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，由所述核酸分子通过引物扩增并连接至质粒PET28b形成；在扩增、连接时，使用的限制性内切酶为NdeⅠ和HindⅢ ，接头为G₄S；所述引物为MAP-scFv引物；

所述MAP-scFv引物由MAP-scFv-F1、MAP-scFv-R1、MAP-scFv-F2和MAP-scFv-R2组成；

所述MAP-scFv-F1的核苷酸序列为：SEQ ID NO：11；所述MAP-scFv-R1的核苷酸序列为：SEQ ID NO：12；所述MAP-scFv-F2的核苷酸序列为：SEQ ID NO：13；所述MAP-scFv-R2的核苷酸序列为：SEQ ID NO：14。

6.一种细胞，其特征在于，转导权利要求2或3所述的核酸分子、权利要求4或5所述的载体中的一种或几种；该细胞表达CPP-scFv融合蛋白。

7.一种药物，其特征在于，其活性成分包含权利要求1所述的CPP-scFv融合蛋白、权利要求6所述的细胞中的一种或两种。

8.如权利要求7所述的药物，其特征在于，为用于治疗HER2+乳腺癌的抗体偶联药物。