CN1321690A - 一种新型双功能水蛭素及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域,具体涉及一种兼具抗凝血酶活性和抗血小板聚集活性的双功能水蛭素(BifunctionalRecombinantHirudin)的蛋白质结构和制备方法及其应用。根据对野生型水蛭素的结构及其生化特性的分析,设计了新型双功能水蛭素分子结构。化学合成突变体基因,然后与真核表达载体pPIC9K重组,转化甲醇营养型酵母GS115,筛选高表达工程菌。工程菌经发酵扩增,离心收集上清液,经三步法纯化双功能水蛭素。所得产品冻干后,具有抗凝血酶活性并能显著抑制ADP诱导的血小板聚集,对于预防血栓性疾病的发生有明显的作用。

Description

一种新型双功能水蛭素及其制备方法和应用

本发明属生物技术领域，涉及一种新型重组双功能水蛭素。更具体地，本发明涉及与野生型水蛭素相比，保持其特异高效抗凝血酶作用，同时兼具抗血小板聚集功能的重组双功能水蛭素。本发明还涉及该重组双功能水蛭素的制备方法及其应用。

天然水蛭素(Hirudin)从医用水蛭的唾液腺中提取而得，是凝血酶的特异抑制剂(Markwardt F et al.Method in Enzymology1970,19:924-32)，可与凝血酶形成摩尔比为1∶1的稳定非共价结合物，是目前所知的最强的凝血酶天然抑制剂(Chang JY.FEBSLett.1983,164:307-13)，所以低浓度的水蛭素即可有效地阻止血液凝固。由于Hirudin与凝血酶的结合不需抗凝血酶-Ⅲ，因此用Hirudin抗凝不会引起抗凝血酶-Ⅲ的消耗，从而降低出血的可能。近年来，研究人员使用纯化的水蛭素进行了一系列的动物实验和若干临床实验，结果表明水蛭素无毒性，无明显抗原性，在合理剂量范围内，没有引起出血的危险。它对于各种血栓性疾病，如冠状动脉血栓、静脉血栓以及弥散性血管内凝血等，都有很好的治疗作用乃至预防作用。

目前血栓性疾病的主导疗法是溶栓疗法，但溶栓疗法存在的主要问题是溶栓后再栓塞的高发性。因此，在利用溶栓药物进行溶栓治疗的同时，通常联合应用肝素、阿斯匹林等抗凝血酶、抗血小板药物，以促进溶栓，并防止再梗塞。位于纤维蛋白和vonWillebrand因子(von Willebrand factor,vWF)上的Arg-Gly-Asp(RGD)序列是血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)复合物的识别位点，两者的结合导致血小板聚集是血栓形成的最后通路，所以阻断该环节是防治血栓形成的新途径(Frishman WH et al.Am.Heart J.1995,130:877-892)；Nichols AJ et al.Trends Pharmacol.Sci.1992,13:413-417)。研究表明含RGD序列的多肽可抑制纤维蛋白原与GPⅡb/Ⅲa复合物的结合，且在一定的构象限制下在溶栓剂中导入RGD序列可获得既有溶栓活性又有血小板黏附活性的双功能溶栓剂(Smith J et al.J.Biol.Chem.1995,270:30486-30490)。

本发明的目的是提供一种兼具抗凝、抗血小板聚集双重功能的新型双功能水蛭素的蛋白质结构及其制备方法。本发明在合成水蛭素基因时将RGD编码顺序融合在野生型水蛭素基因中。该水蛭素衍生物既具有抗凝血酶的作用，又有抑制血小板集聚的作用，其阻断血栓形成的作用更强。

本发明根据水蛭素的结构特点和作用方式，设计具有抑制凝血酶和抑制血小板聚集的新型双功能水蛭素分子结构，并利用基因工程手段生产，所得产品除了具有高效、特异抗凝血酶功能外，尚具有抗血小板聚集的新特性，并且制备工艺简便、安全，产品抗凝血酶比活性与天然水蛭素相同。

水蛭素是一个含65-66个氨基酸的单链多肽，分子量约为7000Da。天然水蛭素存在十种以上变体，主要的三种简称为HV1,HV2和HV3。其分子的氨基末端是其核心部分，含三对二硫键(Cys6…Cys14,Cys16…Cys28,Cys32…Cys39)，使氨基末端肽链绕迭成密集形核心环肽结构，与凝血酶的催化活性位点结合；而羧基末端为一无规则伸展的链状结构，其中Gln49～Gly54有空间和疏水作用，而Asp55～Pro60富含酸性氨基酸，带有负电荷，易与凝血酶碱性的底物识别位点结合。Ser32-Asp33-Gly34-Glu35(SDGE)为一突出于β-折叠间的loop结构，构象自由，对活性无明显作用。研究发现，HV-3的羧基末端(HV-3_54-66)与凝血酶的结合能力比HV-1的羧基末端(HV-1_54-65)更强(Krstenansky JL et al.,Thrombosis Res.1988,52:137-141.)。根据水蛭素的以上特性，本发明设计了双功能水蛭素的分子结构，将野生型水蛭素(HV-1)肽链的Ser32-Asp33-Gly34-Glu35(SDGE)替换为Arg32-Gly33-Asp34-Ser35(RGDS)；羧基末端Asp53-Gly54-Asp55-Phe56-Glu57-Glu58-Ile59-Pro60-Glu61-Glu62-Tyr63-Leu64-Gln65(DGDFEEIPEEYLQ)替换为HV-3的羧基末端Gln53-Gly54-Asp55-Phe56-Glu57-Pro58-Ile59-Pro60-Glu61-Asp62-Ala63-Tyr64-Asp65-Glu66(QGDFEPIPEDAYDE)。本发明双功能水蛭素的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

另一方面，本发明也提供一种生产本发明双功能水蛭素的方法，包括制备至少包含表达生物活性的双功能水蛭素编码序列部分的cDNA；在适于表达的载体中克隆cDNA片段；用该载体转化或转染宿主细胞；在适于表达该cDNA片段的条件下培养该宿主细胞；及从培养物中回收和纯化所需双功能水蛭素。

本发明中双功能水蛭素基因的制备包括化学合成基因片段，并将其连接成编码基因，与质粒PUC19重组，DNA限制性内切酶酶切鉴定筛选阳性克隆，核苷酸序列分析验证合成片段序列及连接是否正确。

将本发明的cDNA片段与和表达载体重组，形成重组表达质粒。本发明不限于特定的表达载体，只要它能够与所述cDNA片段重组，形成适宜表达的质粒。在一优选实施方案中，本发明使用真核表达载体，例如pPIC9K等。

上述重组表达载体可按常规方法导入适宜宿主细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用甲醇营养型酵母菌株如GS115,KM71等。

本发明的表达产物分泌到胞外，存在于宿主细胞培养液上清内。只需离心除去宿主细胞，即可对培养液上清进行分离和纯化所需产品。

以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照《分子克隆实验指南》。

与野生型水蛭素性质比较表明，双功能水蛭素抗凝血酶活性与野生型水蛭素相同，并且能显著抑制ADP诱导的血小板的聚集，具有抗凝、抗血小板聚集双重功能。

实施例1双功能水蛭素的设计、制备和性质研究：

(1)．双功能水蛭素基因的克隆及真核表达质粒HD-pPIC9K的构建

按照双功能水蛭素的设计氨基酸顺序，依照酵母偏好密码子设计核苷酸序列。序列分为10个寡核苷酸用DNA合成仪合成，并将其连接在一起构成双功能水蛭素基因。连接产物与pUC19重组，酶解筛选阳性克隆，核苷酸序列分析证实基因序列合成及连接正确。然后将双功能水蛭素基因切出，与酵母表达载体pPIC9K重组，构成真核表达质粒HD-pPIC9K。转化大肠杆菌JM109，提取质粒，以相应限制性内切酶酶解鉴定，获得特征性片段，证实获得阳性克隆。

限制性内切酶购自BRL公司，大肠杆菌JM109、质粒pUC19为本室保存，甲醇营养型酵母菌GS115、酵母多拷贝表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司。

(2)．高拷贝高效表达菌株的筛选

质粒HD-pPIC9K电转化甲醇营养型酵母GS115，使其与酵母染色体发生重组，G418筛选高效表达菌株。

挑取上述阳性克隆接种于10ml低营养培养液BMG[1.34％YNB,(4×10^-5)％生物素，1％甘油]中30℃快速振摇(250RPM)，培养过夜。次日测定光密度OD₆₀₀，离心弃除BMG培液，用无菌水洗涤后用BMM培液[1.34％YNB,(4×10^-5)％生物素，0.5％甲醇]稀释至OD₆₀₀=1。每天补加体积百分数为0.5％的甲醇。甲醇诱导培养7天，每隔24小时取样1ml，测定抗凝血酶活性。离心弃沉淀，上清于-20℃保存。直接取培液上清与2×上样缓冲液等体积混合后取20μl上样，作还原性SDS-PAGE电泳(浓缩胶5％，分离胶16.5％)。考马斯亮蓝R-250染色后，Pharmacia Imagemaster VDS扫描测定纯度、分子量。可见诱导后上清液在分子量约7kD处有一浓集的条带，经扫描，目的蛋白约占上清总蛋白的85％；表达产物有明显的抗凝血酶作用。上述还原性SDS-PAGE按Laemmli方法进行(参照分子克隆实验指南)。

(3)．工程菌的发酵表达

按上法筛选高表达菌株作为工程菌，然后以5L发酵罐进行高密度发酵。从-70℃深低温冰箱中取出种子菌，室温下解冻，在种子菌培养室100级洁净度条件下划YPD平板，30℃温箱培养2-3天。从平板上挑取单菌落，同样在100级洁净度条件下接种于10mlBMG培养液中，30℃培养过夜，此为一级种子液。再将一级种子液加入140ml BMG培液中，30℃培养6-8小时，直至OD₆₀₀=6，此为二级种子液。种子菌接入后，自然增殖，待基础培养基中预加的甘油被耗尽以后，开始补充甘油，补充速度16ml/L/h，待OD600达到120左右，停止补加甘油。待培养液中甘油被全部耗尽后，开始甲醇诱导。甲醇补料速度从1ml/L/h逐渐升高至12ml/L/h，以后一直维持此速度。发酵技术：用低盐培养基扩增工程菌，诱导前用含微量元素的甘油溶液进行补料，到达一定菌体浓度后用含微量元素的甲醇溶液进行诱导表达。

甲醇诱导40h以后，停止发酵，从发酵罐中立即放出菌液进行离心，分离沉淀菌体，收集上清进行纯化。上清中抗凝血酶活性可达25000ATU/ml。发酵参数为：温度30℃，氧容量控制在35±5％,pH=5，搅拌速度与DO连动。

(4)．超滤浓缩脱盐

将离心所获上清以1∶10稀释，经Millipore超滤装置(NMWL：3000,Millipore公司)超滤浓缩至1.0L，脱去无机盐。

(5)．凝胶过滤

Sephadex G-50(Pharmacia公司)柱用20mmol/L PB(pH7.4)平衡后，将超滤浓缩液上样，注意加样时注意勿扰动Sephadex G-50胶面。然后用PB洗脱，流速10ml/min，收集活性峰。

(6)．Q-Sepharose Fast Flow柱层析

以10倍体积的50mmol/L PB(pH7.4)平衡Q-SepharoseF.F(Pharmacia公司)柱，凝胶过滤后收集的抗凝血酶活力部分以50ml/min的速率将其吸附到Q-Sepharose F.F.柱上。用PB洗柱直至OD₂₈₀为0.00，然后用0-1mol/L NaCl(50mmol/L PB pH7.4)线性梯度洗脱，收集有抗凝血酶活力部分，分装，冷冻干燥，-40℃保存。

所有色谱操作均为常规操作。

(7)．纯度鉴定及分子量测定

样品进行16.5％SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰R-250染色后，Pharmacia Imagemaster VDS扫描测定纯度、分子量。所得产品纯度97％以上，分子量约7kD。

(8)．抗凝血酶活性及比活性测定

取0.5％纤维蛋白原(生理盐水配制)200μl，在缺少或存在不同量的双功能水蛭素的情况下用凝血酶滴定血浆，由凝血酶的消耗量换算双功能水蛭素的单位数，每消耗1NIH单位凝血酶定为1个抗凝血单位(1ATU)，并以Bradford法(试剂为Bio-Rad产品)测定蛋白浓度。纯化产物抗凝血酶比活性为10000ATU/mg左右。

(9)．血小板聚集抑制试验

家兔常规麻醉，颈总动脉取血，枸橼酸钠(110mmol/L)1∶9(V/V)抗凝，1000rpm离心10分钟，制备富血小板血浆(PRP)。吸出PRP后，剩余部分再以3500rpm离心15分钟，制备贫血小板血浆(PPP)。用PPP稀释PRP，使血小板数约为450×10⁹L^-1。取200μl，在连续搅拌条件下加入生理盐水(对照组)或不同终浓度的纯化双功能水蛭素及野生型水蛭素。37℃孵育5min后加入ADP(终浓度20μmol/L)作为诱导剂，即刻用双通道血小板聚集仪以比浊法测定5min内血小板的聚集率。聚集程度以血小板最大聚集率表示，并按下式计算给药后血小板聚集抑制率。分别以野生型水蛭素、生理盐水为对照。 $\mathrm{Ii}\%=\frac{\mathrm{Agg}\max \mathrm{control}-\mathrm{Agg}\max \mathrm{Ci}}{\mathrm{Agg}\max \mathrm{control}}\×100\%$

结果显示，双功能水蛭素能够浓度依赖性抑制ADP诱导的血小板聚集作用，而野生型水蛭素无此作用。实施例2双功能水蛭素的制备

双功能水蛭素真核表达质粒的构建，高拷贝高效表达菌株的筛选，工程菌的发酵表达均同实施例1。发酵液离心后收集上清液，按下法进行纯化制备纯品双功能水蛭素。

(1)．Poros HQ柱层析浓缩

以10倍体积的50mmol/L PB(pH7.4)平衡Poros HQ(Pharmacia公司)柱，发酵液离心后收集的上清以100ml/min的速率将其吸附到Poros HQ柱上。用PB洗柱直至OD₂₈₀为0.00，然后用0-1mol/L NaCl(50mmol/L PB pH7.4)线性梯度洗脱，收集有抗凝血酶活力部分。有抗凝血酶活力部分。

(2)．凝胶过滤

Sephadex G-50(Pharmacia公司)柱用20mmol/L PB(pH7.4)平衡后，将Poros HQ柱层析浓缩液上样，注意加样时注意勿扰动Sephadex G-50胶面。然后用PB洗脱，流速10ml/min，收集活性峰。

(3)．Q-Sepharose Fast Flow柱层析

以10倍体积的50mmol/L PB(pH7.4)平衡Q-SepharoseF.F(Pharmacia公司)柱，凝胶过滤后收集的抗凝血酶活力部分以50ml/min的速率将其吸附到Q-Sepharose F.F柱上。用PB洗柱直至OD₂₈₀为0.00，然后用0-1mol/L NaCl(50mmol/L PB pH7.4)线性梯度洗脱，收集有抗凝血酶活力部分，分装，冷冻干燥，-40℃保存。

所有色谱操作均为常规操作。

(4)．纯度鉴定及分子量测定

样品进行16.5％SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰R-250染色后，Pharmacia Imagemaster VDS扫描测定纯度、分子量。所得产品纯度97％以上，分子量约7kD。

(5)．抗凝血酶活性及比活性测定

取0.5％纤维蛋白原(生理盐水配制)200μl，在缺少或存在不同量的双功能水蛭素的情况下用凝血酶滴定血浆，由凝血酶的消耗量换算双功能水蛭素的单位数，每消耗1NIH单位凝血酶定为1个抗凝血单位(1ATU)，并以Bradford法(试剂为Bio-Rad产品)测定蛋白浓度。纯化产物抗凝血酶比活性为10000ATU/mg左右。实施例3双功能水蛭素在血栓性疾病中的应用

应用本发明所制备的双功能水蛭素进行抗血栓作用实验，证实其在血栓性疾病的防治中有良好的作用，与肝素相比，其应用剂量小，效果更为明显。

(1)．抑制静脉血栓形成

结扎大鼠下腔静脉诱发静脉血栓形成。模型形成2小时后静脉注射给药。阴性对照组给予生理盐水，阳性对照组给予肝素200～400μg/kg，治疗组给予双功能水蛭素10～50μg/kg。给药4小时后取出血栓，称重。结果显示双功能水蛭素能明显抑制静脉血栓的形成，与肝素相比所需剂量小得多。

(2)．抑制动脉血栓形成

用气囊导管损伤家兔股动脉内皮细胞，并结扎损伤部分的血管，使局部血流阻滞而诱发动脉血栓形成。阴性对照组给予生理盐水，阳性对照组给予肝素200～1000μg/kg，治疗组给予双功能水蛭素10～200μg/kg。实验结果表明，双功能水蛭素可使动脉血栓形成率下降，并呈剂量相关性。

(3)．防治弥散性血管内凝血(DIC)

给家兔注射内毒素诱发DIC形成。静脉注射双功能水蛭素可使血小板计数降低，与对照组(生理盐水)相比，具有显著统计学差异。

(4)．冠状动脉成形术(PTCA)后再栓塞的防治

损伤狗的左冠状动脉前降支内皮细胞，诱发阻塞性冠脉血栓形成。应用双功能水蛭素作为链激酶的附加用药，能促进冠脉再通，抑制再栓塞，减少残余血栓的重量，并呈剂量依赖性。与肝素相比，其再通率高，发生再通的时间较短，再灌注的持续时间较长，且残留的血栓重量较轻。

无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

从以上描述，本领域技术人员可很容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。所有这些变更和改进均包括在所附权利要求的保护范围之内。

附图说明

图1序列表SEQ ID NO:1，显示本发明重组双功能水蛭素的氨基酸序列。

图2序列表SEQ ID NO:2，显示本发明重组双功能水蛭素的核苷酸序列。

图3显示本发明重组双功能水蛭素的生产制备过程中各步骤样品的SDS-PAGE电泳照片。其中1：发酵上清液；2：超滤后；3：凝胶过滤后：4：阴离子交换层析后；5：蛋白Marker。

图4显示了双功能水蛭素和野生型水蛭素的抗ADP诱导的血小板聚集试验结果。

Claims (12)

1．一种新型重组双功能水蛭素，其特征在于改变野生型水蛭素的蛋白质结构，保持野生型水蛭素特异、高效抗凝血酶活性，新增抗血小板聚集活性。

2．根据权利要求1所述的新型重组双功能水蛭素，其特征在于：改变野生型水蛭素(HV-1)loop区及酸性羧基端的氨基酸顺序，即32-35位，53-65位氨基酸而得。

3．按权利要求2所述的新型重组双功能水蛭素，其特征在于所述新型分子的蛋白质结构为：野生型水蛭素(HV-1)肽链的Ser32-Asp33-Gly34-Glu35(SDGE)替换为Arg32-Gly33-Asp34-Ser35(RGDS)；Asp53-Gly54-Asp55-Phe56-Glu57-Glu58-Ile59-Pro60-Glu61-Glu62-Tyr63-Leu64-Gln65(DGDFEEIPEEYLQ)替换为Gln53-Gly54-Asp55-Phe56-Glu57-Pro58-Ile59-Pro60-Glu61-Asp62-Ala63-Tyr64-Asp65-Glu66(QGDFEPIPEDAYDE)。而其余氨基酸序列保持不变。

4．一种制备新型重组双功能水蛭素的方法，其特征在于采用下列步骤：(1)根据对野生型水蛭素的结构及其生化特性的分析，设计新型双功能水蛭素分子结构。化学合成衍生物基因片段，并将其连接成编码基因；(2)在适于表达的载体中克隆双功能水蛭素基因；(3)用该重组载体转化或转染适于表达的宿主细胞；(4)在适于表达该cDNA片段的条件下培养宿主细胞，并从   中回收和纯化所需产物。

5．根据权利要求4所述的方法，其中所使用的载体不限于特定的表达载体，只要它能够与所述cDNA片段重组，形成适宜表达的质粒。

6．根据权利要求5所述的方法，其中所使用的载体为真核表达载体。

7．根据权利要求6所述的方法，其中所使用的载体为pPIC9K。

8．根据权利要求4所述的方法，其中所使用的宿主细胞不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。

9．根据权利要求8所述的方法，其中所使用的宿主细胞为甲醇营养型酵母菌株GS115。

10．根据权利要求4所述的方法，其中培养宿主细胞所使用的发酵方法为：用低盐培养基扩增工程菌，诱导前用含微量元素的甘油溶液进行补料，到达一定菌体浓度后用含微量元素的甲醇溶液进行诱导表达。发酵参数为：温度30℃，氧容量控制在35±5％，pH=5，搅拌速度与DO连动；

11．根据权利要求4所述的方法，其中重组双功能水蛭素终产物是通过工程菌发酵后离心收集上清，经超滤浓缩、凝胶过滤、离子交换三步法纯化而获得。

12．根据权利要求1-4所述的双功能水蛭素在制备防治血栓性疾病的药物中的应用。