CN111303270A - 一种利用套装制备血小板生长因子浓集物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用套装制备血小板生长因子浓集物的方法，属于再生医学技术领域。本发明将抗凝全血静置30～60min后，再利用富血小板血浆制备用套装对静置后的抗凝全血进行离心，有利于提高产物的纯度和得率；本发明在离心后保留富血小板血浆层(PPP层)和贫血小板血浆层(PRP层)进行冻融，能够最大化的得到生长因子。本发明的制备方法制备得到的血小板生长因子浓集物(GF‑PL)含有高浓度的各类生长因子，包括PDGF、TGF‑β、IGF‑1、EGF、FGF和VEGF，各因子浓度显著高于常规血小板套装制备的产物(PRP)和常规血小板裂解液制备的产物，差异结果均具有统计学意义。

Description

一种利用套装制备血小板生长因子浓集物的方法
技术领域
本发明涉及再生医学技术领域，尤其涉及一种利用套装制备血小板生长因子浓集物的方法。
背景技术
富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)是自体抗凝全血经离心后得到的血小板浓缩物。PRP通过释放各种生长因子(PDGF、IGF-1、EGF、FGF、TGF-beta、VEGF等)，促进组织再生修复，包括关节软骨的修复。PRP中生长因子的含量越高，越有利于组织的再生修复。目前缺少一种含有高浓度生长因子的血小板浓缩物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用套装制备血小板生长因子浓集物的方法，本发明的血小板生长因子浓集物中生长因子含量高，有利于组织的再生修复。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利用套装制备血小板生长因子浓集物的方法，包括以下步骤：
1)将抗凝全血静置30～60min，利用富血小板血浆制备用套装对静置后的抗凝全血进行离心，收集富血小板血浆层和贫血小板血浆层的产物，得到离心产物；
2)对所述离心产物进行3～6次冻融，得到冻融产物；
3)将所述冻融产物进行离心，收集上清液，得到血小板生长因子浓集物。
优选的，步骤2)中所述冻融的次数为4～5次。
优选的，步骤2)中所述冻融的方式包括液氮冻融。
优选的，步骤2)中每次冻融过程中将所述离心产物于-20～-196℃条件下冷冻5～10min后，于4～37℃的条件下融解5～10min。
优选的，步骤2)中所述冷冻的温度为-30～-80℃。
优选的，所述融解的过程中伴随超声或震荡处理。
优选的，步骤3)中所述离心的转速为3000～10000rpm，时间为5～10min，温度为0～4℃。
本发明还提供了上述方案所述方法制备得到的血小板生长因子浓集物。
本发明还提供了上述方案所述血小板生长因子浓集物在制备组织再生修复的药物中的应用。
优选的，所述组织再生修复包括关节软骨修复、皮肤损伤修复和压疮损伤修复。
本发明的有益效果：本发明提供了一种利用套装制备血小板生长因子浓集物的方法，本发明将抗凝全血静置30～60min后，再利用富血小板血浆制备用套装对静置后的抗凝全血进行离心，有利于提高产物的纯度和得率；本发明在离心后保留富血小板血浆层(PRP，中层)和贫血小板血浆层(PPP，上层)进行冻融，能够最大化的得到生长因子。本发明的制备方法制备得到的血小板生长因子浓集物(GF-PL)含有高浓度的各类生长因子，包括PDGF、TGF-β、IGF-1、EGF、FGF和VEGF，各因子浓度显著高于常规血小板套装制备的产物(PRP)和常规血小板裂解液制备的产物，差异结果均具有统计学意义。
附图说明
图1为实施例3中ELISA法检测GF-PL与PRP中各种生长因子浓度及比较，其中图1中的A为PDGF含量，图1中的B为TGF-β含量，图1中的C为IGF-1，图1中的D为EGF，图1中的E为FGF，图1中的F为VEGF，P<0.01表明GF-PL与PRP之间的浓度具有极显著差异；
图2为实施例4中大鼠机械痛(MWT)检测结果；
图3为实施例4中大鼠热痛(TWL)检测结果；
图4为实施例4中各组大鼠膝关节组织病理切片的观察结果，其中，图4中的A表示正常组，图4中的B表示模型组，图4中的C表示GF-PL干预组，图4中的D表示PRP干预组；
图5为实施例4中各组大鼠膝关节组织病理切片的评分结果；
图6为实施例5中裸鼠模型大体观察结果,其中，图6中的A表示正常组，图6中的B表示模型组，图6中的C表示GF-PL干预组，图6中的D表示PRP干预组，图6中的E表示正常组颈背部皮肤显微放大图，图6中的F表示模型组颈背部皮肤显微放大图，图6中的G表示GF-PL组颈背部皮肤显微放大图，图6中的H表示PRP干预组颈背部皮肤显微放大图；
图7为实施例5中裸鼠皮肤Masson染色组织病理观察结果，其中，图7中的A表示PRP干预组，图7中的B表示GF-PL干预组，图7中的C表示模型组，图7中的D表示正常组；
图8为实施例5中裸鼠皮肤真皮厚度测量结果；
图9为实施例6中压疮模型示意图，其中图9中的A表示压疮模型实体照片，图9中的B表示模型受力示意图；
图10为实施例6中大鼠背部创面大体观察，其中图10中的A表示正常组，图10中的B表示模型组，图10中的C表示GF-PL干预组，图10中的D表示PRP干预组。
具体实施方式
本发明提供了一种利用套装制备血小板生长因子浓集物的方法，包括以下步骤：
1)将抗凝全血静置30～60min，利用富血小板血浆制备用套装对静置后的抗凝全血进行离心，收集富血小板血浆层(PRP，中层)和贫血小板血浆层(PPP，上层)的产物，得到离心产物；
2)对所述离心产物进行3～6次冻融，得到冻融产物；
3)将所述冻融产物进行离心，收集上清液，得到血小板生长因子浓集物。
本发明首先将抗凝全血静置30～60min，利用富血小板血浆制备用套装对静置后的抗凝全血进行离心，收集富血小板血浆层(PRP，中层)和贫血小板血浆层(PPP，上层)的产物，得到离心产物；本发明具体实施过程中，所述抗凝全血采用常规方法采集获得；所述静置的温度优选为18～25℃；所述富血小板血浆制备用套装来源于常规市售，本发明具体实施过程中，所述富血小板血浆制备选用“富血小板血浆(PRP)制备用套装”(国械注准20163661321)，购自山东威高新生医疗器械有限公司，相关专利号为CN105107233A。
得到离心产物后，本发明对所述离心产物进行3～6次冻融，得到冻融产物；所述冻融的次数优选为4～5次；所述冻融的方式优选的包括液氮冻融；每次冻融过程中将所述离心产物于-20～-196℃条件下冷冻5～10min后，于4～37℃的条件下融解5～10min；所述冷冻的温度优选为-30～-80℃；所述融解的过程中优选的伴随超声或震荡处理；所述超声或震荡处理有利于生长因子的释放，能够提高冻融效率和生长因子提取率；所述超声处理优选的在超声波恒温水浴锅中进行；所述超声的功率优选为500～600W；所述超声的频率优选为40～50KHZ；所述震荡处理优选的在恒温震荡金属浴中进行；所述震荡的转速优选为1800rpm；所述震荡的功率优选为200W；所述震荡的震动幅度是3mm的水平回转。
常规富血小板血浆(PRP)发挥作用的原理是血小板逐步释放生长因子发挥作用，而本发明经过3～6次冻融处理后，得到来源于PRP+PPP裂解液的血小板生长因子浓集物(GF-PL)可以直接获得这些生长因子，浓度高于常规PRP。
得到冻融产物后，本发明将所述冻融产物进行离心，收集上清液，得到血小板生长因子浓集物；所述离心的转速优选为3000～10000rpm，时间优选为5～10min，温度优选为0～4℃；所述离心的作用是去除细胞碎片等杂质。
本发明还提供了上述方案所述制备方法制备得到的血小板生长因子浓集物。
本发明还提供了上述方案所述血小板生长因子浓集物在制备组织再生修复的药物中的应用；所述组织再生修复优选的包括关节软骨修复、皮肤损伤修复和压疮损伤修复。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1)将采集后的抗凝全血静置30min，利用“富血小板血浆(PRP)制备用套装”(国械注准20163661321，购自山东威高新生医疗器械有限公司，相关专利号为CN 105107233 A)对静置后的抗凝全血进行离心，收集富血小板血浆层和贫血小板血浆层的产物(PRP+PPP的产物)，得到离心产物；
2)对离心产物于37～-80℃之间(冷冻温度为-20～-80℃，融解温度为4～37℃，融解过程在超声波水浴锅中进行)冻融5次，得到冻融产物；
3)将所述冻融产物进行离心(5000rpm、10min、4℃)，收集上清液，得到血小板生长因子浓集物(GF-PL)。
实施例2
1)将采集后的抗凝全血静置30min，利用“富血小板血浆(PRP)制备用套装”(国械注准20163661321，购自山东威高新生医疗器械有限公司，相关专利号为CN 105107233 A)对静置后的抗凝全血进行离心，收集富血小板血浆层和贫血小板血浆层的产物(PRP+PPP的产物)，得到离心产物；
2)将离心产物置于液氮中冷冻3～5min，再放置于37℃超声水浴锅或金属浴中解冻5～10min，解冻过程中加入超声(水浴锅)或震荡(金属浴)步骤，反复5次，得到冻融产物；
3)将所述冻融产物进行离心(5000rpm、10min、4℃)，收集上清液，得到血小板生长因子浓集物(GF-PL)。
对比例1
利用“富血小板血浆(PRP)制备用套装”(国械注准20163661321，购自山东威高新生医疗器械有限公司，相关专利号为CN 105107233 A)对采集后的抗凝全血，进行离心，收集富血小板血浆层(PRP)，得到富血小板血浆(PRP)。
对比例2
利用常规血小板裂解液(PL)(参考专利CN 104673747 B和CN 103702674 A的共同步骤)对采集后的抗凝全血进行血小板生长因子的提取。具体步骤如下：利用“富血小板血浆(PRP)制备用套装”(国械注准20163661321，购自山东威高新生医疗器械有限公司，相关专利号为CN 105107233 A)对采集后的抗凝全血，进行离心，收集富血小板血浆层(PRP)，在-80～37℃反复冻融5次，得到来源于PRP的血小板冻融裂解液(PL)。
实施例3本发明实施例1制备得到的血小板生长因子浓集物(GF-PL)、对比例1的套装制备方法制备得到的富血小板血浆(PRP)与常规血小板裂解液(PL)(参考专利104673747B)的比较
方法：准备好所有待测样本，先用300μl洗液浸泡酶标板各孔，甩干后在不同孔分别加入标准品和样本(100μl)，而后每孔加入50μl检测抗体，使用封板膜封板，300rpm振荡，室温孵育2h；用洗液洗涤后加酶(辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素)孵育，使用新的封板膜封板，300rpm振荡，室温孵育45min；用洗液洗涤后每孔加入100μl显色底物TMB，避光室温孵育5～30min；最后加每孔加入100μl终止液，颜色由蓝色变为黄色后，使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和570nm或630nm参考波长下的OD值。结果分析：计算标准品和样本的平均OD值，然后减去零浓度标准品的OD值，进行回归拟合生成标准曲线，通过对浓度值和OD值取对数拟合，得到各生长因子的浓度，每个样本检测3次重复。
结果：ELISA检测结果表明(图1，其中图1中的A为PDGF，图1中的B为TGF-β，图1中的C为IGF-1，图1中的D为EGF，图1中的E为FGF，图1中的F为VEGF)，本发明方法得到的血小板生长因子浓集物(GF-PL)含有高浓度的各类生长因子，包括PDGF、TGF-β、IGF-1、EGF、FGF和VEGF，各因子浓度显著高于常规血小板套装制备的产物(PRP)和PL组(**P＜0.01是组间比较，说明PRP和PL组的因子含量极显著低于本发明GF-PL组的因子含量)，差异结果均具有统计学意义。
实施例4本发明实施例1制备得到的血小板生长因子浓集物(GF-PL)与对比例1的套装制备方法制备得到的富血小板血浆(PRP)在关节软骨修复中的应用比较
1、大鼠实验
分组造模及干预：取SPF级雄性大鼠40只，称重后进行随机分组：正常组、模型组、GF-PL组、PRP组，每组10只，饲养一周适应，实验前禁食10h，不断水。各组按0.3ml/100g剂量进行水合氯醛溶液(10％)腹腔注射实施麻醉，脱去大鼠双侧膝关节被毛后消毒，使关节屈曲90度，正常组用微量注射器向双侧关节腔内各注射50μl生理盐水，其余各组注射含4mg浓度的MIA溶液进行MIA造模。造模一周后，GF-PL组、PRP组分别进行关节注射107/ml的GF-PL和PRP)；正常组和模型组关节灌胃等体积的生理盐水。每周干预1次，连续4周。
2、指标检测：
分别在造模前和处理观察4周后进行疼痛行为学指标检测。机械痛：采用YLS-3E电子压痛测定仪对各组大鼠后足压痛阈值进行检测，将大鼠放置于特定暗格中，适应后用压痛仪感应针头刺激大鼠组足底，待大鼠抬腿躲避，从记录仪上得到压力值。每次测量3个重复，取平均值为压痛阈值。热痛：采用RTY-3电子热痛测量仪对各组大鼠后足热痛阈值进行检测，将大鼠放置于特定暗格中，底部有2mm厚玻璃导热板，将热刺激装置放置其下，将探头对准大鼠足底，待大鼠出现收缩反应后记录时间，重复3次，得到平均值为热痛阈值。
3、组织病理检测：疼痛指标检测结束后，过量注射水合氯醛处死各组大鼠，取单侧膝关节进行组织病理学检测。沿胫骨切开膝内侧皮肤，分离周围肌肉和脂肪组织，充分暴露关节囊，分别在中段剪断股骨和胫骨，取出关节置于无菌台布，清除多余肌肉组织后用PBS清洗样本，再打开关节腔，取出部分滑膜组织，将剩余组织置于含4％多聚甲醛的固定液中固定48h，而后进行快速脱钙、脱水、石蜡包埋、组织切片和HE染色。对组织病理片进行显微观察和Mankin评分(表1)。
表1 Mankin评分标准
Figure BDA0002386433560000071
Figure BDA0002386433560000081
结果1：
机械痛(MWT)如图2所示，热痛(TWL)结果如图3所示，造模前各组之间的MWT和TWL值无显著差异；在关节腔注射后第28天，模型组MWT和TWL值与正常组相比显著减小(P<0.01)，说明模型组大鼠产生关节疼痛；GF-PL组的MWT和TWL值较模型组有明显提高(P<0.01)，并且高于PRP组，说明GF-PL能显著缓解MIA引起的关节疼痛，效果优于PRP。
结果2：
对各组大鼠膝关节组织病理切片的观察结果如图4所示，其中，图4中的A表示正常组，图4中的B表示模型组，图4中的C表示GF-PL干预组，图4中的D表示PRP干预组；各组大鼠膝关节组织病理切片的评分结果如图5所示，正常组大鼠膝关节软骨面光滑完整、软骨细胞排列整齐、没有明显缺失和肥大化倾向、软骨基质和软骨下骨形态正常；模型组大鼠膝关节软骨严重缺失、存在软骨下骨纤维病变；GF-PL组关节软骨形态有明显改善、软骨细胞数量形态接近正常、未见软骨下骨病变；PRP组关节软骨有一定程度改善，但存在明显软骨损伤和软骨细胞缺失。Mankin评分结果表明，模型组评分显著高于正常组(P<0.01)，GF-PL组评分显著低于模型组，PRP评分低于模型组，但高于GF-PL组。上述结果表明，GF-PL和PRP均能发挥修复软骨损伤、干预骨关节炎的作用，但GF-PL效果明显优于PRP。
实施例5本发明实施例1制备得到的血小板生长因子浓集物(GF-PL)与对比例1的套装制备方法制备得到的富血小板血浆(PRP)在皮肤损伤修复中的应用比较
造模与干预：
取40只6周龄大的SPF级雄性裸鼠，随机分成5组：正常组、模型组、GF-PL低浓度组、GF-PL组、PRP组，每组10只。正常组外，其余各组动物每天背部皮下注射D-gal(1,000mg/kg，皮下注射)8周，背部左右可进行对比。允许所有动物自由获取水和食物，并且每天观察背部注射部位皮肤的变化。拍照记录。在第8周开始每隔一周分别在GF-PL组和PRP组同一部位注射GF-PL和PRP各107/ml浓度，共4周。对照组注射生理盐水。第12周时处死小鼠，取背部同一区域小块皮肤进行组织学检查，进行Masson染色。
结果：
大体观察结果如图6所示，其中，图6中的A表示正常组，图6中的B表示模型组，图6中的C表示GF-PL干预组，图6中的D表示PRP干预组，图6中的E表示正常组背部皮肤显微放大图，图6中的F表示模型组组背部皮肤显微放大图，图6中的G表示GF-PL干预组背部皮肤显微放大图，图6中的H表示PRP干预组背部皮肤显微放大图；造模后模型组呈现明显的皮肤皱纹，而经过GF-PL和PRP干预后，皱纹明显缓解。其中GF-PL组裸鼠皱纹比PRP组更少。组织病理观察如图7所示，其中，图7中的A表示PRP干预组，图7中的B表示GF-PL干预组，图7中的C表示模型组，图7中的D表示正常组；真皮厚度测量结果如图8所示，正常组表皮层、真皮层完整，染色正常；模型组真皮层明显变薄，且染色较浅，说明真皮组织和胶原含量减少；GF-PL组和PRP组的真皮层及胶原含量均多于模型组，其中GF-PL组真皮层厚度显著高于PRP组。上述结果说明GF-PL和PRP均有修复皮肤衰老的作用，GF-PL的作用明显优于PRP。
实施例6本发明实施例1制备得到的血小板生长因子浓集物(GF-PL)与对比例1的套装制备方法制备得到的富血小板血浆(PRP)在压疮损伤修复中的应用比较
造模与干预：
取50只6周龄大的SPF级雄性ICR小鼠，随机分成5组：正常组、模型组、GF-PL组、PRP组，每组10只。正常组外，其余各组动物剔除背部毛发，用两个厚度为5毫米的圆形磁铁挤压皮肤(如图9所示，其中图9中的A表示压疮模型实体照片，图9中的B表示模型受力示意图)，产生50mmHg的压缩压力。除正常组外，各组动物使用五个局部缺血-再灌注周期使得压力性溃疡形成。单个缺血-再灌注周期包括放置磁铁12h，然后释放或休息12h。允许动物随意进食和饮水。造模后在GF-PL组和PRP组局部溃疡区域分别涂抹GF-PL和PRP各107/ml浓度，每2天1次，连续2周。每天观察创面形态，2周后处死小鼠，取皮肤进行组织病理学检测。
结果：
大体观察结果如图10所示，其中图10中的A表示正常组，图10中的B表示模型组，图10中的C表示GF-PL干预组，图10中的D表示PRP干预组；模型组造成明显的缺血性压疮；经过GF-PL治疗后，创面得到明显修复，牙床面积显著减小；而经过PRP治疗后，创面修复不明显。上述结果表明，在压疮修复方面，GF-PL的作用显著优于PRP。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用套装制备血小板生长因子浓集物的方法，包括以下步骤：
1)将抗凝全血静置30～60min，利用富血小板血浆制备用套装对静置后的抗凝全血进行离心，收集富血小板血浆层和贫血小板血浆层的产物，得到离心产物；
2)对所述离心产物进行3～6次冻融，得到冻融产物；
3)将所述冻融产物进行离心，收集上清液，得到血小板生长因子浓集物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述冻融的次数为4～5次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述冻融的方式包括液氮冻融。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中每次冻融过程中将所述离心产物于-20～-196℃条件下冷冻5～10min后，于4～37℃的条件下融解5～10min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述冷冻的温度为-30～-80℃。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述融解的过程中伴随超声或震荡处理。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述离心的转速为3000～10000rpm，时间为5～10min，温度为0～4℃。
8.权利要求1～7任意一项所述方法制备得到的血小板生长因子浓集物。
9.权利要求8所述血小板生长因子浓集物在制备组织再生修复的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述组织再生修复包括关节软骨修复、皮肤损伤修复和压疮损伤修复。
CN202010099444.0A 2020-02-18 2020-02-18 一种利用套装制备血小板生长因子浓集物的方法 Active CN111303270B (zh)

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