CN103421110B

CN103421110B - 直接凝血酶抑制剂多肽及其用途

Info

Publication number: CN103421110B
Application number: CN201310127718.2A
Authority: CN
Inventors: 莫炜; 黄一农; 于敏; 张艳玲
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2013-04-14
Filing date: 2013-04-14
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-04-14
Also published as: CN103421110A

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及直接凝血酶抑制剂多肽及其用途。本发明在 RGD-Hirudin 的结构基础上，将其分子截短，获得直接凝血酶抑制剂小分子多肽Peptide 1和Peptide 2；经测试及动物实验，结果表明，所述多肽Peptide 1和Peptide 2为凝血酶直接抑制剂，具有抗凝血酶活性，其药物作用靶点明确，对其它凝血因子没有作用，可进一步制备口服或皮下缓释抗凝药物，尤其适用于预防血栓性疾病；本发明所述多肽还可作为直接凝血酶抑制剂的候选药物进行深入研究，为开发出新型直接凝血酶抑制剂奠定基础。

Description

直接凝血酶抑制剂多肽及其用途

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种抗凝多肽及其用途，尤其是直接凝血酶抑制剂的多肽及其用途。

背景技术

现有技术公开了直接凝血酶抑制剂 (DTIs) 的研制和开发在预防和治疗静脉和动脉血栓、肝素诱导的血小板减少症 (HIT) 及急性冠脉缺血性综合症等心脑血管病发挥了巨大的作用。与传统的抗凝剂 (肝素 (heparin) 和维生素 K (VKAs)) 相比，所述DTIs 具有明显的优势；目前已知，已有注射用 DTIs 及口服 DTI 用于临床治疗。然而，实践显示，上述注射用 DTIs 及口服 DTI药物的适应症尚属单一，其中的每种 DTI 仅针对特定的病症，且治疗费用昂贵；因此，开发新型注射用和口服用DTIs，在治疗和预防血栓栓塞疾病方面具有广阔前景。

本申请的发明人在之前研制了新型双功能融合蛋白 RGD-hirudin 具有抗凝血酶、抗血小板聚集的双重功能，属一类生物技术新药，现已进入 I期临床研究阶段；但由于所述RGD-Hirudin 为一种蛋白质/多肽类药物，作为一种直接凝血酶抑制剂只能通过静脉注射的给药方式用药，明显限制了其临床使用范围。

因此，本申请的发明人拟提供一种新型的直接凝血酶抑制剂的多肽，所述多肽应具有抗凝活性，抗凝作用温和、可控，且药物作用靶点明确，对其它凝血因子没有作用，能制备口服或皮下缓释抗凝药物。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗凝多肽及其用途，尤其是直接凝血酶抑制剂的多肽。所述多肽具有抗凝活性，抗凝作用温和、可控，且药物作用靶点明确，对其它凝血因子没有作用。

本发明的抗凝多肽能制备预防血栓性疾病药物，所述药物尤其可制成口服或皮下缓释抗凝药物。

本发明中，通过对 RGD-hirudin 结构功能研究，确定重组双功能水蛭素与凝血酶相互作用关系，即 RGD-hirudin 的 C 末端与凝血酶 exosites I 结合，N 末端与凝血酶活性位点结合，抑制凝血酶活性；然后，以 RGD-hirudin 的序列（“一种新型双功能水蛭素及其制备方法和应用”，2006 年，中国发明专利，专利号：01105798.X）为基础，保留其功能氨基酸残基，采用分子模拟软件提供了具有抗凝活性的多肽Peptide 1和Peptide 2。

所述多肽Peptide 1的序列如SEQ ID NO: 1所示；

所述多肽Peptide 2的序列SEQ ID NO: 2所示。

本发明中，所述的多肽Peptide 1 和Peptide 2为在 RGD-Hirudin 的结构基础上，对其进一步改造，将该分子截短，形成小分子多肽；

本发明中，利用毕赤酵母表达，经纯化、质谱分析结果显示，Peptide 1的理论分子量为 3924.6730 Da (35肽) ，Peptide 2的理论分子量为4023.7275 Da (36肽)；

本发明中，Peptide 1经 HPLC 测定的纯度为82%，Peptide 2经 HPLC 测定的纯度为84%；所述Peptide 1蛋白含量为 32mg，Peptide 2 蛋白含量为 40mg；

本发明中测定了所述多肽的抗凝血酶活性，结果显示，所述Peptide 1 抗凝血酶比活性为7000ATU/mg，所述Peptide 2抗凝血酶比活性为6000ATU/mg；

本发明进行了动物实验，结果显示，所述Peptide 1 和 Peptide 2在 aPTT 在用药后延长，比用药前延长 1 倍左右，抗凝作用持续 2 h后，逐步恢复正常。

上述结果表明，所述多肽Peptide 1和Peptide 2可作为凝血酶直接抑制剂，具有抗凝血酶活性，其药物作用靶点明确，对其它凝血因子没有作用，可进一步制备口服或皮下缓释抗凝药物；本发明所述的凝血酶直接抑制剂药物能克服现有口服抗凝药物存在的出血、血小板减少、导致抗凝治疗失败的缺陷，可用于预防血栓性疾病；

本发明所述多肽还可作为 DTIs 的候选药物进行深入研究，为开发出新型 DTIs 奠定基础。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1显示了本发明所述的多肽Peptide 1建模和Ramachandran 图谱分析结果，其中，

A：多肽Peptide 1建模情况，

B：多肽Peptide 1经Ramachandran 图谱分析的结果。

图2显示了本发明所述的多肽Peptide 2建模和Ramachandran 图谱分析结果，其中，

A：多肽Peptide 2建模情况，

B：多肽Peptide 2经Ramachandran 图谱分析的结果。

图3显示了经甲醇诱导，Peptide 1 和 Peptide 2 表达，培养液上清中的抗凝活性分别为 1800ATU/mL 和 2000ATU/mL。

图4 显示了本发明所述Peptide 1和Peptide 2纯化后的抗凝活性，

其中，

A：多肽Peptide 1纯化后的抗凝活性，

B：多肽Peptide 2纯化后的抗凝活性。

图5显示了本发明所述多肽Peptide 1和Peptide 2的蛋白定量和抗凝血酶活力分析结果。

图6显示了本发明所述多肽Peptide 1和 Peptide 2经HPLC 测定的纯度结果，其中，

A：多肽Peptide 1经 HPLC 测定的纯度为82%，

B：多肽Peptide 2经 HPLC 测定的纯度为84%。

图7显示了本发明所述多肽Peptide 1 和 Peptide 2经 MS 分析的分子量，

其中，

A：多肽Peptide 1经 MS 分析的分子量为3925.5247 Da，

B：多肽Peptide 2经 MS 分析的分子量为4024.5459 Da。

图8显示了aPTT、TT及PT 测定结果，

其中，

A：aPTT 测定结果，

B：TT 测定结果，

C：PT 测定结果。

具体实施方式

实施例 1

1、材料和方法

（1）菌种和质粒

GS115 毕赤酵母菌种、DH5α 大肠杆菌、pPIC9K 质粒由本实验室保存冻存；

（2）试剂和仪器

抗生素 G₄₁₈ 购自 Promega 公司；

丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、YNB、人凝血酶购自 Sigma Aldrich 公司；

酵母提取物、胰蛋白胨购自 OXIOID 公司；

血浆购自上海市血液中心；

质粒抽提试剂盒购自 Invitrogen 公司；

Sephacryl S-100 HR、Sephadex-G50 和 Q-Sepharose-FF 购自 GE 公司；

分子模拟软件 Discovery Studio 3.1 购自创腾公司；

电转化仪及电转化杯购自 Bio-Rad 公司；

其余试剂均为进口或国产分析纯试剂；

（3）溶液及培养基配制

①10 × YNB：134g YNB 溶解于 l000 mL 蒸馏水中，加热至 YNB完全溶解，过滤除菌，存于 4℃；

② 10 × D ( 20% 葡萄糖 )：200g D-葡萄糖溶解于 l000 mL 蒸馏水中，121℃ 高压灭菌 20min；

③ 30% 丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺 29 g，甲叉双丙烯酰胺 l.0 g 溶解于蒸馏水中，定容至 100 mL，4℃棕色瓶中保存；

④ 1.5 mol/L Tris-HCl (pH8.8)：181.7 g Tris 溶解于 800 mL 蒸馏水中，用浓盐酸调节 pH 值 8.8，定容至 1.0 L；121℃ 高压灭菌 20min，室温保存；

⑤ l.0 mol/L Tris-HCl (pH6.8)：121.1 g Tris 溶解于 800 mL 蒸馏水中，用浓盐酸调节 pH 值 6.8，定容至 1.0 L；121℃ 高压灭菌 20min，室温保存；

⑥ 10% SDS：将 10 g 分析纯 SDS 溶解于 80 mL 蒸馏水中，加浓盐酸调节 pH 值 7.2，定容至 100 ml，室温保存；

⑦ 10% 过硫酸铵 (AP)：将 l.0 g过硫酸铵溶解于 l0 mL 蒸馏水中，4℃保存；

⑧ 5×SDS-PAGE 上样缓冲液：1.0 mol/L Tris-HCl (pH6.8) 1.25 mL，SDS 0.5 g，溴酚蓝 0.025 g，甘油 2.5 mL，加蒸馏水至 5.0 mL，500 μL/支分装，室温保存，使用前每支加 25 μL β-巯基乙醇；

⑨ 5×Tris-Gly 电泳缓冲液：Tris 15.1 g，Glycine 94 g，SDS 5 g，加蒸馏水 800mL，待完全溶解后定容至 1.0 L，室温保存；

⑩ 考马斯亮蓝 G-250 染色液：考马斯亮蓝 G-250 1.0g 溶于 450 mL 甲醇，加冰醋酸 100mL，加蒸馏水定容至 1.0 L，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，过滤，室温保存；

⑪ YPD 平板 (100mL)：酵母提取物 1.0 g，胰蛋白胨 2.0 g，琼脂 1.5 g，蒸馏水定容至 90mL，121℃ 高压灭菌 20min 后加入 20% 葡萄糖溶液 10mL，倒入培养皿，室温冷却；

⑫ MD 平板 (1.0 L)：15.0 g 琼脂粉溶解于 800 mL 蒸馏水中，121℃ 高压灭菌 20min 后，于 60℃ 下加入 100 mL 10×YNB (不含氨基酸)，2.0 mL 500×生物素，100 mL 10×葡萄糖，制备平板，待冷却、凝固后备用；

⑬ 1.0 mol/L 山梨醇：18.22g 山梨醇溶解于蒸馏水中，定容至 100 mL，121℃ 高压灭菌 20min；

⑭ BMGY 培养基 (1.0 L)：酵母提取物 10 g，胰蛋白胨 20 g，溶于 700 mL 蒸馏水中，121℃ 高压灭菌 20 min，冷却至室温，加入 1.0 Mol/L 磷酸钾缓冲液 (pH 6.0) 100 mL，YNB 溶液 100mL，生物素 (500×) 2mL，10% (v/v) 甘油 100mL；

⑮ BMMY 培养基 (1.0 L)：酵母提取物 10g，胰蛋白胨 20 g，溶于 700mL 蒸馏水中，121℃ 高压灭菌 20 min，冷却至室温，加入 1 Mol/L 磷酸钾缓冲液 (pH6.0) 100 mL，YNB 溶液 100mL，生物素 (500×) 2mL，每 12h 补加50% (v/v) 甲醇 10mL；

⑯ PTM₁ 溶液 (1.0 L)：CuSO₄·5H₂O 6.0 g，MnSO₄·H₂O 3.0 g，H₃BO₄ 0.2g，ZnCl₂ 20.0 g，KI 0.8 g，NaMoO₄ 2H₂O 0.2 g，CoCl₂ 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 65.0 g，H₂SO₄ 5.0 mL，CaSO₄·2H₂O 0.5 g，过滤除菌；

⑰ 20 mMol/L PB 缓冲液 (10 L)：Na₂HPO₄ 23.02 g，NaH₂PO₄ 4.56 g，加蒸馏水至 10 L，pH 7.4。

2、实验方法

（1）同源建模DTIs 多肽

以 RGD-hirudin 氨基酸为基础，设计 DTIs 多肽序列，通过序列比对，从 PDB 数据库中寻找与 DTIs 序列相似度较高的蛋白作为其同源建模的结构模板；利用 Discovery Studio 3.1，以选定的结构模板对 DTIs 进行同源建模，得到多个模型结构，在 CHARMM 力场下对上述模型进行几何学计算，得到优化的模型，模型质量通过经几何学和能量的评估，模型的立体化学性质通过 PROCHECK 程序得到 Ramachandran 图谱得以评估，所述多肽氨基酸序列如表1所示；

表 1. DTIs 多肽氨基酸序列

名称	氨基酸序列	理论分子量
			Peptide 1	VVYTDCTESGQNLCPKPQSHNQGDFEPIPEDAYDE	3.9kD
Peptide 2	VVYTDCADRGDSRACPKPQSHNQGDFEPIPEDAYDE	4.1kD

；

选择 hirudin 与凝血酶复合物晶体结构 (PDB ID: 3HTC) 中的hirudin variant 2 的结构和 RGD-hirudin (PDB ID: 2JOO) NMR 液相结构作为 DTIs 多肽同源建模的模板，利用 Discovery Studio3.1 进行同源建模 (如图 1a、图2a所示)，优化的模型经 Ramachandran 图谱分析，结果显示，所述多肽 Peptide 1 和 Peptide 2 的结构中各有97.1% (如图 1b所示) 和 97.2% (如图 2b所示) 的氨基酸残基位于最合理的区域，结果表明，本发明中得到的模型结构合理且可进行进一步研究；

（2）全基因合成DTIs 多肽

将所述DTIs 全基因序列进行密码子优化，委托上海生工生物工程公司进行全基因合成，全基因序列插入 pPIC9K 质粒的 Xho I 和 Not I 酶切位点，得到完整 DTIs-pPIC9K 质粒，转化 DH5α 大肠杆菌，抽提质粒，并作基因测序鉴定；

（3）DTIs-pPIC9K 质粒转化毕赤酵母 GS115：

用 Sal I 酶切 DTIs-pPIC9K 质粒，使其完全线性化，经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后溶于无菌蒸馏水中；取 10 μL 上述线性化质粒 (10-20μg)，加入 80 μL 感受态 GS115，混匀后转入预冷的 0.2cm 电转化杯，冰浴 5min，设置电转化参数：电压 1500 V，电容 25 μF，电阻 200 Ω，电击一次，立即加入 1.0 mL 预冷的 1.0 mol/L 山梨醇，于 30℃ 培养箱放置 1 h，涂布 MD 平板，30℃ 培养箱培养，48h 后观察平板上单克隆生长情况；

（4）筛选多拷贝阳性酵母转化子：

使用无菌 96 孔板，每孔加入 YPD 液体培养基 200 μL，用无菌牙签在 MD平板挑取单克隆接种至 96 孔板，30℃ 静置培养 24h；取 10μL 菌液移接种至新的 96 孔板中，每孔 190 μL YPD 液体培养基，30℃ 静置培养 24h；取 2.0 μL菌液分别接种至含不同浓度 G₄₁₈ 抗生素的 YPD 平板 (1、2、4、8.0 mg/mL)，30℃ 静置培养，直至长出单克隆，由高浓度抗生素至低浓度抗生素筛选；

含有 DTIs-pPIC9K 电转化 GS115 菌株，其酵母染色体发生重组，G₄₁₈ 筛选高效表达菌株；

（5）DTIs 多肽的表达

挑取上述阳性克隆接种于 10 mL BMGY 培养液中 30℃ 快速振摇 (250 rpm)，培养过夜；次日测定光密度 OD₆₀₀，离心弃除 BMGY 培液，用无菌水洗涤后用 BMMY 培养液中，稀释至 OD₆₀₀=2.0，培养4天。每 12 h 补加甲醇 (0.5% V/V)；每隔 12 h 取样 1.0 mL，测定抗凝血酶活性；离心弃沉淀，上清于 -20℃保存；

菌体在 BMGY 培养基中培养，OD₆₀₀ 达到 5-6 时，更换培养基 BMMY，加入甲醇诱导，发酵液上清的单位抗凝血酶活性不断上升 (如图 3所示)，诱导 96 h 后，抗凝血酶活性分别达到 1800ATU/mL 和 2000ATU/mL 时，停止诱导；

（6）纯化DTIs 多肽

4000 rpm 离心 30 min，收集酵母培养液上清，置于 4℃，加入硫酸铵，使用磁力搅拌器持续搅拌，直至硫酸铵过饱和，使发酵液上清中所有蛋白完全沉淀，4℃，8000 rpm 离心 20 min，弃上清，将沉淀溶解于 PB (20mMol/L，pH=7.4)缓冲液中；Sephacryl S-100 用 PB (20mmol/L，pH=7.4) 平衡后，将沉淀蛋白浓缩液上样，用 PB 洗脱，流速 5mL/min，收集抗凝活性组份；用 20mmol/L PB 缓冲液平衡 Q-Sepharose-FF，凝胶过滤后收集的抗凝血酶活性部分以 10mL/min的速率将其吸附到 Q-Sepharose-FF 上，用 0-1.0mol/L NaCl (20mmol/L PB) 线性梯度洗脱，收集有抗凝血酶活力部分，分装于 10mL 西林瓶，-80℃ 保存；

离心后，收集 200 mL 培养液，上清中加入饱和硫酸铵，离心弃上清，溶于5.0 mL PB (20 mMol/L，pH=7.4) 缓冲液中；Sephacryl S-100 分子筛层析，出现 1个峰，收集约 100 mL，抗凝活性分别为 3400 ATU/mL (Peptide 1) 和 3600 ATU/mL (Peptide 2)；收集组份用 Q-Sepharose-FF 离子交换继续纯化，0-1.0 mol/L NaCl 线性梯度洗脱，NaCl 浓度为 0.19 mol/mL (19%) 时，Peptide 1 （活性组分）和Peptide 2（活性组分）被洗脱 (如图 4a、b所示)，收集得到 60mL 和 65mL，抗凝活性分别为 8000ATU/mL和 7500ATU/mL；

（7）蛋白定量和抗凝血酶活力分析

用 BCA 方法测定蛋白含量，具体步骤参照Thermo公司Pierce^®BCA 蛋白定量分析试剂盒进行；Peptide 1 为 32mg，Peptide 2 为 40mg；

参照 Markwardt 的方法进行操作，取人血浆 200 μL，在缺少或存在不同量的Peptide 1 或Peptide 2 的情况下用凝血酶 (100 NIH Units/ml) 滴定血浆，由凝血酶的消耗量换算得到 Peptide 1 或Peptide 2 的抗凝活性单位；其中，1 NIH Units 相当于 1 Anti-Thrombin Unit (ATU)；计算抗凝血酶比活性分别为 Peptide 1 7000ATU/mg 和 Peptide 2 6000ATU/mg (如图 5所示)；

（8）HPLC-MS测纯度，分子量

HPLC 流动相：流动相A：水+0.1% TFA 流动相B：100%乙腈+0.1% TFA；梯度：50 分钟内，流动相 B 从 0% 到 100%；流速：0.5mL/min；波长检测：280nm；样品上样量：20μL；

MS 图谱由 Bruker Auto flex II (MALDI-TOF-TOF-MS) 质谱仪测定；

经 HPLC 测定，结果显示，Peptide 1 和 Peptide 2 的纯度分别为 82% 和 84% (如图 6a、b所示)；经 MS 分析，结果显示，Peptide 1 和 Peptide 2 的分子量分别为 3925.5247 Da 和4024.5459 Da (如图 7a、b所示)；

（9） Peptide 1 和 Peptide 2 的抗凝药效测试

SD 大鼠 9 只，雄性，230g±20g，随机分为 3 个组，第一组静脉注射生理盐水作为阴性对照，第二组静脉注射 Peptide I 2mg/kg，第三组静脉注射 Peptide II 2mg/kg；

大鼠经戊巴比妥那(40mg/kg) 腹腔注射麻醉，分离颈总动脉，插入导管，取血 1.0 ml，3.8% 枸橼酸钠 (1:9) 抗凝，静脉注射生理盐水和药物，注射后，每 30 min 取血 1.0 ml，3.8% 枸橼酸钠 (1:9) 抗凝，持续 3 h，即用药后，取血时间点为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和 3.0 h；

抗凝血经 3000 rpm × 10 min 离心，分离血浆，测定部分凝血活酶时间 (aPTT)、凝血酶时间 (TT) 和凝血酶原时间 (PT)，按上海长岛生物技术有限公司测定试剂盒说明书进行；

测定结果如表 2a、2b、2c 和图 8a、8b、8c所示；结果显示，所述Peptide 1 和 Peptide 2 均具有抗凝活性，且抗凝作用温和、可控，在 aPTT 在用药后延长，比用药前延长 1 倍左右，抗凝作用持续 2 h后，逐步恢复正常。

表 2a 部分凝血活酶时间测定结果。

表 2b 凝血酶时间测定结果。

表 2c 凝血酶原时间测定结果。

表 2a

；

表 2b

；

表 2c

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 直接凝血酶抑制剂多肽及其用途

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 35

<212> PRT

<213> Peptide I

<400> 1

Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Pro Lys

1 5 10 15

Pro Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala

20 25 30

Tyr Asp Glu

35

<210> 2

<211> 36

<212> PRT

<213> Peptide 2

<400> 2

Val Val Tyr Thr Asp Cys Ala Asp Arg Gly Asp Ser Arg Ala Cys Pro

1 5 10 15

Lys Pro Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp

20 25 30

Ala Tyr Asp Glu

35

Claims

1.直接凝血酶抑制剂多肽，其特征在于，所述多肽为小分子多肽Peptide 1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.按权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽Peptide 1的分子量为3924.6730Da。

3.按权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽Peptide 1抗凝血酶比活性为7000ATU/mg。

4.权利要求1所述的多肽在制备预防血栓性疾病药物中的用途。

5.按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物为口服或皮下缓释抗凝药物。