CN107446036A - 一种血小板细胞因子浓集物的富集方法 - Google Patents

一种血小板细胞因子浓集物的富集方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血小板细胞因子浓集物的富集方法，所述方法为：取全血，收集血小板并用生理盐水制成细胞悬液，在超声功率100‑200W条件下进行超声破碎若干次，每次破碎时间1‑60s，过滤破碎混合液，取滤液，得到血小板细胞因子浓集物。本发明获得的血小板超声裂解液(细胞因子浓集物)，包括TGF‑β、PDGF、IGFs、FGFs、EGF、VEGF等，具有多种生物活性，可增加机体软骨细胞活力，促进干细胞增殖、分化，有助于软骨及骨组织的再生与修复。该组合物可制成针剂、粉剂等，在医学骨组织工程领域有极佳的应用前景。

Description

一种血小板细胞因子浓集物的富集方法
(一)技术领域
本发明涉及一种可用于软骨及骨组织损伤修复的血小板细胞因子浓集物富集方法。
(二)背景技术
血小板(platelet)是哺乳动物血液中的无核细胞，能通过胞内α颗粒的脱颗粒作用释放大量细胞生长因子，包括血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、类胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factor,IGF-1)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactor,FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等(Sanchez et al.,Int J OralMaxillofac Implants,2003,18(1):93-103)。血小板释放的细胞生长因子具有较强的生物学活性，可诱导骨细胞的分裂增殖及胶原合成，促进骨组织的修复与重建(Marx RE,Implant Dent,2001,10(4):225-228)。其中，PDGF可促进成骨细胞的趋化、增殖，增加胶原蛋白的合成能力；TGF-β具有刺激成骨前体细胞及成骨细胞的趋化和增殖、抑制破骨细胞形成和骨吸收的作用；IGF-1能增加成骨细胞活力、促进软骨与骨基质生成；VEGF可促进新生血管形成，有利于病灶区营养物质的供给，还能直接作用于成骨细胞和软骨细胞，增强其迁移、增值和细胞活力(Bouletreau PJ,et al.,Plast Reconstr Surg,2002,110(1):139-148；Maeda S,et al.,EMOB J,2004,23(3):552-563；Trippel SB,Clin Orthop RelatRes.1998.(355Suppl):301-313；Ferrara N,et al.,Nat Med.2003.9(6):669-676)。血小板可从患者自身全血中提取，经富集处理后发挥治疗作用，具有来源丰富，取材方便，分离简单等特点，广泛应用于骨科、口腔科、运动医学等领域。
目前，血小板细胞因子主要通过富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)和血小板裂解液(platelet lysate,PL)两种形式开展应用。PRP是全血经过离心分离得到的血小板浓缩物，其制备原理是利用血液中各种成分沉降速度不同，通过离心将血液分层。全血经低速离心可分为三层，上层是贫血小板血浆层(PPP)、中间为富血小板血浆层(PRP)、下层为红细胞层，取中间层可得到高度浓缩的含血小板血浆。现有的PRP制备方法有一次离心法和二次离心法。无论是哪种离心法，都无法避免红细胞、白细胞、血小板以及血浆的残留，具有潜在免疫原性和病原感染风险，限制了临床应用(Brittinghan and Chaplin,JAMA,1957,165(7):819-825.)。
PL是PRP经反复冻融裂解细胞后衍生而来，去除了残余细胞结构，降低了免疫原性，并保留了血小板的多种细胞生长因子，为异体或异种移植创造了条件。然而，现有的PL制备方法过于温和，无法完全裂解细胞，未能发挥最佳作用。
本发明涉及一种从未公开过的血小板细胞因子的提取方法及优化工艺，与现有方法相比有较大区别，不仅能充分裂解血小板、获得高浓度的细胞因子、去除残余细胞结构，还建立了相关质量控制标准，能应用于骨组织工程领域中骨与软骨组织的修复和再生。本发明具有较高的重复性和可操作性，有望成为本领域技术人员迫切期待的一种血小板细胞因子制备技术。
(三)发明内容
目前生物医学领域缺少可用于血小板细胞因子提取的有效手段，唯一公开的PL(血小板裂解液)制备方法存在较多不足：①血小板裂解不充分，细胞因子得率低；②缺少浓缩富集步骤，细胞因子浓度低；③缺少质量检测方法。针对上述技术问题，本发明旨在提供一种适用于人和动物血小板细胞因子的超声提取方法，并确定相关质量检测标准。相比现有血小板裂解方法具有提取充分、得率高、可浓缩富集等优势。所获得的血小板细胞因子可促进组织修复和再生。
本发明方法获得可促进干细胞增殖分化的高浓度细胞因子浓集物，去除了血小板膜和其他细胞残片，降低了免疫原性，获得的血小板细胞因子种类多、含量高、提取效率高，适用于包括人在内不同种属的血小板细胞因子。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种血小板细胞因子浓集物的富集方法，所述方法为：取全血(优选人或动物的全血)，收集血小板并用生理盐水制成细胞悬液，在超声功率100-200W条件下进行超声破碎若干次(优选1-6次，每次间隔10s)，每次破碎时间1-60s，过滤破碎混合液，取滤液，得到血小板细胞因子浓集物。
进一步，所述超声是在荷载2-6mm探头的超声细胞破碎仪中进行。
进一步，所述超声条件优选为：超声功率200W，超声1次，破碎时间60s。
进一步，所述细胞悬液中细胞浓度为104-108/ml。
进一步，所述过滤采用0.22-0.45μm孔径滤头过滤。
进一步，所述血小板制备方法为：
(1)采集人或动物的全血与抗凝剂充分混匀，加入离心管a，1000rpm离心10分钟，分为上层、中间层和下层共3层(下层为红细胞，上层为贫血小板层，中间层为富血小板层(含有血小板和白细胞))，收集上层和中间层于离心管b中，无须刻意避免抽取红细胞；所述抗凝剂为枸橼酸钠、肝素或水蛭素；
(2)往步骤(1)取出上层和中间层后的离心管a中加入生理盐水，1000rpm离心10分钟，分为上层、中间层和下层共3层，收集上层和中间层加入步骤(1)离心管b中，混合；
(3)往步骤(2)离心管b中加入红细胞裂解液，混匀静置30分钟，1500rpm离心20分钟，分成上清液层、中间白色絮状层和底部沉淀层，分别收集上清液层与中间白色絮状层，分别置于离心管c和离心管d中；离心管c在1500rpm离心20分钟，收集沉淀加入离心管d中，再加入生理盐水，1500rpm离心20分钟，分成上层、中间白色层和下层，收集中间白色层，即为纯化的血小板。
进一步，步骤(1)抗凝剂与全血体积比为1:9。
进一步，步骤(1)红细胞裂解液为氯化铵、淋巴细胞分离液或其他商品化或自行配制的红细胞裂解液，优选质量浓度为1％的氯化铵水溶液。
本发明血小板细胞因子浓集物，以流式细胞仪对过滤前后的细胞超声裂解液进行分析。人选用CD41a-PE抗体(eBioscience,USA)进行阳性率检测，大鼠和小鼠选用CD61-PE抗体(eBioscience,USA)进行阳性率检测，明确血小板的破碎程度和过滤程度。以酶联免疫法(ELISA法)检测血小板细胞因子浓集物中各细胞因子含量，包括TGF-β、PDGF、IGFs、FGFs、EGF、VEGF等。
现已公开的同类技术是通过反复冻融富血小板血浆(PRP)得到的血小板裂解液(PL)。与之相比，本发明有益效果主要体现在：
1)PL是基于PRP制备的裂解液，由于PRP无法避免红细胞、白细胞以及血浆的残留，导致PL中存在较多杂细胞及血浆残留，会影响其中细胞因子发挥作用，并带来潜在安全隐患；本发明是基于前期专利技术(ZL 2014 1 0508458.8)得到的纯化血小板进行制备，因此能避免杂细胞和血浆的干扰，具有更好的安全性和生物学效应。
2)PL通过反复冻融3次得到，而对PL的流式细胞仪检测结果发现，该方法无法裂解全部血小板，仍有80％以上的血小板保持形态完整，因而未能充分得到细胞因子；本发明通过超声破碎的方法，能充分裂解血小板，最大化提取细胞因子(图4)。
3)酶联免疫法(ELISA法)检测结果显示，本发明得到的TGF-β、PDGF、IGF-1、VEGF含量要显著高于PL中的含量(图5、表1)；细胞实验亦表明，本发明得到的血小板细胞因子浓集物促进干细胞增殖活力的作用显著高于PL(图1、2、3)，进一步证明本发明方法的优势。
本发明获得的血小板超声裂解液(细胞因子浓集物)，包括TGF-β、PDGF、IGFs、FGFs、EGF、VEGF等，具有多种生物活性，可增加机体软骨细胞活力，促进干细胞增殖、分化，有助于软骨及骨组织的再生与修复。该组合物可制成针剂、粉剂等，在医学骨组织工程领域有极佳的应用前景。
(四)附图说明
图1为实施例1中MTT法检测人血小板细胞因子浓集物对人间充质干细胞增殖及活力的影响；柱状图中不同字母代表统计学上有显著性差异，其中a最高，c最低。
图2为实施例2中MTT法检测大鼠血小板细胞因子浓集物对人间充质干细胞增殖及活力的影响；柱状图中不同字母代表统计学上有显著性差异，其中a最高，c最低。
图3为实施例3中MTT法检测小鼠血小板细胞因子浓集物对人间充质干细胞增殖及活力的影响；柱状图中不同字母代表统计学上有显著性差异，其中a最高，c最低。
图4为实施例1流式细胞仪检测结果，a为步骤(5)血小板检测结果，b为PL法血小板冻融裂解液检测结果，c为步骤(6)超声处理后的血小板细胞因子浓集物检测结果。
图5为实施例1ELISA检测结果。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
(1)采集人全血9ml到含有1ml抗凝剂(质量浓度3.2％枸橼酸钠水溶液)的容器中，抗凝剂与全血的体积比是1:9，充分混匀，避免出现凝血。
(2)将步骤(1)混匀的血液分配到离心管a，以转速1000rpm离心10分钟，离心后血液应分为三层：下层为红细胞，上层为贫血小板层，中间层为富血小板层(含有血小板和白细胞)。
(3)利用移液器把步骤(2)离心管a上层和中间层抽出并转移到新的离心管b中，无须刻意避免抽取红细胞。
(4)往步骤(3)取出上层和中间层的离心管a中加入适量生理盐水，以转速1000rpm离心10分钟，再次分成上层(贫血小板层)、中间层(富血小板层)和下层(红细胞)，利用移液器把上层(贫血小板层)和中间层抽出并加入步骤(3)的离心管b中，混合。
(5)往步骤(4)离心管b中加入1ml质量浓度为1％的氯化铵水溶液，混匀静置30分钟，以转速1500rpm离心20分钟，分成上清液层、中间白色絮状层和底部沉淀层，利用移液器分别收集上清液层与中间白色絮状层，分别置于离心管c和离心管d中。其中上清液层(离心管c)再以1500rpm离心10分钟，收集底部白色沉淀加入离心管d中，与白色絮状层混合，再加入适量生理盐水，以转速1500rpm离心10分钟，收集中间白色层，即为纯化的血小板。抽取100微升纯化血小板采用BD流式细胞仪对富集的血小板进行浓度检测，并用CD41a-PE抗体(eBioscience,USA)进行阳性率检测(图4中a)，血小板计数3.1×1011/L，阳性率97.87％，检测结果用于该工艺的质量控制。
(6)将步骤(5)纯化的血小板用生理盐水制成104/ml细胞悬液5ml，以荷载2mm探头超声细胞破碎仪(VCX 500,500W/20KHz,SONICS&MATERIALS.INC.,USA)进行超声破碎，超声功率为200W，破碎时间60s，破碎1次。以0.22μm孔径滤头过滤破碎混合液，得到血小板细胞因子浓集物。以BD流式细胞仪对过滤前的细胞悬液和破碎后的细胞超声破碎混合液进行浓度检测，并用CD41a-PE抗体(eBioscience,USA)进行阳性率检测(图4中c)，血小板计数＜1×109/L，阳性率7.67％，明确血小板的破碎程度和过滤程度。以酶联免疫法(ELISA法)检测血小板细胞因子浓集物中各细胞因子含量，包括TGF-β、PDGF-BB、IGF-1、VEGF，得到结果如表1和图5。
PL法制备的血小板冻融裂解液浓度检测和阳性率检测见图4中b。步骤(6)血小板细胞因子浓集物和PL法制备的血小板冻融裂解液的ELISA检测结果见图5。
(7)将步骤(6)收集的血小板细胞因子浓集物设置成高浓度(原液)、中浓度(1/10原液，剩余为生理盐水)、低浓度(1/50原液，剩余为生理盐水)，分别取50μL加入150μL接种有间充质干细胞的DMEM培养基的96孔板中，37℃分别培养24h、48h、72h，在每个时间点进行细胞活力检测(MTT法)，并与PL法进行比较，结果见图1。结果表明，人血小板细胞因子浓集物从24h起便能显著提高干细胞增殖活力，具有时间依赖性和剂量依赖性，且效果优于PL(图1)。
PL法是指将步骤(5)制备的血小板置于-20℃冷冻后迅速放置37℃解冻，反复3次，得到血小板冻融裂解液，同血小板细胞因子浓集物浓度设置进行MTT法检测及ELISA检测，结果见表1和图1所示。
同样条件下，用等量生理盐水代替血小板细胞因子浓集物作为空白对照。
(8)采用Raybiotech抗体芯片AAH-BLG-507分别对步骤(6)的血小板细胞因子浓集物和PL法制备的血小板冻融裂解液进行成分分析。方法如下：每个样本取400μL，各分为两管，分别加入透析管中，置于500mL、pH＝8.0的PBS的透析液中，4℃过夜透析，期间不时摇晃和更换新的PBS两次。将透析过的样品(透过液)转移至新的1.5mL离心管，4℃，10000rpm，离心5min，将上清转移至新的离心管内。每个透析后样本(透过液)取180μL，按照36μLBiotin/mg Protein加入相对应的Labeling Reagent tube，室温震荡30min。每个样本分别加入3μL Stop Solution(Item D)，震荡混匀后，置于500mL、pH＝8.0的PBS的透析液中，4℃过夜透析，期间不时摇晃和更换新的PBS两次。将透析过的样品转移至新的1.5mL离心管，4℃，10000rpm，离心5min，将上清转移至新的离心管内，用于芯片检测。结果如表2所示，与PL相比，本发明方法得到的血小板细胞因子浓集物中增加了BMP-3b、GDF-10、BMP-4、BMP-8、CCR4、CCR6、FGF R4等细胞因子。说明本方法提取到了更多种类的细胞因子。
表1、ELISA检测结果
表2、抗体芯片检测结果
实施例2
操作步骤同实施例1，所不同的是采用大鼠样本，步骤(6)中，细胞悬液浓度为106/ml，超声破碎仪荷载探头规格4mm，超声功率为150W，每次破碎时间为30s，间隔10s，破碎3次。
制备得到的细胞因子浓集物中TGF-β、PDGF、IGF-1和VEGF含量分别高于100pg/ml、50pg/ml、300pg/ml、70pg/ml，如表3所示。
同实施例1步骤(7)，将实施例2收集的血小板细胞因子浓集物设置成高浓度(原液)、中浓度(1/10原液)、低浓度(1/50原液)，分别加入培养有间充质干细胞的细胞板中，37℃分别培养24h、48h、72h，在每个时间点进行细胞活力(MTT法)检测及ELISA检测，并与PL法进行比较，结果见图2和表3。结果表明，大鼠血小板细胞因子浓集物从24h起也能显著提高干细胞增殖活力，具有时间依赖性和剂量依赖性，且效果优于PL(图2)。
表3、ELISA检测结果
实施例3
操作步骤同实施例1，所不同的是采用小鼠样本，步骤(6)中，细胞悬液浓度为108/ml，超声破碎仪荷载探头规格6mm，超声功率为100W，每次破碎时间为10s，间隔10s，破碎6次。
制备得到的细胞因子浓集物中TGF-β、PDGF、IGF-1和VEGF含量分别高于100pg/ml、50pg/ml、300pg/ml、70pg/ml。
同实施例1步骤(7)，将实施例3收集的血小板细胞因子浓集物设置成高浓度(原液)、中浓度(1/10原液)、低浓度(1/50原液)，分别加入培养有间充质干细胞的细胞板中，37℃分别培养24h、48h、72h，在每个时间点进行细胞活力(MTT法)检测及ELISA检测，并与PL法进行比较，结果见图3和表4。结果表明，小鼠血小板细胞因子浓集物从48h起能显著提高干细胞增殖活力，具有时间依赖性和剂量依赖性，且效果优于PL(图3)。
表4、ELISA检测结果

Claims (9)

1.一种血小板细胞因子浓集物的富集方法，其特征在于所述方法为：取全血，收集血小板并用生理盐水制成细胞悬液，在超声功率100-200W条件下进行超声破碎若干次，每次破碎时间1-60s，过滤破碎混合液，取滤液，得到血小板细胞因子浓集物。
2.如权利要求1所述血小板细胞因子浓集物的富集方法，其特征在于所述超声是在荷载2-6mm探头的超声细胞破碎仪中进行。
3.如权利要求1所述血小板细胞因子浓集物的富集方法，其特征在于所述超声破碎次数为1-6次。
4.如权利要求1所述血小板细胞因子浓集物的富集方法，其特征在于所述超声条件为：超声功率200W，超声1次，破碎时间60s。
5.如权利要求1所述血小板细胞因子浓集物的富集方法，其特征在于所述细胞悬液中细胞浓度为104-108/ml。
6.如权利要求1所述血小板细胞因子浓集物的富集方法，其特征在于所述过滤采用0.22-0.45μm孔径滤头过滤。
7.如权利要求1所述血小板细胞因子浓集物的富集方法，其特征在于所述血小板制备方法为：
(1)采集人或动物的全血与抗凝剂充分混匀，加入离心管a，1000rpm离心10分钟，分成上层、中间层和下层，收集上层和中间层于离心管b中；所述抗凝剂为枸橼酸钠、肝素或水蛭素；
(2)往步骤(1)取出上层和中间层的离心管a中加入生理盐水，1000rpm离心10分钟，再次分成上层、中间层和下层，收集上层和中间层加入步骤(1)离心管b中，混合；
(3)往步骤(2)离心管b中加入红细胞裂解液，混匀静置30分钟，1500rpm离心20分钟，分成上清液层、中间白色絮状层和底部沉淀层，收集上清液层与中间白色絮状层，分别置于离心管c和离心管d中；离心管c在1500rpm离心20分钟，收集沉淀加入离心管d中，再加入生理盐水，1500rpm离心20分钟，分成上层、中间白色层和下层，收集中间白色层，即为血小板。
8.如权利要求7所述血小板细胞因子浓集物的富集方法，其特征在于步骤(1)抗凝剂与全血体积比为1:9。
9.如权利要求7所述血小板细胞因子浓集物的富集方法，其特征在于步骤(1)红细胞裂解液为质量浓度为1％的氯化铵水溶液。
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