CN102153646A - 新型双作用靶点重组水蛭素突变体的优化设计与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型双作用靶点重组水蛭素III突变体R33G34D35M36-rHV3及其制备方法。前期结果(Tan，S.et al.(2007).Mol Biotechnol 36(1)，1-8)显示，R33G34D35-rHV3不表现抗血小板聚集活性，而R33G34D35S36-rHV3则表现出抗血小板活性。这说明紧随RGD之后的第36位氨基酸残基种类对抗血小板聚集活性高低至关重要。本发明通过对紧随RGD序列之后的第36位进行点饱和突变，获得了R33G34D35X36-rHV3突变体库，并对突变体进行了分泌表达和产物分离纯化，在此基础上比较了R33G34D35X36-rHVIII各种突变体的抗凝血酶活性比活力和抗ADP诱导的血小板聚集抑制率，并从中筛选出了与rHV3抗凝血酶活性比活力相当，而抗ADP诱导的血小板聚集抑制率很高的双作用靶点水蛭素新突变体R33G34D35M36-rHV3。
Description
技术领域
本发明属于生物工程制药领域或蛋白质多肽药物领域，涉及一种采用基因工程领域技术研制新型双作用靶点重组水蛭素突变体的制备方法及其应用。
背景技术
水蛭素是一种天然抗凝的蛋白质多肽，由65～66个氨基酸组成，其分子如蝌蚪状。水蛭素分子由2个结构域组成，它们分别与凝血酶分子表面两个不同的表面位点作用。其N-端结构域是一个由氨基酸1-47形成的球状致密的核心结构，它与凝血酶的活性位点(activesite)结合，抑制其催化活力；而其带负电荷的羧基末端结构域氨基酸(49-65)则与凝血酶的阴离子结合外侧位点(anion binding exosite，或称纤维蛋白原识别位点)结合，从而抑制凝血酶与纤维蛋白原的相互作用。在这两个结构域之间存在一指状结构(finger like structure)从复合物中突出向外延伸，不与凝血酶接触。这一指状结构系水蛭素氨基酸残基27-31和36-40形成一反向平行β-折叠(antiparallel β-sheet)链，指端由氨基酸残基32-35形成柔性β-转角，研究表明该指状结构并不参与凝血酶的抑制作用，属于非功能必需区。
整合素(integrins)是一类存在于血小板以及血管内皮细胞表面的跨膜糖蛋白受体，能与纤连蛋白、I型胶原、血纤维蛋白原等配体结合，介导细胞-细胞、细胞-细胞外基质的相互识别和作用，从而调节细胞粘附与通讯。研究发现，这些配体通常包含有一Arg GlyAsp(RGD)序列，且这一功能性的RGD序列通常都位于暴露的、伸展的分子表面环状结构(loop)中。粘附配体如纤维蛋白原、纤连蛋白及Von willebrand因子上的RGD序列可以识别存在于活化血小板上的最丰富的GPIIb/IIIa受体并与其结合而使得血小板聚集，从而起到一种靶向结合的作用，因此，该序列称为整合素吸附序列(integrin affinity sequence)。巧合的是，许多小分子蛇毒(如decorsin，trigramin，kistrin，echistatin等)分子表面的环状结构中也存在这一序列，故又称为粘附识别序列(adhesive recognition sequence)。
基于以上认识，根据水蛭素分子天然结构特点，对其进行分子结构改造已具有极大可能。为此，我们采用loop移植技术，通过基因定点突变技术在其功能非必需区引入了整合素吸附序列(粘附识别序列)RGD，以期在不影响其原有的抗凝血酶活性的基础上，另外获得具有抗血小板聚集的生物活性，从而设计出比水蛭素更为优越的既抗凝血酶又抗血小板聚集的双功能水蛭素III变体药物。然而，我们的前期研究结果(Tan，S.et al.(2007).Mol Biotechnol 36(1)，1-8)显示，当用整合素吸附序列RGD替代水蛭素III分子指状结构非功能区33～35位点时，R33G34D35-rHV3没有表现出抗血小板活性，而R33G34D35S36-rHV3则表现出抗血小板活性。这说明紧随RGD序列之后的第36位氨基酸残基种类对抗血小板聚集活性的高低至关重要。为此，如果对该位点进行点饱和突变分析，就可以发现最适合该关键位点的最佳氨基酸残基，从而设计出结构新颖、并具有抗凝血酶和最佳抗ADP诱导的血小板聚集药理活性的双作用靶点水蛭素新变体药物。
发明内容
本发明的目的是在rHVIII和已构建的R33G34D35S36-rHVIII基础上，应用基因定点饱和突变技术对紧随RGD序列之后的第36位氨基酸进行突变，以获得R33G34D35X36-rHVIII突变体库(X代表20种不同种氨基酸残基)，并进行分泌表达和分离纯化，在此基础上比较R33G34D35X36-rHVIII各种突变体的抗凝血酶活性比活力和抗ADP诱导的血小板聚集抑制率，并从中筛选出与野生型水蛭素III的抗凝血酶活性比活力相当，而抗ADP诱导的血小板聚集抑制率最佳的双作用靶点水蛭素新变体药物。
本发明的具体实施方案如下：以质粒pTASHRGDSV为模板，按照图4重叠延伸PCR定点突变技术原理对第36位氨基酸残基进行点突变。首先以质粒pTASHRGDSV为模板，利用外侧引物f与突变引物r进行PCR扩增出片段A，再以突变引物f与外侧引物r扩增出片段B，然后混合片段A和B，并以此混合物为模板，再利用外侧引物f和外侧引物r进行PCR，由此得到第36位氨基酸残基发生突变的R33G34D35X36-rHVIII突变体基因C片段。PCR引物由本实验室设计，由Integrated DNA Technologies合成，其序列如下：
表1.引物序列
将R33G34D35X36-rHVIII突变体基因C片段与PMD19-T载体进行连接，并转化感受态细胞JM109，涂布LBA抗性平板，并采用PCR方法筛选出阳性克隆，并测序验证。最后将测序正确的5’端融合有L-ASP信号肽基因的R33G34D35X36-rHVIII突变体基因亚克隆到表达载体pTASH(Tan，S.，et al.(2002).Protein Expression and Purification，25，430-436.)中的EcoRI/PstI位点，由此得到R33G34D35X36-rHVIII突变体库。
将R33G34D35X36-rHVIII突变体分泌表达重组质粒进行摇瓶表达，发酵液上清液经分离纯化、冻干后，得到R33G34D35X36-rHVIII纯品。经C18-HPLC分析鉴定，纯度达到99％。样品制备后测定其抗凝血酶活力(活力测定方法参照(F.Markwardt，Hirudin as an inhibitor ofthrombin，Methods Enzymol.1 9(1 970)924-932.)，及其抗ADP诱导的血小板聚集活性，并计算其比活性，从而筛选出抗凝血酶比活性与重组野生型水蛭素III(rHVIII)相当、但抗ADP诱导的血小板聚集抑制率较高的R33G34D35X36-rHVIII突变体。
本发明的目的是公开一种抗凝血酶比活性与重组野生型水蛭素III(rHVIII)相当、但抗ADP诱导的血小板聚集抑制率较高的突变体R33G34D35M36-rHVIII。
附图说明：
图1 pTASH质粒图谱
图2 pMD-19TSHRGDXV3质粒图谱
图3 pTASHRGDXV3质粒图谱
图4重叠延伸PCR定点突变技术原理
图5 pMD19-T-SHRGDXV3的18个突变体的测序图谱
图6双作用靶点水蛭素突变体库抗凝血酶比活力及抗ADP诱导血小板聚集活性图
图7 rHVIII、R33G34D35S36-rHVIII与R33G34D35M36-rHVIII抗ADP诱导的血小板聚集抑制率比较图
具体实施方式
下面的优选例对本发明做详细叙述，但并不意味着限制本发明的范围。实施例中常规分子克隆操作参照文献(《分子克隆实验指南》第二版，金冬雁等译，1995年，科学出版社)。
实施例1 R33G34D35X36-rHVIII突变体基因的构建
从原始的含pTASHV3RGDS质粒的大肠杆菌菌种(谭树华等，中国发明专利01113526.3)中提取模板质粒pTASHV3RGDS，并设计合成引物(见表1)。
以质粒pTASHV3RGDS为模板，在Pfu DNA聚合酶的作用下进行聚合酶链式反应。25μl反应体系组成如下：正向引物f10pmol； 反向引物r10pmol；PfuDNA聚合酶2.5个单位；10×反应缓冲液2.5μl；dNTP(10mM each)0.5μl；MgCl2(25mM)1.5μl；质粒DNA 0.5μl(约2.5 ng)；用无菌水补足到25μl。PCR反应条件如下：95℃变性5分钟；进入循环反应：95℃变性60秒，50℃退火30秒，72℃延伸60秒，反应25个循环；72℃延伸10分钟。
制备突变体上游片段A时，以质粒pTASHRGDSV为模板，采用外侧引物f和突变引物r，；制备下游片段B时，以质粒pTASHRGDSV为模板，采用外侧引物r和突变引物f。制备突变体基因时以片段A和片段B为模板，采用外侧引物f和外侧引物r进行PCR，由此得到第36位氨基酸残基发生突变的R33G34D35X36-rHVIII突变体基因C片段。
PCR反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，以DL2,000TMDNA Marker作为对照，检测基因片段大小正确后，回收目的片段。
实例2R33G34D35X36-rHVIII突变体基因的T-载体克隆
实例一得到的R33G34D35X36-rHVIII突变体目的基因片段与pMD19T载体(宝生物工程(大连)有限公司产品)在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌宿主菌JM109，筛选阳性克隆，测序验证其序列，此组质粒命名为pMD19-TSHV3RGDX。
实施例3pTASHRGDXV3高效分泌表达质粒的构建
提取质粒pMD19-TSHV3RGDX，Ecol I、Pst I双酶切，以DL2,000TMDNA Marker作为对照，经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，并回收5’端融合有L-ASP信号肽基因的R33G34D35X36-rHVIII突变体目的基因片段，然后将回收的基因亚克隆到表达载体pTASH(Tan，S.，et al.(2002).Protein Expression and Purification，25，430-436.)中的EcoRI/PstI位点，由此得到R33G34D35X36-rHVIII突变体库。
实施例4R33G34D35X36-rHVIII突变体的表达及其表达产物的分离纯化
将含R33G34D35X36-rHVIII突变体大肠杆菌种进行摇瓶规模发酵，取1L左右发酵液，10000rpm离心30min，去除菌体沉淀取上清。
HP20大孔吸附树脂装柱(Φ2.6×40cm)，用20mmol/L乙酸平衡，发酵液上清上样。然后，用酸(20mmol/L乙酸)、碱(20mmol/L Tris-HCl，pH＝8.5)洗柱，再用含30％异丙醇的10mmol/L乙酸洗脱，分部收集，收集活性峰组分。
DEAE-纤维素装柱(Φ1.0×40cm)，经20mmol/L哌嗪平衡，将大孔吸附树脂柱洗脱样品经1.0mol/L哌嗪调节pH至6.0后上样，再用平衡缓冲液20mmol/L哌嗪洗涤至基线平稳，然后用含0-0.3mol/L NaCl溶液梯度的20mmol/L哌嗪(pH6.0)洗脱，收集活性峰组分。
采用Bio-Rad BioLogic DuoFlow Pathfinder 20制备型高效液相仪进行反相色谱制备。分离柱：Kromasil 5-C18(10mm×250mm)；流动相：A相0.1％TFA/H2O，B相0.1％TFA/CH3CN；梯度：0-35min，B：15％-35％；37-39min，B：100％；流速2.0ml/min；检测波长280nm。分部收集活性峰组分，冻干得到rHVIII及R33G34D35X36-rHVIII突变体纯品。
实施例5表达产物抗凝血酶活性比活力的测定
精确称取纯化后的表达产物1.0mg，并溶解于1ml去离子水中，并采用下述方法分别测定其蛋白浓度和抗凝血酶活性。
蛋白含量测定参照2010版《中国药典第三部》附录VI U中重组人粒细胞刺激因子蛋白质含量测定方法，经部分改动后按如下方法进行：C-18柱(4.6mm×250mm)，流动相A相：0.1％TFA/H2O，B相：0.1％TFA/CNCH3；流速：1ml/min，检测波长280nm，梯度为：0-40min，B：10％-40％；40-60min，B：40％-100％。
标准品蛋白为BSA(100μg/ml)，经Sephadex G25柱(PD SpinTrapTMG-25，GEHealthcare)脱盐后，将样品溶液和标准品溶液以相同进样体积分别注入SHIMADZULC-2010液相色谱仪，进样量50μl。梯度洗脱，记录色谱图谱。标准品溶液、样品溶液均进样3次。按下式计算：
CR为标准品溶液的含量，μg/ml；AX为样品溶液的平均峰面积；AR为标准品溶液的平均峰面积；nR为标准品溶液的稀释倍数；nX为样品溶液的稀释倍数。
水蛭素抗凝血酶生物活性测定参照Markwardt的凝血酶滴定方法(F.Markwardt，Hirudinas an inhibitor of thrombin，Methods Enzymol.19(1970)924-932.)进行。于酶标板小孔中加200μl0.5％牛血纤维蛋白原(pH7.4，50mM Tris-HCl缓冲液配制)，再加入10-100μl水蛭素溶液，充分混匀。用微量进样器吸取标准的凝血酶溶液(100NIH单位/ml)进行滴定，每次滴定量为5μl(0.5NIH单位)，时间间隔为1min，若在1min内纤维蛋白原发生凝固，说明已达到终点。由于水蛭素与凝血酶是1∶1结合，故每消耗一个凝血酶单位(NIHU)相当于一个抗凝血酶单位(ATU)。因此，可由凝血酶的消耗量换算出水蛭素的单位数。
采用下述公式换计算各个R33G34D35X36-rHVIII突变体的抗凝血酶活性的比活力：比活力＝抗凝血酶活力(ATU)/蛋白含量(mg)
实施例6抗ADP诱导的血小板聚集的药理活性
方法参照HG沃格尔，WH沃格尔著，杜冠华等译.药理学实验指南-新药发现和药理学评价.第一版[M].北京：科学出版社，2001。
新鲜静脉血经柠檬酸钠(0.11mmol/L，9∶1)抗凝，经100g离心15min后获得富血小板的血浆(PRP)。小心吸出PRP上清，剩余部分再经1400g离心10min，获得含血小板较少的血浆(PPP)。聚集试验之前，用PPP稀释PRP，使血小板终浓度为3×105/ml。在比色皿中加入300μl PRP和20μl待测药物溶液，将比色皿放入血小板聚集及凝血因子分析仪中，37℃预热60s，在连续搅拌的情况下加入聚集剂ADP(330mmol/L)10μl，检测5min。记录聚集曲线。以rHVIII作为对照。采用血小板聚集试验对其抗ADP诱导的血小板聚集活性进行了研究，每个实验点的样品数为3，并比对rHVIII、R33G34D35S36-rHVIII与R33G34D35X36-rHVIII在不同浓度下的抗ADP诱导的血小板聚集抑制率见图6、图7。
双作用靶点水蛭素突变体抗凝血酶比活力实验测定结果(见表2)
表2.双作用靶点水蛭素突变体抗凝血酶比活力测定数据
双作用靶点水蛭素突变体库抗ADP诱导血小板聚集实验活性测定结果(见表3)
表3.双作用靶点水蛭素突变体抗ADP诱导血小板聚集抑制率测定数据
SEQUENCE LISTING
<110>中国药科大学
<120>新型双作用靶点重组水蛭素突变体的优化设计与应用
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<220>
<223>以质粒pTASHRGDSV为模板设计合成的R33G34D35F36-rHVIII突变体的正向突变引物
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ggttctcgtggtgactttaaccagtgcgttactg 34
<210>28
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以质粒pTASHRGDSV为模板设计合成的R33G34D35F36-rHVIII突变体的反向突变引物
<400>28
cagtaacgcactggttaaagtcaccacgagaacc 34
<210>29
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以质粒pTASHRGDSV为模板设计合成的R33G34D35P36-rHVIII突变体的正向突变引物
<400>29
ggttctcgtggtgacccgaaccagtgcgttac 32
<210>30
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以质粒pTASHRGDSV为模板设计合成的R33G34D35P36-rHVIII突变体的反向突变引物
<400>30
gtaacgcactggttcgggtcaccacgagaacc 32
<210>31
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以质粒pTASHRGDSV为模板设计合成的R33G34D35T36-rHVIII突变体的正向突变引物
<400>31
ggttctcgtggtgacaccaaccagtgcgttac 32
<210>32
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以质粒pTASHRGDSV为模板设计合成的R33G34D35T36-rHVIII突变体的反向突变引物
<400>32
gtaacgcactggttggtgtcaccacgagaacc 32
<210>33
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以质粒pTASHRGDSV为模板设计合成的R33G34D35W36-rHVIII突变体的正向突变引物
<400>33
gttctcgtggtgactggaaccagtgcgttac 31
<210>34
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以质粒pTASHRGDSV为模板设计合成的R33G34D35W36-rHVIII突变体的反向突变引物
<400>34
gtaacgcactggttccagtcaccacgagaac 31
<210>35
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以质粒pTASHRGDSV为模板设计合成的R33G34D35Y36-rHVIII突变体的正向突变引物
<400>35
ggttctcgtggtgactataaccagtgcgttactg 34
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<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以质粒pTASHRGDSV为模板设计合成的R33G34D35Y36-rHVIII突变体的反向突变引物
<400>36
cagtaacgcactggttatagtcaccacgagaacc 34
<210>37
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以质粒pTASHRGDSV为模板设计合成的R33G34D35V36-rHVIII突变体的正向突变引物
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<223>以质粒pTASHRGDSV为模板设计合成的R33G34D35V36-rHVIII突变体的反向突变引物
<400>38
cagtaacgcactggttcacgtcaccacgagaacc 34
Claims (3)
1.一种具有与重组野生型水蛭素III(rHVIII)抗凝血酶活性比活力相当，而同时具有很高的抗ADP诱导的血小板聚集抑制率的双作用靶点水蛭素新突变体R33G34D35M36-rHVIII，其特征在于在rHVIII的第33-36位引入了可与活化血小板上的最丰富的GPIIb/IIIa受体结合从而抑制血小板聚集的吸附序列为RGDM。
2.根据权利要求1所描述的可与活化血小板上的最丰富的GPIIb/IIIa受体结合从而抑制血小板聚集的吸附序列为RGDM。
3.根据权利要求1或2所属的既抑制凝血酶又抑制ADP诱导的血小板聚集的双作用靶点水蛭素突变体的方法，其特征在于构建编码含有RGDM多肽的基因序列，采用基因工程的方法进行表达，分离和纯化。
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| CN2010106180368A CN102153646A (zh) | 2010-12-31 | 2010-12-31 | 新型双作用靶点重组水蛭素突变体的优化设计与应用 |
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|---|---|---|---|
| CN2010106180368A CN102153646A (zh) | 2010-12-31 | 2010-12-31 | 新型双作用靶点重组水蛭素突变体的优化设计与应用 |
Publications (1)
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| Country | Link |
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| CN (1) | CN102153646A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107083366A (zh) * | 2017-05-19 | 2017-08-22 | 何向锋 | 表达水蛭素的过继免疫细胞及其制备方法和用途 |
| CN107098964A (zh) * | 2017-05-19 | 2017-08-29 | 何向锋 | 一种肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途 |
| CN107216385A (zh) * | 2017-05-19 | 2017-09-29 | 何向锋 | 肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途 |
| CN115572329A (zh) * | 2021-06-21 | 2023-01-06 | 王大勇 | 一组活性增强代谢较慢的菲牛蛭基因重组水蛭素及其制备方法 |
-
2010
- 2010-12-31 CN CN2010106180368A patent/CN102153646A/zh active Pending
Cited By (5)
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| CN107216385A (zh) * | 2017-05-19 | 2017-09-29 | 何向锋 | 肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途 |
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| CN115572329B (zh) * | 2021-06-21 | 2024-02-06 | 王大勇 | 一组活性增强代谢较慢的菲牛蛭基因重组水蛭素及其制备方法 |
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