CN1427012A - 一种重组人胸腺肽β4Y及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组人胸腺肽β4Y(以下简称人Tβ4Y)，其的制备方法，特别是用原核宿主细胞制备重组人胸腺肽β4Y的制备方法，以及该重组人胸腺肽β4Y的用途。所制备的重组的胸腺肽β4Y活性多肽具有促进血管生成和促进人血管内皮细胞迁移的功能，是可用于制备促进创伤愈合的药物组合物类药物。

Description

一种重组人胸腺肽β4Y及其制备方法和用途

本发明涉及一种重组人胸腺肽β4Y(以下简称人Tβ4Y)，其的制备方法，特别是用原核宿主细胞制备重组人胸腺肽β4Y的制备方法，以及该重组人胸腺肽β4Y的用途。由本发明方法所制备的重组人胸腺肽β4Y具有促进血管生成和促进人血管内皮细胞迁移的功能，是可用于制备高效促进创伤愈合的药物组合物类药物。

创伤愈合是健康保障中的一个重要问题。在创伤修复过程中一个核心问题是损伤组织的血管再生。一般说来，创伤发生的同时，体内的修复机制随即启动。创伤修复的基本步骤是微血管形成，即在已有的血管基础上形成新的微血管。这个过程必须有足够的营养和氧的支持，以保证参与修复的细胞能在短时间内，除去坏死的细胞，形成新的肉芽。然而，微血管的形成只是体内对创伤的即时反应，是一个创伤愈合的过渡状态。一般的创伤条件下，血管可在创伤后两天内形成，然后，随着伤口的愈合，血管会逐渐地萎缩消失。但是，就创伤修复的分子机制而言，人体内究竟是哪些因子参与了对血管再生和血管退化的启动和调节我们还知之甚少。目前，已知若干促血管再生的生长因子，诸如血小板起源生长因子(PDGF)、血管上皮生长因子(VEGF)、角化细胞生长因子(KGF)，纤维源生长因子(FGF)，内皮细胞生长因子(EGF)和胸腺肽等等，都可以在伤口渗液中检测得到。尽管，它们参与修复的机理还待进一步研究，但是其在伤口愈合中起的生理作用却是被许多实验所证实。

胸腺肽(Thymosin)是一种在高等真核生物中非常普遍存在的多肽物质，可根据等电点(pI)划分为三类：胸腺肽α(pI低于PH5.0)，胸腺肽β(pI介于PH5.0-7.0)，胸腺肽γ(pI高于PH7.0)(Low等，生物化学杂志(J.Biol.Chem)，254：981，1979)。

Tβ是一组分子量约为5kDa的极端保守的极性多肽，目前已知的家族成员有15种，由40-44个氨基酸组成。Tβ广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物之中(Nachmias，细胞生物学(Cell.Biol)，5：56，1993)。在大多数哺乳动物组织中，Tβ4是Tβ的主要存在形式。其在组织和细胞中分布极广而且浓度很高，占Tβ总含量的70-80％。

对Tβ的研究主要集中在Tβ4上。Tβ4在细胞内是主要的肌动蛋白调节肽，它以1∶1的比例与肌动蛋白单体结合，阻止纤维状肌动蛋白聚合体的形成，因此，可作为一个肌动蛋白单体的调节器。Tβ4在G-actin和F-actin两种形式的转化中也具有调节作用。(Safer等，生物短评(Bioessays)16：473，1994)

Tβ4具有多种生理功能：1)诱导金属蛋白酶；2)促进血管发生；3)抑制炎症；4)抑制骨髓瘤细胞增生；5)影响T淋巴细胞分化；6)影响下丘脑和垂体；7)刺激人体血管内皮细胞迁移(Huff等，细胞生物学生物化学杂志(J.Biochem.Cell.Biol)33：205，2001)。Tβ4在血小板中浓度高达200-500uM，在创伤组织液中浓度高达13ug/ml。虽然目前尚不清楚其分子机制(Safer等，美国国家科学院院报(PNAS.USA)，87：2536，1990)，实验证明Tβ4能促进创伤愈合，是与其促血管发生和刺激人体血管内皮细胞迁移有关。

一般认为人体内有三种Tβ：Tβ4，Tβ10，和Tβ15。然而，1997年Lahn和Page在进行人类Y染色体基因组研究时，首次发现了另外一种Tβ基因(科学，Science，278：675，1997)。这个称为Tβ4Y的基因具有与其他Tβ不同的两个特征，1)Tβ4Y是一个伴性基因，仅位于Y染色体上，而其他的Tβ则不是。例如，Tβ4就在七个染色体上有其位置。2)在氨基酸组成上，Tβ4Y与Tβ4有较高的同源性(90％)，与Tβ10和Tβ15的同源性较差(70％)。但是，在等电点上，Tβ4Y与Tβ10和Tβ15相当接近(～5.3)，与Tβ4(5.0)相去较远。对于Tβ4Y的研究还在非常初级阶段。迄今，尚未见任何从人体内提纯Tβ4Y或用抗体法鉴定Tβ4Y的报道。除了我们实验室之外，也未见其他同行从事它的体外表达和生理功用的研究。

由于人源Tβ4来源的局限性，更限于小分子量的多肽纯化，在技术上要求较高，且纯度和回收率不佳。目前Tβ4主要以从其它动物组织中提取的Tβ4为人源Tβ4的替代品，或者人工合成该功能肽。本发明的目的是在原核及真核表达系统中，将人Tβ4Y以融合蛋白或非融合蛋白的形式克隆与表达，并以融合蛋白中的Tag部分作为特异纯化的标记，对融合蛋白加以分离纯化。对其促进创伤愈合的活性进行鉴定。

目前，市场上医用Tβ4的来源主要是组织提取和人工合成的产物，尚未有基因工程重组形式的产品。至今为止，已有21篇美国专利与“胸腺肽”和“创伤愈合”有关，其中只有一篇关于胸腺肽α1(thymosin alpha1)的专利(Malinda等。US6197751，03/6/2001)与组织修复、血管生成和细胞移动有关。在加拿大有一份胸腺肽的专利(Goldstein等，申请号：CA 2338928，07/29/1999)，该专利涉及到了Tβ4，Tβ10，和Tβ15的保护，但与Tβ4Y无关。

本发明人从人类基因组的BAC库中克隆得到人Tβ4Y基因，并将其以GST或(His)6融合蛋白的形式在原核宿主中表达出来。我们首次对Tβ4Y的体外和体内的生理功能进行了测定。实验表明，1)重组的Tβ4Y具备一般Tβ4的生物活性，对创伤修复有显著的促进作用；2)重组的Tβ4Y带有GST或His标记，因此极大地简化了蛋白质纯化的工艺，而且，重组蛋白质的纯度比天然物提取的产物要高；3)重组的Tβ4Y可在原核细胞中高度表达，极大地降低其生产成本。序列图说明：SEQ ID No.1  人Tβ4Y的核苷酸序列SEQ ID No.2  人Tβ4Y的氨基酸序列

附图说明：图1：重组GST融合蛋白表达体系质粒构建流程图图中以pBGIGST-Tβ4Y表达体系构建为例，其余表达载体构建过程与此类似。图2：本发明采用的表达载体pBGIGST的图谱其相关基因信息为：

tac启动子：-10区：205-211；-35区：183-188；

lac操纵子：217-237；

GST RBS：244；

GST起始密码子(ATG)：258；终止密码子(TGA)：974

凝血酶识别位点编码区：918-935

多克隆位点(MCS)：930-967

β-内酰氨酶编码基因启动子：-10区：1331-1336；-35区：

1308-1313；起始密码子(ATG)：1378；终止密码子(TAA)：2236

质粒复制起始必须序列：2996；复制必须序列：2303-2999；

通用测序引物：GEX5′结合位点：869-891；GEX3′结合位点：1042-

1020。图3：本发明采用的表达载体pBGIHIS的图谱

相关基因信息为：T7启动子370-386T7转录起始位点369His·Tag编码序列270-287T7·Tag编码序列207-239Mcs(BamHI-XhoI)158-203His·Tag编码序列140-157T7终止子26-72pBR322复制起点2255rKan编码序列2964-3776f1复制起点3872-4327图4：用pBGIGST构建的含有人Tβ4Y编码基因的重组表达质粒

pBGIGST-T beta 4Y的图谱。图5：用pBGIHIS构建的含有人Tβ4Y编码基因的重组表达质粒

pBGIHIS-T beta 4Y的图谱。

发明详述：

本发明的第一个方面包括了一种重组胸腺肽β4Y(Tβ4Y)活性多肽，其由包含SEQ.ID No.1所示的人胸腺肽β4Y活性多肽的核苷酸序列或其取代、插入、缺失突变序列的多核苷酸编码编码，只要编码的多肽仍具有胸腺肽β4Y活性或对人体无免疫原性。在本发明的一个实施方案中，所述的重组胸腺肽β4Y(Tβ4Y)活性多肽，其具有SEQ.ID No.2所示的氨基酸序列。

本发明又一方面包括一种制备本发明所述的重组胸腺肽β4Y(Tβ4Y)活性多肽的方法，其包括(1)用含有SEQ.ID No.1所示的人胸腺肽β4Y活性多肽的核苷酸序列或其取代、插入、缺失突变序列的基因转化大肠杆菌，只要编码的多肽仍具有胸腺肽β4Y活性或对人体无免疫原性；(2)从经培养的重组大肠杆菌细胞和/或培养液中提纯重组胸腺肽β4Y活性多肽。在本发明的一个实施方案中，本发明的重组胸腺肽β4Y活性多肽制备方法中所述重组胸腺肽β4Y活性多肽为融合蛋白。本发明又一个实施方案中，本发明的重组胸腺肽β4Y活性多肽制备方法中所述重组胸腺肽β4Y活性多肽为非融合蛋白。

由本发明所制备的重组的胸腺肽β4Y活性多肽具有促进血管生成和促进人血管内皮细胞迁移的功能，是可用于制备促进创伤愈合的药物组合物类药物。

此处所用术语“活性”是指由促进人血管内皮细胞迁移和促进血管生成作用而引起的促进创伤愈合的活性。

为实现本发明所述的诱导表达，所选表达系统一般包括带有适当的严紧诱导型启动子的表达载体，可有效诱导所述启动子的诱导物，以及与所选表达载体及诱导物相适应的适当表达宿主。可用于本发明的表达载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，例如，细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA结合的载体、病毒DNA。不过，只要能在宿主中复制和存活，其它载体也可以利用。表达载体中的DNA序列被有效地与一个合适的表达控制序列(启动子)连在一起，从而指导mRNA的合成。本领域周知，可用多种适当的方法，例如温度转变、化学药品诱导、噬菌体诱导等方法诱导所选诱导型启动子，本发明可用的诱导型启动子包括但不限于：大肠杆菌的lac、trp或tac启动子、噬菌体的P_L启动子、T5、T7启动子以及已知控制原核细胞中基因表达的其它启动子。表达载体也包含翻译起始所需要的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可以具有增强表达的合适序列。此外，为了便于筛选得到的重组表达载体，所用载体优选包含能提供表型特征的一个或多个选择标记基因，以便于转化宿主细胞的筛选，例如大肠杆菌可用四环素、氨苄青霉素、氯霉素、新霉素或卡那霉素抗性。

本发明的所述载体上还应当含有适当的限制性酶切位点，以利于目的蛋白质编码序列的插入和切除。在本发明的一个实施方案中，优选的使用带有Tac或T7-RNA聚合酶启动子的表达载体，例如本发明构建的含Tac或T7启动子的重组表达质粒pBGIGST(如图1所示)或pBGIHIS(如图2所示)。一旦将人的Tβ4Y基因插入到可受Tac或T7启动子调节的位置中，只有当体系中含有IPTG时，受所述启动子调节的目的基因才能被转录并在所选宿主中表达。

本发明所述的Tβ4Y可以是任何来源的，包括但不限于人、小鼠、大鼠、牛、猪等。在本发明的一个实施方案中，优选使用一种人Tβ4Y。

为了获得Tβ4Y，可以通过本领域技术人员周知的PCR扩增技术和重组DNA技术。依据Tβ4Y编码序列设计相应的PCR引物，分别从人的基因组中扩增上述人Tβ4Y。将所得PCR产物通过本领域技术人员周知的方法导入合适的表达载体，构建重组DNA构建体。用所得DNA构建体转化合适的宿主细胞，在适于目标蛋白质表达的条件下培养如此转化的宿主细胞，并通过本领域周知的技术回收并纯化目标蛋白质。

合适的DNA序列可以通过许多方法插到载体中。通常，DNA序列用本领域中已知的方法插入到合适的限制性内切酶位点上。这些方法相信处于本领域技术人员的知识范围内。

包含上述合适的DNA序列、合适的启动子或控制序列的载体可以用于转化合适的宿主，让宿主表达该蛋白。

将构建体导入宿主细胞的方法有：氯化钙转化、氯化镁转化、电穿孔或基因枪方法、TSS转化法、原生质体转化法、醋酸锂转化法等。

通常，重组表达载体包含复制起点和用于转化宿主细胞的选择标记，例如大肠杆菌的卡那霉素抗性基因和啤酒酵母TRP1基因，还包含来自高效表达基因的启动子，从而介导下游结构序列的转录。异源的结构序列以适当的方位与翻译起始和终止序列以及其它优选的序列装配在一起。可选择的情况是，DNA序列可以编码一个融合蛋白，该蛋白含有一个N末端或C末端的确认肽，表现出预期的特征，例如所表达的重组产物的稳定化和简化提纯步骤。所融合的肽或蛋白可以是谷胱甘肽转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白MBP、金黄色葡萄球菌蛋白A、硫氧还蛋白Trx A、氯霉素酰基转移酶CAT、β-半乳糖苷酶、Flag肽、Intein标签、多聚组氨酸标签、多聚精氨酸标签及其它多聚氨基酸标签等。由于GST和6×组氨酸标签使得目标蛋白质易于通过亲和层析纯化、不会改变蛋白质的结构及活性且标签不必除去等，本发明优选在Tβ4Y的N末端或C末端加入GST或6×组氨酸标签。细菌适用的有效表达载体可这样来构建：将编码目的蛋白的结构DNA序列随同适当的翻译起始和终止信号插入到带有功能启动子的可操纵的阅读框中。载体应包含一个或多个表型选择标记和复制起点，复制起点保证了载体在宿主中能保留下来，更理想的是能使载体得到扩增。适于转化的原核宿主有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各种细菌，其它的宿主也可以被选择。

在本发明的一个优选实施方案中，根据已知人Tβ4Y基因序列，设计合成上下游引物，用PCR法扩增，从人类基因组的BAC库中获得Tβ4Y基因序列，重组到表达质粒pBGIGST和pBGIHIS中，并转化大肠杆菌XL1-Blue和BL21，一定条件下经一段时间培养后，采用IPTG诱导表达出目的人Tβ4Y。

在本发明的一个实施方案中，根据待克隆基因序列、限制性酶切图谱、表达载体pBGIGST和pBGIHIS多克隆位点序列、以及Tβ4Y基因终止密码子下游200bp左右序列(由于Tβ4Y的基因仅132bp，较难进行克隆操作)设计引物，应用常规PCR克隆法从人基因组中得到人胸腺肽β4Y基因，与pGEM T-easy vector(Promega公司，美国)载体连接，得到重组的克隆载体。用上述引物对作常规菌落PCR鉴定得到阳性克隆。提取阳性克隆的重组质粒，通过NotI(3’)和BamHI(5’)双酶切，经凝胶电泳分离并回收含Tβ4Y的基因片断(得到353bp的核苷酸片段)，与Notl(3’)和BamHI(5’)双酶切的表达融合蛋白的载体相连接(质粒构建图见附图1)，电转化大肠杆菌表达宿主，得到经菌落PCR和测序鉴定的阳性重组克隆。

Tβ4Y的突变体的克隆分别采取单点突变和多点突变的方法进行。单点突变使用Stratagen公司的Quick Change ^TM Site-DirectedMutagenesis Kit(Stratagen，美国)，应用长片段PCR法，对克隆于表达载体中的野生型Tβ4Y进行单位点定点突变。通过人工化学合成方法，合成出互补引物对，该引物除了中心位置碱基改为目的碱基而与模板不配对外，其两侧各十个碱基与模板完全配对。按试剂盒说明，将模板、突变引物对、Pfu DNA聚合酶及其它试剂加入反应体系，进行长片段PCR反应。反应完成后，在反应体系中加入限制性内切酶DpnI消化模板DNA。取少量反应产物转化宿主菌XL10-Blue，涂布抗性平板后37℃温箱培养过夜，挑取克隆提取质粒，测序鉴定是否为单点突变体。多点突变采用全片段人工合成法，对克隆于表达载体中的野生型Tβ4Y进行多位点定点突变。考虑到人工合成长片段的正确率和产率，将Tβ4Y编码基因分成5个交叉互补的单链核苷酸分别进行人工合成，并在Tβ4Y编码基因的3’和5’端分别加上限制性位点。将合成好的五个单链DNA片段按1∶1∶1∶1∶1的摩尔比例加入反应体系，同时加入T4 PNK(多聚核苷酸末端磷酸激酶)、ATP等试剂，在37℃条件下水浴75分钟，反应完成后，以酚-氯仿-异戊醇抽提蛋白质，并用乙醇沉淀DNA，真空干燥。在沉淀中加入T4 DNA连接酶缓冲溶液等试剂，温度梯度下降的条件下对片段进行复性配对，用T4 DNA连接酶进行连接。反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳分离回收完整的连接片段。将回收的Tβ4Y基因片段以平末端连接方式插入质粒pUC18中，取少量反应产物转化宿主菌XL1-Blue，涂布Amp抗性LB平板后37℃温箱培养过夜，挑取白菌斑扩菌并提质粒。利用在Tβ4Y基因两端加上的限制性位点，用限制性内切酶对Tβ4Y基因进行切除，电泳回收Tβ4Y基因，并插入表达载体，转化相应的大肠杆菌表达宿主。

挑取通过测序鉴定的阳性克隆进行重组菌的培养。采用检测发酵液光密度值法检验宿主菌株的生长情况，确定诱导物的加入时间。加入诱导物的时间可以为重组宿主菌采用间歇培养法培养至O.D.₆₀₀为0.3以上时。本领域普通技术人员周知可通过流加培养、高密度培养等方法培养重组宿主菌，其加入诱导物时的培养液O.D.₆₀₀应相应增高。在本发明的一个实施方案中，当重组宿主菌在培养液中生长至O.D.600＝0.3-0.6时，加入IPTG，诱导Tβ4Y表达。

通常用离心或膜过滤的方法收获细胞，用于表达蛋白质的微生物细胞的破碎可以用任何便捷的方法，通常用物理、化学的或生物的方法破碎细胞，包括冻融循环、超声波破碎、机械破碎如高压匀浆、高速珠磨，或者使用化学渗透法、酶溶法，这些方法都是本领域的技术人员熟知的。再通过本领域技术人员周知的离心、过滤等方法除去细胞破碎液中的细胞碎片及其它杂质，得到破碎上清液。如重组菌培养液中含有Tβ4Y，则可将细胞破碎液与培养液合并得Tβ4Y粗提液，备下一步纯化。调整离子强度和pH值等溶液性质后，可用如下纯化方法：沉淀法如硫酸胺、乙醇、聚乙二醇沉淀法、亲和沉淀法；层析方法如离子交换层析、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、羟基磷灰石层析、反相层析、层析聚焦、亲和层析如Tβ4Y抗体层析法直接回收Tβ4Y。在本发明的一个优选实施方案中，对于用重组表达质粒pBGIGST-Tβ4表达所得的Tβ4Y粗提液，采用谷胱甘肽亲和层析纯化其中含有GST的Tβ4Y，采用竞争性洗脱方式如还原型谷胱甘肽洗脱，纯化Tβ4Y；对于用重组表达质粒pBGIHIS-Tβ4转化的Tβ4Y粗提液，采用金属螯和层析纯化所表达的含有(His)₆标签的Tβ4Y，采用竞争性洗脱方式如用咪唑洗脱，纯化Tβ4Y。还可以采用膜过滤法如微滤、超滤、亲和膜以及双水相萃取法、反胶束法等对Tβ4Y进行纯化。

融和蛋白对创伤愈合的生物活性的检测，可以从两个实验分析着手：A.促正常人血管内皮细胞HMVEC-d细胞迁移的活性鉴定。用改良的Boyden腔式细胞迁移法进行分析，分别采用空白对照，阴性对照，血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子对照组，Tα5，Tβ4(市售)对照组，并对Tα5、Tβ4、GST、待测样品作梯度稀释，检测其活性。在O.D.₆₀₀下检测迁移了的HMVEC-d细胞，检测到的细胞越多，表明在创伤愈合过程中样品促细胞迁移的活性越高。B.促血管生成的活性鉴定。同样采用空白对照，阴性对照，血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子对照组，Tα5，Tβ4(市售)对照组，并对Tα5、Tβ4、GST、待测样品作梯度稀释，检测其活性，通过聚焦显微镜观察新血管的生成情况。

本发明的又一方面，涉及一种含有利用本发明所述方法制备的Tβ4Y的药物组合物。所述药物组合物制剂任选地还包括保持Tβ4Y生物学活性所需的辅因子。本发明所述的药物组合物制剂任选地包括与保持Tβ4Y生物学活性相容的稳定剂。本发明所述的药物组合物制剂可以呈液体、固体、半固体、气雾剂或冷冻干燥品形式。在本发明的一个实施方案中，本发明所述的药物组合物可以为粉剂，糊剂，油剂，油膏剂，片剂，胶囊，气雾剂，胶体剂，霜膏剂，混悬剂，溶液剂。上述的生物制品也可以制备成用于治疗过程的固型材料的有效组成部分，如绷带等。

上述制剂中可含有药典认可的成分作为基质和载体，这些基质和载体包括无菌水，生理盐水，多聚烷烯醇类，如聚乙醇，植物油，萘或其类似物，甘氨胆酸盐，脂质体等。生物制品中还可以含有少量蛋白质稳定剂如人血白蛋白，单糖如葡萄糖，多糖，可以加入少量抗氧化剂。

本发明所述的药物组合物制剂中的Tβ4Y融合蛋白任选地还可经大分子修饰，经修饰后的Tβ4Y其活性保持不变，而稳定性得到提高、半衰期延长、抗原性被遮盖。用于修饰Tβ4Y的大分子可以是聚乙二醇、聚丙二醇等线性的或分枝聚醇类化合物，也可以是葡聚糖等多糖类化合物。

本发明另一方面涉及如本发明所述方法制备的重组Tβ4Y可用于下列临床治疗：

(1)由糖尿病引起的足、腿等肢端溃疡；

(2)  血管溃疡如静脉淤血性溃疡、动脉溃疡、静脉曲张型溃疡、

     先天性静脉缺失和引起的溃疡、白斑萎缩症导致的溃疡；

(3)  褥疮溃疡和皮肤损伤；

(4)  创伤极其所导致的溃疡，如外伤皮肤损伤、烧伤、化学损伤、

     外科手术后损伤、新生儿和早产儿的皮肤组织损伤；

(5)  冻伤，如冻疮皮肤损伤；

(6)  肿瘤导致的溃疡，如基底细胞癌、鳞状细胞癌、恶性黑色素

     细胞瘤引起的皮肤溃疡；

(7)  血液病引起的溃疡及其并发症；

(8)  皮肤病导致的溃疡及其并发症，如银屑病等；

(9)  由代谢疾病所导致的溃疡并发症；

(10) 皮肤缺血性溃疡；

(11) 血管炎导致的溃疡；

(12) 由病毒，细菌等感染所引起的溃疡；

(13) 手术所导致的皮肤、组织损伤和其所引起的溃疡。

本发明通过以下实施例和附图做进一步阐述：

                               实施例实施例1人Tβ4Y基因的克隆

根据人Tβ4Y基因序列、限制性酶切图谱、表达载体pBGIGST和pBGIHIS多克隆位点序列、以及Tβ4Y基因终止密码子下游200bp左右序列(由于Tβ4Y的基因仅132bp，较难进行克隆操作)设计引物(其中划线部分为引入的限制性酶切位点)：5’正向引物：5′CT GGATCCGACAAACCTGGTATGGCTGAGATCG 3′3’反向引物：5′T GCGGCCGCTATTTTCCTTCCCTGCCAGCCAGAC 3′(引物由北京奥科试剂公司合成)

应用常规PCR技术从人基因组BAC库中得到人胸腺肽β4Y基因。PCR的条件为：94℃变性2分钟，然后94℃变性20秒，52℃退火30秒，72℃延长10秒，进行35次循环，最后，72℃延长10分钟，4℃保存。反应完成后，做琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR反应，扩增出一条大小约为350bp特异性扩增条带。由于PCR产物浓度很高，可以不经过纯化直接做连接反应。将PCR产物与pGEM T-easy vector(Promega公司，美国)用T4连接酶直接连接。反应完成后，将连接产物电转化宿主菌XL1-Blue，涂布Amp⁺LB平板，37℃温箱过夜孵育。挑取10个单菌落，作常规菌落PCR鉴定，并同时以原始模板作为阳性对照，不加模板做阴性对照，电泳观察，结果显示所挑取的10个克隆均为阳性。实施例2 含有Tβ4Y编码基因的GST融合蛋白重组表达质粒的构建

挑取阳性克隆，扩增菌体量并提取质粒。先用限制性内切酶BamHI酶切质粒，反应条件为37℃温育4小时。反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳分离线性质粒和环形质粒，将线性DNA从琼脂糖凝胶中切出，利用DNA回收试剂盒(Qiagen公司，德国)从胶中回收DNA。再用限制性内切酶NotI酶解线性质粒，反应条件为37℃温育4小时。反应完成后，电泳分离质粒和Tβ4Y片断，将353bp片段从琼脂糖凝胶中切出，从胶中回收DNA(以上和后续酶切反应所用限制性内切酶BamHI和NotI及其相应buffer、BSA均购自Promega公司，美国)。

pBGIGST质粒由pGEX-4T(B)(A.Phamacia公司，英国)改造而来，应用限制性内切酶Xcml切去其lacI基因部分，以减小质粒分子量，有利于提高质粒与小片段DNA的连接效率，而阻遏蛋白LacI由表达宿主菌XL1-Blue过量表达提供。pBGIGST质粒图见附图2。从宿主菌中提取pBGIGST质粒，相继用限制性内切酶NotI和BamHI消化处理成线性质粒，使其两端分别带上BamHI和NoyI粘性末端。先用限制性内切酶NotI处理质粒，反应条件为37℃温育4小时。反应完成后，电泳分离线性质粒和环形质粒，将线性DNA从琼脂糖凝胶中切出，从胶中回收DNA。再用限制性内切酶BamHI处理线性质粒，反应完成后，电泳分离线性质粒(约4.4kb)和切出的载体小片段(约20bp)，将线性DNA从琼脂糖凝胶中切出回收载体。将带有粘性末段的Tβ4Y基因插入限制酶消化过的载体pBGIGST中，二者比例为3∶1，由于表达载体和外源片段两端分别带有不同的粘性末端，因此外源片段插入载体的方向是确定的。反应条件为15℃温育18小时(连接反应所用10^*连接buffer，T4连接酶均购自Promega公司，美国)。反应完成后，分别在两种反应液中加入无水乙醇沉淀并洗涤DNA以除去盐分，加入4ul双蒸去离子水重新溶解，电转化表达宿主XL1-Blue，分别涂布Amp⁺平板，37℃温箱孵育过夜，计算克隆数。从连接反应平板上挑取28个克隆，从自连对照平板上挑取2个克隆，用引物对作常规菌落PCR鉴定，同时做一个不加模板的阴性对照。电泳观察，结果显示得到了的阳性克隆。实施例3Tβ4Y突变体的构建

1.单点突变：使用Stratagen公司的Quick Change^TM Site-DirectedMutagenesis Kit，应用长片段PCR法，对克隆于表达载体中的野生型Tβ4Y进行单位点定点突变。

通过人工化学合成方法，合成出一对长度为21bp的互补引物对，该引物除了中心位置碱基改为目的碱基而与模板不配对外，其两侧各十个碱基与模板完全配对。以重组的Tβ4Y融和蛋白表达质粒为模板，按试剂盒说明，将模板、突变引物对、Pfu DNA聚合酶及其它试剂加入反应体系，进行长片段PCR反应，反应条件为：第一步95℃1分钟，第二步95℃ 50秒，第三步60℃ 50秒，第四步68℃ 12分钟，第五步为回到第二步17次，第六步68℃ 7分钟。反应完成后，在反应体系中加入限制性内切酶DpnI，将质粒模板消化成线性DNA，反应条件为37℃温育1小时。取少量反应产物转化宿主菌XL10-Blue，涂布抗性平板后37℃温箱培养过夜，挑取5个克隆，扩菌后提取质粒，测序鉴定后证实5个克隆均为单点突变体。

2.多点突变：采用全片段人工合成法，对克隆于表达载体中的野生型Tβ4Y进行多位点定点突变。

考虑到人工合成长片段的正确率和产率，将Tβ4Y编码基因分成5个交叉互补的单链核苷酸分别进行人工合成，并在Tβ4Y编码基因的3’和5’端分别加上限制性位点。将合成好的五个单链DNA片段按1∶1∶1∶1∶1的摩尔比例加入反应体系，同时加入T4 PNK(多聚核苷酸末端磷酸激酶)、ATP等试剂，在37℃条件下水浴75分钟，反应完成后，以酚-氯仿-异戊醇抽提蛋白质，并用乙醇沉淀DNA，真空干燥。在沉淀中加入T4 DNA连接酶缓冲溶液等试剂，按反应条件：90℃ 3分钟，85℃ 3分钟，75℃ 15分钟，65℃ 30分钟，55℃ 30分钟，45℃ 15分钟，37℃ 15分钟，24℃ 15分钟，4℃ 15分钟，对片段进行复性配对。反应完成后以乙醇沉淀和洗涤DNA，真空抽干。在沉淀中加入水、T4 DNA连接酶缓冲溶液和T4 DNA连接酶等试剂，按反应条件16℃，18小时对复性DNA进行连接。反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳分离回收完整的连接片段(约130bp)。

将回收的Tβ4Y基因片段以平末端的连接方式插入质粒pUC18中，反应条件为14℃温育18小时，取少量反应产物转化宿主菌XL1-Blue，涂布Amp抗性LB平板后37℃温箱培养过夜，挑取白菌斑扩菌并提质粒。利用在Tβ4Y基因两端加上的限制性位点，用限制性内切酶对Tβ4Y基因进行切除，电泳回收Tβ4Y基因，并插入表达载体，转化相应的大肠杆菌表达宿主。实施例4含有Tβ4Y编码基因的组氨酸标志融合蛋白重组表达质粒的构建

pBGIHIS为6^*His Tag融合蛋白表达载体，由pET-28a表达载体(Novagen公司，德国)改造而来。利用限制性内切酶SphI和HpaI切去原质粒中598-1629之间的片段，以减小质粒分子量，提高连接效率。从宿主菌中提取质粒，相继用限制性内切酶NotI和BamHI消化处理成线性质粒，使其两端分别带上BamHI和NotI粘性末端。先用限制性内切酶NotI处理质粒，反应条件为37℃温育4小时。反应完成后，电泳分离线性质粒和环形质粒，将线性DNA从琼脂糖凝胶中切出，从胶中回收DNA。再用限制性内切酶BamHI处理线性质粒，反应完成后，电泳分离线性质粒(约4.3kb)和切出的载体小片段(约30bp)，将线性DNA从琼脂糖凝胶中切出回收。将带有粘性末段的Tβ4Y基因插入限制酶消化过的载体pBGIHIS中，二者比例为3∶1，连接反应条件为15℃温育18小时。电转化表达宿主XL1-Blue，分别涂布Kan⁺LB平板，37℃温箱孵育过夜，计算克隆数。由于表达载体和外源片段两端分别带有不同的粘性末端，因此外源片段插入载体的方向是确定的。通过常规菌落PCR鉴定阳性克隆。电泳观察，结果显示得到了的阳性克隆。实施例5：Tβ4Y的诱导表达及初步纯化

挑取阳性克隆经小量培养后，接种于LB/Amp液体培养基中，分别在37℃摇床培养至O.D.₆₀₀为0.3-2.0，加入0.4-1.0mM IPTG诱导表达。28-37℃继续培养6小时。离心收集菌体，保留一部分菌体，其余用相对应的层析平衡缓冲液(重组Tβ4Y-GST融合蛋白用，详见实施例6)(重组Tβ4-组氨酸尾标签融合蛋白用金属螯合层析的Binding Buffer重悬菌体，详见实施例7)，200w间歇式超声破碎菌体100秒，离心分离上清和沉淀。与原预先保留的菌体一起作12％SDS-PAGE，电泳结束后考马斯亮蓝法对胶进行染色，结果显示，融合蛋白在超声上清组分中，证明为可溶性表达。收集破碎液上清备做纯化。实施例6：重组Tβ4Y-GST融合蛋白的纯化

加入15毫升预冷的PBS重悬菌体，超声彻底破碎菌体，离心收集上清。在上清中加入0.5mlGST亲和层析介质彻底混匀，离心弃上清，加入12mlPBS洗沉淀三次，弃上清。加入3ml洗脱液(内有10mM还原型谷胱甘肽)，混匀后上柱收集洗脱液(50mM Tris-HCl，pH8.0，10mMGSH)，透析(透析液成分：50mM磷酸钾，pH7.4，5mM DTT，1mMEDTA)过夜浓缩。取纯化前和纯化后的样品跑SDS-PAGE鉴定纯化效果，结果显示，通过此步亲和层析已可得到相当纯的目的蛋白。实施例7：重组Tβ4Y-组氨酸尾标签融合蛋白的纯化

采用金属鏊合层析方法，层析介质为瑞典安法码西亚生物技术公司的金属螯合层析(Chelating SepharoseTM Fast Flow)，层析设备为AKTAPurifier(Pharmacia Biotech AB，瑞典)。用3倍柱体积的无菌水预平衡填装好的层析柱，再用五倍柱体积的上样缓冲液(Charging Buffer，50mMNiSO4)平衡层析柱，然后用3倍柱体积的结合缓冲液(5mM咪唑、0.5MNaCl、20mM Tris-HCl，pH7.9)平衡层析柱。实施例6中步骤2得到的菌体超声破碎后离心的上清和调过离子强度和pH值的细胞培养上清液为上样样品，流速30cm/小时。上样后，用10倍柱体积的结合缓冲液淋洗，然后用6倍柱体积的洗涤缓冲液(20mM咪唑、0.5MNaCl、20mMTris-HCl，pH7.9)除去结合弱的杂蛋白。用6倍柱体积的洗脱缓冲液(0.5M咪唑、0.5MNaCl、20mM Tris-HCl，pH7.9)，收集洗脱峰，即得重组Tβ4-组氨酸尾标签融合蛋白。最后用6倍柱体积剥离缓冲液(Strip Buffer，10mM EDTA、0.5MNaCl、20mM Tris-HCl，pH7.9)脱去Ni²⁺，用20％乙醇平衡后4℃保存。当层析时流速明显减低或层析介质经填充Ni²⁺后却不再显蓝绿色时，柱子需再生。经金属鏊合层析纯化的Tβ4Y的纯度大于85％。回收率大于87％。通过进一步的凝胶过滤层析对Tβ4Y的进行精制。实施例8：重组Tβ4Y的精制

将凝胶过滤层析柱Supredex 75 HR 10/30(瑞典安法玛西亚生物技术公司)用制备药物组合物制剂所用的缓冲液充分进行平衡，将经金属螯合层析纯化的人DNase I按小于层析柱柱体积5％的上样，流速为30cm/小时，上样后继续用药物组合物制剂溶液洗脱，收集Tβ4Y活性峰。本步层析回收率大于95％。经金属鏊合层析或谷胱甘肽亲和层析以及凝胶过滤层析纯化的重组人Tβ4Y的纯度均大于95％。

取纯化前和纯化后的样品跑SDS-PAGE鉴定纯化效果，考马氏亮兰染色结果显示重组Tβ4Y在SDS-PAGE凝胶上为单条带。实施例9Tβ4Y的PEG修饰

溶解5克甲氧基聚乙二醇(mPEG)或在聚乙二醇(PEG)在25毫升无水二氧己环中。搅拌加入6mmol溶解于10ml无水丙酮中的N-琥珀酰亚胺氯甲酸酯或N，N-N-二琥珀酰亚胺碳酸酯。再加入6mmol溶解于无水丙酮中的4-二甲基氨基吡啶。继续搅拌反应2或6小时。过滤除沉淀，收集上清。加入二乙基乙酯，得到琥珀酰亚胺碳酸酯化的聚乙二醇(SC-PEG)。将经纯化的重组人Tβ4Y溶解于0.1M，pH7.5的磷酸盐缓冲液，浓度为1-10mg/ml。搅拌中加入SC-PEG，过夜反应，即得到PEG化的Tβ4Y。经凝胶过滤层析Superdex 75 HR选择具有一定修饰度的PEG-Tβ4Y。实施例10：Tβ4Y促血管生成和细胞迁移活性的检验方法(Yebra等，生物学化学杂志(J.Biol.Chem.)，271：29393，1996；Ott等，细胞生物学杂志(J Cell Biol.)，140：1241，1998；Malinda等，美国社会实验生物学协会杂志(FASEB J.)11：474，1997)

1.细胞迁移检验

检测用细胞为培养于内皮生长培养基的正常人血管内皮细胞(HMVEC-d)。采用改良的Boyden腔式检验法用于细胞迁移分析试验。将12μm孔径的无PVP的聚碳酸酯膜(Millipore，USA)包被一层溶于0.1％乙酸的0.05mg/ml胶原质IV，干燥2小时以上。收集HMVEC-d细胞并重悬于含有0.1％BSA的内皮细胞基础介质。改良的Boyden腔式检验法中的底腔装以含有待测物或对照物的内皮细胞基础介质。接着将HMVEC-d细胞按50,000或100,000细胞/孔的浓度加到上腔中，将腔整体温育于37℃4小时。迁移穿过到膜上面的细胞被固定后以紫罗兰染色，染色细胞被洗脱下来并在600nm波长光下定量。

2.血管生成检验

检测用细胞为培养于内皮生长培养基的正常人血管内皮细胞(HMVEC-d)。体外血管生成作用是在包被一层基膜蛋白质(由鼠肿瘤EHS制备)的96孔板中检测的。收集HMVEC-d细胞并以50000细胞/孔的浓度加入到包被好的孔中，同时在孔中加入待测物和对照，将96孔板在37℃温育16小时。血管内皮细胞迅速排列形成中空管状结构，该结构可在聚焦显微镜下观察，并以此估计不同物质处理下的血管生成作用。

表1Tβ4Y的活性检测结果

促细胞迁移因子	浓度(nM)	O.D.600	标准差
				空白对照		0.000	0.000
阴性对照		0.122	0.000
				血管内皮生长因子	100	0.295	0.002
成纤维细胞生长因子	10	0.176	0.023
				血小板源生长因子	10	0.140	0.007
Tα5	10	0.249	0.074
				100	0.257	0.018
	1000	0.228	0.023
				Tβ4	10	0.181	0.040
100	0.259	0.013
			1000		0.268	0.006
GST	1	0.149					0.026
			10	0.175	0.008
	100	0.165				0.000
			1000	0.151	0.032
	GST-Tβ4Y融合蛋白	1				0.210	0.020
10			0.291	0.023
		100			0.285	0.037
1000			0.312	0.010
		(His)6-Tβ4Y融合蛋白			1	0.275	0.008
10	0.249		0.035
				100	0.261	0.006
1000	0.283		0.004

                           序列表<110>北京华大基因研究中心<120>一种重组人胸腺肽beta4Y及其制备方法和用途<130>idc010037<160>2<170>Patentln version 3.1<210>1<211>135<212>DNA<213>Artificial<400>1atgctcgaca aacctggtat ggctgagatc gagaaattcg ataagtcgaa actgaagaag    60acagaaacgc aagagaagaa tccattgtct tccaaagaaa ctatcgaaca ggagaggcaa    120gcaggcgaat cttaa                                                     135<210>2<211>44<212>PRT<213>Artificial<400>2Met Ser Asp Lys Pro Gly Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser1               5                   10                 15Lys Lcu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Ser Ser Lys

        20                  25                  30Glu Thr Ile Glu Gln Glu Arg Gln Ala Gly Glu Ser

    35                  40

Claims (11)

1、一种重组胸腺肽β4Y(Tβ4Y)活性多肽，其由包含SEQ.ID No.1所示的人胸腺肽β4Y活性多肽的核苷酸序列或其取代、插入、缺失突变序列的多核苷酸编码编码，只要编码的多肽仍具有胸腺肽β4Y活性或对人体无免疫原性。

2、权利要求1所述的重组胸腺肽β4Y(Tβ4Y)活性多肽，其具有SEQ.ID No.2所示的氨基酸序列。

3、一种制备权利要求1的重组胸腺肽β4Y(Tβ4Y)活性多肽的方法，其包括(1)用含有SEQ.ID No.1所示的人胸腺肽β4Y活性多肽的核苷酸序列或其取代、插入、缺失突变序列的基因转化大肠杆菌，只要编码的多肽仍具有胸腺肽β4Y活性或对人体无免疫原性；(2)从经培养的重组大肠杆菌细胞和/或培养液中提纯重组胸腺肽β4Y活性多肽。

4、权利要求2的重组胸腺肽β4Y活性多肽制备方法，其中所述重组胸腺肽β4Y活性多肽为融合蛋白或非融合蛋白

5、权利要求4的重组胸腺肽β4Y活性多肽制备方法，其中所述重组胸腺肽β4Y活性多肽为GST融合蛋白或6×His融合蛋白。

6、权利要求2的重组胸腺肽β4Y活性多肽制备方法，其中具有胸腺肽β4Y活性的多肽存在于诱导表达后的大肠杆菌菌体中和培养菌体的培养液中。

7、一种包含有效治疗剂量的由权利要求2所述的制备方法获得的胸腺肽β4Y活性多肽的药物组合物。

8、权利要求7的药物组合物，其呈液体、固体、半固体、气雾剂或冷冻干燥品形式。

9、权利要求7的药物组合物，其中胸腺肽β4Y活性多肽可以被聚合物修饰。

10、权利要求9的药物组合物，其中经修饰的胸腺肽β4Y活性多肽聚合物是水溶性的或脂溶性的。

11、权利要求1的胸腺肽β4Y活性多肽用于制备促进创伤愈合的药物组合物的用途。

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