CN102925470A - 一种在酵母中重组表达生产人胸腺肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可以大规模，低成本生产人胸腺肽的方法，所述方法通过酶切操作形成具有如下结构的融合基因序列：A-X-C，其中A部分为编码成熟人血清白蛋白N-端1-150～1-372位氨基酸的核苷酸序列，X为编码包含肠激酶或烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切位点的连接肽的核苷酸序列，C为人胸腺肽基因。将融合基因序列连接到表达载体，将表达载体转化导入酵母菌中，经诱导表达获得可溶性的人血清白蛋白-胸腺肽融合蛋白，通过加入肠激酶或烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切，经分离纯化获得重组人胸腺肽。本发明所述的胸腺肽生产方法具有可保证产品质量一致性，不受原料来源限制，且成本很低，表达量高，可以大规模生产等优点。

Description

一种在酵母中重组表达生产人胸腺肽的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域,具体涉及一种利用酵母重组表达生产人胸腺肽的方法。

背景技术

多肽对人体具有非常重要的不可替代的调节作用，这种作用几乎涉及到人体的所有生理活动。对人体的免疫系统来说，多肽尤其是胸腺肽或胸腺素（Thymosins）显得更加重要和直接。胸腺肽是一种应用较早的免疫药物(Goldstein AL.2007.History of the discovery of the thymosins.Ann N YAcad Sci.1112:1-13)。胸腺肽是由胸腺上皮细胞所分泌，含有40多种组分的一类多肽激素混合物,由Goldstein等于1966年首次从胎牛胸腺蛋白提取液中发现，其水平与机体的免疫功能密切相关。根据这些多肽在等电聚焦电泳分析图谱上的位置，可以划分为三型。其中：pI＜5的为α；5＜pI＜7的为β；pI＞7的为γ（Goldstein AL,Slater FD,White A.1966.Preparation,assay,and partialpurification of a thymiclymphotopoietic factor(thymosin).Proc Nat AcadSci USA.56:1010-1017）。

在β型胸腺肽中，目前已经有20多种异构体被鉴定出来，而人体内主要存在三种：胸腺肽β4，β10和β15。由于近年来发现胸腺肽β家族成员的功能不仅仅局限于与肌动蛋白结合，影响细胞的生长和迁移，而且在其他多方面均有作用。同时，胸腺肽β家族新的功能也为一些疾病的诊断和治疗提供了新的研究思路，从而越来越多地引起众多研究者的注意（Goldstein AL,Hannappel E,Sosne G,Kleinman HK.2012.Thymosin β4:a multi-functional regenerative peptide.Basic properties and clinical applications.Expert Opin Biol Ther.12:37-51)。尤其是胸腺肽β4(Tβ4)在胸腺肽β家族中丰度最高,广泛分布于各组织、器官和细胞中。已有大量实验结果证明Tβ4与免疫功能、神经发育和肌动蛋白功能密切(Hannappel E.Beta-Thymosins.2007.Ann N Y Acad Sci.1112:21-37)。Tβ4还具促进血管生成（Smart N,Rossdeutsch A,Riley P.2007.Thymosin beta 4 and angiogenesis:Modes of action and therapeuticpotential.Angiogenesis.10:229-241;Freeman KW,Bowman BR,ZetterBR.2011.Regenerative protein thymosin beta-4 is a novel regulator ofpurinergic signaling.FASEB J.25:907-15）、修复受损的心肌（Ehrlich HP,Hazard SW 3rd.2010.Thymosin beta4 enhances repair by organizingconnective tissue and preventing the appearance of myofibroblasts.Ann NY Acad Sci.1194:118-24;Smart N,Dubé KN,Riley PR.2010.Identificationof Thymosin β4 as an effector of Hand1-mediated vascular development.NatCommun.1:46;Dubé KN,Bollini S,Smart N,Riley PR.2012.Thymosin β4protein therapy for cardiac repair.Curr Pharm Des.18:799-806;Gajzer DC,Balbin J,Chaudhry HW.2012.Thymosin β4 and cardiac regeneration:arewe missing a beat? Stem Cell Rev.2012 May 25.DOI:10.1007/s12015-012-9378-3）、创伤愈合（Malinda KM et al.1999.Thymosinbeta 4 accelerates wound healing.J Invest Dermatol.113:364-368;Bock-Marquette I,Saxena A,White MD,Dimaio JM,Srivastava D.2004.Thymosin β4 activates integrin-linked kinase and promotes cardiac cellmigration,survival and cardiac repair.Nature.432(7016):466-472;PhilpD,Kleinman HK.2010.Animal studies with thymosin beta,a multifunctionaltissue repair and regeneration peptide.Ann N Y Acad Sci.1194:81-86)、激活毛囊干细胞引起毛发生长(Philp D.et al.2004.Thymosin beta 4increases hair growth by activation of hair follicle stem cells.FASEBJ.18:385-387;Philp D,St-Surin S,Cha HJ,Moon HS,Kleinman HK,ElkinM.2007.Thymosin beta 4 induces hair growth via stem cell migration anddifferentiation.Ann N Y Acad Sci.1112:95-103)、细胞保护功能（Kumar S,Gupta S.2011.Thymosin beta 4 prevents oxidative stress by targetingantioxidant and anti-apoptotic genes in cardiac fibroblasts.PLoS One.6(10):e26912）、修复受损角膜（Sosne G,Qiu P,Kurpakus-Wheater M,MatthewH.2010.Thymosin beta4 and corneal wound healing:visions of thefuture.Ann N Y Acad Sci.1194:190-8）、修复脑损伤（Morris DC,Chopp M,Zhang L,Lu M,Zhang ZG.2010.Thymosin beta4 improves functionalneurological outcome in a rat model of embolic stroke.Neuroscience.169:674-82）、促进牙的发育(Choi BD,Yun SH,Jeong SJ,Wang G,Kim HJ,LimDS,Jeong MJ.2012.Expression of thymosin β4 in odontoblasts duringmouse tooth development.Int J Mol Med.29:841-7)甚至抗肿瘤功能（CaersJ.et al.2010.Thymosin β4 has tumor suppressive effects and itsdecreased expression results in poor prognosis and decreased survival inmultiple myeloma.Haematologica.95:163-167）。

目前,关于Tβ4的临床试验包括压迫性溃疡、大疱性表皮松解症、静脉淤积性溃疡、糖尿病的玻璃体切割术和急性心肌梗死,其中前四项已进入Ⅱ期临床试验（司信喜，方宏清，陈惠鹏。2009.胸腺肽β4研究进展。生物技术通讯。20（4）：580-583;Crockford D,Turjman N,Allan C,Angel J.2010.Thymosinbeta4:structure,function,and biological properties supporting currentand future clinical applications.Ann N Y Acad Sci.1194:179-189)。

胸腺肽α1(Tα1)是由28个氨基酸残基组成的多肽（Elizondo-Riojas MA,Chamow SM,Tuthill CW,Gorenstein DG,Volk DE.2011.NMR structure of humanthymosin alpha-1.Biochem Biophys Res Commun.416:356-61），具有多种生物学活性的免疫增强剂（Jiang YF,Ma ZH,Zhao PW,Pan Y,Liu YY,Feng JY,Niu JQ.2010.Effect of thymosin-α(1)on T-helper 1 cell and T-helper 2cell cytokine synthesis in patients with hepatitis B virus eantigen-positive chronic hepatitis B.J Int Med Res.38:2053-2062），已在临床上广泛应用于治疗乙肝、丙肝、癌症和免疫缺陷等疾病（Goldstein AL,Goldstein AL.2009.From lab to bedside:emerging clinical applicationsof thymosin alpha 1.Expert Opin Biol Ther.9:593-608；Tuthill C,Rios I,McBeath R.2010.Thymosin alpha 1:past clinical experience and futurepromise.Ann N Y Acad Sci.1194:130-5；Mao HY,Shi TD.2011.Treatment withinterferon and thymosin alpha-1 versus interferon monotherapy for HBeAgpositive chronic hepatitis B:a meta-analysis.Zhonghua Gan Zang Bing ZaZhi.19(1):29-33）。除了通常用于提高免疫力以外，胸腺肽α1还可作为流感疫苗的联合佐剂（Panatto D,Amicizia D,Lai PL,Camerini R,De Rosa A,Gasparini R.2011.Utility of thymosin alpha-1(Zadaxin)as a co-adjuvantin influenza vaccines:a review.J Prev Med Hyg.52:111-115）、与其他细胞因子例如IRX-2合用具有更强的促进T细胞和免疫能力（Naylor PH,HaddenJW.2010.Preclinical studies with IRX-2 and thymosin alpha1 incombination therapy.Ann N Y Acad Sci.1194:162-8.）、甚至原胸腺肽α1(Prothymosinα1)也具有抗肿瘤能力（Ioannou K,Samara P,Livaniou E,Derhovanessian E,Tsitsilonis OE.2012.Prothymosin alpha:a ubiquitouspolypeptide with potential use in cancer diagnosis and therapy.CancerImmunol Immunother.61(5):599-614.）或者在神经退行性疾病亨廷顿病中起到治疗作用（Dong G,Callegari EA,Gloeckner CJ,Ueffing M,Wang H.2012.Prothymosin-α interacts with mutant huntingtin and suppresses itscytotoxicity in cell culture.J Biol Chem.287:1279-89）。

虽然胸腺肽β4和胸腺肽α1有着广泛的应用前景,但由于其分子各具有43和28个氨基酸残基，采用传统的多肽化学合成方法,成本较高，很难满足市场化需要。例如仅以化学合成的28个氨基酸残基的胸腺肽α1为例，意大利赛生公司的产品“日达仙”每支含量仅为1.6毫克,而价格却为800元左右,一个疗程为5万多元,价格昂贵,普通人难以承受。

采用基因工程方法生产重组Tβ4或Tα1蛋白，可以避免从生物原材料中直接提取率低或直接化学合成成本代价高等缺点。Tβ4和Tα1对化学合成耒说虽然分子太大,但对生物工程表达又太小,难以直接在微生物中表达。Tβ4在细菌中融合表达已有报道。如在Tβ4的N端融合5个氨基酸(HKCDI),可以使Tβ4在大肠杆菌得到高效表达,纯化后的蛋白可促进T细胞的增殖和分化（陈妍柯,杨辉,路凡等。2002。人胸腺肽β4基因的克隆表达及活性检测,生物化学与生物物理学报。34(4):502-505）,Tβ4融合蛋白在大肠杆菌表达后经亲和层析和DTT水解,可得到C端融合5个氨基酸(LEGSS)的重组Tβ4,不仅可以促进淋巴细胞的增殖和分化,而且可以促进伤口愈合（Li X,Zheng L,Peng F.et al.2007.Recombinantthymosin beta 4 can promote full-thickness cutaneous wound healing.Protein Expr Purif.56:229-236）,此外,His6-Tβ4可在大肠杆菌中高效表达并具有促血管生成的生物活性（贾琪,华子春。2007。人胸腺肽β4基因在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及促血管生成生物活性研究,东南大学学报:医学版。26(4):298-301）。张珍利用串联重复技术在大肠杆菌中成功表达了重组Tβ4,经过硫酸铵盐析、疏水作用和离子交换作用层析,得到高纯度的重组蛋白,不仅具有生物学活性,也为下一步功能研究奠定了基础[张珍。2008。重组人胸腺素β4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测,第四军医大学学报。29(16)]。关于胸腺肽α1在细菌中表达具有更多的报道（秦桂湘,龚兴国,纪静。2005。胸腺素α1的研究进展。细胞生物学。27,621-624；Li J,Liu CH,Wang FS.2010.Thymosinalpha 1:biological activities,applications and genetic engineeringproduction.Peptides.31:2151-8；Li W,Song L,Wu S,Xue X,Zhang L,HeL,Han W,Wang Q,Ling R,Zhang W,Yan Z,Zhang Y.2011.Expression,purification and characterization of a novel soluble human thymosinalpha1 concatemer exhibited a stronger stimulation on mice lymphocytesproliferation and higher anti-tumor activity.Int J Biol Sci.7(5):618-28；Zhang HY,Chen PF,Xu JM,Dai QM,Xu F,Han QW,Wang JJ,JinHY.2011.Separation and purification of Escherichia coli-expressed humanthymosin-α1 using affinity chromatography and high-performance liquidchromatography.Protein Expr Purif.77:140-5）。

但细菌表达往往存在复性问题,使得融合蛋白的酶切较难,另外细菌属于胞内表达,分离纯化工艺复杂,因而在工业上成本很高,大规模生产受到限制。而毕赤酵母表达系统具有非常优良的性能（刘忠渊,张富春,毛新芳,王芸。2004。利用毕赤酵母表达外源蛋白的研究。生物技术。14：56-59；马兴元,谭建华,朱平,孙曼霁。2003。巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达系统及其在外源蛋白生产中的优势与应用前景。中国兽医学报。23：98-102；Gao DM,Zhang XL,Zhang J,Cao JC and Wang FS.2008.Expression of thymosinα1-thymopentin fusionpeptide in Pichia pastoris and its characterization.Arch Pharm Res 31：1471-1476）。

人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)全长具有609个氨基酸残基，但N-端最初24个氨基酸残基为信号肽（signal peptide)或前导肽（propeptide)。其成熟人血清白蛋白是从第25位天门冬氨酸（D)开始至最后第609位亮氨酸（L)，因此成熟人血清白蛋白由585个氨基酸残基组成,分子量约为66.5kDa,是血浆的主要成分（GenBank：NM_000477；Uniprot:P02768)。以下人血清白蛋白均指成熟，不含信号肽或前导肽，具有585个氨基酸残基的蛋白。因人血清百蛋白在体内外非常稳定,没有酶学和免疫学活性,因而是一种理想的生物活性蛋白载体（郭美锦,庄英萍等。2002。基因工程菌Pichia pastoris高密度发酵表达重组人血清白蛋白。华东理工大学学报。33(1)：88-92）。虽然已经有众多关于融合人血清白蛋白生产目的蛋白尤其胸腺肽α1的报道（赵洪亮,薛冲,熊向华,张伟,杨秉芬,刘志敏。2005。人血清白蛋白-睫状神经营养因子突变体融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化和活性鉴定。生物工程学报。21:254-258；黄雯,李兆育,金礼吉,安利佳。2002。人胸腺素α1基因在毕赤酵母的融合表达。遗传(北京)。24：679-783；Yang YF.et al.2005.Construction,expressionand characterization of human interferon alpha2b-(G4S)n-thymosin alpha1fusion proteins in Pichia pastoris.World J Gastroenterol.11,2597-602；Chen JH,Zhang XG,Jiang YT,Yan LY,Tang L,Yin YW,Cheng DS,Chen J,Wang M.2010.Bioactivity and pharmacokinetics of two human serumalbumin-thymosin alpha1-fusion proteins,rHSA-Talpha1 andrHSA-L-Talpha1,expressed in recombinant Pichia pastoris.Cancer ImmunolImmunother.59:1335-45.）,但它们大多是融合整个血清白蛋白质分子。由于目的多肽短小,相对量就很少,人胸腺肽α1只占整个融合蛋白的4.6%,从而使表达量很低。

使用蛋白质内含肽(intein)介导切割技术无疑具有极大的优势(Wu WY,Miller KD,Coolbaugh M,Wood DW.2011.Intein-mediated one-steppurification of Escherichia coli secreted human antibodyfragments.Protein Expr Purif.76:221-228),但Intein技术具有严密的专利技术保护，同时使用细菌还需要破碎细菌细胞壁，产生热源等等问题。例如，Li报道使用大肠杆菌表达系统成功地表达了Thymosin α1-thymopentin(Tα1-TP5)融合蛋白。他们的方法是把此融合蛋白结合到几丁质结合肽，通过几丁质柱子进行纯化，然后再由二硫苏糖醇进行自身切割，生产Tα1-TP5融合蛋白（Li J,Zheng L,Li P,Wang F.2012.Intein-mediated expression,purification,and characterization of thymosin α1-thymopentin fusionpeptide in Escherichia coli.Protein Expr Purif.84(1):1-8）。

虽然已有把人胸腺肽β4或者α1融合到整个人白蛋白分子的报道,但无论是酵母，细菌，还是其他表达系统中,还未见通过融合氨基端部分人血清白蛋白生产胸腺肽β4和α1的报道。我们的方法是通过将胸腺肽β4，α1或其他多肽与氨基端部分白蛋白融合,并在酵母中高表达,通过简单的酶切工艺,可纯化获得大量廉价的胸腺肽。因此利用基因工程技术进行此类药物的研究与生产具有非常重要的意义。

发明内容

针对现有技术不足,本发明的目的是提供一种可用于制备人胸腺肽的重组人血清白蛋白-人胸腺肽融合蛋白及编码该融合蛋白的融合基因，以及一种可以大规模,低成本生产人胸腺肽的方法。

本发明的一个目的是提供一种可用于制备人胸腺肽的重组人血清白蛋白-人胸腺肽融合蛋白及编码该融合蛋白的融合基因。所述融合基因具有形如A-X-C结构的基因序列,其中A部分为编码人血清白蛋白N-端1-150～1-372位氨基酸的核苷酸序列，X为编码包含肠激酶或烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切位点的连接肽的核苷酸序列，C为人胸腺肽基因。

所述融合基因中，A部分截取人血清白蛋白N-端部分氨基酸序列为融合蛋白的一部分，考虑到表达的效率和产量，截取人血清白蛋白N-端的1-150～1-372位氨基酸序列是比较合适的，更优选截取人血清白蛋白N-端的1-181～1-300位氨基酸序列，最优选的是截取人血清白蛋白N-端结构域I以及之后连接肽的1-186氨基酸序列为融合蛋白的一部分。

所述融合基因中，C部分的人胸腺肽基因可为人胸腺肽α、β或γ型基因，优选人胸腺肽β4基因或人胸腺肽α1基因。

所述融合基因可通过载体连接转化宿主菌表达得到重组人血清白蛋白-人胸腺肽融合蛋白。本发明构建的融合基因，优选具有如SEQ ID No.15所示的核苷酸序列，其中人胸腺肽密码子经过毕赤酵母偏爱性优化，其编码人白蛋白-胸腺肽β4融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.16所示；或者具有如SEQ ID No.17所示的核苷酸序列，其编码人白蛋白-胸腺肽α1融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。

本发明的另一目的提供一种可以大规模,低成本生产人胸腺肽的方法，所述方法包括如下的步骤：

（1）、在保持各自基因密码子阅读框架不变的前提下，在编码人血清白蛋白部分基因序列和人胸腺肽基因的两侧引入限制性内切酶识别位点，然后通过酶切操作形成具有如下结构的融合基因序列：A-X-C,其中A部分为编码人血清白蛋白N-端1-150～1-372位氨基酸的核苷酸序列，X为编码包含肠激酶或烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切位点的连接肽的核苷酸序列，C为人胸腺肽基因；

（2）、将上述的A-X-C融合基因序列连接到表达载体，将表达载体转化导入酵母菌中，经筛选得到重组基因工程菌；

（3）、高密度发酵重组酵母菌，经诱导表达获得可溶性的人血清白蛋白-胸腺肽融合蛋白，加入肠激酶或烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切，经分离纯化获得重组人胸腺肽。

本发明所述的方法适合用于表达各种类型的人胸腺肽，所述C部分的人胸腺肽基因可为人胸腺肽α、β或γ型基因，优选人胸腺肽β4基因或人胸腺肽α1基因。

成熟人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)是由585个氨基酸残基组成的蛋白质（序列表中SEQ ID No.2）,分子量约为66.5kDa。因人血清白蛋白在体内外非常稳定,没有酶学和免疫学活性,因而是一种理想的生物活性蛋白载体。本发明截取人血清白蛋白N-端部分氨基酸序列为融合蛋白的一部分，考虑到表达的效率和产量，截取人血清白蛋白N-端的1-150～1-372位氨基酸序列是比较合适的，更优选截取人血清白蛋白N-端的1-181～1-300位氨基酸序列，最优选的是截取人血清白蛋白N-端结构域I以及之后连接肽的1-186氨基酸序列为融合蛋白的一部分。

人血清白蛋白部分基因和人胸腺肽基因序列可以通过PCR方法克隆，也可通过化学合成。编码人血清白蛋白部分基因序列的多核苷酸和编码人胸腺肽基因的融合，在保持各自阅读框架不变的前提下，可以用本领域周知的各种方法，如通过PCR的方法，在编码序列的两侧引入限制性内切酶识别位点，通过酶切产生粘性末端，然后通过DNA连接酶连接，从而获得编码融合蛋白的基因。如果需要可在本发明的编码融合蛋白基因的两侧引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有限制性内切酶识别位点。

构建人血清白蛋白部分基因序列时，可按照GenBank人血清白蛋白基因序列设计引物,在基因序列两端引入限制性酶切位点，优选分别引入XhoI和PstI的酶切位点和保护碱基。引物委托上海生工生物公司合成。纯化后的PCR产物待酶切备用。

在构建人胸腺肽基因时，可在基因的5’端先引入蛋白酶切位点，然后在基因两侧引入限制性酶切位点。上述基因结构可通过人工合成，也可通过PCR方法构建。优选的可构建如B-X-C-D结构的基因序列,其中B和D为限制性酶切位点，X为编码包含肠激酶(EK)或烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切位点的连接肽的核苷酸序列，C为人胸腺肽基因。B/D可优选为PstI/XbaI酶切位点。

通过酶切连接可以将上述的两个基因拼接为融合基因，连接白蛋白和胸腺肽β4基因的是限制性内切酶PstI位点序列(产生的氨基酸L-Q)。因而，一个优选的实施例中，融合基因中A部分为编码白蛋白结构域I及之后5个氨基酸连接肽的共186个氨基酸的基因序列，X部分为编码LQDDDDK氨基酸序列的多核苷酸，C部分为胸腺肽β4基因。另一个优选的实施例中，融合基因中A部分为编码白蛋白结构域I及之后连接肽的186个氨基酸序列的基因序列，X部分为编码LQENLYFQ氨基酸序列的多核苷酸，C部分为人胸腺肽α1基因。

本发明构建的融合基因，优选具有如SEQ ID No.15所示的核苷酸序列，其中人胸腺肽密码子经过毕赤酵母偏爱性优化，其编码人白蛋白-胸腺肽β4融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.16所示；或者具有如SEQ ID No.17所示的核苷酸序列，其编码人白蛋白-胸腺肽α1融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.18所示。

一个优选的实施例中，在构建表达人胸腺肽β4的基因工程菌时，可根据全球公共序列数据库GenBank中记载序列号为NM_000477的成熟人血清白蛋白基因(序列表中SEQ ID No.1)，设计2个引物，经PCR方法从人cDNA文库扩增获得具有186个氨基酸序列的部分人血清白蛋白基因。人胸腺肽β4基因全长根据GenBank序列号NP_066932记载为编码44个氨基酸残基，但成熟的人胸腺肽β4由于第一个蛋氨酸已经去掉，因此只有43个氨基酸残基（Uniprot:P62328）。成熟人胸腺肽β4 DNA片段通过化学方法合成(序列表中SEQ ID No.5)。连接白蛋白和胸腺肽β4基因的限制性内切酶PstI和经密码子优化的肠激酶切位点（序列表中SEQ IDNo.3）在化学合成时与人胸腺肽β4基因融合在一起合成(序列表中SEQ ID No.7)。两个DNA片段(1.部分白蛋白基因;2.PstI-肠激酶切位点-人胸腺肽β4基因)通过限制性内切酶酶切,将两者克隆至酵母表达质粒中。其整个融合基因包含186氨基酸残基的人血清白蛋白基因,限制性内切酶PstI,肠激酶酶切位点,人胸腺肽β4基因和终止的碱基序列。将融合基因克隆至表达载体pPICZα,序列正确表达载体转化宿主菌野生型毕赤酵母X33,通过博莱霉素筛选而得到基因工程菌。

在一个优选的实施例中，在构建表达人胸腺肽α1的基因工程菌时，可根据全球公共序列数据库GenBank中记载序列号为NM_000477的成熟人血清白蛋白基因(序列表中SEQ ID No.1)，设计2个引物，经PCR方法从人cDNA文库扩增获得具有186个氨基酸序列的部分人血清白蛋白基因。人胸腺肽α1基因根据GenBank中序列号NM_001099285.1记载全长为111个氨基酸残基，但其成熟，具有功能的为28个氨基酸残基(序列表中SEQ ID No.11)。该人胸腺肽α1基因片段通过化学方法合成获得。连接白蛋白和胸腺肽α1基因的限制性内切酶PstI和经密码子优化的烟草蚀纹病毒(Tev)蛋白酶切位点（序列表中SEQ ID No.9），在化学合成时与经密码子优化的人胸腺肽α1基因融合在一起合成(序列表中SEQ ID No.13)。两个DNA片段(1.部分白蛋白基因;2.PstI-Tev蛋白酶切位点-人胸腺肽α1基因)通过限制性内切酶酶切,将两者克隆至酵母表达质粒中。其整个融合基因包含186氨基酸残基的人血清白蛋白基因,限制性内切酶PstI,Tev蛋白酶切位点,人胸腺肽α1基因和终止的碱基序列。将融合基因克隆至表达载体pPICZ-α-A,序列正确表达载体转化宿主菌野生型毕赤酵母X33,通过博莱霉素筛选而得到基因工程菌。

构建好融合基因后，可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。许多表达载体和其对应的宿主可以从公司购得，如酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D₂，pPIC9，pHIL-S₁（Invitrogen Corp.San Diego.California.USA），动物细胞表达载体pSVK3、pMSG（Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA）等。优选的方法是将编码本发明中的融合蛋白或多肽的核酸克隆至酵母表达载体pPICZ-α-A，该质粒为酵母整合型质粒，带有醇氧化酶操纵子（AOX1）5’序列和3’序列，用于方便编码基因整合至酵母染色体，和控制编码基因的表达。这些质粒及对应的宿主菌等可以从Invitrogen Corp.San Diego.California.USA构得，优选的启动子为AOX1。

载体可经转化或转染至原核生物或真核生物宿主。转化所需核酸至宿主细胞中去可用通常的方法，如：电穿孔，制备感受态的原生质球等。成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞，可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鉴定。或者，细胞培养上清中或细胞破碎液中的蛋白可用抗HSA或抗人胸腺肽的抗体检测。

表达融合蛋白的宿主可以是酵母、哺乳动物细胞、细菌、动物、植物等，优选为酵母菌，如酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌属酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母、孢圆母属酵母或裂殖酵母等，更优选为毕赤酵母。融合蛋白或多肽可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的，是从宿主中分泌出来。分泌所用的信号肽，优选的是天然的人血清白蛋白的信号肽，或酵母MFα信号肽，或这两种信号肽的类似物。更优选的用酵母MFα信号肽，用该信号肽时融合蛋白表达水平较高。融合蛋白或多肽也可以不用信号肽，而在酵母中以胞内可溶形式表达。编码融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。

可以通过培养含有本发明DNA构建体的宿主，如重组酵母、重组哺乳动物细胞、重组细菌、转基因动植物等，生产本发明的融合蛋白。具体的培养方法，可以用摇瓶或生物反应器等，生产时优选的为生物反应器。培养基应能提供菌体（或细胞）生长和产物表达所需的物质，应包含氮源、碳源、pH缓冲成分等，培养基配方一般应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可分两个阶段，第一阶段主要用于菌体（或细胞）的生长，第二阶段主要用于合成产物。

将构建完成的基因工程菌进行液体培养和发酵,通过甲醇诱导,表达大量细胞外的可溶性人白蛋白-胸腺肽β4或者人白蛋白-胸腺肽α1融合蛋白。发酵产生的白蛋白-胸腺肽β4融合蛋白经盐析,肠激酶酶解,层析纯化而获得重组人胸腺肽β4。发酵产生的白蛋白-胸腺肽α1融合蛋白经盐析,Tev蛋白酶酶解,层析纯化而获得重组人胸腺肽α1。可以用各种蛋白分离的方法分离纯化蛋白，如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。

分别利用人胸腺肽β4和人胸腺肽α1可以刺激小鼠脾细胞生长的原理，分别检测纯化得到的人胸腺肽β4和人胸腺肽α1，证明重组胸腺肽β4和α1具有生物活性。

本发明的经肠激酶切割纯化的胸腺肽β4纯品和经烟草蚀纹病毒Tev蛋白酶切割纯化的胸腺肽α1纯品可以作为注射制剂，应用于急性心肌梗死和增强免疫功能及其它各种适应症的治疗。本发明所述的胸腺肽生产方法具有可保证产品质量一致性，不受原料来源限制，且成本很低，表达量高，可以大规模生产等优点。例如人胸腺肽α1的融合蛋白产量1.51g/L,人胸腺肽α1纯品可达85mg/L;而人胸腺肽β4的融合蛋白产量1.63g/L,人胸腺肽α1纯品可达116mg/L，相比于现有技术的生产技术有很大的提高。

附图说明

图1A为pPICZα-HSA-Tβ4的构建过程;图1B为pPICZα-HSA-Tα1的构建过程;

图2为重组人胸腺肽β4表达蛋白凝胶电泳结果;图2中:BSA为1μg牛血清白蛋白;M为蛋白质分子量标准,单位为千道尔顿;1,2,3和4为工程菌株在未经甲醇诱导,诱导一天，两天和三天后的表达量。

图3为重组人胸腺肽β4纯化工艺流程图。

图4为重组人胸腺肽α1纯化工艺流程图。

具体实施方式

实施例1:重组人胸腺肽β4的生产

步骤一、氨基端部分人血清白蛋白质(N-HSA)基因的设计与生物合成

按照GenBank中序列号记载为NM_000477或者Uniprot序列号记载为P02768（SEQ ID No.1）的人血清白蛋白基因，设计2个引物,上下分别引入XhoI和PstI的酶切位点和保护碱基,此DNA片段含有XhoI,PstI酶切位点和编码氨基端人血清白蛋白186个氨基酸残基。

上游引物序列:5’-GATCAGTCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGC-3’;

下游引物序列:5’-GCAGTCACTGCAGCCGAAGTTCATCGAGCTTTGGC-3’；

引物委托上海生工生物公司合成。PCR的方法是:50μl体系中加入5μl 10×Pfu缓冲液(含MgSO4),40μl水,1μl(100ng/μl)

cDNA文库,上下游引物各1μl(5μmol/L),1μl dNTP(10mM each),1μl PfuDNA Polymerase。所有试剂均从上海生工订购。用Bio-Rad公司的PCR仪扩增DNA,PCR条件为94℃预变性2分钟,94℃变性30秒,56℃退火30秒,72℃延伸1分钟,循环35次。反应结束后，将4管反应产物合并成1管至1.5mM离心管中,用EZ-10Spin Column PCR Product Purification Kit试剂盒(上海生工生物公司)进行回收纯化。纯化后的PCR产物经过XhoI和PstI双酶切,再用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物公司)进行回收。

步骤二、人胸腺肽β4基因的设计与化学合成

按照GenBank序列号NP_066932记载或者Uniprot序列号P62328记载的人胸腺肽β4氨基酸序列,根据毕赤酵母密码子偏好性，设计SEQ ID No.5中的DNA序列;此外，设计内切酶PstI序列和肠激酶切位点的连接肽DNA和氨基酸序列如（SEQ ID No.3和SEQ ID No.4）。委托上海生工生物公司化学合成连接肽和人胸腺肽β4 DNA如SEQ ID No.7(SEQ ID No.3和No.5连接后的序列)。化学合成的SEQ ID No.7包括PstI DNA酶切位点,肠激酶切位点,人胸腺肽β4基因,终止碱基序列。DNA片段的两端引入PstI和XbaI的酶切位点并已经克隆至pUC57质粒上（上海生工生物公司）。转化大肠杆菌感受态的DH5α细胞,挑取阳性克隆,提取含有胸腺肽β4序列的pUC57质粒,在37℃用PstI和XbaI双酶切,凝胶回收此由化学合成的DNA片段。

步骤三、酵母表达载体pPICZ-α-A酶切、回收

在0.5ml离心管中加入2μg酵母表达载体pPICZ-α-A（Invitrogen公司）、3.0μl限制性内切酶XhoI、3.0μ1限制性内切酶XbaI、10μ1限制性内切酶缓冲液，加去离子水至100μl，混合均匀，将混合物放入37℃水浴锅中，反应5小时，取出备用。用DNA凝胶回收试剂盒对酶切后的酵母表达载体pPICZ-α-A进行回收纯化，将回收纯化后的酵切酵母表达载体pPICZ-α-A，存储于-20℃条件下，备用；

步骤四、氨基端部分人血清白蛋白质(N-HSA)基因，人胸腺肽β4基因和酵母表达载体pPICZ-α-A的连接

N-HSA-连接肽-胸腺肽β4融合蛋白的构建。为了使表达的融合蛋白能分泌到酵母胞外,选择pPICZ-α-A作为载体,在该载体克隆位点的XhoI和XbaI,插入融合蛋白的基因。将步骤一（XhoI/PstI双酶切）,步骤二（PstI/XbaI双酶切）得到的DNA片段产物与步骤三pPICZαA（XhoI/XbaI双酶切）质粒通过T4DNA联酶催化进行连接，其连接后的DNA和氨基酸序列如SEQ ID No.15和No.16所示。

连接体系的配制：在0.5ml离心管中加入0.1μg酶切酵母表达载体pPICZ-α-A、0.1μg酶切N-HSA DNA片段、0.1μg酶切人胸腺肽β4片段、1.0μ1 T4DNA连接酶缓冲液(10倍)、1.0μ1T4 DNA连接酶混合均匀，后将0.5ml离心管放在16℃条件下，放置12小时，形成混合物备用。连接产物转化至感受态的大肠杆菌DH5α。重组质粒的构建过程如图1A所示。

步骤五:毕赤酵母工程菌的构建和发酵

将步骤四筛选的重组质粒委托上海生工生物公司测序,测序正确的质粒经线性化后,电转入毕赤酵母X-33（Invitrogen公司）。经过100,500,1000μg/ml博莱霉素的筛选,SDS-PAGE凝胶电泳分析筛选出表达量最高的菌株。接种入5mlYPD培养基(酵母提取液10g/L,胰蛋白胨20g/L,葡萄糖10g/L)中,30℃,250转/分钟振荡培养24小时,按1%接菌量取0.5ml上述培养的菌液接入50ml/500ml三角烧瓶的BMGY培养基中(酵母提取液10g/L,胰蛋白胨20g/L,pH 6.0的0.1M磷酸钠缓冲液,1.34%YNB,4x10^-5%生物素,甘油10g/L),30℃,250转/分钟振荡培养30小时,离心上述均液,收集均体,一并转入50ml/500ml三角烧瓶的BMMY培养基中(酵母提取液10g/L,胰蛋白胨20g/L,pH 6.0的0.1M磷酸钠缓冲液,1.34%YNB,4x10^-5%生物素),加入0.5%甲醇,30℃,250转/分钟振荡培养,每24小时,补加0.5%甲醇一次,诱导表达直至5天。经离心收集上清,得发酵液。SDS-PAGE电泳分析显示工程菌所产的最高融合蛋白,约占总分泌蛋白的85%(图2)。白蛋白-胸腺肽β4经过诱导培养三天后在发酵液中的总量为1.63克/升。

步骤六:融合蛋白的纯化和酶切

收集发酵液,加入85%饱和度的硫酸铵,4℃,6小时后离心,沉淀。使用G-25脱盐,收集融合蛋白主峰,稀释溶解于含1mM CaCl₂的20mM磷酸缓冲液,加入肠激酶(融合蛋白摩尔数:肠激酶摩尔数=100:1)酶解。酶切后的胸腺肽β4经凝胶层析柱分离获得（图3）。纯化后的胸腺肽β4经SDS-PAGE电泳分析为均一条带,纯度超过92%。根据胸腺肽β4(43个氨基酸残基)在整个融合蛋白比例,胸腺肽β4的理论值是18.2%,我们获得的纯胸腺肽β4为116毫克/升发酵液(理论值为300毫克),得率为38.7%。

步骤七:重组胸腺肽β4的生物活性检测

从小鼠单个脾细胞悬液中分离淋巴细胞,用含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640调整细胞浓度,加入ConA使其终浓度为2.5mg/L,按每孔4x10⁵细胞加入96孔细胞培养板中,37℃孵箱培养6小时后,加入经酶切纯化的重组Tβ4,和Tβ4化学合成品(作对照),终浓度分别为1,5,10μM,继续培养72小时,MTT法测定淋巴细胞的增殖和分化。结果表明与对照比,重组胸腺肽β4的活性是93.6%,与化学合成的相似。

实施例2:重组人胸腺肽α1的生产

步骤一、氨基端部分人血清白蛋白质(N-HSA)基因的设计与生物合成

按照GenBank中序列号记载为NM_000477或者Uniprot序列号记载为P02768（SEQ ID No.1）的人血清白蛋白基因，设计2个引物,上下分别引入XhoI和PstI的酶切位点和保护碱基,此DNA片段含有XhoI,PstI酶切位点和编码氨基端人血清白蛋白186个氨基酸残基。

上游引物序列:5’-GATCAGTCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGC-3’;

下游引物序列:5’-GCAGTCACTGCAGCCGAAGTTCATCGAGCTTTGGC-3’；

引物委托上海生工生物公司合成。PCR的方法是:50μl体系中加入5μl 10×Pfu缓冲液(含MgSO4),40μl水,1μl(100ng/μl)cDNA文库,上下游引物各1μl(5μmol/L),1μl dNTP(10mM each),1μl Pfu DNA Polymerase。所有试剂均从上海生工订购。用Bio-Rad公司的PCR仪扩增DNA,PCR条件为94℃预变性2分钟,94℃变性30秒,56℃退火30秒,72℃延伸1分钟,循环35次。反应结束后，将4管反应产物合并成1管至1.5mM离心管中,用EZ-10 Spin Column PCRProduct Purification Kit试剂盒(上海生工生物公司)进行回收纯化。纯化后的PCR产物经过XhoI和PstI双酶切,再用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物公司)进行回收。

步骤二、人胸腺肽α1基因的设计与化学合成

人胸腺肽α1基因根据GenBank中记载序列号为NM_001099285.1，通过化学方法合成获得(序列表中SEQ ID No.11)。限制性内切酶PstI和经密码子优化的烟草蚀纹病毒(Tev)蛋白酶切位点（序列表中SEQ ID No.9），在化学合成时与人胸腺肽α1基因融合在一起合成(序列表中SEQ ID No.13)。两个DNA片段(1.N-HSA;2.PstI-Tev蛋白酶切位点-人胸腺肽α1基因)通过限制性内切酶酶切,将两者克隆至酵母表达质粒中。其整个融合基因包含186氨基酸残基的人血清白蛋白基因,限制性内切酶PstI,Tev蛋白酶切位点,人胸腺肽α1基因,终止密码子序列。

步骤三、酵母表达载体pPICZ-α-A酶切、回收

在0.5ml离心管中加入2μg酵母表达载体pPICZ-α-A（Invitrogen公司）、3.0μl限制性内切酶XhoI、3.0μ1限制性内切酶XbaI、10μ1限制性内切酶缓冲液，加去离子水至100μl，混合均匀，将混合物放入37℃水浴锅中，反应5小时，取出备用。用DNA凝胶回收试剂盒对酶切后的酵母表达载体pPICZ-α-A进行回收、纯化，将回收、纯化后的酵切酵母表达载体pPICZ-α-A，存储于-20℃条件下，备用；

步骤四、氨基端部分人血清白蛋白质(N-HSA)基因，人胸腺肽α1基因和酵母表达载体pPICZ-α-A的连接

氨基端部分人血清白蛋白-连接肽-胸腺肽α1融合蛋白的构建。为了使表达的融合蛋白能分泌到酵母胞外,选择pPICZ-α-A作为载体,在该载体的克隆位点XhoI和XbaI,插入融合蛋白的基因。将步骤一（XhoI/PstI双酶切）,步骤二（PstI/XbaI双酶切）得到的DNA片段产物与步骤三pPICZ-α-A（XhoI/XbaI双酶切）得到的质粒通过T4 DNA联酶催化连接(图1B）。其连接后的DNA和氨基酸序列如SEQ ID No.17和No.18所示。

连接体系的配制：在0.5ml离心管中加入0.1μg酶切酵母表达载体pPICZ-α-A、0.1μg酶切N-HSA基因、0.1μg酶切人胸腺肽α1基因、1.0μ1 T4 DNA连接酶缓冲液(10倍)、1.0μ1 T4 DNA连接酶混合均匀，后将0.5ml离心管放在16℃条件下，放置12小时，形成混合物备用。连接产物转化至感受态的大肠杆菌DH5α，筛选重组质粒。

步骤五:毕赤酵母工程菌的构建和发酵

将步骤四获得的重组质粒委托上海生工生物公司测序,测序正确的质粒经线性化后,电转入毕赤酵母X-33。经过100,500,1000μg/ml博莱霉素的筛选的筛选,SDS-PAGE凝胶电泳分析筛选出表达量最高的菌株。接种入5ml YPD培养基(酵母提取液10g/L,胰蛋白胨20g/L,葡萄糖10g/L)中,30℃,250转/分钟振荡培养24小时,按1%接菌量取0.5ml上述培养的菌液接入50ml/500ml三角烧瓶的BMGY培养基中(酵母提取液10g/L,胰蛋白胨20g/L,pH 6.0的0.1M磷酸钠缓冲液,1.34%YNB,4x10^-5%生物素,甘油10g/L),30℃,250转/分钟振荡培养30小时,离心上述均液,收集均体,一并转入50ml/500ml三角烧瓶的BMMY培养基中(酵母提取液10g/L,胰蛋白胨20g/L,pH 6.0的0.1M磷酸钠缓冲液,1.34%YNB,4x10^-5%生物素),加入0.5%甲醇,30℃,250转/分钟振荡培养,每24小时,补加0.5%甲醇一次,诱导表达直至5天。经离心收集上清,得发酵液。SDS-PAGE电泳分析显示工程菌株产生最高融合蛋白,约占总分泌蛋白的80%。白蛋白-人胸腺肽α1经过诱导培养三天后在发酵液中的总量为1.51克/升。

步骤六:融合蛋白的纯化和酶切

收集发酵液,加入85%饱和度的硫酸铵,4℃,6小时后离心,沉淀。使用G-25脱盐,收集融合蛋白主峰,稀释溶解于1倍Tev蛋白酶的缓冲液（50mM Tris-HCl，pH8.0,0.5mM EDTA,1mM DTT）。将Tev蛋白酶加入至融合蛋白(200ug融合蛋白:100U Tev蛋白酶)，体积为1.5ml,30°C，3小时酶解。酶切后的人胸腺肽α1经高效液相色谱层析柱分离获得（图4）。根据人胸腺肽α1(28氨基酸残基)在整个融合蛋白比例,人胸腺肽α1的理论值是12.6%,我们获得的纯胸腺肽人胸腺肽α1为85毫克/升发酵液(理论值为190毫克),得率为44.7%。

步骤七:重组人胸腺肽α1生物活性检测

活性测试主要按照小鼠脾脏细胞增殖实验[苗红，郭葆玉，张冉，张莉。2003.重组胸腺肽的表达，纯化和生物学活性。中国生物化学与分子生物学报。19（5）:636-639]。取小鼠脾脏，用无菌注射器芯将脾脏挤压过200目的钢丝网，得到单个细胞。用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液配成5x10⁶个细胞/ml，将细胞悬液以200ul/孔铺96孔扳，加入ConA使其终浓度为2.5mg/L,加入经酶切纯化的重组胸腺肽α1,化学合成品(阳性对照),终浓度分别为0.1,1.0μM,继续培养72小时,MTT法测定淋巴细胞的增殖和分化。复3孔，37°C，5%CO2温箱中培养72小时，MTT法测定。与对照（无胸腺肽）相比，重组胸腺肽α1在0.1和1.0μ浓度对小鼠脾细胞具有显著促进生长作用（p<0.01)，其活性与化学合成的相似。

Claims (10)

1.一种编码人血清白蛋白-人胸腺肽融合蛋白的融合基因，所述融合基因具有形如A-X-C结构的基因序列,其中A部分为编码成熟人血清白蛋白N-端1-150～1-372位氨基酸的核苷酸序列，X为编码包含肠激酶或烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切位点的连接肽的核苷酸序列，C为人胸腺肽基因。

2.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于：所述融合基因中，A部分为编码成熟人血清白蛋白N-端1-150～1-372位氨基酸的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于：所述融合基因具有如SEQ IDNo.15或SEQ ID No.17所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1-3任一项权利要求所述的融合基因编码的人血清白蛋白-人胸腺肽融合蛋白。

5.根据权利要求4所述的人血清白蛋白-人胸腺肽融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有如SEQ ID No.16或SEQ ID No.18所示的氨基酸序列。

6.携带有如权利要求1-5任一项所述基因序列的载体。

7.一种生产人胸腺肽的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）、在保持各自基因密码子阅读框架不变的前提下，在编码人血清白蛋白部分基因序列和人胸腺肽基因的两侧引入限制性内切酶识别位点，然后通过酶切操作形成具有如下结构的融合基因序列：A-X-C,其中A部分为编码成熟人血清白蛋白N-端1-150～1-372位氨基酸的核苷酸序列，X为编码包含肠激酶或烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切位点的连接肽的核苷酸序列，C为人胸腺肽基因；

（2）、将上述的A-X-C融合基因序列连接到表达载体，将表达载体转化导入酵母菌中，经筛选得到重组基因工程菌；

（3）、高密度发酵重组酵母菌，经诱导表达获得可溶性的人血清白蛋白-胸腺肽融合蛋白，加入肠激酶或烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切，经分离纯化获得重组人胸腺肽。

8.根据权利要求7述的方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，融合基因C部分的人胸腺肽基因为人胸腺肽α、β或γ型基因。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中，在人胸腺肽基因两侧引入限制性酶切位点，构建如B-X-C-D结构的基因序列,其中B和D为限制性酶切位点，X为编码包含肠激酶(EK)或烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切位点的连接肽的核苷酸序列，C为人胸腺肽基因。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法步骤（2）中，所述的载体选自酵母表达载体pPICZ-α-A、pHIL-D₂、pPIC9或pHIL-S₁，动物细胞表达载体pSVK3或pMSG。

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