CN109045360A - 一种胶原-丝素蛋白-壳聚糖/黄芪多糖工程皮肤三维支架的制备方法 - Google Patents
一种胶原-丝素蛋白-壳聚糖/黄芪多糖工程皮肤三维支架的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医疗器械领域，尤其涉及人工工程皮肤领域。一种胶原‑丝素蛋白‑壳聚糖/黄芪多糖工程皮肤三维支架的制备方法，该方法包括以下的步骤：1）将胶原蛋白与丝素蛋白分别溶于蒸馏水中，配成3.0~4.0%的胶原蛋白水溶液以及1.0~2.0%的丝素蛋白水溶液中；2）将胶原蛋白水溶液与丝素蛋白水溶液按照溶质蛋白质量比1:1~5:1混合，在将制备好的黄芪多糖/壳聚糖微球加入到混合液中，充分搅拌混匀；3）将上述含有微球的混合溶液加至事先做好的模具容器内，‑30~‑20℃预冻成型，然后‑65~‑55℃真空干燥48h~72h，获得的工程皮肤三维支架。该方法制备份工程皮肤三维支架巧妙利用壳聚糖微球包裹黄芪多糖构建缓释系统，并复合在胶原‑丝素蛋白三维支架上，以解决该生物复合材料支架促血管化的目的。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械领域，尤其涉及人工工程皮肤领域。
背景技术
皮肤是面积最大的人体器官，具有感觉、调节体温、分泌与排泄、防止水分蒸发等多种作用，其中最主要的功能是作为人体与外界环境的屏障以维持内环境的稳定，同时其也是免疫系统的重要组成部分。随着我国经济、社会的快速发展，各种急、慢性致伤因素，如机械损伤、烧伤、体表肿瘤切除、慢性溃疡、交通事故、建筑事故等导致的皮肤缺损在临床上十分常见，常常导致非常严重的肢体残疾，甚至死亡。大面积皮肤缺损的治疗方法，主要有伤口覆盖物、自体皮肤移植、异体皮肤移植等，但伤口覆盖物没有生理功能，自体皮肤移植取材面积有限，异体皮肤移植免疫排斥反应大、皮肤容易脱落坏死等，易造成对患者的二次损伤，增加患者的痛苦。因此，应用组织工程皮肤修复为解决此问题带来了希望。
近二十年来，组织工程学的迅猛发展，为大面积皮肤缺损的重建与修复提供了新的思路和治疗途径。1987年，美国国家科学基金会(NSF)在加利福尼亚举行的生物工程专家讨论会上，首次提出了组织工程的概念，并明确了组织工程的定义：“Tissue Engineering”is the application of principles and methods of engineering and life sciencestoward the fundamental understanding of structure-function relationships innormal and pathological mammalian tissues and development of biologicalsubstitutes to restore，maintain，or improve tissue function。其核心是利用生命科学、材料学、计算机科学和工程学等学科的原理与方法，研究和开发产品替代、修复、改善人体各种组织和器官或使其再生的一门交叉学科。随着组织工程学的创立和发展，皮肤组织工程学迅速兴起，并成为近十年来研究的热点。经典意义上的组织工程皮肤包括表皮替代物、真皮替代物和表皮-真皮双层替代物，涉及生物支架材料、种子细胞、体内微环境、生物活性因子和刺激信号等多个方面。理想的皮肤替代物应符合如下4个条件：(1)具有相互连通的三维多孔结构，为细胞的长入、营养物质与代谢产物的转运提供便利；(2)具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且降解速率与新生组织生成速率相匹配；(3)合适的表面化学结构，有利于细胞的黏附、增殖及分化；(4)具有与待植入部位的目标组织相匹配的机械强度。
经过几十年的发展，目前已有多个组织工程皮肤产品问世，如ApligrafTM、OrCelTM、IntegraTM等产品已先后被美国药品与食品管理局(FDA)批准上市并应用于临床皮肤缺损的治疗中。然而，结合多年临床应用过程中遇到的问题，经文献检索，我们认为目前组织工程皮肤还面临着许多缺点和不足：1、由于血管生成能力差，易导致移植的皮肤早期没有血管系统供给营养，使皮肤替代物容易发生坏死，致移植失败；2、活性组织工程皮肤中所含的各种异体细胞容易引起免疫排斥反应，临床上常出现移植的皮肤坏死、脱落，甚至出现全身免疫反应等严重并发症，且存在传播疾病的危险；3、目前所有的组织工程皮肤产品都只能恢复正常皮肤的部分解剖结构和生理功能，无法再生具有重要功能的皮肤附属器结构，如：血管、毛囊、皮脂腺、汗腺等；4、现阶段组织工程皮肤修复常伴有创面感染、不愈合等并发症，成活率低，治疗效果并不理想。究其原因，与创面移植物修复的早期血管化程度密切相关。目前所研究的组织工程皮肤、脱细胞真皮支架等，都不具备血管网结构，本身没有营养来源，植入体内后，需通过诱导周围组织血管长入，使其逐渐与周围组织建立血液循环、获得营养。因此，如何实现快速血管化是目前组织工程皮肤领域面临的重大难题之一。
近年来，随着科学技术的不断发展，组织工程皮肤血管化的研究也逐渐深入，并取得了很大的成功。研究表明，通过构建复合材料缓释系统、筛选种子细胞类型、添加有效活性因子、细胞基因修饰等方式，均可促进组织工程皮肤的早期血管化。而复合生物材料以其优越的性能而备受青睐，其中，胶原蛋白(collagen，COL)-丝素蛋白(silkfibroin，SF)材料支架被发现具有很好的亲水性、组织相容性和生物降解性。胶原蛋白，是动物结缔组织的主要结构成分，不同种类动物来源的胶原具有非常相似的化学和生物学特征。胶原蛋白无毒具有较低的免疫原性、良好的生物相容性及生物可降解性，而且来源广泛，是应用最早的天然生物材料，可为细胞的贴壁、生长、增殖和定向分化提供微环境；丝素蛋白，是一种含有人体必需氨基酸的天然蛋白质，具有良好的生物相容性和力学性能，且降解缓慢。丝素蛋白由蚕丝经过脱胶制得，是一种无生理活性的天然高分子纤维蛋白，占蚕丝的70％～80％，含18种氨基酸，其中甘氨酸(Gly)约占46％、丙氨酸(Ala)约占29％、丝氨酸(Ser)约占12％。丝素蛋白由重链(H链，相对分子质量350kD)、轻链(L链，相对分子质量25.8kD)及糖蛋白p25(相对分子质量23.55kD)、3个寡糖链组成。此外，丝素蛋白存在SilkI和SilkII两种不同的构象，SilkI构象包括无规则线团和a-螺旋，SilkII构象则为反平行β-折叠。其中SilkI结构不够稳定，经极性溶剂、热处理等可转变成稳定的SilkII结构。Vepari等与Altman等认为丝素蛋白主要优点如下：1、具有其他天然纤维无法比拟的力学性能和柔性；2、对水和氧通透性好；3、可通过相对简单的处理获得多种不同的形态；4、有利于组织细胞长入，体内、外降解缓慢。基于上述优点，多孔丝素蛋白在皮肤组织工程支架中的应用研究日趋得到发展。因此，在胶原中加入一定比例的丝素蛋白，能有效改善其干态下的机械物理性能，如提高力学和抗水性能、降低热水溶失率、增强其对成纤维细胞、皮肤表皮细胞的黏附性，为细胞提供长久的支持，以更好的地匹配组织细胞的生长速度，而且可经过不同的处理方法达到不同的形态和孔隙要求，增强支架的弹性和多空状结构。
作为祖国医学的瑰宝，中医中药在治疗骨伤科、皮肤科疾病方面，活血化瘀法一直被认为是最重要的治法之一。而活血药物促进血管新生的药理作用已被许多学者证实，其广泛应用于缺血性脑卒中、冠心病、骨折等疾病的临床治疗。黄芪是常用中草药，其味甘，性微温，具有益气补虚之功效，可生用，亦可炙用。生用能固表，并能排毒、生肌；炙用能益气补中；其皮可利尿逐水湿，且持续时间较长。是中医补气要药。现代药理研究发现其具有增强免疫系统，抵御疾病、增强体质，抗氧化延缓衰老，改善心功能状态，抗病毒，抗癌等功能。中医认为补气以生血，李杲《内外伤辨惑论》首载该方重用黄芪，认为黄芪能够“大补脾肺之气，以裕生血之源…使阳生阴长，气旺血生”。有学者研究发现证明黄芪具有很强的促血管再生作用，而该作用主要归功于黄芪的有效成分-黄芪多糖(Astragalus Polysacharin，APS)。黄芪多糖对体外培养的大鼠肠黏膜微血管内皮细胞增殖具有促进作用，研究发现APS在低浓度时可明显促进细胞的增殖。
中国发明专利(公开号：CN104586775A)公开了一种治疗放射性肺炎的黄芪多糖缓释微球，按重量计，包括：黄芪多糖1份，壳聚糖3～7份，其中壳聚糖的聚合度为30CPS，50CPS，130CPS，同时公开了该黄芪多糖缓释微球的制备方法，采用该方法制备的黄芪多糖缓释微球，具有理想的靶向效果，给药后缓慢释放，作用时间长，增强黄芪多糖在靶器官中的浓度，且不造成局部血液浓度高；产品安全、环保、对放射性肺炎的治疗效果高、副作用小；操作简便、工艺稳定、易于工业化生产；产品的包封率及载药量高；皮肤光滑细腻。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种胶原-丝素蛋白-壳聚糖/黄芪多糖工程皮肤三维支架的制备方法，该方法制备份工程皮肤三维支架巧妙利用壳聚糖微球包裹黄芪多糖构建缓释系统，并复合在胶原-丝素蛋白三维支架上，以解决该生物复合材料支架促血管化的目的。
为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种胶原-丝素蛋白-壳聚糖/黄芪多糖工程皮肤三维支架的制备方法，该方法包括以下的步骤：
1)将胶原蛋白与丝素蛋白分别溶于蒸馏水中，配成3.0～4.0％的胶原蛋白水溶液以及1.0～2.0％的丝素蛋白水溶液中；
2)将胶原蛋白水溶液与丝素蛋白水溶液按照溶质蛋白质量比1:1～5:1混合，在将制备好的黄芪多糖/壳聚糖微球加入到混合液中，充分搅拌混匀；
3)将上述含有微球的混合溶液加至事先做好的模具容器内，-30～-20℃预冻成型，然后-65～-55℃真空干燥48h～72h，获得的工程皮肤三维支架。
作为优选，所述的黄芪多糖/壳聚糖微球的制备方法包括以下的步骤：
1)将壳聚糖固体，50℃水浴条件下，加至1～5％的冰乙酸溶液中，30～50rpm搅拌，使壳聚糖完全溶解，获得壳聚糖-冰乙酸溶液；
2)将黄芪多糖，加至制备好的壳聚糖-乙酸溶液中，搅拌使其完全溶解，获得混合溶液；
3)在烧杯中加入含有1～2％体积百分比的Span-80的液体石蜡作为油相，将壳聚糖混合溶液逐滴加入到油相，50℃水浴条件下，30～50rpm搅拌使其乳化，并维持10～30min；
4)待乳化结束后，向溶液中加入戊二醛；50℃水浴条件下，30～50rpm搅拌2～4h后，将反应物转移至离心管，静置离心，弃上层液，石油醚洗涤沉淀2～4次。
5)将洗涤好的混合物进行真空抽滤，同时用异丙醇淋洗，预期获得橘黄色固体粉末，即为黄芪多糖/壳聚糖微球。
作为优选，所述的胶原蛋白的制备方法如下：
1)取新鲜的牛腹，剔除肌肉、脂肪和筋膜，用三蒸水反复冲洗；
2)取适量处理的牛键剪成碎块，用0.1％的Na2C03浸泡2h，再用三蒸水冲洗5次；
3)将牛键碎块移入研钵，倒入适量液氮充分冷冻，然后用组织匀聚机将其打成牛腱粉末，-20℃下保存备用；
4)取适量牛键粉末，加入0.5％乙酸溶液加1％胰蛋白酶溶液4℃下充分溶胀、消化24h以上，然后加入几滴H2O2，充分混匀后静置10-15min；加入3％乙酸1000ml，充分混匀后，布氏漏斗过滤，将未溶胀的牛腱颗粒过滤掉。溶胀物于离心机中离心，2000rpm/min，15min以除去不溶物；
5)以5％NaCl溶液盐析，离心，2000rpm/min，5min，收集沉淀；沉淀物于3％乙酸中充分溶胀，未溶胀牛腱颗粒再溶胀后上述步驟；4℃下三蒸水中透析72h，每12h换水一次；
透析后的胶原，经冷冻冻干后于4℃下保存备用。
本发明的制备的胶原-丝素蛋白-壳聚糖/黄芪多糖工程皮肤三维支架，该工程皮肤三维支架包括胶原/丝素蛋白支架和黄芪多糖/壳聚糖微球，黄芪多糖/壳聚糖微球均匀负载在胶原/丝素蛋白支架上，黄芪多糖/壳聚糖微球与胶原/丝素蛋白支架的质量比为1:1～1:20；所述的胶原/丝素蛋白支架由胶原蛋白和丝素蛋白构成，胶原蛋白和丝素蛋白的质量百分比为1:1～5:1；所述的黄芪多糖/壳聚糖微球由黄芪多糖和壳聚糖构成，黄芪多糖包封在壳聚糖内，黄芪多糖的载药量为10～30％。
作为优选，所述的黄芪多糖/壳聚糖微球与胶原/丝素蛋白支架的质量比为1:5～1:10。
作为优选，所述的黄芪多糖/壳聚糖微球的平均粒径为20～50μm，胶原/丝素蛋白支架的孔隙率为85～95％。
作为优选，所述的胶原蛋白和丝素蛋白的质量百分比为2:1～3:1，所述的黄芪多糖的载药量为15～25％。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
本发明由于采用了上述的技术方案，以胶原-丝素蛋白构建的三维结构为基质制备组织支架，复合壳聚糖包裹中药单体黄芪多糖缓释系统，来构建的新型生物复合皮肤材料。该新型生物复合皮肤材料具有以下独特的优点：①COL-SF支架材料具有良好的生物相容性、生物可降解性和合适的表面化学结构，其无明显毒性，不会引起皮内免疫排斥反应，具有良好的生物安全性，并在一定的时间内讲解有利于组织内细胞长入支架，符合其作为组织工程皮肤的基本条件，将大大提高临床治疗效率；②缓释APS的COL-SF支架在制备过程和SD大鼠体内依旧保持其活性，可显著促进COL-SF支架内血管化和组织再生；③制备的COL-SF三维支架具有相互连通的三维多孔结构，能为组织内细胞的迁移、生长、贴壁、增殖、营养物质与代谢产物的转运提供便利；④动物移植术后能形成早期新生血管系统，将很好得解决移植皮肤容易坏死、成活率低的问题；⑤相对于目前的组织工程皮肤产品，此新型皮肤复合材料将更大程度的恢复和再生正常皮肤组织的解剖结构和生理功能。
本发明的制备的胶原-丝素蛋白-壳聚糖/黄芪多糖工程皮肤三维支架具有良好的生物相容性，可以促进新生皮肤血管网络再生，提高新生皮肤修复的速度和效率，增强修复重建的生物活性，有利于新生皮肤组织的重塑，为机械损伤、体表肿瘤切除、交通事故和建筑事故等导致的大面积皮肤缺损的治疗，提供源源不断且高效的新型组织工程皮肤来源，为创伤骨科、烧伤外科和修复重建外科对大面积皮肤缺损的治疗，开辟了一种崭新的将组织工程皮肤和中医药理论相结合的途径。
附图说明
图1、图2为流式细胞仪检测HUVEC被相应处理24小时后的细胞周期。A：对照组；B：0.1μg/mL APS；C：1μg/mL APS；D：10μg/mL APS；E：50μg/mL APS；F：100μg/mL APS；G：200μg/mL APS；H：20ng/mL VEGF。
图3、图4为流式细胞仪检测HUVEC被相应处理24小时后的细胞凋亡。A：对照组；B：0.1μg/mL APS；C：1μg/mL APS；D：10μg/mL APS；E：50μg/mL APS；F：100μg/mL APS；G：200μg/mL APS；H：20ng/mL VEGF。
图5为荧光倒置显微镜检测HUVEC被相应处理24小时后的VEGF表达(200X)。A：对照组；B：0.1μg/mL APS；C：1μg/mL APS；D：10μg/mL APS；E：50μg/mL APS；F：100μg/mL APS；G：200μg/mL APS；H：20ng/mL VEGF。
图6为黄芪多糖/壳聚糖微球光镜下观察结果。
图7为黄芪多糖/壳聚糖微球扫描电子显微镜下观察结果。
图8为黄芪多糖/壳聚糖微球体外缓释曲线。
图9为复合支架扫描电子显微镜下观察结果。
具体实施方式
一、材料与方法
1.细胞系：人脐静脉内皮细胞系HUVEC，购自上海皓歌生物科技有限公司。用含10％胎牛血清的M200培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养，2-3天换液1次。
2.药物与试剂：APS(西安旭煌生物科技有限公司)；M200细胞培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，胰蛋白酶(美国Gibco公司)，VEGF(杭州纽龙生物公司)，鼠抗人VEGF单抗(Abcam)，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(康成生物)，AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒(碧云天生物)，细胞周期检测试剂盒(碧云天生物)。
3.主要仪器：CO2培养箱(Thermo)，荧光倒置显微镜(日本Nikon)，流式细胞仪(美国BD公司)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)。
4.实验分组：对照组，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml，50μg/ml，100μg/mL，200μg/mL，VEGF组。
5.细胞周期检测：釆用流式细胞仪检测。HUVEC经PBS洗涤、消化，用含0.5％FBS的M200培养基制成细胞悬液。经细胞记数，按每孔1×105/2ml接种于6孔板。全培养基培养24小时后弃去培养液，换上只含有0.5％FBS的培养基预处理24小时，以达到细胞同步化。分别加入2ml对照组，实验组和阳性对照组培养基。继续常规培养24小时后，离心收集细胞，PBS洗涤2次，弃上清，加入1ml预冷的70％乙醇，细胞吹打成单细胞悬液固定，4℃存放。PBS洗涤固定的细胞2次，2000rpm离心5min，加入n(终浓度为20μg/ml)和RNaseA(终浓度为50μg/ml)，37℃避光染色30min，上机前将细胞混匀，过200目尼龙网。30min内上机检测。釆用美国BD公司生产的流式细胞仪进行DNA测量，激发波长480mn，检测细胞周期分布情况。应用BD公司提供的相应软件程序进行资料处理。
6.细胞凋亡检测：采用流式细胞仪检测。HUVEC经PBS洗涤、消化，用含0.5％FBS的M200培养基制成细胞悬液。经细胞记数，按每孔1×105/2ml接种与6孔板。全培养基培养24小时后弃去培养液，换上只含有0.5％FBS的培养基预处理24小时，以达到细胞同步化。分别加入2ml对照组，实验组和阳性对照组培养基。继续常规培养24小时后，离心收集细胞，PBS洗涤2次，收集各组细胞1×106个于离心管中。将细胞重悬于500μL Buffer液中，分别加入5μL PI和5μL AnnexinV-FITC，室温避光孵育30min后混匀转到流式管中用于检测。
7.细胞免疫荧光染色：HUVEC经PBS洗涤、消化，用含0.5％FBS的M200培养基制成细胞悬液。经细胞记数，按每孔1×105/2ml接种与6孔板。全培养基培养24小时后弃去培养液，换上只含有0.5％FBS的培养基预处理24小时，以达到细胞同步化。分别加入2ml对照组，实验组和阳性对照组培养基。继续常规培养24小时后，PBS清洗3次。4％多聚甲酸固定细胞60min，PBS清洗3次。滴加5％正常山羊血清封闭30min后直接滴加滴加兔VEGF单克隆抗体(1:100)，常温孵育90min。PBS清洗3次后滴加FITC标记的山羊抗兔荧光二抗(1:100)，室温避光孵育60min。PBS清洗3次，滴加DAPI标记细胞核，室温避光孵育10min。PBS清洗3次，直接荧光显微镜观察细胞绿色荧光的多少。DAPI标记细胞核，荧光显微镜观察为蓝色。
8.统计学分析：数据釆用SPSS18.0(USA)进行处计量资料釆用均数士标准差表示，p<0.05认为有统计学意义。
二、结果
1.APS对HUVEC细胞周期的影响
流式细胞周期检测结果显示APS组、VEGF组均能使HUVEC细胞周期G2/M期和S期比例增加。空白对照组G0/G1期，G2/M期和S期分别为50.67％，23.49％，10.21％。随着APS浓度增加，G2/M期和S期的比例增加，10ug/ml时与空白对照组相比即有统计学意义。APS浓度在100ug/ML时达到最高，G2/M期和S期分别为40.67％和13.01％。VEGF组作用小24时后，G0/G1期，G2/M期和S期分别为32.87％，40.67％和15.59％，其作用较空白对照组有统计学差异。这些结果表明处理细胞后可以诱导细胞细胞周期向给G2/M期和S期转变。
2.检测细胞调亡
流式细胞仪检测细胞调亡率如图3、图4所示。空白对照组，APS组和VEGF组作用24h后Q2期和Q3期调亡率没有明显改变。这些结果表明APS对HUVEC无明显的毒性作用。3.细胞免疫荧光染色
VEGF是HUVEC细胞特异性促增长因子，可显著促进HUVEC细胞形成血管网[3]。如图6所示，空白对照组HUVEC细胞仅少量表达VEGF。APS组、VEGF组均能刺激HUVEC细胞表达更多的VEGF。随着APS浓度的增加，VEGF表达量增加，并在100μg/mL时VEGF表达量最高，为空白对照组表达量的倍，有显著统计学差异。100μg/mL APS较空白组VEGF表达增加，比VEGF组表达量略低，是VEGF组VEGF表达量的88.9％。这些结果表明，APS可以促进HUVEC细胞表达VEGF，这对于HUVEC细胞早期血管化尤其重要。
本发明发现APS在一定浓度范围内具有促进HUVEC增殖的作用，促进HUVEC细胞周期从G0/G1期向G2/M期和S期转变，并且与剂量成正比，在100μg/mL时达到最高。APS作用24h后，100μg/mL组和VEGF组G2/M期和S期分别为40.67％和13.01％以及40.67％和15.59％，而空白对照组G2/M期和S期分别为23.49％和10.21％。且24h作用后，流式细胞凋亡检测显示APS并未增加HUVEC凋亡率，APS促进内皮细胞增殖和血管化作用而不产生副作用。细胞免疫荧光染色实验结果表明，APS作用24h后，HUVEC的VEGF表达也与APS剂量成正相关，100μg/mLAPS促进HUVEC的VEGF表达明显高于空白对照组。200μg/mL时APS作用较100μg/mL略下降，这一现象可能是与APS浓度为200μg/mL时出现的轻微细胞毒性有关。
以上研究结果证实APS有良好的促进HUVEC细胞增殖，增加HUVEC细胞周期中G2/M期和S期的比例。同时APS可以上调HUVEC中VEGF的表达，可以进一步促进新生血管的生成及组织血管化进程。通过探讨APS治疗缺血性疾病的机制，从而为组织再生、促进组织血管化提供实验依据。
实施例2负载黄芪多糖/壳聚糖微球的胶原/丝素蛋白支架的制备及质量评价
1.实验目的
(1)采用乳化-交联法制备黄芪多糖/壳聚糖微球，并优化制备方案；
(2)构建负载黄芪多糖/壳聚糖微球的胶原/丝素蛋白支架。
2.实验试剂及仪器
2.1实验试剂
实验所需试剂见表2-1。
表2-1实验试剂
2.2实验仪器
实验所需试剂见表2-2。
表2-2实验仪器
3.实验步骤
3.1黄芪多糖/壳聚糖微球制备
采用乳化-交联法制备黄芪多糖/壳聚糖微球，具体步骤如下：
(1)精确称取2g壳聚糖固体，50℃水浴条件下，加至100mL 2％的冰乙酸溶液中，40rpm搅拌，使壳聚糖完全溶解，获得壳聚糖-冰乙酸溶液。
(2)精确称取1g黄芪多糖，加至制备好的壳聚糖-乙酸溶液中，搅拌使其完全溶解，然后量取20mL混合溶液。
(3)在烧杯中加入90mL含2mLSpan-80的液体石蜡作为油相，将壳聚糖混合溶液逐滴加入到油相，50℃水浴条件下，40rpm搅拌30min使其乳化并维持20min。
(4)待乳化结束后，向溶液中加入2mL 25％的戊二醛。50℃水浴条件下，40rpm搅拌3h后，将反应物转移至离心管，静置离心，弃上层液，石油醚洗涤沉淀3次。
(5)将洗涤好的混合物进行真空抽滤，同时用异丙醇淋洗，预期获得橘黄色固体粉末，即为黄芪多糖/壳聚糖微球。将在载药微球取出，放在干净的表面皿上，50℃的恒温烘箱中烘干24h。
3.2负载黄芪多糖/壳聚糖微球的胶原/丝素蛋白支架的制备
采用溶液浇注-冷冻干燥技术，具体制备过程如下：
(1)将胶原蛋白与丝素蛋白分别溶于一定体积的蒸馏水中，配成3.5％的胶原蛋白水溶液以及1.5％的丝素蛋白水溶液中。
(2)将胶原蛋白水溶液与丝素蛋白水溶液按照溶质蛋白质量比7:3混合，在将制备好的黄芪多糖/壳聚糖微球按一定的量加入到混合液中，充分搅拌混匀。
(3)将上述含有微球的混合溶液加至事先做好的模具容器内，-20℃预冻成型，然后-60℃真空干燥48h至72h，获得的支架为圆柱形，底面半径为0.70cm，高度为0.50cm，每个支架含有黄芪多糖/壳聚糖微球0.1g。
4.性能测试
4.1形貌粒径观察
采用离子溅射仪对黄芪多糖/壳聚糖微球及负载黄芪多糖/壳聚糖微球的胶原/丝素蛋白支架做导电处理，喷镀电流为10mA，时间为40s。然后，应用扫描电镜对处理好的样品进行表面形貌观察，并通过图像测量和分析，计算微球平均粒径。
4.2载药率和包封率
采用蒽酮-硫酸比色法测定黄芪多糖/壳聚糖微球载药率及包封率。首先，称取蒽酮0.2g，加至100mL浓硫酸中，充分搅拌溶解，得到蒽酮试剂。然后，取6支带塞试管，精密配制一系列葡萄糖溶液，浓度依次为0、10、20、30、40、50μg/mL，每支试管1mL，每个浓度做3次重复。然后，迅速向每只试管中加入蒽酮试剂4mL，振荡混匀后，各管同时置于沸水中加热10min。取出，迅速浸入冰水中冷却并放置10min。以0μg/mL管为空白，分别用紫外分光光度计于620nm处测定吸光度A，并以浓度(μg/mL)为横坐标、吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
取一定量的黄芪多糖/壳聚糖微球于研钵中充分研磨后，移至烧杯中，加入蒸馏水充分溶解黄芪多糖(可超声助溶)，离心取上清，蒸馏水定容后，于620nm处测定吸光度A，并根据标准曲线计算黄芪多糖浓度。微球载药率及包封率的计算公式如下：
载药率＝(微球内药量/微球总质量)×100％
药物包封率＝(微球内药量/加入的总药量)×100％
4.3微球体外释放行为
精确称取一定量的黄芪壳聚糖微球于pH 7.4的磷酸缓冲液中，模拟药物体内释放条件，设置转速为200rpm，温度为37℃±5℃。分别于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8、10、12、20、25、30、48h各取样5.0mL，并补充5.0mL新鲜介质溶液。然后，采用紫外分光光度计于620nm处测定样品吸光度A，并根据标准曲线计算黄芪多糖浓度以及药物累计释放率，公式如下：
累计释放率＝药物释放总量/(载药微球重量×载药率)×100％
4.4孔隙率测定
采用介质浸泡法测定支架孔隙率。首先测定样本的底面半径(r)以及高度(h)，并计算出支架体积。然后，称得干燥样品在空气中的质量记为m1，将支架浸入液体石蜡(密度为ρ)中待其饱和(可通过负压脱气)后，再取出样品，轻轻擦去样品表面的介质。再次称量样品质量记为m2，并根据公式计算出孔隙率：
孔隙率(％)＝(m2-m1)/ρ/(hπr^2)×100％
5.实验结果
5.1黄芪多糖/壳聚糖微球载药量及包封率
(1)标准曲线
分别以药物浓度(C)和吸光度(A)为横坐标及纵坐标，绘制黄芪多糖在溶液中的散点图及线性拟合曲线，并推算线性拟合方程为Y＝0.0056X-0.0007，R2＝0.9996，620nm处，黄芪多糖在10μg/ml～50μg/ml浓度范围内线性关系良好。
(2)样品包封率及载药率
根据测得的载药微球在溶液中的吸光度，代入线性拟合方程，计算出药物浓度，每个测试点平行测量3次，得出黄芪多糖/壳聚糖微球的载药率为13.7％，包封率为70.6％。
5.2黄芪多糖/壳聚糖微球光镜及扫描电镜结果
(1)光镜下观测结果
黄芪多糖/壳聚糖微球外观呈橘黄色粉末，颗粒分散均匀，无粘连。显微镜下微球呈橘黄色圆球状，微球大小比较均一，见图7。
(2)扫面电子显微镜下观测结果
壳聚糖载药微球的球形形态较好，微球平均粒径为35μm，分散性较好，少量微球之间有粘连现象，见图8。
5.3黄芪多糖/壳聚糖微球体外释放结果
将制备的黄芪/壳聚糖微球置于pH 7.4的PBS缓冲溶液中测试其体外缓释性质，所得缓释曲线如图9所示。从载药微球的累积释放时间曲线可以看出在2h内黄芪多糖释放量达到50％，在8h内黄芪多糖释放量达到70％，说明载药微球前期释放速度稍快，但是没有突释现象出现。在10h后载药微球释放速度变缓，缓释效果明显，在48h后黄芪多糖累积释放接近100％，基本完成释放。整个缓释过程，累积缓释曲线是逐渐上升的，载药微球有明显的缓释效果。
5.4负载黄芪多糖/壳聚糖微球的胶原/丝素蛋白支架孔隙率分析
负载黄芪多糖/壳聚糖微球的胶原/丝素蛋白支架的质地均匀。根据三次平行测量的结果可知(表2-3)，负载黄芪多糖/壳聚糖微球的胶原/丝素蛋白支架的孔隙率为90.8％，较为合理，有利于细胞营养物质的吸收和废物的排放。
表2-3复合支架孔隙率分析
5.5负载黄芪多糖/壳聚糖微球的胶原/丝素蛋白支架电镜结果
组织工程支架的表面微结构(如孔的尺寸、分布、孔的形态及孔隙率)均影响细胞的黏附、增殖和分化。根据扫面电镜结果(图9)显示，负载黄芪多糖/壳聚糖微球的胶原/丝素蛋白支架孔隙较大，形态良好，微球在其中分布均匀。
6.结论
(1)经重复实验优化处理，制备出载药率13.7％、包封率70.6％的黄芪多糖/壳聚糖微球，其平均粒径为35μm。光镜及扫描电镜下观察，黄芪多糖/壳聚糖微球形态较好，分散性较好，只有少量微球之间有粘连现象。
(2)体外实验显示，本次制得的黄芪多糖/壳聚糖微球在48h内可较稳定地释放药物，且不存在突释现象。
(3)负载黄芪多糖/壳聚糖微球的胶原/丝素蛋白支架质地均匀，孔隙率为90.8％。扫面电子显微镜下观察，复合支架孔隙较大，形态良好，微球在其中分布均匀，有利于黄芪多糖在人体内的缓慢长效稳定释放，也有利于细胞的物质交流及废物排放。
Claims (3)
1.一种胶原-丝素蛋白-壳聚糖/黄芪多糖工程皮肤三维支架的制备方法，其特征在于，该方法包括以下的步骤：
1）将胶原蛋白与丝素蛋白分别溶于蒸馏水中，配成3.0~4.0%的胶原蛋白水溶液以及1.0~2.0%的丝素蛋白水溶液中；
2）将胶原蛋白水溶液与丝素蛋白水溶液按照溶质蛋白质量比1:1~5:1混合，在将制备好的黄芪多糖/壳聚糖微球加入到混合液中，充分搅拌混匀；
3）将上述含有微球的混合溶液加至事先做好的模具容器内，-30~-20℃预冻成型，然后-65~-55℃真空干燥48h~72h，获得的工程皮肤三维支架。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，黄芪多糖/壳聚糖微球的制备方法包括以下的步骤：
1）将壳聚糖固体，50℃水浴条件下，加至1~5%的冰乙酸溶液中，30~50 rpm搅拌，使壳聚糖完全溶解，获得壳聚糖-冰乙酸溶液；
2）将黄芪多糖，加至制备好的壳聚糖-乙酸溶液中，搅拌使其完全溶解，获得混合溶液；
3）在烧杯中加入含有1~2%体积百分比的Span-80的液体石蜡作为油相，将壳聚糖混合溶液逐滴加入到油相，50℃水浴条件下，30~50 rpm搅拌使其乳化，并维持10~30 min；
4）待乳化结束后，向溶液中加入戊二醛；50℃水浴条件下，30~50 rpm搅拌2~4 h后，将反应物转移至离心管，静置离心，弃上层液，石油醚洗涤沉淀2~4次；
5）将洗涤好的混合物进行真空抽滤，同时用异丙醇淋洗，预期获得橘黄色固体粉末，即为黄芪多糖/壳聚糖微球。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，胶原蛋白的制备方法如下：
1）取新鲜的牛腹，剔除肌肉、脂肪和筋膜，用三蒸水反复冲洗；
2）取适量处理的牛键剪成碎块，用0.1%的Na2C03浸泡2 h，再用三蒸水冲洗5次；
3）将牛键碎块移入研钵，倒入适量液氮充分冷冻，然后用组织匀聚机将其打成牛腱粉末，-20℃下保存备用；
4）取适量牛键粉末，加入0.5%乙酸溶液加1%胰蛋白酶溶液4℃下充分溶胀、消化24h以上，然后加入几滴H2O2，充分混匀后静置10-15 min；加入3%乙酸1000ml，充分混匀后，布氏漏斗过滤，将未溶胀的牛腱颗粒过滤掉；
5）溶胀物于离心机中离心，2000 rpm/min，15min以除去不溶物；
6）以5% NaCl溶液盐析，离心，2000 rpm/min，5min，收集沉淀；沉淀物于3%乙酸中充分溶胀，未溶胀牛腱颗粒再溶胀后上述步驟；4℃下三蒸水中透析72h，每12h换水一次；透析后的胶原，经冷冻冻干后于4℃下保存备用。
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