CN110305221A

CN110305221A - 一种增强型抗肿瘤融合蛋白及制备方法及用途

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Publication number: CN110305221A
Application number: CN201810260322.8A
Authority: CN
Inventors: 孙嘉琳
Original assignee: Individual
Current assignee: Nanjing Double Bond Targeted Drug Technology Co ltd; Sun Jialin
Priority date: 2018-03-27
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2019-10-08
Anticipated expiration: 2038-03-27
Also published as: CN110305221B

Abstract

本发明公开了一种增强型抗肿瘤融合蛋白及制备方法及用途，所述融合蛋白包括诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.1、诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.2和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A中至少两种，本发明的融合蛋白将B7.1、B7.2和SEA至少两种构建成融合蛋白，发挥出叠加放大的效果，其显示的生物活性远远超过单个原料蛋白，诱导并激活T细胞来杀死肿瘤，T细胞可分泌的细胞因子例如肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)、颗粒酶并诱导作为靶细胞的癌细胞产生Fas等从而导致癌细胞凋亡，实验证明本发明的各个融合蛋白对于各种癌症和实体肿瘤有着很明显的杀伤作用。

Description

一种增强型抗肿瘤融合蛋白及制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及制备方法及用途，特别是涉及一种由诱导并激活T细胞的共刺激分子(Costimulatory molecules)和能引起抗癌免疫反应的超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素所构建的融合蛋白，公开了它们的结构(蛋白序列)、制备方法以及抗癌的生物活性。

背景技术

T细胞的有效活化需要两个信号的参与,即需要抗原肽-MHC复合物与T细胞上的TCR-CD3结合提供第1信号，以及共刺激分子(Costimulatory molecules)介导的第2信号。最基本的共刺激信号由抗原递呈细胞表达的B7.1(CD80)、B7.2(CD86)分子与T细胞上表达的相应受体(CD28和CTLA-4)提供(Amj Respir Crit Care Med,162,5164-5168,2000；Immunol Cell Biol,77,304-311,1999；Clin Cancer Res,13,5271-5279,2007；TrendsImmunol,24,313-318,2003)。

B7.1表达在活化的DC、B细胞和单核细胞上，B7.2在B细胞、T细胞、DC和巨噬细胞上呈低水平表达，但B7.2可被诱导快速上调，而B7.1被诱导上调表达时间比B7.2晚。初始T细胞上的CD28与APC上的B7.1/B7.2结合，可以促进IL-2转录，同时使IL-2受体在T细胞上表达增加，从而促进T细胞增殖，还可以通过增加Bcl-xl的表达途径使T细胞免于凋亡。

作为药物的应用，B7.1-Fc或B7.2-Fc可以诱导并激活抗癌的T细胞，显示出抗肿瘤的生物活性(Cancer Res,59,4964-4972,1999；Cancer Res,59,2650-2656,1999；ClinCancer Res,11,8492-8502,2005；J Immunol,172,1347-1354,2004；Cancer Res,62,5727-5735,2002)。

超抗原(Superantigen)也能引起细胞毒作用，它是一类特殊的抗原分子，主要是一些细菌的毒素和逆转录病毒基因的产物，不需要抗原提呈细胞的加工处理，而以完整的蛋白质形式直接与细胞膜上的MHC II类分子结合形成复合物，识别TCR的Vb片段，激活比普通抗原多得多的T细胞(包括CD4⁺，CD8⁺)，并释放大量细胞因子，对靶细胞产生强而有力的细胞毒作用。

超抗原与人类多种急、慢性疾病的发生有关，但在抗肿瘤研究中也发挥了独特的作用，尝试用它激活的T细胞来杀伤肿瘤，并取得了一定的成果，目前较有研究基础的超抗原主要是金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C等(Technol Cancer Res Treat,16,125-132,2017；Biosci Biotechnol Biochem,81,1741-1746,2017；Anticancer Res,25,3565-3573,2005；Biochem Biophys Res Commun,290,1336-1342,2002；Cancer Immunol Immunother,33,231-237,1991)。

目前，尚未有使用各种诱导或刺激T细胞分子联合用于肿瘤治疗的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种增强型抗肿瘤融合蛋白。

本发明的第二个目的是提供一种增强型抗肿瘤融合蛋白的制备。

本发明的第三个目的是提供一种增强型抗肿瘤融合蛋白在制备抗肿瘤药物的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种增强型抗肿瘤融合蛋白，包括诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.1、诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.2和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A中至少两种；所述诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.1简称B7.1；所述诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.2简称B7.2；超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A简称SEA。

B7.1的氨基酸序列用SEQ ID No.2所示；所述B7.2的氨基酸序列用SEQ ID No.4所示；所述SEA的氨基酸序列用SEQ ID No.6所示。

优选地，B7.1和B7.2融合的融合蛋白、B7.1和SEA融合的融合蛋白、B7.2和SEA融合的融合蛋白、B7.1、B7.2和SEA融合的融合蛋白。

所述B7.1和B7.2融合的融合蛋白的氨基酸序列用SEQ ID No.8所示；所述B7.1和SEA融合的融合蛋白的氨基酸序列用SEQ ID No.10所示；所述B7.2和SEA融合的融合蛋白的氨基酸序列用SEQ ID No.12所示；所述B7.1、B7.2和SEA融合的融合蛋白的氨基酸序列用SEQ ID No.14所示。

重组载体，含有编码权利要求4所述的融合蛋白的核苷酸序列，编码B7.1和B7.2融合的融合蛋白的核苷酸序列由SEQ ID No.7所示；编码B7.1和SEA融合的融合蛋白的核苷酸序列由SEQ ID No.9所示；编码B7.2和SEA融合的融合蛋白的核苷酸序列由SEQ ID No.11所示或编码B7.1、B7.2和SEA融合的融合蛋白的核苷酸序列由SEQ ID No.13所示；

一种增强型抗肿瘤融合蛋白衍生物，对融合蛋白进行的点突变、氨基酸序列缺失或增加产生的突变体。

一种宿主细胞，含有上述重组载体。

一种增强型抗肿瘤融合蛋白的制备方法，其特征在于培养上述宿主细胞，收集表达融合蛋白。

上述融合蛋白在制备治疗癌症和抗实体肿瘤药物的应用。

本发明的优点：

本发明的融合蛋白将B7.1、B7.2和SEA至少两种构建成融合蛋白，发挥出叠加放大的效果，其显示的生物活性远远超过单个原料蛋白，诱导并激活T细胞来杀死肿瘤，T细胞可分泌的细胞因子例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、颗粒酶并诱导作为靶细胞的癌细胞产生Fas等从而导致癌细胞凋亡，实验证明本发明的各个融合蛋白对于各种癌症和实体肿瘤有着很明显的杀伤作用。

附图说明

图1表示各种蛋白抑制肿瘤生长，图中横轴表示荷瘤小鼠生长天数，纵轴表示肿瘤体积(cm³)，图中右边曲线编号表示实验用小鼠的编组，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。

图2表示第9天杀死荷瘤小鼠解剖后的肿瘤重量，横轴表示的是实验用小鼠的编组，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。

图3利用常规免疫组化检测肿瘤组织内的T细胞，棕色小点部分是T细胞，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。

图4利用常规免疫组化检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，棕色部分是T细胞分泌的TNF-α，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。

图5利用常规免疫组化检测颗粒酶(Granzyme B)，棕色部分是T细胞分泌的颗粒酶，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。

图6利用常规免疫组化检测凋亡因子Fas，棕色部分是肿瘤细胞表面表达的Fas，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。

图7利用常规免疫组化检测染色体断裂，棕色部分是发生染色体断裂的肿瘤细胞，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

为了尝试强化T细胞抗肿瘤的能力，建立小鼠荷瘤模型，检查各种单一蛋白和融合蛋白的诱导并激活T细胞生物活性的能力，分析了T细胞的生物活性，例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、颗粒酶并诱导作为靶细胞的癌细胞产生Fas等。

B7.1基因信息参考B7.1论文(J Exp Med,174,625-631,1991)和GenBank数据库(NM_005191)，这里所采用的序列是它的细胞外片断(核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，氨基酸序列为SEQ ID No.2所示)。

B7.2基因信息参考B7.2的GenBank数据库(NM_175862和L25259)，这里所采用的序列是它的细胞外片断(核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，氨基酸序列为SEQ ID No.4所示)。

SEA基因信息参考SEA论文(J Biol Chem,262,7006-7013,1987；J Bacteriol,170,34-41,1988)和GenBank数据库(M18970)(核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，氨基酸序列为SEQ ID No.6所示)。

构建的各种单一蛋白是B7.1、B7.2和SEA，各种融合蛋白是B7.1-B7.2、B7.1-SEA、B7.2-SEA和B7.1-B7.2-SEA。

实施例1构建表达各种蛋白的载体

所采用的表达质粒是pET22b(Novagen公司)，含有各种限制酶切位点(BamHI-EcoRI-SacI-SalI-HindIII-NotI-XhoI)供编码外源蛋白的DNA片断的插入，以及在表达外源蛋白的C端有His-tag(含有6个His)供纯化蛋白用。

DNA片断由TAKARA公司和上海生工生物工程公司合成。

合成B7.1的核酸序列由SEQ ID No.1所示；

合成B7.2的核酸序列由SEQ ID No.3所示；

合成SEA的核酸序列由SEQ ID No.5所示；

合成B7.1-B7.2融合蛋白的核酸序列由SEQ ID No.7所示，B7.1和B7.2之间有一个连接肽的核酸小片断(gtcgacaagctttccggcggaggtggc)(SEQ ID No.15所示)；

合成B7.1-SEA融合蛋白的核酸序列由SEQ ID No.9所示，B7.1和SEA之间有一个连接肽的核酸小片断(gtcgacaagctttccggcggaggtggc)(SEQ ID No.15所示)；

合成B7.2-SEA融合蛋白的核酸序列由SEQ ID No.11所示，B7.2和SEA之间有一个连接肽的核酸小片断(gtcgacaagctttccggcggaggtggc)(SEQ ID No.15所示)；

合成B7.1-B7.2-SEA融合蛋白的核酸序列由SEQ ID No.13所示，B7.1和B7.2之间有一个连接肽的核酸小片断(gtcgacaagctttccggcggaggtggc)(SEQ ID No.15所示)，B7.2和SEA之间有一个连接肽的核酸小片断(gtcgacaagctttccggcggaggtggc)(SEQ ID No.15所示)。

在上述各个核酸序列的前面加入aattcggatccgaattcgagctcc碱基，这些增加的碱基小片断含有BamHI、EcoRI和SacI的限制酶切位点。

在上述各个核酸序列的后面加入aagcttgcggccgcactcgagcac碱基，这些增加的碱基小片断含有HindIII、NotI和XhoI的限制酶切位点。

利用所合成各个核酸序列的前面和后面的限制酶切位点就很容易把各种基因片段插入表达质粒pET22b，经DNA测序鉴定，这些pET22b质粒所表达的蛋白的序列：

由pET22b-B7.1表达的B7.1蛋白的氨基酸序列由SEQ ID No.2所示；

由pET22b-B7.2表达的B7.2蛋白的氨基酸序列由SEQ ID No.4所示；

由pET22b-SEA表达的SEA蛋白的氨基酸序列由SEQ ID No.6所示；

由pET22b-B7.1-B7.2表达的B7.1-B7.2蛋白的氨基酸序列由SEQ ID No.8所示；

由pET22b-B7.1-SEA表达的B7.1-SEA蛋白的氨基酸序列由SEQ ID No.10所示；

由pET22b-B7.2-SEA表达的B7.2-SEA蛋白的氨基酸序列由SEQ ID No.12所示；

由pET22b-B7.1-B7.2-SEA表达的B7.1-B7.2-SEA蛋白的氨基酸序列由SEQ IDNo.14所示。

编码连接肽的核酸小片断(gtcgacaagctttccggcggaggtggc)(SEQ ID No.15所示)所翻译的氨基酸序列由SEQ ID No.16所示。

实施例2各种蛋白的表达、变性和复性以及纯化

将各种表达质粒pET22b-B7.1、pET22b-B7.2、pET22b-SEA、pET22b-B7.1-B7.2、pET22b-B7.1-SEA、pET22b-B7.2-SEA和pET22b-B7.1-B7.2-SEA分别用电穿孔法转入大肠杆菌BL21(DE3)，利用抗生素Amp(Ampicillin)筛选阳性菌。接下来各种蛋白的表达、变性和复性以及纯化的过程大致相同，操作如下：

含有表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)先进行大规模37℃培养，然后加入IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside)使之浓度达到1mM并过夜30℃培养，从而诱导表达蛋白。第2天离心培养液和收集菌体，用超声波法破细胞壁，离心收集包含体沉淀，这里的蛋白是以包含体形式存在。包含体蛋白用6M尿素变性溶解，然后进行多阶段透析，透析溶液是逐步稀释的尿素例如3M、2M和1M，接下来是0.5M尿素，0.4M L-精氨酸，375μM氧化型谷胱甘肽GSSG，1.875mM还原型谷胱甘肽GSH，透析后进行离心，所得上清液就是蛋白的复性溶液。用His·Bind Purification Kit试剂盒(Novagen公司)对于蛋白进行纯化，先用BindingBuffer冲洗凝胶柱，同时也在蛋白溶液里加入Binding Buffer，将蛋白样品上柱，用WashBuffer漂洗，然后用Elute Buffer洗脱，用蛋白质电泳进行鉴定，将纯度为一条带的蛋白用于以后的实验。这样得到7种高纯度的B7.1、B7.2、SEA、B7.1-B7.2、B7.1-SEA、B7.2-SEA和B7.1-B7.2-SEA蛋白。

实施例3抑制肿瘤实验

选择雄性ICR小鼠，4-5周，18-22g，随机分成8组，每组30只小鼠。小鼠肉瘤细胞S180来自于小鼠腹水培养，将5x10⁵小鼠肉瘤细胞S180接种于小鼠的右侧腋下，然后第2天起隔天往尾静脉内分别注射B7.1、B7.2、SEA、B7.1-B7.2、B7.1-SEA、B7.2-SEA和B7.1-B7.2-SEA蛋白溶液0.2ml(500pmol)/只，而对照组注射等量生理盐水(0.9％NaCl)，第9天处死小鼠，观察小鼠肿瘤生长情况以及测量处死小鼠后肿瘤的重量。

图1表示各种蛋白抑制肿瘤生长，图中横轴表示荷瘤小鼠生长天数，纵轴表示肿瘤体积(cm³)，图中右边曲线编号表示实验用小鼠的编组，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。生理盐水组第4天可以触摸到肿瘤，B7.1组、B7.2组和SEA组第5天可以触摸到肿瘤，B7.1-B7.2组、B7.1-SEA组和B7.2-SEA组第6天可以触摸到肿瘤，B7.1-B7.2-SEA组第7天可以触摸到肿瘤。

结果表明B7.1、B7.2、SEA、B7.1-B7.2、B7.1-SEA、B7.2-SEA和B7.1-B7.2-SEA蛋白都可以有效抑制肿瘤生长，而B7.1-B7.2-SEA融合蛋白的抑制肿瘤的效果最好。

实施例4肿瘤组织内T淋巴细胞的检测

注射生理盐水、B7.1、B7.2、SEA、B7.1-B7.2、B7.1-SEA、B7.2-SEA和B7.1-B7.2-SEA蛋白溶液后的荷瘤小鼠在第9天杀死，S180肿瘤组织切成小块，用石蜡包埋制成石蜡切片，然后进行免疫组织化学实验。为了检测肿瘤组织内的T细胞，抗T细胞的特异性抗体采用Santa Cruz Biotechnolog公司的兔抗小鼠抗CD3抗体，然后用二抗以及avidin-biotin-perxidase complex(Zymed公司)，最后用Diaminobenzidine(DAB)显色，以后下面的实验中的二抗和DAB显色采用类似的方法。

图3利用常规免疫组化检测肿瘤组织内的T细胞，棕色小点部分就是T细胞，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。

经B7.1、B7.2、SEA、B7.1-B7.2、B7.1-SEA、B7.2-SEA和B7.1-B7.2-SEA蛋白注射的小鼠肿瘤组织内都发现有T细胞(图3显示的棕色小点部分)。

结果显示：

作为对照的生理盐水组的肿瘤内几乎没有T细胞；

B7.1、B7.2和SEA试验组的肿瘤内有少量T细胞；

B7.1-B7.2、B7.1-SEA和B7.2-SEA试验组的肿瘤内有一定数量的T细胞；

B7.1-B7.2-SEA试验组的肿瘤内有大量的T细胞，T细胞的数量是所有试验组中最多的。

实施例5肿瘤组织内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的检测

用免疫组织化学方法检测肿瘤组织内由T细胞分泌的细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，抗体是Santa Cruz Biotechnolog公司的兔抗小鼠抗TNF-α抗体。图4利用常规免疫组化检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，棕色部分就是T细胞分泌的TNF-α，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。

经B7.1、B7.2、SEA、B7.1-B7.2、B7.1-SEA、B7.2-SEA和B7.1-B7.2-SEA蛋白注射的小鼠肿瘤组织内都发现有TNF-α(图4显示的棕色部分)。

结果显示：

作为对照的生理盐水组的肿瘤内几乎没有TNF-α；

B7.1、B7.2和SEA试验组的肿瘤内有少量TNF-α；

B7.1-B7.2、B7.1-SEA和B7.2-SEA试验组的肿瘤内有一定量的TNF-α；

B7.1-B7.2-SEA试验组的肿瘤内有大量的TNF-α，是所有试验组中最多的。

实施例6肿瘤组织内颗粒酶(Granzyme B)的检测

用免疫组织化学方法检测肿瘤组织内由T细胞分泌的颗粒酶，抗体是Abcam公司的兔抗小鼠抗Granzyme B抗体。图5利用常规免疫组化检测颗粒酶(Granzyme B)，棕色部分就是T细胞分泌的颗粒酶，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。

经B7.1、B7.2、SEA、B7.1-B7.2、B7.1-SEA、B7.2-SEA和B7.1-B7.2-SEA蛋白注射的小鼠肿瘤组织内都发现有颗粒酶(图5显示的棕色部分)。

结果显示：

作为对照的生理盐水组的肿瘤内几乎没有颗粒酶；

B7.1、B7.2和SEA试验组的肿瘤内有少量颗粒酶；

B7.1-B7.2、B7.1-SEA和B7.2-SEA试验组的肿瘤内有一定量的颗粒酶；

B7.1-B7.2-SEA试验组的肿瘤内有大量的颗粒酶，是所有试验组中最多的。

实施例7肿瘤组织内由肿瘤细胞表面表达的凋亡因子Fas的检测

用免疫组织化学方法检测肿瘤组织内由肿瘤细胞表面表达的凋亡因子Fas，抗体是Santa Cruz Biotechnolog公司的兔抗小鼠抗Fas抗体。图6利用常规免疫组化检测凋亡因子Fas，棕色部分就是肿瘤细胞表面表达的Fas，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。

经B7.1、B7.2、SEA、B7.1-B7.2、B7.1-SEA、B7.2-SEA和B7.1-B7.2-SEA蛋白注射的小鼠肿瘤组织内都有肿瘤细胞表达Fas(图6显示的棕色部分)。

结果显示：

作为对照的生理盐水组的肿瘤内的肿瘤细胞几乎不表达Fas；

B7.1、B7.2和SEA试验组的肿瘤内的肿瘤细胞有少量表达Fas；

B7.1-B7.2、B7.1-SEA和B7.2-SEA试验组的肿瘤内的肿瘤细胞有一定量表达Fas；

B7.1-B7.2-SEA试验组的肿瘤内的肿瘤细胞有大量表达Fas，是所有试验组中最多的。

实施例8常规免疫组化检测肿瘤细胞染色体的断裂(TUNEL分析)

用免疫组织化学方法检测肿瘤组织内肿瘤细胞的染色体是否断裂，从而判断肿瘤细胞是否死亡，TUNEL分析试剂盒来自罗氏公司。图7利用常规免疫组化检测染色体断裂，棕色部分就是发生染色体断裂的肿瘤细胞，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。

经B7.1、B7.2、SEA、B7.1-B7.2、B7.1-SEA、B7.2-SEA和B7.1-B7.2-SEA蛋白注射的小鼠肿瘤组织内都有肿瘤细胞死亡(图7显示的棕色部分)。

结果显示：

作为对照的生理盐水组的肿瘤内的肿瘤细胞几乎不死亡；

B7.1、B7.2和SEA试验组的肿瘤内的肿瘤细胞有少量死亡；

B7.1-B7.2、B7.1-SEA和B7.2-SEA试验组的肿瘤内的肿瘤细胞有一定量死亡；

B7.1-B7.2-SEA试验组的肿瘤内的肿瘤细胞有大量死亡，是所有试验组中最多的。

T细胞可以通过多种手段来杀死肿瘤，例如分泌凋亡因子TNF-α和干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、诱导肿瘤细胞表达凋亡因子Fas来导致肿瘤细胞的死亡、分泌穿孔素和颗粒酶进入肿瘤细胞来杀死肿瘤细胞(cell Mol Immunol,6,15-25,2009；ImmunolToday,16,194-201,1995；Cell,46,641-642,1986；Immunol Today,16,202-206,1995；AnnHematol,84,627-639,2005；Apoptosis,8,237-249,2003)，B7.1、B7.2和SEA分子都可以诱导并激活T细胞，构建多种融合蛋白含有B7.1、B7.2或SEA都可以强化诱导并激活T细胞的能力，而B7.1-B7.2-SEA融合蛋白则发挥最大的这样能力。

肿瘤细胞通过其自身上的PD-L1分子与T细胞上的PD-1分子相互作用而导致T细胞凋亡，这样肿瘤就逃避了免疫监视以及T细胞对于肿瘤的攻击(Drug Design DevelopTher,9,2883-2886,2015；Cancer Treat Rev,54,58-67,2017；Int J Infect Dis,56,221-228,2017；J Biomed Sci,24,26,2017)，为了解决肿瘤细胞躲避免疫监视而引起T细胞凋亡，本发明通过一种增强型抗肿瘤融合蛋白诱导并激活T细胞，增加T细胞的数量，增强T细胞的活性，使得这些大量有活性的T细胞攻击肿瘤，这项技术不局限于某一特定的肿瘤，而是可以广泛应用于各种实体肿瘤和血液肿瘤等癌症的治疗。就如同抗PD1抗体通过阻断肿瘤细胞上的PD-L1分子与T细胞上的PD-1分子相互作用而避免T细胞凋亡，PD1抗体可以应用于多种肿瘤包括血液肿瘤的治疗(Onco Targets Ther,8,929-937,2015；Clin CancerRes,9,462-468,2013；J Clin Oncol,31,4311-4318,2013；Ther Adv Med Oncol,7,97-106,2015；Ther Adv Med Oncol,7,85-96,2015)。

一种增强型抗肿瘤融合蛋白衍生物，含有B7.1、B7.2和SEA这三种分子的至少2种以上所构建的融合蛋白所产生的点突变、氨基酸序列缺失或导入突变体，这样可以更大幅度提高融合蛋白衍生物诱导并激活T细胞的能力，从而更有效地杀死肿瘤。一种增强型抗肿瘤融合蛋白，只要含有B7.1、B7.2和SEA这三种分子的至少2种以上所构建的融合蛋白，其连接方式不限于目前连接方式。

作为药物其剂型可以是乳化剂、脂质体、分散剂、稳定剂等一起制成各种注射、口服、敷贴以及手术处理等药物的给药形式。除了融合蛋白质本身可以作为药物外，编码融合蛋白质的核苷酸片段或载体还可以作为基因治疗形式来应用。

以上实施例和优选实施方式的描述属于对权利要求限定的本发明的示意性说明，而不是限制本发明。需要特别指出的是，只要不脱离本发明的宗旨，所有显而易见的改变以及具有等价代换的相似发明，均包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 孙嘉琳

<120> 一种增强型抗肿瘤融合蛋白及制备方法及用途

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 624

<212> DNA

<213> 智人种(Homo sapiens)

<400> 1

gttatccacg tgaccaagga agtgaaagaa gtggcaacgc tgtcctgtgg tcacaatgtt 60

tctgttgaag agctggcaca aactcgcatc tactggcaaa aggagaagaa aatggtgctg 120

actatgatgt ctggggacat gaatatatgg cccgagtaca agaaccggac catctttgat 180

atcactaata acctctccat tgtgatcctg gctctgcgcc catctgacga gggcacatac 240

gagtgtgttg ttctgaagta tgaaaaagac gctttcaagc gggaacacct ggctgaagtg 300

acgttatcag tcaaagctga cttccctaca cctagtatat ctgactttga aattccaact 360

tctaatatta gaaggataat ttgctcaacc tctggaggtt ttccagagcc tcacctctcc 420

tggttggaaa atggagaaga attaaatgcc atcaacacaa cagtttccca agatcctgaa 480

actgagctct atgctgttag cagcaaactg gatttcaata tgacaaccaa ccacagcttc 540

atgtgtctca tcaagtatgg acatttaaga gtgaatcaga ccttcaactg gaatacaacc 600

aagcaagagc attttcctga taac 624

<210> 2

<211> 208

<212> PRT

<213> 智人种(Homo sapiens)

<400> 2

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

<210> 3

<211> 666

<212> DNA

<213> 智人种(Homo sapiens)

<400> 3

gctcctctga agattcaagc ttatttcaat gagactgcag acctgccatg ccaatttgca 60

aactctcaaa accaaagcct gagtgagcta gtagtatttt ggcaggacca ggaaaacttg 120

gttctgaatg aggtatactt aggcaaagag aaatttgaca gtgttcattc caagtatatg 180

ggccgcacaa gttttgattc ggacagttgg accctgagac ttcacaatct tcagatcaag 240

gacaagggct tgtatcaatg tatcatccat cacaaaaagc ccacaggaat gattcgcatc 300

caccagatga attctgaact gtcagtgctt gctaacttca gtcaacctga aatagtacca 360

atttctaata taacagaaaa tgtgtacata aatttgacct gctcatctat acacggttac 420

ccagaaccta agaagatgag tgttttgcta agaaccaaga attcaactat cgagtatgat 480

ggtattatgc agaaatctca agataatgtc acagaactgt acgacgtttc catcagcttg 540

tctgtttcat tccctgatgt tacgagcaat atgaccatct tctgtattct ggaaactgac 600

aagacgcggc ttttatcttc acctttctct atagagcttg aggaccctca gcctccccca 660

gaccac 666

<210> 4

<211> 222

<212> PRT

<213> 智人种(Homo sapiens)

<400> 4

Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro

1 5 10 15

Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val

20 25 30

Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly

35 40 45

Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser

50 55 60

Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys

65 70 75 80

Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly

85 90 95

Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn

100 105 110

Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn Val

115 120 125

Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu Pro Lys

130 135 140

Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp

145 150 155 160

Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val

165 170 175

Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met Thr

180 185 190

Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His

210 215 220

<210> 5

<211> 699

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<400> 5

agcgagaaaa gcgaagaaat aaatgaaaaa gatttgcgaa aaaagtctga attgcaggga 60

acagctttag gcaatcttaa acaaatctat tattacaatg aaaaagctaa aactgaaaat 120

aaagagagtc acgatcaatt tttacagcat actatattgt ttaaaggctt ttttacagat 180

cattcgtggt ataacgattt attagtagat tttgattcaa aggatattgt tgataaatat 240

aaagggaaaa aagtagactt gtatggtgct tattatggtt atcaatgtgc gggtggtaca 300

ccaaacaaaa cagcttgtat gtatggtggt gtaacgttac atgataataa tcgattgacc 360

gaagagaaaa aagtgccgat caatttatgg ctagacggta aacaaaatac agtacctttg 420

gaaacggtta aaacgaataa gaaaaatgta actgttcagg agttggatct tcaagcaaga 480

cgttatttac aggaaaaata taatttatat aactctgatg tttttgatgg gaaggttcag 540

aggggattaa tcgtgtttca tacttctaca gaaccttcgg ttaattacga tttatttggt 600

gctcaaggac agtattcaaa tacactatta agaatatata gagataataa aacgattaac 660

tctgaaaaca tgcatattga tatatattta tatacaagt 699

<210> 6

<211> 233

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<400> 6

Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser

1 5 10 15

Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr

20 25 30

Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu

35 40 45

Gln His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr

50 55 60

Asn Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr

65 70 75 80

Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys

85 90 95

Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr

100 105 110

Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn

115 120 125

Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys

130 135 140

Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg

145 150 155 160

Arg Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp

165 170 175

Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro

180 185 190

Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr

195 200 205

Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met

210 215 220

His Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser

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<210> 7

<211> 1317

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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gagtgtgttg ttctgaagta tgaaaaagac gctttcaagc gggaacacct ggctgaagtg 300

acgttatcag tcaaagctga cttccctaca cctagtatat ctgactttga aattccaact 360

tctaatatta gaaggataat ttgctcaacc tctggaggtt ttccagagcc tcacctctcc 420

tggttggaaa atggagaaga attaaatgcc atcaacacaa cagtttccca agatcctgaa 480

actgagctct atgctgttag cagcaaactg gatttcaata tgacaaccaa ccacagcttc 540

atgtgtctca tcaagtatgg acatttaaga gtgaatcaga ccttcaactg gaatacaacc 600

aagcaagagc attttcctga taacgtcgac aagctttccg gcggaggtgg cgctcctctg 660

aagattcaag cttatttcaa tgagactgca gacctgccat gccaatttgc aaactctcaa 720

aaccaaagcc tgagtgagct agtagtattt tggcaggacc aggaaaactt ggttctgaat 780

gaggtatact taggcaaaga gaaatttgac agtgttcatt ccaagtatat gggccgcaca 840

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ttgtatcaat gtatcatcca tcacaaaaag cccacaggaa tgattcgcat ccaccagatg 960

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<210> 8

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

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Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

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Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

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Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

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Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

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165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

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Val Asp Lys Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala

210 215 220

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Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn

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Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val

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275 280 285

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Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val

325 330 335

Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser

340 345 350

Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg

355 360 365

Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln

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Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser

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Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr

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<210> 9

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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acgttatcag tcaaagctga cttccctaca cctagtatat ctgactttga aattccaact 360

tctaatatta gaaggataat ttgctcaacc tctggaggtt ttccagagcc tcacctctcc 420

tggttggaaa atggagaaga attaaatgcc atcaacacaa cagtttccca agatcctgaa 480

actgagctct atgctgttag cagcaaactg gatttcaata tgacaaccaa ccacagcttc 540

atgtgtctca tcaagtatgg acatttaaga gtgaatcaga ccttcaactg gaatacaacc 600

aagcaagagc attttcctga taacgtcgac aagctttccg gcggaggtgg cagcgagaaa 660

agcgaagaaa taaatgaaaa agatttgcga aaaaagtctg aattgcaggg aacagcttta 720

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<210> 10

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

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Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

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Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Val Asp Lys Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile

210 215 220

Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu

225 230 235 240

Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu

245 250 255

Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln His Thr Ile Leu Phe Lys

260 265 270

Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp Phe

275 280 285

Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu

290 295 300

Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys

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Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Asp Asn Asn Arg Leu

325 330 335

Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gln

340 345 350

Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr

355 360 365

Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr

370 375 380

Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu

385 390 395 400

Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe

405 410 415

Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp

420 425 430

Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr

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Thr Ser

450

<210> 11

<211> 1392

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctcctctga agattcaagc ttatttcaat gagactgcag acctgccatg ccaatttgca 60

aactctcaaa accaaagcct gagtgagcta gtagtatttt ggcaggacca ggaaaacttg 120

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ggccgcacaa gttttgattc ggacagttgg accctgagac ttcacaatct tcagatcaag 240

gacaagggct tgtatcaatg tatcatccat cacaaaaagc ccacaggaat gattcgcatc 300

caccagatga attctgaact gtcagtgctt gctaacttca gtcaacctga aatagtacca 360

atttctaata taacagaaaa tgtgtacata aatttgacct gctcatctat acacggttac 420

ccagaaccta agaagatgag tgttttgcta agaaccaaga attcaactat cgagtatgat 480

ggtattatgc agaaatctca agataatgtc acagaactgt acgacgtttc catcagcttg 540

tctgtttcat tccctgatgt tacgagcaat atgaccatct tctgtattct ggaaactgac 600

aagacgcggc ttttatcttc acctttctct atagagcttg aggaccctca gcctccccca 660

gaccacgtcg acaagctttc cggcggaggt ggcagcgaga aaagcgaaga aataaatgaa 720

aaagatttgc gaaaaaagtc tgaattgcag ggaacagctt taggcaatct taaacaaatc 780

tattattaca atgaaaaagc taaaactgaa aataaagaga gtcacgatca atttttacag 840

catactatat tgtttaaagg cttttttaca gatcattcgt ggtataacga tttattagta 900

gattttgatt caaaggatat tgttgataaa tataaaggga aaaaagtaga cttgtatggt 960

gcttattatg gttatcaatg tgcgggtggt acaccaaaca aaacagcttg tatgtatggt 1020

ggtgtaacgt tacatgataa taatcgattg accgaagaga aaaaagtgcc gatcaattta 1080

tggctagacg gtaaacaaaa tacagtacct ttggaaacgg ttaaaacgaa taagaaaaat 1140

gtaactgttc aggagttgga tcttcaagca agacgttatt tacaggaaaa atataattta 1200

tataactctg atgtttttga tgggaaggtt cagaggggat taatcgtgtt tcatacttct 1260

acagaacctt cggttaatta cgatttattt ggtgctcaag gacagtattc aaatacacta 1320

ttaagaatat atagagataa taaaacgatt aactctgaaa acatgcatat tgatatatat 1380

ttatatacaa gt 1392

<210> 12

<211> 464

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro

1 5 10 15

Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val

20 25 30

Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly

35 40 45

Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser

50 55 60

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65 70 75 80

Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly

85 90 95

Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn

100 105 110

Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn Val

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Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu Pro Lys

130 135 140

Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp

145 150 155 160

Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val

165 170 175

Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met Thr

180 185 190

Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His Val Asp

210 215 220

Lys Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu

225 230 235 240

Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn

245 250 255

Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys

260 265 270

Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe

275 280 285

Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser

290 295 300

Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly

305 310 315 320

Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala

325 330 335

Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu

340 345 350

Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr

355 360 365

Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln

370 375 380

Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu

385 390 395 400

Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val

405 410 415

Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala

420 425 430

Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys

435 440 445

Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser

450 455 460

<210> 13

<211> 2043

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gttatccacg tgaccaagga agtgaaagaa gtggcaacgc tgtcctgtgg tcacaatgtt 60

tctgttgaag agctggcaca aactcgcatc tactggcaaa aggagaagaa aatggtgctg 120

actatgatgt ctggggacat gaatatatgg cccgagtaca agaaccggac catctttgat 180

atcactaata acctctccat tgtgatcctg gctctgcgcc catctgacga gggcacatac 240

gagtgtgttg ttctgaagta tgaaaaagac gctttcaagc gggaacacct ggctgaagtg 300

acgttatcag tcaaagctga cttccctaca cctagtatat ctgactttga aattccaact 360

tctaatatta gaaggataat ttgctcaacc tctggaggtt ttccagagcc tcacctctcc 420

tggttggaaa atggagaaga attaaatgcc atcaacacaa cagtttccca agatcctgaa 480

actgagctct atgctgttag cagcaaactg gatttcaata tgacaaccaa ccacagcttc 540

atgtgtctca tcaagtatgg acatttaaga gtgaatcaga ccttcaactg gaatacaacc 600

aagcaagagc attttcctga taacgtcgac aagctttccg gcggaggtgg cgctcctctg 660

aagattcaag cttatttcaa tgagactgca gacctgccat gccaatttgc aaactctcaa 720

aaccaaagcc tgagtgagct agtagtattt tggcaggacc aggaaaactt ggttctgaat 780

gaggtatact taggcaaaga gaaatttgac agtgttcatt ccaagtatat gggccgcaca 840

agttttgatt cggacagttg gaccctgaga cttcacaatc ttcagatcaa ggacaagggc 900

ttgtatcaat gtatcatcca tcacaaaaag cccacaggaa tgattcgcat ccaccagatg 960

aattctgaac tgtcagtgct tgctaacttc agtcaacctg aaatagtacc aatttctaat 1020

ataacagaaa atgtgtacat aaatttgacc tgctcatcta tacacggtta cccagaacct 1080

aagaagatga gtgttttgct aagaaccaag aattcaacta tcgagtatga tggtattatg 1140

cagaaatctc aagataatgt cacagaactg tacgacgttt ccatcagctt gtctgtttca 1200

ttccctgatg ttacgagcaa tatgaccatc ttctgtattc tggaaactga caagacgcgg 1260

cttttatctt cacctttctc tatagagctt gaggaccctc agcctccccc agaccacgtc 1320

gacaagcttt ccggcggagg tggcagcgag aaaagcgaag aaataaatga aaaagatttg 1380

cgaaaaaagt ctgaattgca gggaacagct ttaggcaatc ttaaacaaat ctattattac 1440

aatgaaaaag ctaaaactga aaataaagag agtcacgatc aatttttaca gcatactata 1500

ttgtttaaag gcttttttac agatcattcg tggtataacg atttattagt agattttgat 1560

tcaaaggata ttgttgataa atataaaggg aaaaaagtag acttgtatgg tgcttattat 1620

ggttatcaat gtgcgggtgg tacaccaaac aaaacagctt gtatgtatgg tggtgtaacg 1680

ttacatgata ataatcgatt gaccgaagag aaaaaagtgc cgatcaattt atggctagac 1740

ggtaaacaaa atacagtacc tttggaaacg gttaaaacga ataagaaaaa tgtaactgtt 1800

caggagttgg atcttcaagc aagacgttat ttacaggaaa aatataattt atataactct 1860

gatgtttttg atgggaaggt tcagagggga ttaatcgtgt ttcatacttc tacagaacct 1920

tcggttaatt acgatttatt tggtgctcaa ggacagtatt caaatacact attaagaata 1980

tatagagata ataaaacgat taactctgaa aacatgcata ttgatatata tttatataca 2040

agt 2043

<210> 14

<211> 681

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Val Asp Lys Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala

210 215 220

Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln

225 230 235 240

Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn

245 250 255

Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val

260 265 270

His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr

275 280 285

Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys

290 295 300

Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met

305 310 315 320

Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val

325 330 335

Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser

340 345 350

Ser Ile His Gly Tyr Pro Glu Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg

355 360 365

Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln

370 375 380

Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser

385 390 395 400

Phe Pro Asp Val Thr Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr

405 410 415

Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp

420 425 430

Pro Gln Pro Pro Pro Asp His Val Asp Lys Leu Ser Gly Gly Gly Gly

435 440 445

Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser

450 455 460

Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr

465 470 475 480

Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu

485 490 495

Gln His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr

500 505 510

Asn Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr

515 520 525

Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys

530 535 540

Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr

545 550 555 560

Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn

565 570 575

Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys

580 585 590

Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg

595 600 605

Arg Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp

610 615 620

Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro

625 630 635 640

Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr

645 650 655

Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met

660 665 670

His Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser

675 680

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtcgacaagc tttccggcgg aggtggc 27

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Val Asp Lys Leu Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

Claims

1.一种增强型抗肿瘤融合蛋白，其特征是包括诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.1、诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.2和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A中至少两种；所述诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.1简称B7.1；所述诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.2简称B7.2；超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A简称SEA。

2.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征是所述B7.1的氨基酸序列用SEQ ID No.2所示；所述B7.2的氨基酸序列用SEQ ID No.4所示；所述SEA的氨基酸序列用SEQ ID No.6所示。

3.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征是B7.1和B7.2融合的融合蛋白、B7.1和SEA融合的融合蛋白、B7.2和SEA融合的融合蛋白、B7.1、B7.2和SEA融合的融合蛋白。

4.根据权利要求3所述融合蛋白，其特征是所述B7.1和B7.2融合的融合蛋白的氨基酸序列用SEQ ID No.8所示；所述B7.1和SEA融合的融合蛋白的氨基酸序列用SEQ ID No.10所示；所述B7.2和SEA融合的融合蛋白的氨基酸序列用SEQ ID No.12所示；所述B7.1、B7.2和SEA融合的融合蛋白的氨基酸序列用SEQ ID No.14所示。

5.重组载体，其特征在于含有编码权利要求4所述的融合蛋白的核苷酸序列，为

编码B7.1和B7.2融合的融合蛋白的核苷酸序列由SEQ ID No.7所示；

编码B7.1和SEA融合的融合蛋白的核苷酸序列由SEQ ID No.9所示；

编码B7.2和SEA融合的融合蛋白的核苷酸序列由SEQ ID No.11所示；

或编码B7.1、B7.2和SEA融合的融合蛋白的核苷酸序列由SEQ ID No.13所示。

6.权利要求1-4之一的一种增强型抗肿瘤融合蛋白衍生物，其特征在于对融合蛋白进行的点突变、氨基酸序列缺失或增加产生的突变体。

7.一种宿主细胞，其特征是含有权利要求5的重组载体。

8.一种增强型抗肿瘤融合蛋白的制备方法，其特征在于培养权利要求7的宿主细胞，收集表达权利要求5所述的融合蛋白。

9.权利要求1-4之一的融合蛋白在制备治疗癌症和抗实体肿瘤药物的应用。