CN102690342B

CN102690342B - 抗癌止痛肽vkvr及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102690342B
Application number: CN201110069002.2A
Authority: CN
Inventors: 张景海; 刘岩峰; 崔勇; 吴春福
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2011-03-22
Filing date: 2011-03-22
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2031-03-22
Also published as: CN102690342A

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，涉及从天然材料提取、分离、纯化获得的抗癌止痛肽VKVR及其制备方法、利用基因工程技术获得抗癌止痛肽VKVR方法、抗癌止痛肽VKVR衍生物、类似物、活性片段的结构及其制备方法和抗癌止痛肽VKVR及其衍生物、类似物、活性片段作为镇痛和抗癌药物在医药领域中的应用。所述的抗癌止痛肽VKVR及其衍生物或类似物或活性片段可以与药学上可接受的载体混合制备临床上可接受的注射剂、口服制剂、透皮吸收制剂、粘膜吸收制剂。本发明所述的抗癌止痛肽VKVR及其衍生物、类似物、活性片段具有较好的镇痛和抗肿瘤活性，其获得方法常规、简单、产量高。

Description

抗癌止痛肽VKVR及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，涉及抗癌止痛肽VKVR及其制备方法与应用，具体地说，本发明涉及抗癌止痛肽VKVR及其衍生物、类似物、活性片段的结构以及其制备方法和作为镇痛和抗癌药物在医药领域中的应用。

背景技术

蝎作为中医珍贵药材又称全虫、全蝎，始载于《开宝本草》、《本草纲目》等医药学名著，距今已有2000多年的药用历史，具有熄风镇痉、攻毒散结、痛络止痛之功效。临床用于治疗偏头痛、面神经瘫痪、风湿痹痛及癌痛等症，疗效确切。蝎主要活性成分是尾腺分泌的毒素，其中蕴涵大量具有药学价值的活性组分，是一个富含有多种功能肽的天然活性肽库。目前，从蝎或蝎毒中分离纯化并结构解析具有镇痛和抗肿瘤活性的成分还不是很多，但也有相关的发明专利，如“蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽”。

本发明就是从全蝎或蝎尾或蝎毒中，分离纯化筛选获得一种具有镇痛和抗肿瘤活性的新型结构多肽。同时，利用基因工程技术或化学合成技术解决该活性肽的获得方法。此外，利用基因工程技术获得仍具有镇痛和抗肿瘤活性的该活性肽的衍生物或类似物或活性片段。

发明内容

本发明的目的是针对蝎抗癌止痛肽VKVR，利用蛋白提取、分离、纯化技术，从蝎毒或蝎尾或全蝎中筛选、分离、纯化获得。抗癌止痛肽VKVR获得方法简单易行，可与任何载体混合制备医学上可接受的剂型。

本发明的目的可以通过以下措施来达到:

利用全蝎或蝎尾或蝎毒中抗癌止痛肽VKVR的分子量、等电点、分子表面的疏水性与其它蛋白质、多肽、酶的差异,单独或综合借助这些差异,通过超滤;胶过滤、离子交换、疏水、反相层析方法,从全蝎或蝎尾或蝎毒中获得抗癌止痛肽VKVR（VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIR

VPGRCNG）。根据该活性肽的结构,利用化学合成方法获得该活性肽或该活性肽的部分片段或该活性肽的衍生物、类似物。根据该活性肽的结构,利用化学合成方法或生物技术获得该活性肽或该活性肽的部分片段或该活性肽的衍生物、类似物的基因,通过重组DNA技术即基因工程方法,克隆至基因工程表达载体中,经表达、纯化获得抗癌止痛肽VKVR或该活性肽的部分片段或该活性肽的衍生物、类似物。本发明所述的抗癌止痛肽VKVR或该活性肽的部分片段或该活性肽的衍生物、类似物不仅可作为治疗各种疼痛和肿瘤疾病的药物,也可作为研究工具,用于镇痛、抗肿瘤的新化合物的筛选。

本发明的技术方案包括：⑴原料（蝎毒或蝎尾或全蝎）首先进行匀浆（以蝎尾或全蝎为原料），利用蒸馏水或酸性溶液或碱性溶液溶解抽提，离心除去不溶杂质得到抽提液；（2）该抽提液可以通过疏水层析柱、离子交换层析柱、凝胶过滤层析柱的不同组合以及经超滤去除盐、杂蛋白和浓缩得到抗癌止痛肽VKVR；（3）经反向层析柱得到高纯度的抗癌止痛肽VKVR。比如，蝎毒经酸性溶液溶解，离心除去不溶杂质得到抽提液；抽提液经疏水层析柱分离得到抗癌止痛活性组分；得到活性组分经超滤以去除盐和杂蛋白，同时进行浓缩，通过离子交换层析柱分离得到活性组分；经疏水层析柱进一步分离得到活性组分；经超滤以去除盐和浓缩，通过离子交换层析柱纯化得到活性组分；经凝胶过滤层析柱进一步纯化得到活性组分；经反向层析柱得到高纯度的抗癌止痛肽VKVR。

本发明目的之二是针对抗癌止痛肽VKVR的生物活性，利用基因工程技术获得抗癌止痛肽VKVR及其部分片段或衍生物或类似物，通过获得表达产物的生物活性，以获得可以进一步开发抗癌、镇痛类药物的抗癌止痛肽VKVR及其部分片段或衍生物或类似物，本发明所述的的获得方法常规、简单、产量高，不仅具有重要的指导意义和实用价值，也为工业化生产奠定了基础。

本发明目的之三是提供多种抗癌止痛肽VKVR及其部分片段或衍生物或类似物的制备方法，它包括：利用基因工程技术进行表达或通过化学合成获得。基因工程技术包括：

⑴将抗癌止痛肽VKVR及其部分片段或衍生物或类似物编码DNA重组至表达载体；

⑵用步骤⑴的重组表达载体转化适当的宿主细胞（原核或真核细胞）；

⑶在适合的诱导表达条件下，培养步骤⑵的被转化的宿主细胞；

⑷收获并纯化所得到的蛋白质。

本发明提供上述抗癌止痛肽VKVR及其部分片段或衍生物或类似物的表达产物分离纯化方法。可使用盐析沉淀、超滤、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法从细胞的溶胞产物及培养液中分离并纯化所需的表达产物。在表达产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法(WESTERN)检测表达产物的存在及相应分子大小。

本发明首次进行上述抗癌止痛肽VKVR及其部分片段或衍生物或类似物的生物活性实验。

本发明还提供了上述抗癌止痛肽VKVR及其部分片段或衍生物或类似物在生物制药领域的应用，具体地说包括镇痛和抗癌生物活性。

本发明的再一个目的是提供含有如上限定的蛋白质及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。可按照制药工业领域已知的基本原则和方法制备适于胃肠道外途径给药的药物组合物(如参见Remington’s Pharmaceutical Science, 15th., Mack Publishing Company, 1980)。可通过各种给药途径，特别是静脉内、肌肉内、关节内、腹腔内、鼻内、皮内、皮下等胃肠道外途径投用本发明的药物组合物。

本发明的再一个目的是提供如上限定的蛋白质在生产镇痛、抗癌药物中的应用。可使用本发明的蛋白或含有该蛋白质的药物组合物作为治疗剂，用于治疗特定类型人体的各种疼痛相关疾病。本发明的药物组合物的治疗有效剂量一般应根据疾病的性质、严重程度及对药物的敏感适应性，以及给药途径等诸多因素由临床医生按照个体化原则来确定。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。

本发明所述的抗癌止痛肽VKVR或该活性肽的部分片段或该活性肽的衍生物、类似物的获得方法常规、简单、产量高,对研制开发镇痛、抗肿瘤肽类药物具有重要的指导意义和实用价值,为工业化生产和实用化奠定了基础。

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限制本发明特批权利要求的范围。

实施例1：

从蝎毒获得抗癌止痛肽VKVR

获得抗癌止痛肽VKVR的提取、分离、纯化体系基本条件的特征：1.操作温度在0℃-45℃；2.溶液的酸碱度在pH2-pH12。上述条件既不破坏提取、分离、纯化所采用介质的理化性质，又不影响抗癌止痛肽VKVR的活性。

（1）抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提

A.蝎毒溶于蒸馏水后,15000转/分离心15分钟,取上清液用0.01M盐酸或磷酸溶液调pH为2, 15000转/分离心15分钟,取上清液用碱性溶液调pH为12, 15000转/分离心15分钟，上清液为含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提液。

B.蝎毒溶于pH为2的缓冲溶液或酸性溶液，15000转/分离心15分钟,取上清液用碱性溶液调pH为12, 15000转/分离心15分钟，上清液为含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提液。

C.蝎毒溶于pH为12的缓冲溶液或碱性溶液，15000转/分离心15分钟,取上清液用酸性溶液调pH为2, 15000转/分离心15分钟，上清液为含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提液。

上述提取液的酸碱度从pH2-pH12，均不影响含有抗癌止痛肽VKVR的生物活性，且从原料中能够提取活性成分。

（2）抗癌止痛肽VKVR的疏水层析分离

取上述含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提液，用盐酸水溶液或磷酸水溶液或酸性溶液或碱性溶液调pH至中性条件范围下,加中性盐至2M浓度,上样于预先用2M 中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱,分别用2.0M、1.5M、1.0M、0.5M 中性盐-缓冲液洗脱,最后用缓冲液洗脱,将含有抗癌止痛肽VKVR的洗脱液合并。

疏水层析分离的特征：1.疏水层析介质选择苯基-疏水层析添料或正辛烷-疏水层析添料-或己烷-疏水层析添料-或丁烷-疏水层析添料；2.中性盐选择(HN₃)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl；3.缓冲液的pH选择在pH2-pH12，此条件既不影响抗癌止痛肽VKVR的生物活性，又不影响活性成分的分离；4.缓冲液的浓度选择在1mM-100mM，此条件既不影响抗癌止痛肽VKVR的生物活性，又不影响活性成分的分离。

（3）超滤处理抗癌止痛肽VKVR活性成分溶液

利用超滤处理的目的是除去抗癌止痛肽VKVR活性成分溶液中的盐或杂蛋白或更换缓冲液，此外，对抗癌止痛肽VKVR活性成分溶液进行浓缩。选择能够使抗癌止痛肽VKVR透过的超滤膜进行超滤处理，此时收集超滤透过液，而杂蛋白被截留实现分离的目的。选择能够截留抗癌止痛肽VKVR的超滤膜进行超滤处理，此时收集超滤浓缩液（抗癌止痛肽VKVR被截留），而盐、缓冲液的缓冲对、能透过超滤膜的杂蛋白、水被透过，实现去除盐、杂蛋白或更换缓冲液或浓缩的目的。

超滤处理的特征：1.透过抗癌止痛肽VKVR的超滤膜选择是分子量为10kDa或20kDa或30kDa或40kDa或50kDa的超滤膜，优选30kDa的超滤膜，大于或小于30kDa的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；2.截留抗癌止痛肽VKVR的超滤膜选择是分子量为1kDa或2kDa或3kDa或5kDa的超滤膜，优选1kDa的超滤膜，大于或小于1kDa的超滤膜，其收率或超滤效率均受影响；3.超滤处理的温度选择在0℃-45℃，此条件既不破坏超滤膜的理化性质，又不影响抗癌止痛肽VKVR的活性。

（4）抗癌止痛肽VKVR的离子交换层析分离

方法（3）超滤处理的抗癌止痛肽VKVR活性成分溶液，进一步用本实验的缓冲液进行除盐、缓冲液更换和浓缩。待处理好的样品液上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析柱,先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白,分别用0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.4M、0.5M盐溶液进行阶段洗脱,将含有抗癌止痛肽VKVR的洗脱液合并。

离子交换层析分离的特征：1.层析介质选择阳离子交换层析添料，如CM-离子交换层析添料或SP-离子交换层析添料或S-离子交换层析添料等阳离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7；2.层析介质选择阴离子交换层析添料，如Q-离子交换层析添料或DEAE-离子交换层析添料或QAE-离子交换层析添料等离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH12；3.缓冲液的浓度选择在1mM-50mM，此条件既不影响抗癌止痛肽VKVR的生物活性，又不影响活性成分的分离；4.阶段洗脱的盐溶液选择是要求浓度（0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.4M、0.5M）的缓冲液或在10mM缓冲液中加中性盐到需要的浓度（0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.4M、0.5M）；5.中性盐选择(HN₃)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl或KCl，优选NaCl。

（5）抗癌止痛肽VKVR的疏水层析进一步分离

得到的抗癌止痛肽VKVR活性成分按照方法（2）的基本框架进一步分离。抗癌止痛肽VKVR活性成分溶液加中性盐至2M浓度,上样于预先用2M 中性盐-缓冲液溶液平衡的疏水层析柱,进行中性盐浓度梯度(2.0M～0.0M)洗脱,合并收集含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的洗脱峰,进行超滤去盐和浓缩处理。

疏水层析分离的特征：1.疏水层析介质选择苯基-疏水层析添料或正辛烷-疏水层析添料-或己烷-疏水层析添料-或丁烷-疏水层析添料；2.中性盐选择(HN₃)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl；3.缓冲液的pH选择在pH2-pH12；4.缓冲液的浓度选择在1mM-100mM。

（6）抗癌止痛肽VKVR的离子交换层析进一步分离

得到的抗癌止痛肽VKVR活性成分按照方法（4）的基本框架进一步分离。待处理好的样品液上样于预先用缓冲液平衡好的离子交换层析柱,先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白,进行盐浓度梯度(0.0M～1.0M)洗脱,合并收集含有抗癌止痛肽VKVR的洗脱峰。

离子交换层析分离的特征：1.层析介质选择阳离子交换层析添料，如CM-离子交换层析添料或SP-离子交换层析添料或S-离子交换层析添料等阳离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH2-pH7；2.层析介质选择阴离子交换层析添料，如Q-离子交换层析添料或DEAE-离子交换层析添料或QAE-离子交换层析添料等离子交换层析添料，此时缓冲液酸碱度选择在pH7-pH12；3.缓冲液的浓度选择在1mM-50mM；4.盐梯度洗脱的盐溶液选择是要求浓度（1.0M）的缓冲液或在10mM缓冲液中加中性盐到需要的浓度（1.0M）；5.中性盐选择(HN₃)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl或KCl，优选NaCl。

（7）抗癌止痛肽VKVR的凝胶层析纯化

含有抗癌止痛肽VKVR的溶液进行超滤浓缩，样品液上样于预先用洗脱液平衡好的凝胶过滤层析柱并进行纯化, 收集含有抗癌止痛肽VKVR的洗脱峰。

凝胶层析分离的特征：1.层析介质可以选择Sephacryl S-100 HR或Sephacryl S-200 HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75或Sephadex G-100或Sephadex G-150或Superose 12 prep grade或Superose 6 prep grade或Superdex 30 prep grade或Superdex 75 prep grade或Superose 12 HR或Superose 6 HR或Superdex Peptide HR或Superdex75 HR或Superdex Peptide PE等凝胶层析添料；2.洗脱液的pH选择在pH2-pH12；3.洗脱液的浓度选择在离子浓度大于0.15M及以上。

（8）抗癌止痛肽VKVR的反相层析高纯度纯化

活性组分,上样于预先用0.1%三氟醋酸-20%乙腈水溶液平衡好的反相层析柱,如SOURCE 15RPC、30RPC层析添料,先用0.1%三氟醋酸-20%乙腈水溶液充分洗涤,而后进行乙腈浓度梯度(20%至95%) 洗脱, 合并收集洗脱峰面积最大的洗脱峰组分-抗癌止痛肽VKVR。

从蝎毒获得的抗癌止痛肽VKVR的结构特征：

VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。

实施例2：

从蝎尾获得抗癌止痛肽VKVR

本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。

（1）抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提

A.蝎尾加蒸馏水后进行匀浆, 15000转/分离心15分钟,上清液用0.01M盐酸或磷酸溶液或酸性溶液调pH为2, 15000转/分离心15分钟,取上清液用碱性溶液调pH为12, 15000转/分离心15分钟，上清液是从蝎尾获得含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提液。

B.蝎尾加pH为2的缓冲溶液或酸性溶液后进行匀浆，15000转/分离心15分钟,取上清液用碱性溶液调pH为12, 15000转/分离心15分钟，上清液是从蝎尾获得含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提液。

C.蝎尾加pH为12的缓冲溶液或碱性溶液后进行匀浆，15000转/分离心15分钟,取上清液用酸性溶液调pH为2, 15000转/分离心15分钟，上清液是从蝎尾获得含有抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提液。

上述提取液的酸碱度从pH2-pH12，均不影响抗癌止痛肽VKVR的生物活性，且从原料中能够提取活性成分。

（2）抗癌止痛肽VKVR的分离纯化以及高纯度纯化

取上述含有抗癌止痛肽VKVR成分的抽提液，同实施例1中的（2）—（8）的策略、基本方法和基本过程分离纯化抗癌止痛肽VKVR。

从蝎尾获得的抗癌止痛肽VKVR的结构特征：

VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。

实施例3：

从全蝎获得抗癌止痛肽VKVR

本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例2。

（1）抗癌止痛肽VKVR活性成分的抽提

A.全蝎加蒸馏水后进行匀浆,15000转/分离心15分钟,取上清液用0.01M盐酸或磷酸溶液或酸性溶液调pH为2, 15000转/分离心15分钟,取上清液用碱性溶液调pH为12, 15000转/分离心15分钟，上清液为从全蝎获得含有抗癌止痛肽VKVR成分的抽提液。

B.全蝎加pH为2的缓冲溶液或酸性溶液后进行匀浆，15000转/分离心15分钟,取上清液用碱性溶液调pH为12, 15000转/分离心15分钟，上清液为从全蝎获得含有抗癌止痛肽VKVR成分的抽提液。

C.全蝎加pH为12的缓冲溶液或碱性溶液后进行匀浆，15000转/分离心15分钟,取上清液用酸性溶液调pH为2, 15000转/分离心15分钟，上清液为从全蝎获得含有抗癌止痛肽VKVR成分的抽提液。

取上述含有抗癌止痛肽VKVR成分的抽提液，同实施例1中（2）-（8）的策略、基本方法和基本过程分离纯化抗癌止痛肽VKVR。

从全蝎获得的抗癌止痛肽VKVR的结构特征：

VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。

实施例4：

抗癌止痛肽VKVR的获得

本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。

蝎毒或蝎尾或全蝎中的抗癌止痛肽VKVR活性成分抽提的策略、基本方法和基本过程同实施例1、实施例2和实施例3。

抗癌止痛肽VKVR的分离纯化的策略、基本方法和基本过程同实施例1。获得的抗癌止痛肽VKVR成分抽提液可以通过疏水层析柱、离子交换层析柱、凝胶过滤层析柱的不同组合以及经超滤去除盐、杂蛋白和浓缩得到镇痛活性肽-SYPU1，经反相层析柱得到高纯度的抗癌止痛肽VKVR。

这种组合的特征：1.抗癌止痛肽VKVR活性成分抽提液经过离子交换层析分离-疏水层析分离-离子交换层析进一步分离-疏水层析进一步分离-凝胶层析纯化-反向层析；2.抗癌止痛肽VKVR活性成分抽提液经过凝胶层析纯化-离子交换层析分离-疏水层析分离-离子交换层析进一步分离-疏水层析进一步分离-反向层析；3.抗癌止痛肽VKVR活性成分抽提液经过凝胶层析纯化-疏水层析分离-离子交换层析分离-疏水层析进一步分离-离子交换层析进一步分离-反向层析；4.按照上述的分离纯化体系，不论如何组合不同层析顺序，均能分离纯化获得抗癌止痛肽VKVR。

获得的抗癌止痛肽VKVR的结构特征：

VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。

实施例5：

抗癌止痛肽VKVR及其衍生物、类似物、活性片段的获得

1.抗癌止痛肽VKVR基因的构建

本实施例列举描述用于表达本发明抗癌止痛肽VKVR及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建策略和基本方法。

根据抗癌止痛肽VKVR的N末端和C末端氨基酸序列，分别设计相应寡核苷酸引物，同时在上述两个寡核苷酸引物的5′端，分别加上限制性核酸内切酶NdeⅠ和 BamHⅠ水解位点序列；以蝎cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收；经过限制性核酸内切酶NdeⅠ和 BamHⅠ双酶切后与同样进行双酶切的质粒在T4 DNA ligase的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞DH 5α，经过菌落PCR和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行DNA序列测定。结果表明，通过上述基因工程的方法构建抗癌止痛肽VKVR基因。

2.抗癌止痛肽VKVR及其衍生物、类似物、活性片段的获得

利用基因过程技术，将抗癌止痛肽VKVR基因重组至大肠杆菌表达质粒中，提取质粒进行测序。

该重组表达质粒编码表达产物的结构特征为:MHHHHHHM VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。

将阳性重组质粒热转化大肠杆菌BL21(λDE3)，然后从该 LB固体平板上挑取单菌落后接种至3 ml LB (含卡那抗生素，50 μg/ml)，于37 ℃，200 r/min振荡过夜培养。按照1%接种量将过夜培养物接种至400 ml含相应抗生素的新鲜LB培养基的三角瓶中，于37 ℃，200 r/min振荡培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为0.166 mmol/L的诱导物异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，培养4 h。结束发酵，3000 g、4 ℃离心20 min，收集菌体。用40 ml 裂解缓冲液(0.1 M PBS, 0.15 M NaCl, 50 mM咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，超声结束后于12,000g、4 ℃离心20 min，得上清液，所得沉淀按照上述步骤重复破碎一次，合并两次上清液，直接上样于0.1 M PBS (pH 8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过两个不同阶段的pH缓冲液分别充分洗涤5个柱床体积后，使用0.5 M 咪唑 (pH 9.0)进行洗脱并收获该洗脱液。所得产物经过15% SDS-PAGE验证其纯度。由柱层析色谱图和SDS-PAGE图谱说明，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。上述获得的表达产物，利用化学法在M处断裂肽链，从而获得抗癌止痛肽VKVR，结构特征为: VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。

同上原则获得抗癌止痛肽VKVR衍生物、类似物、活性片段的表达产物，其结构特征为:

MVKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。

VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNGG。

MVKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNGG。

（SGGGG）n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。（n可以是1或2或3或4或5）。

（SGGGG）n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNGG。（n可以是1或2或3或4或5）。

M（SGGGG）n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。（n可以是1或2或3或4或5）。

M（SGGGG）n VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNGG。（n可以是1或2或3或4或5）。

3.抗癌止痛肽VKVR在酵母中的表达及其纯化

将编码抗癌止痛肽VKVR基因的序列用下列寡核苷酸引物进行扩增，获得插入片断。PCR反应所使用的5′寡核苷酸引物序列含有EcoRⅤ限制性内切酶的酶切位点和抗癌止痛肽VKVR的N末端区域氨基酸序列的编码序列，3′端引物序列含有EcoRⅠ限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止密码子和抗癌止痛肽VKVR的C末端区域氨基酸序列的编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于酵母表达载体pPIC9K上的限制性内切酶酶切位点（其中EcoRⅤ和SnaBⅠ的内切酶切口为平末端），该质粒载体编码抗生素抗性（Amp^r和Kan^r），一个来自2μ质粒的复制子，一个AOX1启动子，在毕赤酵母中可由甲醇诱导高效表达，一个α-因子的信号肽序列，一个转录终止信号，一个HIS4选择性标记以及整合序列。

用SnaBⅠ和EcoRⅠ消化pPIC9K载体，用EcoRⅤ和EcoRⅠ消化插入片段，随后将插入片段连入pPIC9K载体，连接产物热转化E.coli DH 5α菌株，在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在含有Amp（100μg/ml）的LB液体培养基中过夜培养含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证插入片段正确插入。

取质粒线性化后，电转化入酵母细胞，线性化的重组载体通过与宿主基因组的同源序列发生同源重组产生稳定的酵母转化体。利用G418筛选出高拷贝的整合转化子。将筛选得到的菌株接种于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28～30℃/250～300 转/分培养至OD600 = 2～6 (16～18 h)；室温下3000转/分离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的MM、BMM或 BMMY重悬菌体（约10～20ml）；将步骤2所得的菌液置于100ml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28～30℃/250～300转/分的摇床上继续生长；每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%；分离样品的上清液, 用截留分子量为3000Da的超滤膜超滤除去色素，用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。该体系表达产物结构特征为: VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。

MVKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。

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实施例6：

体内镇痛活性—小鼠醋酸扭体法

本实施例通过小鼠体内镇痛模型确定抗癌止痛肽VKVR的体内生物活性-镇痛活性。此外也旨在验证抗癌止痛肽VKVR衍生物、类似物、活性片段的镇痛活性。蛋白浓度采用Lowry方法进行测定。

小鼠醋酸扭体法镇痛模型：将冰醋酸作为化学刺激物注入昆明种小鼠腹腔内，继而引起深部的、大面积而较持久的疼痛刺激，致使小鼠产生“扭体”反应(腹部内凹、躯干与后腿伸张、臀部高起)。以吗啡为阳性对照，生理盐水为空白对照，按照下述公式计算各个给药组的扭体反应抑制率。

从实施例1.、2. 、3.、4.、5.获得的抗癌止痛肽VKVR或该活性肽的部分片段或该活性肽的衍生物、类似物, 在小鼠醋酸扭体模型,注射给予上述样品,剂量在0.1mg/kg体重至16.0mg/kg_体重, 小鼠扭体反应抑制率在0.0%至100%。如，从实施例1.获得的SDS-PAGE单一区带的抗癌止痛肽VKVR的ED₅₀(半数有效量)为2.7mg/kg体重；阳性对照药-吗啡的ED₅₀(半数有效量)为1.1mg/kg_体重；抗癌止痛肽VKVR部分片段、衍生物、类似物的ED₅₀不高于3.0mg/kg_体重。

实施例7：

体内镇痛活性—小鼠热板法模型

在小鼠热板法模型,注射给予从实施例1.、2. 、3.、4.、5.获得的抗癌止痛肽VKVR或该活性肽的部分片段或该活性肽的衍生物、类似物样品,剂量在0.1mg/kg_体重至16.0mg/kg_体重, 小鼠痛阈值(在55℃±5℃热板上舔后足所需时间)为正常值(10秒至30秒) 至60秒(如果痛阈值超过60秒, 小鼠仍不舔后足,则取出小鼠)之间。如，从实施例1.获得的SDS-PAGE单一区带的抗癌止痛肽VKVR, 注射给予3.5mg/kg_体重,在5分钟、15分钟、25分钟、35分钟、45分钟、60分钟、90分钟的痛阈提高率，分别为160%、244.8%（痛阈值超过60秒）、244.8%（痛阈值超过60秒）、216%、108%、44%、15%；而注射给予10.0mg/kg_体重吗啡的痛阈提高率，则分别为2%、80%、160%、75%、19%、4%、4%；抗癌止痛肽VKVR部分片段、衍生物、类似物（3.5mg/kg_体重），在5分钟、15分钟、25分钟、35分钟、45分钟、60分钟、90分钟的痛阈提高率，均分别不低于140%、244.8%（痛阈值超过60秒）、244.8%（痛阈值超过60秒）、200%、90%、30%、10%。

实施例8：

体内抗肿瘤活性—小鼠S₁₈₀肉瘤的实体型肿瘤模型

在小鼠试验肿瘤模型（S₁₈₀肉瘤的实体型肿瘤),从实施例1.、2. 、3.、4.、5.获得的抗癌止痛肽VKVR或该活性肽的部分片段或该活性肽的衍生物、类似物样品均具有抗肿瘤活性。

注射给予0.1mg/kg_体重至10.0mg/kg_体重, 连续给样七天,其S₁₈₀肉瘤实体型肿瘤的瘤重抑制率〔(C-T)/C;C:对照组平均瘤重,T:样品组平均瘤重〕为0%至72%。如，从实施例1.获得的SDS-PAGE单一区带的抗癌止痛肽VKVR,剂量为4.4 mg/kg_体重, 其瘤重抑制率为46%；而阳性对照药-环磷酰胺, 剂量为60.0 mg/kg_体重, 其瘤重抑制率为50%。

实施例9：

体内抗肿瘤活性—小鼠S₁₈₀肉瘤的艾氏腹水型肿瘤模型

在小鼠试验肿瘤模型（S₁₈₀肉瘤的艾氏腹水型肿瘤), 从实施例1.、2. 、3.、4.、5.获得的抗癌止痛肽VKVR或该活性肽的部分片段或该活性肽的衍生物、类似物样品均具有抗肿瘤活性。

注射给予0.1mg/kg_体重至10.0mg/kg_体重，连续给样十天,在艾氏腹水型肿瘤模型的生命延长率为0%至39%。如，从实施例2.获得的SDS-PAGE单一区带的抗癌止痛肽VKVR,剂量为4.4 mg/kg_体重, 其生命延长率分别为20%;而阳性对照药-环磷酰胺, 剂量为60.0 mg/kg_体重, 其生命延长率为17%。

SEQUENCE LISTING

<110> 沈阳药科大学

<120>抗癌止痛肽VKVR及其制备方法与应用

<130>抗癌止痛肽VKVR及其制备方法与应用

<160> 1

<170> PatentIn Version 3.1

<210> 1

<211> 65

<212> PRT

<213> Mesobuthus martensi

<400> 1

Val Lys Asp Gly Tyr Ile Val Asp Asp Lys Asn Cys Ala Tyr Phe

1 5 10

Cys Gly Arg Asn Ala Tyr Cys Asp Asp Glu Cys Glu Lys Asn Gly

16 20 25

Ala Glu Ser Gly Tyr Cys Gln Trp Ala Gly Val Tyr Gly Asn Ala

31 35 40

Cys Trp Cys Tyr Lys Leu Pro Asp Lys Val Pro Ile Arg Val Pro

46 50 55

Gly Arg Cys Asn Gly

61

Claims

1.抗癌止痛肽VKVR，其特征在于，它是从蝎毒或蝎尾或全蝎提取、分离、纯化获得的，其结构特征为：

VKDGYIVDDKNCAYFCGRNAYCDDECEKN

GAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGRCNG。

2.如权利要求1所述的抗癌止痛肽VKVR的制备方法，其特征在于，它包括（1）蝎毒或蝎尾或全蝎用蒸馏水或酸性溶液或碱性溶液溶解提取，离心除去杂质得到抽提液，（2）抽提液经疏水层析柱分离得到抗癌止痛活性组分，（3）得到抗癌止痛活性组分经超滤以去除盐和杂蛋白，同时进行浓缩，通过离子交换层析柱分离得到抗癌止痛活性组分，（4）经疏水层析柱进一步分离得到抗癌止痛活性组分，（5）经超滤以去除盐和浓缩，通过离子交换层析柱纯化得到抗癌止痛活性组分，（6）经凝胶过滤层析柱进一步纯化得到抗癌止痛活性组分，（7）经反向层析柱得到高纯度的抗癌止痛肽VKVR。

3.根据权利要求1所述的抗癌止痛肽VKVR的制备方法，其特征在于，所述的分离和纯化包括蝎毒或蝎尾或全蝎用蒸馏水或酸性溶液或碱性溶液溶解提取并经离心除去杂质得到抽提液，该抽提液通过疏水层析柱、离子交换层析柱、凝胶过滤层析柱的不同组合以及经超滤去除盐、杂蛋白和浓缩得到抗癌止痛肽VKVR。

4.如权利要求1所述的抗癌止痛肽VKVR的制备方法，利用基因工程技术进行表达获得，其特征在于，表达宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

5.如权利要求4所述的抗癌止痛肽VKVR的制备方法，其特征在于，基因工程表达后的分离纯化方法包括：（1）表达的基因工程菌体经破碎后，离心除去不溶物获得的上清液；或基因工程菌分泌表达后离心除去不溶物获得的上清液（2）上清液经疏水层析柱分离得到抗癌止痛活性组分，（3）得到抗癌止痛活性组分经超滤以去除盐和杂蛋白，同时进行浓缩，通过离子交换层析柱分离得到抗癌止痛活性组分，（4）经疏水层析柱进一步分离得到抗癌止痛活性组分，（5）经超滤以去除盐和浓缩，通过离子交换层析柱纯化得到抗癌止痛活性组分，（6）经凝胶过滤层析柱进一步纯化得到抗癌止痛活性组分，（7）经反向层析柱得到高纯度的抗癌止痛肽VKVR。

6.根据权利要求1所述的抗癌止痛肽VKVR的制备方法，利用化学合成技术获得，其特征在于，化学合成为人工合成或合成仪合成。

7.权利要求1所述抗癌止痛肽VKVR在制备镇痛药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的抗癌止痛肽VKVR与药学上可接受的载体混合制备临床上可接受的注射剂、口服制剂、透皮吸收制剂、粘膜吸收制剂。